Фармако-токсикологические свойства и клиническая эффективность ливазена при гепатозах коров

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Работа выполнялась в 2014-2021 гг. в ФГБНУ «Краснодарский научный центр по зоотехнии и ветеринарии» на базе отдела фармакологии Краснодар- ского НИВИ в соответствии с Государственными планами научных исследова- ний с No госрегистрации 114100140033; с планом научно-исследовательских работ по направлению 160. Молекулярно-биологические и нанобиотехнологи- ческие методы создания биопрепаратов нового поколения, технологии и спосо- бы их применения с целью борьбы с особо опасными инфекционными, парази- тарными и незаразными болезнями животных с No госрегистрации АААА-А19- 117021310281-1.
В проведении отдельных клинических испытаний и лабораторных иссле- дований принимали участие М.П. Семененко, Е.В. Кузьминова, А.А. Абрамов, Е.П. Долгов.
Экспериментальные и научно-производственные опыты проведены в со- ответствии с законодательством Российской Федерации, положениями «Евро- пейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспе- риментальных и других научных целей» (ETS No 123, Страсбург, 1986), поло- жениями Guide for the Care and Use of Laboratory Animals/ Руководство по уходу и использованию лабораторных животных (National Research Council, 2011) и другими нормами международного права, регламентирующими вопросы со- держания и использования лабораторных животных.
Экспериментальная часть диссертационной работы посвящена доклини- ческим исследованиям инъекционного лекарственного средства ливазен, а так- же его терапевтической эффективности при гепатозе крупного рогатого скота. Производитель: ООО «УНИФАРМ» (г. Славянск-на-Кубани, Краснодарский край).
Изучение безвредности препарата ливазен было проведено на базе ви- вария отдела фармакологии Краснодарского НИВИ – обособленного струк- турного подразделения ФГБНУ КНЦЗВ. При этом объем доклинических ис- пытаний определялся следующими нормативными документами: Методы опре-
деления токсичности и опасности химических веществ, под ред. И.В. Саноцко- го (1970); Методические рекомендации по токсико-экологической оценке ле- карственных средств, применяемых в ветеринарии (1998); Руководство по экс- периментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических ве- ществ, под общей редакцией проф. Р.У. Хабриева (2005); Научно- методологические аспекты исследования токсических свойств фармакологиче- ских лекарственных средств для животных (Смирнов А.М., Дорожкин В.И., 2008);
При постановке опытов применялись клинические, гравиметрические, токсикологические, фармакологические, морфологические, биохимические, и другие методы исследований.
Клиническая оценка препарата проведена в условиях ОАО «Кубань» Но- вопокровского района, ООО «Агрофирма Кубань» Северского района, ООО Агрофирма «Лада» и
Программа токсикологических исследований предусматривала проведе- ние экспериментов на лабораторных видах животных для оценки общетоксиче- ского (острая и субхроническая токсичность), раздражающего, аллергизирую- щего, эмбриотокисческого и тератогенного действия препарата ливазен, а так- же его влияния на органы и системы организма при длительном и кратковре- менном введении.
Острую токсичность ливазена изучали на белых нелинейных крысах обо- его пола при его однократном внутрижелудочном и парентеральном (внутри- мышечном) введении в двух повторностях. Группы животных (четыре – две опытные и две контрольные) по 6 особей в каждой формировались по принципу парных аналогов с учетом массы тела, развития и клинического состояния. Эксперимент предполагал использование максимальных объемов ливазена для крыс, масса тела которых не превышает 190 г: внутрижелудочно – 3,0 мл/ кг массы тела, внутримышечно (в заднебедренную группу мышц) – 5,0 мл/кг мас- сы тела. Контрольным группам животным с учетом способа введения в тех же дозах применялся физиологический раствор.
Субхроническую токсичность ливазена оценивали на 40 белых беспород- ных белых крысах обоего пола с начальной массой тела 170-177 г с учетом предварительного определения 3 уровней токсических доз от максимально вве- денной в остром эксперименте внутримышечной дозе – 5 мл на животное.
Для соблюдения режима и применяемых в клинической практике тера- певтических сроков введения образцы препарата ливазен вводились крысам на протяжении 28 суток ежедневно с внешней поверхности бедра инсулиновыми шприцами со сменными иглами.
Руководство по проведению доклинических исследований лекарствен-
ных средств (часть первая), под редакцией А.Н. Миронова (2012).
В экспериментальных и научно-хозяйственных опытах использовались
лабораторные (белые беспородные крысы, морские свинки, кролики) и сель- скохозяйственные (коровы молочного направления голштинской породы) жи-
вотные.
учебно-опытного хозяйства «Кубань» Кубанского
государственного аграрного университета.
Эксперимент включал оценку физиологических (общее состояние, аппе- тит, двигательные и поведенческие реакции), гематологических, биохимиче- ских и гистологических показателей подопытных крыс. Кроме того, о токсич- ности препарата ливазен судили по состоянию интегральных признаков, отра- жающих уровень общеобменных процессов – массе тела крыс и внутренних ор- ганов с последующим расчетом их весовых коэффициентов.
