Разработка электрохимического иммуносенсора для определения антигена вируса клещевого энцефалита

Научно-исследовательская работа связана с получением и исследованием конъюгатов на основе наночастиц серебра, которые в дальнейшем были использованы при разработке электрохимического иммуносенсора для определения антигена вируса клещевого энцефалита. В результате исследования были подобраны оптимальные рабочие условия для регистрации электрохимического сигнала от наночастиц серебра и их конъюгатов методом анодной инверсионной вольтамперометрии, разработан электрохимический иммуносенсор для определения антигена вируса клещевого энцефалита в вакцине.

Введение ………………………………………………………………………………………………….. 15
Глава 1 Литературный обзор ………………………………………………………………….. 18
1.1 Способы получения конъюгатов и их характеристики ………………………. 18
1.2 Нековалентная конъюгация НЧ с биомолекулами …………………………….. 19
1.3 Ковалентная конъюгация наночастиц с биомолекулами ………………………. 20
1.4 Характеристика конъюгатов физико-химическими методами анализа .. 23
1.4.1 Взаимодействие с хлоридом натрия …………………………………………… 23
1.4.2 Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия………………………….. 24
1.4.3 Спектрофотометрический метод анализа ……………………………………. 26
1.4.4 Просвечивающая электронная микроскопия ………………………………. 28
1.4.5 Регистрация электрохимического сигнала от НЧ серебра ……………….. 30
Глава 2 Материалы и методы исследования …………………………………………… 32
2.1 Приборы и оборудование…………………………………………………………………… 32
2.2 Реактивы ………………………………………………………………………………………….. 34
2.3 Объекты исследования …………………………………………………………………… 35
2.4 Методы исследования ……………………………………………………………………….. 35
2.4.1 Синтез наночастиц серебра и их концентрирование ……………………….. 35
2.4.2 Подбор соотношения наночастиц серебра – белок …………………………. 36
2.4.3 Получение серебряных конъюгатов с бычьим сывороточным
альбумином (БСА) ………………………………………………………………………………. 37
2.4.4 Получение конъюгатов антивидовых моноклональных антител против
ВКЭ с меткой НЧ серебра (Сантител=1600 ед/мл) ……………………………………… 38
2.4.5 Методика очистки конъюгатов от несвязанного белка ……………………. 39
2.4.6 Методика записи вольтамперограмм …………………………………………….. 39
2.4.7 Методика десорбции антигена ВКЭ с алюминием гидроксида………… 40
2.4.8 Методика определения антигена вируса клещевого энцефалита в
образцах ……………………………………………………………………………………………… 40
Глава 3 Результаты и обсуждения …………………………………………………………… 43
3.1 Характеристика наночастиц серебра…………………………………………………… 44
3.2 Характеристика конъюгатов наночастиц серебра с бычьим сывороточным
альбумином (БСА) …………………………………………………………………………………. 50
3.3 Сборка тест-системы и усиление сигнала серебра ……………………………….. 55
3.3.1 Характеристика конъюгатов НЧ серебра с антивидовыми
моноклональными противоклещевыми антителами ……………………………….. 55
3.3.2 Усиление сигнала серебра ……………………………………………………………. 57
3.3.3 Апробация электрохимического иммуносенсора по определению
рекомбинантного белка в вакцине ЭнцеВир ………………………………………….. 59
Глава 4 Финансовый менеджмент, ресурсоэффективность и
ресурсосбережение…………………………………………………………………………………… 62
4.1 Предпроектный анализ …………………………………………………………………… 62
4.1.1 Потенциальные потребители результатов исследования …………………. 62
4.1.2 Анализ конкурентных технических решений с позиции
ресурсоэффективности и ресурсосбережения ………………………………………… 63
4.2 SWOT-анализ ……………………………………………………………………………………. 64
4.3 Оценка готовности проекта к коммерциализации………………………………… 66
4.4 Метод коммерциализации результатов научно-технического исследования
……………………………………………………………………………………………………………… 68
4.5 Инициация проекта …………………………………………………………………………… 68
4.6 Ограничения и допущения проекта…………………………………………………….. 69
4.7 Планирование управления научно-техническим проектом …………………… 70
4.7.1 Организационная структура проекта …………………………………………….. 70
4.7.2 План проекта……………………………………………………………………………….. 70
4.8 Бюджет научного исследования …………………………………………………………. 72
4.8.1 Специальное оборудование для научных (экспериментальных) работ 73
4.8.2 Основная заработная плата исполнителей темы …………………………….. 75
4.8.3 Отчисления на социальные нужды ……………………………………………….. 77
4.9 Определение ресурсной (ресурсосберегающей), финансовой, бюджетной,
социальной и экономической эффективности исследования ……………………… 78
4.9.1 Оценка сравнительной эффективности исследования …………………….. 78
Глава 5 Социальная ответственность……………………………………………………… 82
5.1 Правовые и организационные вопросы обеспечения безопасности ………. 82
5.1.1 Специальные (характерные для проектируемой рабочей зоны)
правовые нормы трудового законодательства ……………………………………….. 84
5.1.2 Организационные мероприятия при компоновке рабочей зоны ………. 86
5.2 Производственная безопасность ………………………………………………………… 87
5.2.1 Анализ опасных и вредных производственных факторов, которые
могут возникнуть в лаборатории при проведении исследования и
обоснование мероприятий по их устранению ………………………………………… 88
5.2.1.1 Работа с вредными химическими веществами …………………………….. 88
5.2.1.2 Отклонение показателей микроклимата ……………………………………… 89
5.2.1.3 Превышение уровня шума …………………………………………………………. 91
5.2.1.4 Освещенность рабочей зоны………………………………………………………. 91
5.2.1.5 Электробезопасность ………………………………………………………………… 92
5.3 Экологическая безопасность ……………………………………………………………… 94
5.3.1 Анализ влияния объекта и процесса исследования на окружающую
среду ………………………………………………………………………………………………….. 94
5.3.2 Мероприятия по защите окружающей среды …………………………………. 94
5.4 Безопасность в чрезвычайных ситуациях ……………………………………………. 95
5.4.1 Анализ вероятных ЧС, которые могут возникнуть в лаборатории при
проведении исследований ……………………………………………………………………. 95
5.4.2 Обоснование мероприятий по предотвращению ЧС и разработка
порядка действия в случае возникновения ЧС ……………………………………….. 95
Заключение …………………………………………………………………………………………….. 99
Список публикаций ………………………………………………………………………………. 100
Список используемых источников ………………………………………………………… 101
ПРИЛОЖЕНИЕ А …………………………………………………………………………………. 108

