Изучение химического состава и структуры препаратов диоксанлигнина методами ЯМР-спектроскопии

Обзор литературы, представленный в первой главе, включает 5 разделов, в которых систематизированы общие сведения о строении лигнинов, в том числе рассматриваются вариации в структуре лигнинов, содержащихся в составе различных растительных объектов. Показано, что несмотря на возросшую активность к исследованию химической структуры лигнинов корки и коры в целом, а также лигнинов трав, в литературе практически отсутствует информация о химической структуре лигнина флоэмы, за исключением нескольких случаев, и лигнинов арктических растений.
Обобщена информация по способам выделения препаратов лигнина из растительных материалов. Отмечены их достоинства и недостатки. Показано, что ДЛ рассматривается как препарат, близко отражающий химические и структурные особенности природного лигнина, и широко используются для изучения особенностей его химического строения, в том числе и с использованием методов ЯМР- спектроскопии. Однако анализ ДЛ в основном заключается в идентификации известных структурных фрагментов лигнина, в то время как модификации, происходящие с лигнином в ходе извлечения, оказывались без внимания. Следовательно, характеристика таких препаратов оказывается не полной.
Рассмотрены основные методы и подходы к исследованию химической структуры лигнина. Показана доминирующая роль в данном вопросе методов ЯМР- спектроскопии. Особое внимание уделено особенностям методологии исследования
методом ЯМР-спектроскопии. Показано отсутствие критериев, используемых в качестве идентификаторов для оценки точности анализа, а также методических подходов к идентификации неизвестных кросс-пиков.
В методической части работы приведен перечень оборудования и реагентов, используемых для выполнения экспериментальной части работы. В качестве основного аналитического оборудования использовался ЯМР-спектрометр высокого разрешения AVANCE III 600 (Bruker, Германия) с резонансной частотой для протонов 600 МГц. Для характеристики препаратов лигнина использовалось следующее оборудование: Система эксклюзионной хроматографии на базе жидкостного хроматографа LC-20 Prominence (Shimadzu, Япония); Система газовой хроматографии – масс-спектрометрии QP-2010 Ultra (Shimadzu, Япония), Элементный CHNS анализатор EA-3000 (EuroVector, Италия), а также ИК-Фурье-спектрометр Vertex-70v (Bruker, Германия) и УФ-спектрофотометр Specord 250 Plus (Analytik Jena, Германия).
Приведено описание методик выполнения экспериментов. Основные сигналы в 1D ЯМР-спектрах и кросс-пики на 1Н-13С HSQC были назначены путем сравнения значений их химических сдвигов с литературными данными. Идентификация неизвестных кросс-пиков проводилась путем комбинации данных 1Н-13С HMBC и 1Н- 1Н TOCSY спектров и экспертной системой ACD/Labs®. Содержание основных типов связей определялось комбинированным методом по данным HSQC и 13С ЯМР- спектров. Относительное количественное определение основных ФПЕ осуществлялось путем объемного интегрирования соответствующих кластеров в ароматической области HSQC спектра. Содержание ОСН3-групп определялось по данным 13С ЯМР. Расчет содержания ОН-групп и СООН-групп проводили по данным 31Р ЯМР-спектров.
Дана характеристика растительного сырья, используемого для выделения препаратов лигнина. Анализ компонентного состава проводили по общепринятым методикам1. В качестве реальных образцов для определения особенностей химической структуры препаратов ДЛ и совершенствования методологии анализа химической структуры лигнинов методами ЯМР-спектроскопии изучались лигнины, выделенные из лиственницы (Larix sibirica), сосны (Pinus cembra) – типичные представители семейства сосновые (Pinaceae), а также можжевельника (Juniperus communis) – семейство кипарисовых (Cupressaceae), как представитель лигнина реликтовых хвойных пород древесины.
25-30 лет. Результаты
анализа компонентного состава представлены в таблице 1.
В качестве представителя арктических растений выступало растение
камнеломка (Saxifraga oppositifólia) (возраст не менее 3-х лет) отобранное членами экспедиции Арктический плавучий университет в 2019 году на территории арх. Шпицберген. Массовая доля лигнина Класона и целлюлозы в исследуемом образце установлена на уровне 44,0 и 23,6 % от массы а.с.в, соответственно.
1 Оболенская А.В., Ельницкая З.П., Леонович А.А. Лабораторные работы по химии древесины и целлюлозы: Учебное пособие для вузов. М.: «Экология», 1991. – 320 с.
Отбор проб растительного материала осуществлялся на
территории Архангельской области. Всего было отобрано по три представителя
каждой породы древесины, средний возраст которых составил
Для исследования лигнинов флоэмы использовался внутренний слой коры ели и березы, отделенный от древесины возрастом 80-90 лет. Результаты определения компонентного состава представлены в таблице 1 и близки к литературным данным.
Таблица 1. Компонентный состав используемого растительного материала, в % от массы а.с.в.