Определение массы тела у животных проводилось дважды – в начале эксперимента и по его окончанию, кровь для морфо-биохимических исследова- ний отбиралась в конце опыта у пяти животных из каждой группы. По завер- шению крыс выводили из эксперимента с соблюдением правил гуманного об- ращения с лабораторными животными для учета патологоанатомических изме- нений внутренних органов. Внутренние органы (сердце, легкие, печень, селе- зенка, почки) взвешивали для определения коэффициентов их массы, после че- го фрагменты органов подвергались гистологическому исследованию согласно «Морфологическим исследованиям в ветеринарных лабораториях» (2002). Учет и оценку гистологических изменений органов проводили под микроскопом МС 300 (Австрия), увеличение х5, х10.
Изучение функционального состояния пищеварительной и мочевыдели- тельной систем при длительном применении препарата ливазен проводилось на клинически здоровых коровах голштинской породы по физико-химическим свойствам мочи и фекалий. Сбор мочи осуществлялся на 7, 14, и 21 сутки опы- та. Критерием оценки служили: цвет, запах, консистенция, удельный вес, со- держание белка, гемоглобина, углеводов, желчных пигментов и концентрация водных ионов в сравнении с аналогичными показателями мочи контрольных животных. Наличие в моче белков определяли кипячением с 20 %-ной суль- фосалициловой кислотой, кровяных и желчных пигментов – бензидиновой про- бой Адлера и пробой Фуше, углеводов – пробой Гайнеса.
Фекалии собирали дважды – в начале опыта и на 21 день. Органолептиче- ски тестировалась консистенция, форма, цвет, запах и наличие посторонних примесей. Физико-химическое исследование каловых масс включало в себя определение pH (с помощью тест-полосок), наличие крови – бензидиновой про- бой, желчных пигментов – пробой Терквея, билирубина – пробой Фуше, наличие жира и крахмала – микроскопически при помощи судана III и раствора Люголя (Смирнов А.М., Конопелько П.Я., Пушкарев Р.П. и др., 1988).
Раздражающее действие препарата ливазен изучалось на кроликах конъ- юнктивальной пробой и морских свинках – методом накожных аппликаций. Аллергизирующее действие – на морских свинках методом эпикутанной сенси- билизации (Миронов А.Н., 2012).
Эмбриотоксическое и тератогенное действие определяли согласно «Ме- тодическим указаниям по изучению репродуктивной токсичности фармаколо- гических веществ» (Хабриев Р.У., 2005).
О качестве мяса кроликов после введения ливазена судили по результа- там ветеринарно-санитарной экспертизы. При этом оценивались органолепти- ческие и вкусовые качества мяса и бульона, а также биохимические показатели,
9

включающие определение рН (с помощью рН метра), содержание аммиака (с реактивом Несслера), реакции на пероксидазу и формольной реакции. О нали- чии продуктов распада белка судили по реакции с сернокислой медью в мясном бульоне (Сенченко Б.С., 2001).
Изучение активности ливазена, обладающего прогнозируемыми гепато- защитными свойствами, проводилось в двух сериях на экспериментальных мо- делях поражения печени у лабораторных крыс – остром токсическом гепатите, индуцированным тетрахлорметаном и гиперлипидемии, вызванной введением детергента Твин-80. Острое токсическое повреждение печени у беспородных крыс осуществляли однократным внутрибрюшинным введением 50 %-ного мас- ляного раствора тетрахлорметана (СС14) в дозе 0,4 мл/кг массы животных. Ги- перлипидемию у крыс моделировали внутрибрюшинным введением Твин-80 в дозе 200 мг/100 г массы тела в 1 мл воды для инъекций.
В первой серии крысам опытных групп за 1 час до введения четыреххло- ристого углерода внутрибрюшинно вводился раствор ливазена в дозе 0,5 мл на животное, и далее 1 раз в сутки внутримышечно в течение 3-х недель (21 день) в той же дозе. Во второй серии при моделировании гиперлипидемии опытным группам крыс на протяжении 6 дней внутримышечно вводился ливазен в дозах 0,25 и 05 мл/животное. На 6 день через 1,5 часа после введения препарата внут- рибрюшинно был введен детергент. Крысы контрольных групп внутримышечно получали эквиобъемное количество физраствора.
Гепатозащитную эффективность препарата ливазен оценивали по клини- ческому статусу подопытных животных, гравиметрическим показателям, степе- ни нормализации биохимического и метаболического гомеостаза, показателям антиоксидантной системы организма и снижению эндотоксикоза, а также пато- морфологическим и гистологическим изменениям органов и тканей печени крыс.
Уровень эндогенной интоксикации определяли по молекулам средней массы (МСМ) по методу Н.И. Габриэлян и В.И. Липатовой (1984).
Оценку гематологических показателей крови проводили на автоматиче- ском гематологическом анализаторе для in vitro диагностики фирмы «ORPHEE» – Mythic 18 (страна-производитель Швейцария). Биохимические показатели крови определялись на автоматическом анализаторе Vitalab Selectra Junior с версией программного обеспечения 1.0. (открытая система для прове- дения фотометрических тестов, изготовитель Vital Scientific N.V. Netherlands) с использованием реактивов фирмы ELITech Clinical Systems (Франция) и Аnalyticon biotechnologies AG (Германия). Уровень белковых фракций измерялся нефелометрически, каротин – по Бессею, в модификации Анисовой.