По результатам проведенного исследования
1) Получены НЧ серебра сферической формы со средним размером 14 – 16
нм, путем химического восстановления нитрата серебра боргидридом натрия.
2) Методом пассивной адсорбции получены конъюгаты на основе
антивидовых моноклональных антител против ВКЭ с меткой НЧ серебра. Было
выявлено, что на синтез конъюгатов влияет соотношение антител (1600 ед/мл) к
НЧ серебра, которое в нашем случае составило 18:1.
3) Конъюгаты были охарактеризованы инсрументальными методами
анализа.
4) Эффективным растворителем конъюгата Ab@Ag является смесь
уксусной и азотной кислот. Рабочими вольтамперометрическими условиями
регистрации сигнала от серебра конъюгатов являются: метод анодной
инверсионной вольтамперометрии с Енак= минус 0,600 В; tнак=80с, скорость
развертки 40 мВ/с; фоновый электролит: KNO3 0,040 M + HNO3 0,15 M.
5) Разработан модельный электрохимический иммуносенсор для
определения антигена ВКЭ.
6) Электрохимический иммуносенсор для определения антигена ВКЭ
апробирован на вакцине ЭнцеВир.
Список публикаций

1. XХ Международная научно-практическая конференция студентов и
молодых ученых «Химия и химическая технология в XXI веке» имени
профессора Л.П. Кулёва. Раздел: Теоретические и прикладные аспекты
физической и аналитической химии.
Тезис на тему «Подбор стабилизаторов для наночастиц серебра,
применяемых в качестве меток для электрохимических сенсоров».
2. XХI Международная научно-практическая конференция студентов и
молодых ученых «Химия и химическая технология в XXI веке» имени
профессора Л.П. Кулёва. Раздел: Теоретические и прикладные аспекты
физической и аналитической химии.
Тезис на тему «Определение антигена вируса клещевого энцефалита
методом вольтамперометрии» (печать).