Целлюлоза
Лигнин
Сосна Лиственница Можжевельник Флоэма березы
ЭД ЛД2 ЭД ЛД2 ЭД ЛД3 ЭД ЛД4 40,3±1,8 46,6-51,2 43,9±2,2 41,9-44,8 43,7±2,3 36,4-47,0 24,8 27,3
Флоэма ели
ЭД ЛД4 30,0 32,8 37,0 –
31,8±3,7 27,1-27,6 31,9±1,2 26,1-29,5 34,8±4,9 28,6-34,2
28,5 – 22,5* 19,5
10,5
37,7 28,5
24,6 31,2
6,63*
Вещества,
извлекаемые – – – – – – 21,8 23,8
1% NaOH Экстрактивные вещества
14,8±3,4 8,1-10,5 13,9±2,0 16,0-18,7 2,40±1,32 – 14,4 14,6
* После щелочного гидролиза
Экспериментальная часть состоит из 3 глав, отражающих основные
результаты исследования и их обсуждение в соответствие с поставленными задачами.
1. Изучение особенностей химической структуры малоизмененных препаратов лигнина на примере диоксанлигнина хвойных пород древесины
Препараты лигнина и их
характеристика. Данные характеристике выделенных препаратов ДЛ хвойных пород древесины представлены в таблице 2, исходя из которых видно, что исследуемые ДЛ имеют высокий индекс полидисперстности (отношение Mw/Mn) и состоят, преимущественно, из ФПЕ G- типа. Выход ДЛ варьировался в диапазоне от 15,0 до 26,0 % от лигнина Класона.
Таблица 2. Характеристика исследуемых ДЛ ДЛ-С ДЛ-Л ДЛ-М
Элементный анализ, %, (P=0,95; n=3)
Молекулярно-массовые характеристики
по
С Н О
63,8±0,3 7,47±0,58 28,7±0,3
62,2±1,6 7,02±0,23 27,5±0,8
63,5±0,6 7,43±0,43 29,1±0,9
Mw, Да Mn, Да Mw/Mn
4100 980 4,18
3800 950 4,00
3500 740 4,72
S:G:H*
*По данным Пир. ГХ–МС
0,8:93,6:5,6
0,9:92,6:6,5
0,5:90,5:9,0
Целевой поиск основных структурных фрагментов лигнина по данным 1Н-13С HSQC спектров. Анализ 2D ЯМР-спектров показал (Рис. 1), что все исследуемые лигнины хвойных пород состоят преимущество из G-единиц с незначительным количеством ФПЕ H- и S-типа. В качестве димерных фрагментов и концевых структур макромолекулы лигнина идентифицированы β-ариловый эфир, фунилкумаран, резинол, дибензодиоксоцин, кетон Гибберта, конифериловый спирт, а также продукты окисления: ванилин, ванилиновая кислота и ацетонанилон.
2 Гелес, И.С. Древесное сырье – стратегическая основа и резерв цивилизации. Петрозаводск: Карельский научный центр РАН. – 2007. – 499 с.
3Зубов, И.Н. Особенности формирования лигноуглеводной матрицы хвойных на примере можжевельника // Автореф. дис. на соиск. уч. степени канд. хим. наук. САФУ им. М.В. Ломоносова, Архангельск, 2013. 18 с.
4Гелес, И.С. Древесная биомасса и основы экологически приемлемых технологий ее химико- механической переработки. Петрозаводск: Карельский научный центр РАН. – 2001. – 382 с.
Далее, по результатам систематического анализа HSQC спектров установлено, что соответствие экспериментальных значений химических сдвигов со справочными данными должно быть достаточно точным, в пределах ± 0,05 м.д. для 1H и ± 0,5 м.д. для 13C. В совокупности с критерием, характеризующим присутствие всех характеристических кросс-пиков, данные пределы соответствия можно использовать в качестве показателя оценки точности идентификации.
кислородсодержащие
Анализ не идентифицированных кросс-пиков. Показано, что комбинированное использование гомо- и гетероядерных корреляционных методов ЯМР в совокупности с экспертными системами идентификации и моделирования ЯМР-спектров позволяет успешно решать задачи идентификации кросс-пиков, в том числе и сигналов слабой интенсивности. Для идентификация неизвестных кросс-пиков предложено два подхода. Первый основан на использовании базы данных ЯМР химических сдвигов различных органических соединений с учетом корреляций, присутствующих на экспериментальных ЯМР-спектрах. При этом максимально допустимое отклонение для протонов не должно превышать 1 м.д., а для углеродов 5 м.д. С использованием данного подхода удалось идентифицировать в составе всех исследуемых ДЛ несколько новых кросс-пиков, относящихся к продуктам деструкции фрагмента спиродиенона (обозначены как К’ и K”), фенилкумарана и изомерам кетона Гибберта (Hk’) (Рис. 2).
Рисунок 2.