Исследования по изучению терапевтических свойств препарата проведе- ны в условиях ОАО «Кубань» Новопокровского района на коровах голштин- ской породы в возрасте 3-5 лет в период сухостоя с признаками жирового гепа- тоза. Комплексом клинических и инструментальных методов исследований (перкуссия, аускультация, лабораторные исследования, ультрасонография) у животных были установлены серьезные поражения печени, сопровождающиеся чрезвычайно широким спектром обменных нарушений.
Для проведения эксперимента по принципу парных аналогов было сфор- мировано две группы по 15 коров в каждой (контрольная и опытная). Первой группе препарат ливазен вводился внутримышечно в соотношении 1:5 (4 мл препарата и 20 мл стерильного физиологического раствора) – в заднебедренные группы мышц ежедневно в течение 21-го дня. Контрольной группе в том же объеме инъецировали 24 мл стерильного физиологического раствора.
Эффективность терапии определялась по результатам клинического кон- троля, биохимических исследований крови, оценке уровня эндогенной интокси- кации и УЗИ-обследованию печени опытных и контрольных коров с помощью ветеринарного ультразвукового сканера PS-380V (Россия) при длине датчика 5,0 мГц.
Экспериментальная часть исследований строилась таким образом, чтобы можно было оценить профилактическую эф- фективность препарата ливазен не только как самостоятельного лекарственного средства, обладающего органоспецифической активностью, но и в комплексной
системе профилактики гепатозов у высокопродуктивного молочного скота. Исследования проведены в двух сериях на коровах различного физиоло- гического состояния: животные второго триместра беременности (5-6 месяцы
стельности); новотельные животные (1-2 недели после отела).
Каждая серия эксперимента предусматривала определенную схему про- филактических мероприятий. Длительность экспериментального периода со- ставила 14 дней, в течение которого оценивалось физиологическое состояние коров, показатели клинического и метаболического статуса, результаты УЗИ- диагностики. Биохимические исследования сыворотки крови проводились по окончании опытного периода по основным обменным показателям и гепатоин- дикаторным ферментам. Кроме того, в качестве прогностического критерия эффективности разработанной системы осуществлялось определение количе- ственных показателей содержания веществ средней молекулярной массы (ВСММ) в крови подопытных коров как маркера развития эндогенной интокси-
кации в организме животного.
Экономическая эффективность рассчитывалась по «Методике определе-
ния экономической эффективности ветеринарных мероприятий» (2000) и реко- мендаций И.Н. Никитина по ее применению (2007, 2012).
Статистическая обработка полученных результатов проводилась с помо- щью программного обеспечения фирмы Mikrosoft ®, фирмы Carl Zeiss ®. Кри- терий достоверности определялся по таблице Стьюдента, при этом рассчиты- вался средний показатель (М); для обработки данных исследования использо- вались методы описательной статистики c последующим проведением множе- ственного парного сравнения с помощью критерия Ньюмена-Кейлса при 5 % уровне значимости различий (р<0,05). Изучение действия ливазена в комплексной системе мероприятий по профилактике гепатозов у стельных и новотельных коров проведено в условиях учебно-опытного хозяйства «Кубань» Кубанского государственного аграрного университета имени И.Т. Трубилина на двух группах коров голштинской поро- ды в возрасте 2-3 лет (1-2 лактации). 3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1 Состав и физико-химические свойства ливазена Ливазен – инъекционный препарат, лекарственная форма которого пред- ставляет собой 20 %-ный раствор для внутримышечного введения, без запаха, слегка маслянистой консистенции, вязкий, сладковато-горьковатого вкуса. рН раствора составляет 5,5. В качестве активных веществ в 1000 мл содержится: диизопропиламмония дихлорацетат – 200 г; этанол 96 % – 175 мл; глицерин – 625 мл. Хранится в стеклянных флаконах, плотно закрытых резиновой пробкой с алюминиевыми колпачками без доступа воздуха, объёмом по 5, 10, 50 и 100 мл. Препарат сохраняет стабильность в течение 2-х лет при условии хранения в герметичной упаковке, в сухом, защищенном от прямых солнечных лучей ме- сте, отдельно от пищевых продуктов и кормов, при температуре от 0°С до 25°С. 3.2 Токсикологическая оценка препарата ливазен Доклинические токсикологические исследования препарата ливазен про- водились с целью определения характера и выраженности его повреждающего действия на организм животных и оценки безопасности при однократном и длительном применении. Острая токсичность ливазена была изучена на белых нелинейных крысах обоего пола при его однократном внутрижелудочном и парентеральном (внут- римышечном) введении в двух повторностях. В первой повторности опытной группе грызунов (n=6) ливазен вводился однократно натощак в желудок в максимально допустимом для крыс, имеющих массу тела до 190 г, объеме – 3,0 мл/кг массы тела. Во второй повторности пре- парат инъецировался в заднебедренные группы мышц подопытных крыс (n=6) в максимальном объеме – 5,0 мл/кг массы тела. Контрольным группам животных с учетом способа введения в тех же дозах применялся физиологический раствор. При пересчете доз были установлены следующие величины – 3 мл на жи- вотное соответствовало в среднем 3,4 г/на крысу или 20,3 г/кг массы тела; 5 мл на животное – 5,6 г на крысу или 33,8 г/кг тела. Данные токсикометрии, а также наблюдения за лабораторными живот- ными на протяжении 14 суток в постинтоксикационном периоде острого отрав- ления по следующим показателям – общему состоянию, внешнему виду, пове- денческим реакциям, степени возбудимости, уровню двигательной активности, шерстному покрову, состоянию слизистых оболочек и величине зрачка, отно- шению к воде и пище, подвижности, ритму и частоте дыхания, не выявили раз- личий между опытными и контрольными крысами, что позволило по ГОСТ 12.1.007-76 «Вредные вещества» отнести ливазен к 4-му классу опасности (ве- щества малоопасные). Субхроническую токсичность препарата оценивали на 40 нелинейных бе- лых лабораторных крысах с начальной массой тела 170-180 г, разделенных на 4 группы (n=10). Крысам опытных групп ежедневно, внутримышечно, в течение 28 дней вводился препарат ливазен, по схеме: – 1 группа (1/10) – 0,5 мл/жив – максимальная тестируемая доза; – 2 группа (1/20) – 0,25 мл/жив – средняя тестируемая доза; – 3 группа (1/50) – 0,01 мл/жив – минимальная тестируемая доза; – 4 группа (контрольная) – 0,5 мл/жив – стерильный физраствор. Расчет доз производился от максимальной внутримышечной дозы препа- рата, введенной в остром опыте – 5 мл на животное. Установлено, что введение ливазена лабораторным крысам в субтоксиче- ских дозах не оказывает значимых изменений в гомеостазе крови животных. В лейкоцитарной формуле сдвиги клеточного состава по группам, включая кон- трольную, носили следующий характер: эозинофилы – увеличение в первой опытной группе (на 12,0 %) в группе контроля – на 10,0 %; сегментоядерные нейтрофилы – умеренное снижение во всех группах при нормальном содержа- нии палочкоядерных нейтрофилов и других форм лейкоцитов (лимфоцитов, моноцитов). Подобная вариативность лейкограммы происходила в пределах референсных значений нормы и, скорее всего, была связана с возрастом живот- ных, не являясь патологией. Средние значения всех определяемых эритроци- тарных индексов крови крыс опытных групп варьировали в пределах 2,5-4,8 %, не выходя за пределы нормы, и значимо не отличались от контроля, что позво- лило констатировать отсутствие патологических нарушений в организме крыс. При оценке биохимического профиля крови в опытных группах установ- лено увеличение уровня общего белка на 3,3-5,4 %, глюкозы – на 23,1-33,8 %, а также стабилизация ферментов печени. Длительное парентеральное введение ливазена не оказало патологическо- го действия на функциональную активность желудочно-кишечного тракта, функцию почек и мочевыводящих путей крупного рогатого скота. Препарат при контакте с кожными покровами не обладает потенциальной раздражающей и аллергенной активностью, как при однократном, так и дли- тельном нанесении, проявляя при этом слабое кратковременное раздражающее действие на слизистые оболочки глаз. Назначение ливазена не вызывает нарушения процессов оплодотворения у самок крыс и не оказывает токсического действия на течение беременности и роды, а также не вызывает значимых изменений в функциональной активности и гистологической структуре их внутренних органов. При ветеринарно-санитарной оценке продуктов убоя кроликов отрица- тельного влияния препарата на органолептические, физико-химические и бак- териологические показатели мяса и бульона не выявлено. 3.3 Гепатозащитное действие препарата ливазен Изучение активности ливазена, обладающего прогнозируемыми гепато- защитными свойствами, проводилось на модельных системах патологического воспроизведения острого токсического гепатита и гиперлипидемиии у лабора- торных белых крыс. Острое токсическое повреждение печени у крыс вызывали однократным внутрибрюшинным введением 50 %-ного масляного раствора тетрахлорметана (СС14) в дозе 0,4 мл/кг массы. Для проведения эксперимента было сформировано три группы животных: – 1 группа – опытная (n=6), животным за 1 час до внутрибрюшинного введения четыреххлористого углерода внутримышечно вводился раствор лива- зена в дозе 0,5 мл и далее 1 раз в сутки в течение 3-х недель (21 день) в той же дозе; – 2 группа – опытная (n=6), внутрибрюшинное введение четыреххлори- стого углерода без последующего лечения; – 3 группа – контроль (n=6) – внутрибрюшинное введение физраствора в дозе 0,5 мл/животное. Гепатопротективное действие ливазена оценивали по клиническому со- стоянию, динамике массы тела, сохранности лабораторных животных, функци- ональной активности печени крыс и уровню эндогенной интоксикации. Установлено, что в группе крыс, к которым была применена терапия ли- вазеном, на 5 день исследований было выявлено улучшение клинического со- стояния, характеризующееся повышением двигательной активности, появлени- ем аппетита, восстановлением реакций на внешние раздражители. Тогда во второй опытной группе нивелирование токсического