области 1Н-13С HSQC спектров,
Рисунок 1. Алифатические
исследуемых ДЛ хвойных пород
Сопоставление 1Н-13С HSQC и HMBC спектров и диаграмма атомного связывания на
примере идентификации сигналов метил-замещенного фенилкумарона. Также представлены
структурные формулы других впервые идентифицированных методом ЯМР фрагментов ДЛ

Второй подход заключается в построении модельных спектров предполагаемого фрагмента с помощью программы ACD/Spectrus Processor и сопоставлении с экспериментальными данными (Рис. 3). Ключевым фактором здесь являются точность расчета модельного спектра, которая в дальнейшем будет влиять на точность сопоставления расчетных спектров с экспериментальным (табл. 3). Показано, что
С использованием данных подходов, удалось идентифицировать сигналы, относящиеся к структуре дигидрокверцетина и диванилилтетрагидрофурана. Кроме того, анализ спектров показал, что данные фрагменты являются отличительным признаком для ДЛ некоторых хвойных пород древесины. В частности, дигидрокверцетин наблюдается только в составе препарата ДЛ лиственницы. Отличительным признаком ДЛ можжевельника является отсутствие сигналов секоизоларицирезинола и продукта его ацидолиза – диванилилтетрагидрофурана.
наибольший вклад вносит степень совпадения химического сдвига в протонном
измерении.
Таблица 3. Погрешность расчета химических
сдвигов модельного спектра
40 45 50 55 60 65 70 75
±Δ, м.д. 36,40 3,14
±Δ, м.д.
0,16 0,16
0,00
0,91 0,91
0,38 0,38 0,38 0,10
No группы 13С, атомов м.д.
1Н, м.д.
2,65 2,67
2,10
3,39 3,74
6,68 6,67 6,54 3,72
Сα-Нα’ (-С6-Н6-) Сα-Нα” (-С13-Н13-)
Cβ (-C3-Н3-) Сγ-Нγ’ (-C2-Н2-)
Сγ-Нγ” (-C5-Н5-)
С2 111,06
С5 115,26
C6 120,63 СН3О- 55,51
45,47
73,58 1,92
7,54
δH [м.д.]
Рисунок 3. С
3,5 3,0 2,5
3,80 3,80 3,80 0,50
равнение сигналов расчетного
спектра с кросс-пиками на экспериментальном
HSQC спектре
Идентификация новых структурных фрагментов препаратов ДЛ. Не смотря на все преимущества экспертных систем, на спектре все еще присутствуют сигналы, которые не удалось идентифицировать ввиду их низкой интенсивности. Анализ литературных данных позволил установить их сходство по химическому сдвигу с кросс-пиками на спектре препаратов лигнина, стабилизированного формальдегидом (ЛСФ). Известно, что в ходе ацидолиза, некоторые структурные фрагменты подвергаются реакциям элиминирования γ-углеродного атома с образованием свободного формальдегида. Однако об его участии с алифатическими ОН-группами β- ариловых эфиров ранее не сообщалось. Для того, чтобы подтвердить данное предположение был получен препарат ДЛ, но с заменой воды в составе реакционной смеси на раствор формальдегида. Исходя из ЯМР-спектра данного препарата, видно, что основные кросс-пики действительно резонируют от β-ариловых эфиров в виде 1,3- диоксановой структуры (Рис. 4). Сравнение спектров ДЛ, полученных двумя различными способами, подтверждает наше предположение об участии реакционного формальдегида в защите бензилспиртовых ОН-групп в ходе ацидолиза.
δC [м.д.]

Кроме того, HSQC спектр ЛСФ позволил установить и другие модификации протолигнина. А именно впервые идентифицирована 1,3-диоксановая структура фрагмента 1,2-диарилпропана (К). Это свидетельствуют о том, что в составе протолигнина лигнина сосны должен присутствовать фрагмент спиродиенона.
Рисунок 4 . Сравнение 1Н-13С HSQC спектров ДЛ (слева) и ЛСФ (справа), а также фрагменты лигнина, образующиеся при взаимодействии с формальдегидом: Ае’ – эретро и At’ – трео изомеры
Результаты количественного анализа ЯМР-спектров показывают (Табл. 4), что для всех ДЛ наблюдается схожий состав ФГ. Повышенное значение алифатических ОН-групп в составе ДЛ-Л можно объяснить присутствием в составе образца большей доли остаточных углеводов, в то время как повышенное содержание фенольных ОН-групп связанно с присутствием в образце ДЛ-Л дигидрокверцетина. Тот факт, что оба фенольных кольца в составе данной
структуры по данным Р ЯМР имеют
свободные фенольные ОН-группы свидетельствует о том, что дигидрокверцетин может присутствовать в состав ДЛ-Л в виде примеси.
Таблица 4. Результаты количественного анализа функциональных групп, мономерных единиц и основных типов связи для исследуемых ДЛ хвойных пород (P=0,95; n=3)
ДЛ-С Основные типы связи и в расчете на
ДЛ-Л ДЛ-М метоксильные групп 100 ФПЕ
ОСН3-группы
β-O-4’
α-O-4’/β-5’ 7,17±0,33 β-β’/α-O-γ’ 3,22±0,46 α-O-4’/ β-O-4’ 1,37±0,44
92,6±3,4
20,3±2,6 7,48±0,83 3,62±1,21 2,46±1,23 20,4±2,6
95,4±4,9
17,0±2,7 7,24±0,92 3,52±0,43 1,37±0,42 21,5±3,6
2,56±0,58 95,6±0,5 1,88±0,32
95,7±2,1 17,7±1,6
5-5’
H, % G, % S, %
Алифатические 6,66±0,46
OH
Фенольные OH 3,49±0,45
СООН 0,10±0,03
*Наблюдается только в одном из трех препаратов ДЛ-Л
21,1±0,3
Относительное содержание ФПЕ
4,35±1,33 94,7±1,6 1,40±0,36
4,52* 97,1±3,8 1,43±1,05
Содержание ФГ, % от массы образца
7,39±0,74
6,87±0,42
3,78±0,83 0,10±0,03
3,45±0,51 0,11±0,02
Для всех ДЛ также наблюдаются близкие значения по содержанию основных типов связей, схожие с ЛД, за исключением β-О-4’, доля которых оказалась значительно меньше, что объясняется протеканием реакций гидролитической деструкции, с образованием фрагментов кетона Гибберта, кросс-пики которого наблюдаются на всех HSQC спектрах, исследуемых ДЛ.