действия тетрахлорметана стало проявляться только с 8 дня эксперимента, и то не у всех животных. При этом на 15 день исследований в этой группе была отмечена гибель одной кры- сы, при вскрытии которой были зафиксированы признаки некротического по- ражения гепатоцитов печени. Применение четыреххлористого углерода оказало значительное влияние на гравиметрические показатели животных обеих групп. Однако в первой груп- пе к концу исследований потери массы тела крыс составили 4,0 % от средних значений массы тела аналогов 3 группы, тогда как во второй группе этот пока- затель снизился на 10,2 %. Межгрупповые различия составили 6,2 % в пользу крыс, к которым была применена фармакотерапия. Изучение биохимических показателей крови крыс выявило выраженное гепатопротекторное действие препарата ливазен, характеризуемое восстанов- лением функциональной активности печени и снижением синдрома цитолиза гепатоцитов, что проявилось увеличением уровня общего белка на 7,7 %, сни- жением трансаминаз (АсАТ, АлАТ) на 15,7 % и 14,8 %, ЩФ – на 17,4 %, холе- стерина – на 40,0 % и общего билирубина – на 24,0 % в сравнении с показате- лями биохимического гомеостаза животных второй опытной группы. Ливазен способствовал ослаблению эндотоксикоза, обусловленного дей- ствием четыреххлористого углерода, уменьшая уровень среднемолекулярных пептидов в крови в 1,28-2,36 раза (в зависимости от измеряемой длины волны). Диизопропиламмония дихлорацетат, входящий в состав ливазена, по сво- ей природе имеет сходство с пангамовой кислотой, способствующей подавле- нию липолиза и холестерогенеза, а также снижению степени жировой инфиль- трации в клетках печени. В связи с чем на модели скринингового исследования было изучено влияние ливазена на липидный обмен лабораторных крыс на фоне развития гиперлипидемии, вызванной введением детергента Твин-80 (По- лисорбат-80, Е 433). Эксперимент выполнен на белых нелинейных крысах обоего пола (n= 24) с массой тела 160-210 г, разделенных на четыре группы по 6 особей в каждой. Схема проведения исследования представлена в таблице 1. Гиперлипидемию у крыс первых трех групп моделировали внутрибрю- шинным введением Твин-80 в дозе 200 мг/100 г массы тела в 1 мл воды для инъекций на 6 день эксперимента через 1,5 часа после парентерального введе- ния препаратов. Таблица 1 – Схема проведения экспериментальной гиперлипидемии у крыс, вызванной Твин-80 Группа (n=6) 1 опытная 2 опытная 3 опытная (контроль) 4 опытная (интактная) Период исследования 6 дней Доза детергента Твин-80 200 мг/100 г мас- сы тела – Внутримышечное введение препарата, мл ливазен – 0,25 ливазен – 0,5 физиологический раствор – 0,5 – Через сутки после затравки детергентом все крысы выводились из экспе- римента для оценки морфо-биохимической картины крови. В гематологических показателях крови подопытных крыс в сравнении с интактными животными было отмечено увеличение сегментоядерных нейтро- филов – в 1,75 (1 опытная группа), 1,53 (2 опытная группа) и 1,88 (контрольная группа) раз на фоне снижения лимфоцитов на 31,3; 23,5 и 40,2 % соответствен- но. При этом общее количество лейкоцитов по группам сохранялось в пределах видовой нормы. Основные изменения отмечались внутри лейкограммы, обу- славливая нейтрофилию со сдвигом вправо при одновременном развитии лим- фоцитопении. Твиновая гиперлипидемия привела к увеличению показателей липидного обмена – холестерина и триглицеридов (рис. 1). Повышение холестерина отно- сительно значений интактных грызунов в первой опытной группе составило 3,73 раза, во второй опытной группе – 3,16 раза, а в группе контрольных анало- гов – 5,75 раза, триглицеридов – в 3,2, 2,5 и 4,3 раза соответственно. Рис. 1 – Влияние Твин-80 на показатели липидного обмена у крыс на фоне введения ливазена Однако превентивное инъецирование ливазена позволило в опытных группах снизить признаки дислипидемии. Различия между опытными и кон- трольной группами по холестерину составили 2,02 и 2,6 раза, по триглицеридам – 1,1 и 1,8 раза. В группах с терапией произошло значительное снижение ЛПНП: в первой – на 36,3 %, во второй – на 42,13 % относительно показателей группы контроля. Фармакологическая поддержка ливазеном оказала положительное влия- ние на печень, улучшая синтезобразующие функции гепатоцитов и потенцируя их липолитическую активность. Уровень ферментной активности печени в пер- вых двух опытных группах снизился на 25,4-31,0 % (АсАТ), 25,0-40,3 % (АлАТ) и 11,9-25,2% (ЩФ), общего билирубина – на 3,9-20,3 %, глюкозы – на 32,3-38,4 % соответственно. При этом в условиях острой твиновой липидопатологии наиболее выра- женный эффект показателей липидного обмена в сыворотке крови наблюдался при внутримышечном введении ливазена в дозе 0,5 мл/животное. 3.4 Влияние ливазена на уровень эндогенной интоксикации Изучение влияния ливазена на степень развития эндотоксикоза у коров проводилось в условиях ООО «Агрофирма Кубань» Северского района Крас- нодарского края. Для поведения исследования было сформировано четыре группы животных по 5 голов в каждой – две опытные и две контрольные. Пер- вая опытная группа – животные, находящиеся на пятом месяце стельности, вто- рая опытная – новотельные коровы. Животным опытных групп препарат вво- дили внутримышечно в профилактической дозе (2 мл ливазена +10 мл физрас- твора) в течение 14 дней. Контрольным группам животных с учетом способа введения в тех же дозах применялся только физиологический раствор. Оценка результатов проводилась по динамике холестерина и среднемоле- кулярных пептидов (МСМ) в сыворотке крови, для чего в начале эксперимента и по его окончанию у всех коров, отобранных в опыт, производился забор крови. Анализ результатов биохимического исследования сыворотки крови установил, что введение коровам ливазена оказало существенное влияние на показатели холестерина и МСМ. Концентрация холестерина в первой опытной группе снизилась на 21,0 % относительно фоновых значений, во второй опыт- ной группе – на 15,9 % соответственно. Тогда как в контрольных группах, напротив, произошло увеличение данного показателя на 16,3 % и 12,2 % (таб- лица 2). Таблица 2 – Влияние ливазена на уровень холестерина и среднемолекулярных пептидов в организме коров (М±m; n=5) Стельные коровы Показатели Холестерин, ммоль/мл МСМ254, усл. ед. МСМ280, усл. ед. Показатели Холестерин, ммоль/мл МСМ254, усл. ед. МСМ280, усл. ед. Начало опыта Опыт Контроль 6,3±0,2 4,9±0,2 0,20±0,0** 0,26±0,01 0,17±0,01** 0,23±0,01 Конец опыта Опыт 5,0±0,29 0,18±0,01** 0,15±0,01** Контроль 5,7±0,05 0,24±0,0 0,22±0,01 Новотельные коровы Начало опыта Опыт 5,6±0,35 0,26±0,01 0,23±0,01 Контроль 4,1±0,2 0,24±0,0 0,22±0,02 Конец опыта Опыт Контроль 4,7±0,1 4,6±0,30 0,25±0,01 0,24±0,01 0,23±0,02 0,23±0,02 Степень достоверности: **р ≤0,01 по отношению к контрольной группе Показатель молекул средней массы с момента начала опыта в первой опытной группе снизился в зависимости от длины экспозиции на 10,0 % и 11,8 % что, объективно указывает на снижение интенсивности катаболических процессов и улучшение функционирования интегральных (детоксикационных) систем организма. Уровень средних молекул в опытной группе новотельных коров при длине экспозиции 254 усл. ед. снизился на 4,0 %, не изменившись при длине волны 280 усл. ед. Возможно, в этом случае применение препарата стабилизирует протекание биохимических реакций в организме, обеспечивая его нормальное функционирование. Уровень МСМ в контрольных группах претерпел изменения только у стельных коров. В конце экспериментального периода произошло их снижение (на уровне тенденции) на 7,7 % и 4,3 % в зависимости от длины экспозиции. У новотельных животных данные показатели остались практически неизменны- ми, либо незначительно выросли (на 4,5 % при длине волны 280 усл. ед.). 3.5 Клиническая эффективность ливазена при гепатозах коров 3.5.1 Лечебная эффективность ливазена Исследования по изучению терапевтических свойств препарата проведе- ны на коровах голштинской породы в возрасте 3-5 лет в период сухостоя с при- знаками жирового гепатоза. Диагноз ставился на основании анамнестических данных, клинического обследования животных, биохимического исследовании сыворотки крови и ультрасонографии печени. По принципу парных аналогов было сформировано две группы по 15 жи- вотных в каждой (контрольная и опытная). Первой группе препарат ливазен вводился внутримышечно из расчета 4 мл препарата и 20 мл стерильного фи- зиологического раствора ежедневно в течение 21-го дня. Контрольной группе в том же объеме инъецировали 24 мл стерильного физиологического раствора. Результатами исследований установлено, что ливазен оказывает положи- тельное влияние на гомеостаз крови животных, нормализуя клиническое и ме- таболическое состояние животных. Концентрация общего белка и мочевины на 21 день исследований увеличилась относительно контрольных аналогов на 17,6 % и в 1,78 раза, относительно фоновых значений – на 26,3 % и в 2,29 раза, альбуминов – на 27,2 % при одновременном снижении γ-глобулинов на 18,6 %. Фармакотерапия ливазеном привела к снижению трансаминаз: АсАТ – на 20,4 %, АлАТ – на 17,8 %, нивелируя синдроматику цитолиза клеток печени. Отмечено уменьшение холестатического синдрома, что проявилось снижением щелочной фосфатазы в 1,71 раза (р≤0,05), общего билирубина – в 1,87 раза; улучшилась каротиндепонирующая функция печени (концентрации каротина возрасла в 5,0-6,7 раза). При клиническом осмотре у животных была отмечена нормализация ра- боты желудочно-кишечного тракта, улучшение аппетита, двигательной актив- ности, отсутствие атонии преджелудков. Выраженная эффективность ливазена в коррекции основных синдромов по- ражения печени у коров подтвердилась результатами УЗИ-диагностики (рис. 2, 3). Рисунок 2 – Гомогенная структура паренхимы Рисунок 3 – Мелкоочаговые уплотнения в печени коров после терапии ливазеном паренхиме печени, очаги жировой дистрофии у коров контрольной группы после завершения эксперимента При ультрасонографии через 21 день эксперимента в паренхиме органа были выявлены процессы клеточной регенерации, четкость и ровность краев, гомогенность эхоструктуры и отсутствие дистрофических участков 18 Тогда как в группе контрольных коров эхоструктура имела пеструю кар- тину, паренхима печени была неравномерно, мелкоочагово уплотнена, встреча- лись участки жировой дистрофии. Проведенными исследованиями установлено выраженное терапевтиче- ское действие ливазена, способствующее улучшению клинического состояния больных животных, восстановлению биохимических показателей крови, прояв- ляемых позитивной тенденцией развития активности маркерных ферментов по- ражения печени, общих обменных процессов организма, а также восстановле- нию морфофункционального состояния печени коров. 