Анализ модификаций основных структурных фрагментов протолигнина в ходе ацидолиза по данным ЯМР-спектроскопии. Для того чтобы оценить изменения структуры лигнина в ходе ацидолиза была проведена сравнительная количественная оценка содержания основных типов связи в сравнении с менее измененными препаратами лигнина, а именно ЛСФ и ЛМР на примере лигнина сосны (Табл. 5). В результате установлено, что содержание связей β-О-4’ в составе протолигнина сосны
должно составлять порядка 50 на 100 ФПЕ, в то время как в составе ДЛ их доля не значительна. Следовательно, можно предположить, что в ходе 4-х ч ацидолиза примерно 45 % связей разрушается. Различия в содержании β-О-4’ связей между ЛСФ и ЛМР можно объяснить протеканием реакции деструкции с образованием фрагмента арилглицерола, кросс-пики которого наблюдаются на HSQC спектре ЛМР. Различия в содержании фрагментов фенилкумарана также объясняются реакциями гидролитической деструкции. Также присутствующие на HSQC спектре ЛМР кросс-
пики подтверждают наличие фрагмента спиродиенона в составе протолигнина сосны. Таблица 5. Результаты количественного анализа
основных типов связи в расчете на 100 ФПЕ
Таким образом, сравнительный
анализ ДЛ с лигнинами, выделенными с
помощью других более щадящих методов
показал, что его вполне можно использовать
для исследования структуры протолигнина,
ключевым фактором здесь является наличие
знаний о процессах, происходящих с
фрагментами лигнина в ходе ацидолиза, что
позволит экстраполировать полученные
данные на нативную структуру лигнина. 23-27
Тип связи (структурный фрагмент)
β-O-4’, в том числе:
– β-ариловый эфир
-1,3-диоксан (erythro)
– 1,3-диоксан (threo) α-O-4’/β-5’ (Фенилкумаран) β-β’/α-O-γ’ (Резинол) α-O-4’/ β-O-4’/5-5’ (Дибензодиоксоцин)
β–1’
– Спиродиенон – 1,3-диоксан
Связь 5-5 (Бифенил)
ЛМР ЛСФ
44,6 52,3 44,6 5,1
– 36,0
– 11,1 13,0 9,40 5,49 3,40
4,46 -*
1,80 5,60 1,80 –
– 5,60 20,5 16,5
ЛД5 43-52
9-12 4
5-9 1-3
* Сигнал присутствует, но слабой интенсивности
2. Изучение особенностей химической структуры лигнина арктических растений на примере диоксанлигнина камнеломки супротивнолистной
С помощью предложенного ранее комплекса методов ЯМР-спектроскопии исследован ДЛ, выделенный из веток растения камнеломка (Saxifraga oppositifólia L.). Данный вид представляет собой многолетнее низкорослое растение с ползучими древесными стеблями, которое является типичным обитателем арктических экосистем.
Характеристика объекта исследования. Полученный по методу Пеппера препарат ДЛ-К представлял собой темно-коричневый порошок с низким выходом – 0,92 % от лигнина Класона. В то время как содержание лигнина по Класону – 44 % от массы а.с.в. Это может указывать на присутствие в образце прочих фенольных соединений, легко конденсируемых в кислой среде. Однако, характеристика выделенного образца по данным элементного анализа и ИК-спектроскопии подтвердила его лигнинную природу. В частности, массовая доля углерода составила 60,5%, что сопоставимо с содержанием углерода в лигнинах, выделенных из других покрытосеменных растений, однако соотношение H:G:S по данным ПГХ-МС – 49,5:38,8:11,7. ИК-спектр ДЛ-К содержит полосы поглощения, характерные для лигнина с преобладанием G-единиц над ФПЕ S-типа, а также жирных кислот и полисахаридов: 3300, 2920, 2851, 1712, 1363, 1171, 1057, 867 и 831 см-1. Значения Mw и Mn для исследуемого ДЛ-К составляют 4200 и 2300 Да, соответственно.
5 Chang, H.-M. Biphenyl structure and its impact on the macromolecular structure of lignin: A critical review / H.-M. Chang, X. Jiang // Journal of Wood Chemistry and Technology. – 2020. – Vol. 40. – P. 81–90.
Анализ структурных особенностей ДЛ-К по данным ЯМР-спектроскопии показал, что ДЛ-К состоит из всех трех типов ФПЕ, среди которых Н-единицы являются преобладающими, в то время как доля S-единиц незначительна, что не характерно для лигнинов покрытосемянных растений (H:G:S – 40,2:45,4:14,4). В тоже время следует отметить, что кросс-пики Н-единиц перекрываются с кросс-пиками ароматических аминокислот (фенилаланин и тирозин), что могло повлиять на результаты количественного анализа. Основными димерными фрагментами, как и для всех лигнинов, являются β-ариловых эфир (11,5/100 ФПЕ), фенилкумаран (0,89/100 ФПЕ) и резинол (0,11/100 ФПЕ). Также на спектрах имеются кросс-пики, свидетельствующие о присутствии в составе образца молекул суберина и полифенольных компонентов, одновременно извлекаемых с лигнином. Однако, не смотря на присутствие в 2D ЯМР-спектре кросс-пиков, подтверждающих лигнинную природу исследуемого образца, профиль 13С ЯМР-спектра вызывает сомнения. Присутствующие сигналы свидетельствуют том, что Н-единицы могут не являться составляющей структуры протолигнина, так как интенсивность их сигналов на 13С спектрах на порядок превышают все остальные, кроме того присутствуют интенсивные сигналы, относящиеся к пирокатехиновым (С) звеньям. Кроме того, содержание ОСН3- групп оказалось достаточно низким – 28/100 ФПЕ. В совокупности с этим, рассчитанное по данным 31Р ЯМР высокое содержание фенольных ОН-групп (5,42 в % от массы образца), а также низкое соотношение ОНА/OHФ (0,89), свидетельствуют о преобладании в составе препарата ВПК. Однако кросс-пики флороглюциновых звеньев, обнаруженные с помощью HSQC спектров, имеют слабую интенсивность относительно кросс-пиков лигнина, что не согласуется с данными 13С и 31Р ЯМР. Вероятно, в ходе ацидолиза находящиеся в составе камнеломки конденсированные танины (оставшиеся после экстракции ацетоном) подверглись реакциям полимеризации, в результате между звеньями флороглюцина образовались новые С-С связи, идентификация которых возможна только по данным 13С ЯМР.
Рисунок 5. Частичный HSQC (слева) и 13С ЯМР-спектр (справа) ДЛ-К
Присутствие в составе исследуемого препарата ВПК вносит вклад в процедуру количественного анализа структурных особенностей лигнина и объясняет полученные ранее низкие значения по содержанию основных типов связей и ОСН3-групп. Повышенное содержание СООН-групп (0,53 % от массы образца) объясняется присутствием в препарате жирных кислот.
12

3. Исследование особенностей химической структуры лигнина флоэмы ели и березы
С помощью описанной ранее аналитической схемы и идентифицированных особенностей препаратов ДЛ подробно проанализирована химическая структура лигнинов в составе флоэмы ели (Picea abies) и березы (Betula pendula) – как важных представителей хвойных и лиственных пород древесины. В связи с тем, что базовые знания о лигнине являются необходимым условием для точной идентификации основных структурных фрагментов, препараты ДЛ выделенные из ксилемы ели и березы будут выступать в качестве образца сравнения.
Препараты лигнина и их характеристика. Изолированные ДЛ флоэмы ели и березы представляли собой аморфный порошок фиолетового цвета. Выход ДЛ-ФЕ был незначительным и составил всего 4,73 % от лигнина Класона; в то время как выход ДЛ- ФБ составил 30,3 %, что превышает выход лигнина из ксилемы соответствующей древесины. Известно, что цвет лигнина в значительной степени зависит от наличия в его структуре различных хромофорных групп. Сравнение УФ-Вид спектров ДЛ флоэмы и ксилемы показало, что исследуемые препараты ДЛ флоэмы имеют высокую степень сопряженных двойных связей, что характеризуется появлением полосы поглощения в области 550 нм (Рис. 6). Сравнение ИК-спектров, исследуемых препаратов ДЛ, показало, что между ДЛ-ФБ и ДЛ-КБ не существуют явных отличительных признаков, за исключением различий в интенсивности полос 1270 и 1506 см-1, что может быть связано с повышенным содержанием G-единиц в ДЛ-ФБ (Рис. 7).
Однако для ДЛ-ФЕ и ДЛ-КЕ был обнаружен ряд различий как в положении,
так и в относительной интенсивности полос поглощения. В частности, отсутствие
полосы при 1670 см-1 может быть вызвано большим содержанием двойных связей.
Отсутствие полосы в области 1420 см-1 на ИК-спектре ДЛ-ФЕ указывает на низкое
содержание ОСН3-групп. Все это приводит к заключению о том, что исследуемый
препарат ДЛ-ФЕ может представлять собой смесь полифенольных соединений
нелигнинной природы.
Рисунок 6. УФ-Вид спектры ДЛ флоэмы ели и берёзы в сравнении со спектрами ДЛ
ксилемы. Увеличенная область спектра в диапазоне длин волн 450–700 нм
Рисунок 7. Сравнение ИК-спектра ДЛ-ФБ с ИК- спектром ДЛ-КБ
Известно, что присутствие ВПК в составе препаратов ДЛ может в значительной
степени сказаться на результатах исследования его структуры. В связи с этим в данной
работе было исследовано по два образца лигнина флоэмы, выделенный без и после ЩГ.