3.5.2 Эффективность ливазена в системе мероприятий по профилактике гепатозов у коров Научно-хозяйственный опыт по изучению профилактической эффектив- ности препарата ливазен на этапе возникновения метаболических и морфо- функциональных изменений в клетках печени в комплексе с гепатопротектор- ным антитоксическим премиксом проведен в двух сериях на коровах различно- го физиологического состояния: животные второго триместра беременности (5- 6 месяцы стельности) и новотельные животные (1-2 недели после отела). Каждая серия эксперимента предусматривала следующую схему профи- лактических мероприятий (таблица 3). Таблица 3 – Схема научно-хозяйственного опыта (n=40) Группы Количество животных I – контрольная 10 II – опытная 10 IV – опытная 10 Схема профилактических мероприятий ОР (основной рацион) + внутримышечно 12 мл физраствора ОР+внутримышечное введение ливазена в соотношении 1:5 к стерильному физиологическому раствору (2 мл препарата и 10 мл физраствора) ОР + 100 г адсорбента токсинов в корма III – опытная 10 ОР + внутримышечное введение ливазена в соотношении 1:5 к стерильному физиологическому раствору (2 мл препарата и 10 мл физиологического раствора) + 100 г адсорбента токсинов в корма Длительность экспериментального периода составила 14 дней. Анализ результатов биохимического исследования сыворотки крови установил, что предложенные схемы применения препаратов коровам оказали значительное влияние на ряд показателей. У стельных коров в белковом обмене во всех группах установлено досто- верное увеличение общего белка с приоритетом по группе, сочетающей ком- плексное использование ливазена и антитоксического премикса. Концентрация общего белка в сыворотке коров этой группы повысилась на 19,1 %, тогда как использование одного только премикса способствовало возрастанию белка лишь на 6,1 %. Подобная тенденция прослеживалась и по содержанию альбу- минов, средние величины которой в опытных группах повысились на 8,9- 14,0 %, со стабилизацией глобулиновых фракций. Следует отметить, что применение одного ливазена не проявило стиму- лирующего влияния на углеводный обмен. Тогда как использование препаратов в комплексной системе профилактических мероприятий позволило повысить уровень глюкозы к концу исследований на 16,9 %. Нормализация показателей липидного обмена проявилась увеличением концентрации триглицеридов в первой опытной группе в 3,1 раза, во второй опытной группе – в 2,3 раза и в третьей – в 2,4 раза соответственно. При этом уровень холестерина увеличился в группе с применением ливазена на 24,7 %, в группе с применением антитоксического премикса – на 11,4 %. Во всех опыт- ных группах уровень билирубина в сыворотке крови имел тенденцию к сниже- нию, тогда как в контроле, напротив, его концентрация резко повысилась (в 2,44 раза). Профилактическое использование препаратов позволило обеспечить тен- денцию к снижению ферментной активности во всех опытных группах (по АсАТ – на 6,9 %, 16,4 % и 4,3 %; по АлАТ – на 24,4 %, 27,6 % и 24,8 %; по ЩФ – на 11,6 % и 7,3 % в первой и второй опытных группах), в отличие от кон- трольных животных, у которых показатели аспартатаминотрансферазы возрос- ли на 11,3 % от начальных. В биохимических показателях сыворотки крови новотельных коров в ди- намике отмечена сходная картина. Введение ливазена в схему профилактиче- ских мероприятий позволило увеличить концентрацию общего белка в крови животных опытных групп на 4,9-8,8 %, стабилизировать протеинограммы за счет увеличения альбуминов на 8,9-14 % на фоне снижения γ-глобулинов на 13,8-20,9 %. Использование фармакопрофилактики способствовало активизации угле- водного, липидного и минерального обменов подопытных коров, в той или иной мере увеличивая основные метаболиты, отражающие интенсивность их течения в организме животных. Наиболее значимые изменения в крови отмече- ны по уровню общего билирубина. Его снижение в группе с применением од- ного ливазена составило 2,15 раза, а в группе с комплексным применением ли- вазена и премикса уровень билирубина снизился в 3,9 раза. Причем, в группе с применением только премикса концентрация общего билирубина практически не изменилась, сохраняясь на достаточно высоком уровне. То есть именно ли- вазен оказал выраженное гепатопротективное действие. А введение в рационы антитоксического премикса усилило его фармакологические эффекты. Препараты, как по отдельности, так и в комплексе, способствовали опти- мизации ферментной активности и сохранению уровня АсАТ и АлАТ в грани- цах референсных пределов. Тогда как в группе негативного контроля на конец эксперимента уровень АлАТ, напротив, повысился