Выход ДЛ после ЩГ в случае флоэмы березы снизился с 30,3 до 24,7 % (от лигнина
Класона), а для флоэмы ели с 4,73 до 3,08 %. Кроме того, цвет ДЛ-ФБ, полученного
после ЩГ, ничем не отличался от обычного ДЛ, однако препарат ДЛ-ФЕщ имел темно-
коричневый оттенок. Это может свидетельствовать о том, что в составе данного
образца все еще содержаться ВПК. Данные по характеристике препаратов
представлены в таблица 6. Необходимо отметить, что содержание углерода по данным
элементного анализа для ДЛ-ФБ заметно отличаются от ДЛ-КБ и близко к лигнинам
хвойных пород. Это еще раз свидетельствует о том, что ДЛ-ФБ может содержать
больше G-единиц, чем ДЛ-КБ.
Таблица 6. Характеристика исследуемых препаратов ДЛ
Препарат лигнина
ДЛ-ФЕ ДЛ-ФЕщ ДЛ-КЕ ДЛ-ФБ ДЛ-ФБщ ДЛ-КБ
Элементный состав,
в % от массы (P=95%, n=3)
Молекулярно-массовое распределение Mw/Да Mn/Да Mw/Mn 4100 2300 1,78 5800 2300 2,52 8400 3000 2,80 4350 2210 1,97 4400 1500 2,93 4400 1700 2,59
С 63,2±1,2 63,0±0,1 61,9±0,3 62,8±0,1 60,7±0,3 58,6±0,3
Н 7,39±0,32 5,39±0,06 7,53±0,06 8,03±0,01 5,51±0,28 7,34±0,63
О 29,4±1,5 30,7±0,2 30,6±0,4 29,2±0,1 32,6±0,2 34,1±0,9
Характеристика состава и химической структуры препаратов диоксанлигнина флоэмы ели по данным ЯМР-спектроскопии. Исследование химической структуры лигнинов флоэмы началось с анализа 1D ЯМР-спектров, которые в значительной степени дополняет данные 2D ЯМР спектров, отражая его недостатки в идентификации сигналов С-С связей, характерных для ВПК. Как и ожидалось, на спектре ДЛ флоэмы, выделенного без ЩГ, присутствуют ряд отличительных признаков. На 13С ЯМР- спектре к ним относятся два широких сигнала при 115 и 145 м.д., интенсивность которых на порядок превышает интенсивность других сигналов. На спектре 31Р ЯМР это интенсивный сигнал при 139 м.д., что в целом свидетельствует о том, что основным компонентом ДЛ флоэмы ели являются ВПК, состоящие из С-единиц. Также, необходимо отметить, что на спектре лигнина, полученного после ЩГ также присутствуют сигналы от С-единиц, но с меньшей интенсивностью.
Более подробный анализ особенностей исследуемых препаратов ДЛ ели осуществлялся по данным 2D ЯМР-спектров. Установлено, что основными димерными фрагментами лигнина флоэмы ели являются β-ариловые эфиры, фенилкумаран, резинол и дибензодиоксоцин. В тоже время есть ряд отличительных признаков. В частности, спектр ДЛ, полученного без ЩГ, содержит кросс-пики ароматических аминокислот, стильбеновых единиц и слабые кросс-пики
лигнином. Еще одним отличием в спектре ДЛ-ФЕ является интенсивная группа
Это может
свидетельствовать о том, что ВПК в составе клеточных стенок флоэмы ели связаны с
сигналов, резонирующих от COOH–групп, а также углеродов в составе метиловых и
метиленовых групп.
Узкая полидисперсность ДЛ флоэмы, полученных без ЩГ, позволяет предположить, что они являются относительно более однородными по сравнению с ДЛ
ксилемы.

флороглюциновых звеньев, которые, вероятно являются составляющей ВПК, так как отсутствуют на спектре лигнина, полученного после ЩГ. Однако ранее по данным 1D ЯМР установлено, что ДЛ-ФЕ содержит значительную долю С-единиц, которые на первых взгляд не наблюдаются на спектре 2D ЯМР. Сравнение спектров в формате полихромного отображения, позволило провести сравнение интенсивностей кросс- пиков. На рисунке 8 видно, что наблюдаются различия в интенсивности областей кросс-пиков G2, G5 и G6. Одна из основных причин этого заключается в том, что именно атомы углерода С-единиц попадают в эту область. Данный подход можно использовать в качестве метода идентификации С-единиц в составе препаратов лигнина, выделенных из сырья, обогащенного ВПК.
Рисунок 8. Сравнение ароматической области HSQC спектров в формате полихромного отображения кросс-пиков
Результаты количественного анализа свидетельствуют об явных различиях в содержании основных типов связей и ФГ в исследуемых препаратах ДЛ (Табл. 7).
Таблица 7. Результаты количественного анализа функциональных групп, мономерных единиц и основных типов связи
ДЛ-ФЕ ДЛ-ФЕщ ДЛ- КЕ
Содержание основных типов связи и метоксильных групп в расчете на 100 ФПЕ
Установлено, что основным
типом связей в составе ДЛ флоэмы ели
также, как и в ксилеме, являются β-O-4′
связи, и их содержание увеличивается с 15
(ФЕ) до 18 (КЕ) на 100 ФПЕ, без учета
продуктов деструкции. Повышенное
содержание 5-5′ связей во флоэме ели
связано с присутствием ВПК. Наличие
кросс-пиков от единиц Н-типа можно
объяснить тем, что лигнин в составе
флоэмы находится на ранних этапах
лигнификации.
ОСН3-группы 32 β-O-4’ 6,9 (β-ариловый эфир)
α-O-4’ (Фенилкумаран) 1,8 α-O-γ’ (Резинол) 0,5 α-O-4’/β-O-4’/5-5 0,6 5-5 (Бифенил) –
69 104 15,1 18,0
5,2 8,0 5,1 4,9 – 1,1
25,9 18,7 Относительное содержание ФПЕ
S,% G,% H,%
0,3 0,0 1,1 78,5 94,9 98,9 21,1 5,1 0,0 от массы образца
5,59 6,57 5,62 4,25 0,68 0,25
Содержание ФГ, в % Алифатические OH 4,84 Фенольные OH 10,2 СООН группы 0,91
В ходе характеристики химической структуры лигнина флоэмы березы установлено, что по данным 1D ЯМР спектров нет явных отличительных признаков, свидетельствующих о присутствии в составе образца ВПК, за исключением слабого сигнала на 31Р ЯМР-спектре. На всех спектрах присутствует основные сигналы, характерные как для G-, так и S-единиц, при чем судя по интенсивности сигналов доля
S-единиц для лигнина ксилемы намного выше. Однако данные по содержанию ОСН3- групп не показали существенных различий. Это может быть связано с тем, что в составе ДЛ-КБ содержится значительная доля фрагментов, образованных через 4-О-5 связь, сигналы которых резонируют в области сигналов S-единиц, что могло повлиять на результаты количественного анализа. Кросс-пики 2D ЯМР спектров показывают, что основными фрагментами также являются β-ариловые эфиры, резинол и фенилкумаран. Результаты количественного анализа показывают, что ДЛ флоэмы, выделенные как без, так и после ЩГ имеют схожее число ФГ и основных типов связей (Табл. 8). Это свидетельствует о том, среди ВПК флоэмы березы содержится незначительная доля веществ склонных к реакциям конденсирования в кислой среде.
При сравнении с результатами количественного анализа ДЛ-КБ установлено, что по направлению от флоэмы к ксилеме в значительной степени повышается доля S-единиц и соответствующих β-О-4’ связей, в то время как доля фрагментов фенилкумарана уменьшилась. В тоже
Таблица 8. Результаты количественного анализа ФГ, мономерных единиц и основных типов связи
ФБ ФБщ КБ Содержание основных типов связей и ФГ в расчете
на 100 ФПЕ Метоксильные группы 133 β-O-4’ 35,9
(β-ариловый эфир)
α-O-4’/β-5’ (Фенилкумаран) 4,7 β-β’/α-O-γ’ (Резинол) 8,1
132 136 34,3 42,5 4,3 1,4
7,3
7,4 Относительное содержание ФПЕ
время, помимо
ароматической
макромолекулы лигнина, на спектре ДЛ- ФБ, имеются ряд отличительных кросс- пиков, в дальнейшем назначенных структуре ВПК.
Идентификация элементов структуры ВПК, присутствующих в составе ДЛ флоэмы, осуществлялась с
43,5 46,1 73,3 54,5 53,9 26,7
кросс-пиков составляющей
0,0 0,0 Содержание ФГ, в % от массы образца
S, %
G, %
H,% 2,0
Алифатические OH 7,91 Фенольные OH 4,44 СООН 0,33
7,81 7,40 3,78 2,81 0,33 0,18
помощью
модельных спектров,
относящихся
флавоноидов.
сравнения
экспериментального HSQC спектров,
установлено, что элементарным звеном
ВПК флоэмы ели является катехин, а для
ВПК флоэмы березы структуры
лютеолина и афзелехина (Рис. 9).
Отсутствие кросс-пиков от атомов флороглюциновых звеньев может быть подтверждением того, что они участвуют в образовании С–С связей, образую высокомолекулярный полимер.
Таким образом, в ходе исследования химической структуры лигнинов флоэмы и ксилемы установлено, что между ними существуют различия в количестве основных структурных фрагментов и соотношении ФПЕ, которые можно объяснить
к
различным классам После визуального расчетных и
Рисунок 9. Сравнение расчетных спектров лютеолина и афзелехина с экспериментальным 1H-13C HSQC спектром ДЛ флоэмы березы
особенностью типов клеток. В свою очередь, схожий набор специфических элементов указывает на то, что состав прекурсоров, участвующих в формировании лигнина в составе склереид флоэмы и волокон ксилемы может быть одинаковым. В этом плане, наиболее интересным оказался состав мономерных единиц лигнина флоэмы ели, по которому основными ФПЕ является единицы G-типа, что не согласуется с принятой теорией, согласно которой все лигнины клеточных стенок тканей склеренхимы должны быть обогащены S-единицами6. Следовательно, необходимо провести больше исследований, чтобы установить особенности строения лигнина в зависимости от типа клеток и ткани. Результаты данной работы также дали ответ на вопрос о корректности исследования лигнинов флоэмы без предварительной процедуры ЩГ.