на 13,3 %. Включение ливазена в комплексную профилактику гепатозов у коров оказало выраженное влияние на показатели среднемолекулярных пептидов в крови животных. Показатель молекул средней массы в группе стельных коров с момента начала опыта у животных, которым вводился ливазен и ливазен с пре- миксом, в зависимости от длины экспозиции снизился на 8,5 % и 5,3 % и на 9,5 % и 7,3 % соответственно. В контрольных группах за этот период уровень МСМ, напротив, повысился на 6,1 % и 7,4 %. В группе новотельных коров у опытных животных, которым внутримышечно вводился ливазен, снижение среднемолекулярных пептидов было наиболее выражено и составило 30,9 % при длине волны λ = 254 усл. ед. и 33,3 % при длине волны λ = 280 усл. ед. В контро- ле значения среднемолекулярных пептидов оставались неизменными на протя- жении всего периода исследований. Через 14 дней при УЗИ-исследовании наблюдались регенеративные про- цессы в печени почти у всех опытных животных. Края долей печени были ров- ными, местами четкими. Эхоструктура имела гомогенное строение с одинако- вым распределением сигналов по интенсивности, равномерным изображением сосудов. Таким образом, использование инъекционного гепатопротекторного пре- парата ливазен в системе профилактических мероприятий оказывает выражен- ное позитивное действие на возникновение и развитие гепатопатологий, обу- словленных метаболическими нарушениями в организме молочных коров. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Выводы: 1. Ливазен – инъекционный препарат, лекарственная форма которого представляет собой 20 % прозрачный раствор для внутримышечного введения без запаха, слегка маслянистой консистенции, вязкий, сладковато-горьковатого вкуса. В препарате в качестве активных веществ содержится: диизопропилам- мония дихлорацетат – 200 г, этанол 96 % – 175 мл, глицерин – 625 мл. По сте- пени воздействия на организм животных относится к 4 классу опасности – ве- щества малоопасные (ГОСТ 12.1.007-76), не вызывая гибели и клинической картины токсикоза как в острых, так и хронических опытах. Длительное внут- римышечное введение ливазена в субтоксических дозах не оказывает негатив- ного влияния на гравиметрические показатели, гомеостаз крови, массу и строе- ние внутренних органов подопытных животных. Препарат не проявляет раз- дражающего, аллергизирующего и кожно-резорбтивного действия, не обладает эмбриотоксическими и тератогенными свойствами, не влияет на органолепти- ческие и качественные показатели мяса. 2. Гепатозащитные свойства ливазена, проводимые на модельной системе острого тетрахлорметанового гепатита у лабораторных животных, характери- зуются восстановлением целостности мембран гепатоцитов и их структуры, обуславливая снижение трансаминаз (АсАТ, АлАТ) на 15,7 % и 14,8 %, ЩФ – на 17,4 %, холестерина – на 40,0 %, общего билирубина – на 24,0 %, уменьшая уровень среднемолекулярных пептидов в крови в 1,28-2,36 раза. 3. Введение крысам с экспериментальной гиперлипидемией, вызванной детергентом Твин-80 ливазена, сопровождается снижением интенсивности ли- полиза и показателей липидного обмена: холестерина – в 1,5-1,8 раз, триглице- ридов – в 1,3-1,7 раз, улучшением гомеостатического баланса крови в организ- ме опытных животных. Уровень ферментной активности печени снижается на 25,4-31,0 % (АсАТ), 25,0-40,3 % (АлАТ) и 11,9-25,2 % (ЩФ), общего билируби- на – на 3,9-20,3 %, глюкозы – на 32,3-38,4 % соответственно. 4. При метаболических нарушениях в организме животных ливазен про- являет выраженное эндотоксическое действие, препятствуя накоплению кон- центрации среднемолекулярных пептидов, уровень которых снижается на 8,5- 33,4 % в зависимости от тяжести патологического процесса. 5. Применение препарата при терапии жирового гепатоза у коров способ- ствует нормализации клинического состояния и обмена веществ животных, что сопровождается увеличением концентрации общего белка на 17,6-26,3 %, аль- буминов – на 27,2 % при одновременном снижении γ-глобулинов на 18,6 %. Фармакотерапия ливазеном приводит к уменьшению уровня трансаминаз: АсАТ – на 20,4 %, АлАТ – на 17,8 %, нивелируя синдроматику цитолиза клеток печени; уменьшается холестатический синдром за счет снижения уровня ще- лочной фосфатазы в 1,71 раза (р≤0,05), общего билирубина – в 1,87 раза. 6. Включение ливазена в схему профилактических мероприятий стельным и новотельным коровам с клиническими и метаболическими нарушениями ра- боты печени, обеспечивает активизацию белкового обмена на 6,1-19,1 % (р≤0,05), стабилизацию протеинограмм, обусловленную увеличением альбуми- нов на 8,9-14 % на фоне снижения γ-глобулинов на 13,8-20,9 %, увеличение триглицеридов в 2,3-3,1 раза, холестерина – на 24,7 %, снижение общего били- рубина – в 2,15 раза, активности АсАТ – на 6,9-16,4 %; АлАТ – на 24,4-27,6 %, ЩФ – на 7,3-29,3 %, а также способствует клеточной регенерации и восстанов- лению функциональной активности гепатоцитов, подтверждаемой ультрасоно- графическими исследованиями. 7. Экономический эффект от применения препарата при профилактике гепатоза у коров составляет 7,56 руб. на один рубль затрат.