ВЫВОДЫ
1. Использование комбинации 2D ЯМР-экспериментов в сочетании с экспертной системой анализа и моделирования ЯМР-спектров позволило провести назначение не идентифицированным ранее кросс-пикам и расширить базу данных химических сдвигов структурных фрагментов лигнина. Среди впервые идентифицированных методами ЯМР структурных фрагментов лигнина – метил-замещенный фенилкумарон, изомер кетона Гибберта, диванилилтетрагидрофуран и продукты деструкции фрагмента 1,2-диарилпропана. Также установлено, что для наиболее точной идентификации известных структурных фрагментов по данным 2D ЯМР- спектроскопии, соответствие экспериментальных значений химических сдвигов со справочными данными должно быть в пределах ± 0,05 м.д. для 1H и ± 0,5 м.д. для 13C.
2. Исследование химической структуры препаратов диоксанлигнина в сравнении с другими малоизмененными лигнинами позволило установить ряд особенностей. Показано, что в наибольшей степени гидролитической деструкции подвергаются фрагменты спиродиенона и β-арилового эфира, что может быть критичными в отношении идентификации структуры протолигнина. Установлено, что выделяемый в ходе ацидолиза формальдегид может связываться с бензилспиртовыми гидроксильными группами β-ариловых эфиров с образованием 1,3-диоксановой структуры.
3. Сравнительное исследование препаратов диоксанлигнина, выделенных из древесины различных хвойных пород показало, что их состав не имеет существенных различий по химической структуре. Исключением является присутствие дигидрокверцетина в составе препарата диоксанлигнина лиственницы и отсутствие фрагментов секоизоларицирезинола и диванилилтетрагидрофурана в составе препаратов диоксанлигнина можжевельника. Разница в количестве содержащихся структурных единиц и функциональных групп для диоксанлигнинов, выделенных из древесины сосны, лиственницы и можжевельника незначительна.
4. В ходе исследования химического состава и структуры диоксанлигнина камнеломки показано, что лигнин камнеломки извлекается в комплексе с веществами
6 Barros, J. The cell biology of lignification in higher plants / J. Barros, H. Serk, I. Granlund, E. Pesquet // Annals of Botany. – 2015. – Vol. 115. – P. 1053–1074.
нелигнинной природы, представляющими собой помимо остаточных углеводов, суберин, белки и высокомолекулярные полифенольные компоненты. Установлено, что макромолекулы лигнина, присутствующие в составе исследуемого препарата, состоят из фрагментов β-арилового эфира, с незначительным присутствием фенилкумарана и резинола. Мономерный состав диоксанлигнина камнеломки представлен в основном единицами H- и G-типа с не значительной долей S-единиц (S/G 0,32), что нехарактерно для лигнинов двудольных растений.
5.По результатам анализа ЯМР-спектров диоксанлигнина флоэмы ели, выделенного после предварительного щелочного гидролиза, установлено, что состав мономерных единиц лигнина флоэмы ели не существенно отличается от лигнина ксилемы ели, за исключением незначительного количества Н-структур. Среди димерных фрагментов наибольшие различия наблюдаются в количестве фрагментов фенилкумарана.
6.В ходе исследования особенностей химической структуры препаратов диоксанлигнина флоэмы и ксилемы березы установлено, что лигнин флоэмы березы в большей степени обогащен гваяцильными единицами, соотношение S/G составляет 0,86, в то время как в составе лигнина ксилемы березы – 2,74. Также в лигнине флоэмы березы, в отличие от ксилемы, содержится больше фрагментов фенилкумарана, а также β-арилового эфира, соединяющих гваяцильные единицы.
7.Показано, что извлечение лигнина из флоэмы должно обязательно сопровождаться предварительным этапом щелочного гидролиза. Исследование препаратов диоксанлигнина флоэмы, содержащих в составе нелигниные полифенольные компоненты, показало, что они в значительной степени оказывают влияние на результат анализа структуры лигнина и могут привести к неточной идентификации и количественной оценке содержания основных типов связей и функциональных групп. Сочетание методов 13С и 31Р ЯМР оказалось наиболее эффективным в идентификации структуры высокомолекулярных полифенольных компонентов нелигнинной природы, присутствующих в составе диоксанлигнина.
ПЕРЕЧЕНЬ ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ
– Mw – среднемассовое значение молекулярной массы
значение
– ДЛ-ФБщ – диоксанлигнин флоэмы березы, выделенный после щелочного гидролиза
– ДЛ-ФЕ – диоксанлигнин флоэмы ели
– ДЛ-ФЕщ – диоксанлигнин флоэмы ели,
выделенный после щелочного гидролиза
– ЛД – литературные данные
– ЛМР – лигнин механического размола
– ЛСФ – лигнин, стабилизированный
формальдегидом
– С-единицы – пирокатехиновые единицы – ФГ – функциональные группы
– ФПЕ – фенилпропановая единица
– ЩГ – щелочной гидролиз
– ЭД – экспериментальные данные
– ЯМР – ядерный магнитный резонанс