Молекулярно-биохимические маркеры эндотелиальной дисфункции при хроническом воздействии ртути

Вглавепервойприведенобзоротечественных изарубежных
публикаций, посвященных современным представлениям об эндотелиальной
дисфункции (ЭД), механизмах ее развития и клинических проявлений.
Рассмотрены возможные механизмы влияния ртути и вклад генетических
полиморфизмов в развитие эндотелиальной дисфункции. В главе второй
представлены материалы и методы исследования, которые включают описание
группихарактеристикуусловийтрудаобследованныхлиц.Были
сформированы две основных когорты: стажированные работники, находящихся
в контакте с ртутью, со стажем работы во вредных условиях труда более 5 лет
(113 чел.) но не имеющие профессионального заболевания; пациенты с
установленным диагнозом ХРИ разной степени выраженности (бывшие
сотрудники ООО «Усольехимпром» и работающие ОАО «Саянскхимпласт» –
59 чел.). Были выделены следующие группы: практически здоровые лица без
наличия сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) (1 группа); лица с ССЗ –
артериальной гипертонией (АГ) или ишемической болезнью сердца (ИБС) (2
группа). В зависимости от наличия ССЗ все обследованные лица с ХРИ были
разделены на группы с сопутствующими ССЗ (АГ, ИБС) – 4 и 6 группы; и без
таковой – 3 и 5 группы. В соответствии с Руководством Р.2.2.2006-05 по оценке
содержания вредных химических веществ в воздухе рабочей зоны, труд
рабочих всех профессиональных групп (по степени вредности и опасности) в
выделенных производствах ООО «Усольехимпром» и ОАО «Саянскхимпласт»
следует квалифицировать как вредный второй степени (класс 3.2). Группу
сравнения составили лица с АГ или ИБС, не имеющие в профессиональной
деятельности контакта с вредными производственными факторами – 21 человек
(Таблица 1).
Таблица 1 – Характеристика обследуемых групп; Med (Q25-Q75)
ГруппаВозраст,Стаж,Экспозиционная
летлетнагрузка, мг
137110,9
Стажированные без ССЗ, n=8333-479-140,6-1,4
252*17*2*
Стажированные с ССЗ, n=3044-5511-281-3
350*24*6*
ХРИ без ССЗ, n=947-5116-262-7
450*23*3*
ХРИ с ССЗ, n=845-5519-272-8
555*154*^
ХРИотд. без ССЗ, n=1851-5611-193-7
655*164*^
ХРИотд. с ССЗ, n=2450-5811-203-6
Группа сравнения46–
с ССЗ. n=2144-50
р0,0000,990,99
Примечание: р – уровень статистической значимости по ANOVA Краскела-Уоллиса (р0,05);
* и ^ – различия статистически значимы по U-критерий Манна-Уитни (р0,003) по
сравнению с 1 и 2 группой соответственно.
Биохимические методы исследования включали определение содержания
эндотелина-1(ЭТ-1),серотонина,гистамина,ангиотензинаII,hsСRP,
гомоцистеина, фактора Виллебранда, sICAM-1, sVCAM-1, VEGF и антител к
окисленным ЛПНП (АТ к окЛПНП) методом иммуноферментного анализа при
помощи соответствующих тест-систем. Суммарное содержание стабильных
метаболитовоксидаазота(нитритыинитраты(NOx))определяли
спектрофотометрическим методом. На биохимическом анализаторе «Labio
2000» «Mindray», Китай) определяли уровни общего холестерина (ОХ),
холестерина липопротеидов высокой плотности (ХС ЛПВП), триглицеридов
(ТГ) и фосфолипидов (ФЛ), используя соответствующие тест-системы.
Выявление содержания холестерина липопротеидов низкой и очень низкой
плотности (ХС ЛПНП и ХС ЛПОНП) проводили расчетным методом по
формулам Фридвальда. Индекс атерогенности (ИА) рассчитывали отношением
суммы атерогенных фракций к неатерогенным. Исследование полиморфизмов
генов эндотелина-1 (EDN1 Lys198Asn), эндотелиальной синтазы оксида азота
(NOS3 Т786С), ангитензиногена (AGT Thr174Met и Met235Thr) проводилось
методом ПЦР с использованием коммерческих комплектов реагентов «SNP-
экспресс» (ООО НПФ «Литех», Россия).
Статистическую обработку и анализ результатов проводили с помощью
программы STATISTICA 6.1 Stat_Soft® Inc. Использовали критерий Шапиро-
Уилкса, анализ ANOVA Краскела-Уоллиса, метод U-критерия Манна-Уитни с
применением поправки Бонферрони, коэффициент ранговой корреляции
Спирмена, χ2 Пирсона с поправкой Йетса, 95% доверительный интервал (ДИ),
отношение шансов. Результаты исследований представлены в виде значений:
медианы (Med) и интерквартильного диапазона верхнего (Q25) и нижнего(Q75).
В главе третьей представлены результаты собственных исследований,
которые включают подглавы биохимические показатели ДЭ: у стажированных
рабочих, экспонированных ртутью; у лиц с впервые установленным диагнозом
ХРИ; у лиц с ХРИ в отдаленном периоде; результаты исследований генов-
маркеров ЭД у обследованных лиц; особенности проявления маркеров ЭД у
лиц с ССЗ при воздействии ртути; разработку способа прогнозирования
значений ИА у стажированных работающих в условиях экспозиции ртутью.
На первом этапе исследования были установлены закономерности
проявления ЭД при хроническом воздействии ртути на разных этапах развития
интоксикации. Нами отмечены как у стажированных работающих в условиях
контакта с ртутью, так и у пациентов с диагнозом ХРИ нарушения в
концентрации биохимических маркеров ЭД, которые выражались в снижении
уровня оксида азота в 57-89% случаев, повышении содержания гистамина – в
50-95%, ангиотензина II – в 77-100%, гомоцистеина в 39-66%, и эндотелина-1 у
29-72% обследуемых (Таблица 2).
Таблица 2 – Содержание маркеров эндотелиальной дисфункции в крови у лиц,
экспонированных ртутью; Med (Q25-Q75)
ПоказательАнгиотензин II Эндотелин-1NOxГистамин Гомоцистеин
ед. изм.нг/млфмоль/млмкмоль/лнг/млмкмоль/л
Референсный0,01-0,060,26-1,032,5-45,6<1,05-15 уровень 10,4060,7227,72,3919,1 Стажированные без(0,029-2,249)(0,48-1,36) (14,6-44,9) (1,57-2,89) (13,4-28,6) ССЗ 20,4811,24*25,22,3619,2 Стажированные(0,003-4,601)(1,02-2,10) (7,9-42,9) (1,48-3,03) (13,1-22,1) с ССЗ 30,3551,0429,31,6916,3 ХРИ без ССЗ(0,273-0,481)(0,91-1,38) (26,2-34,1) (1,59-1,98) (12,4-22,8) 40,7031,7524,52,8713,5 ХРИ с ССЗ(0,351-2,500)(0,99-2,59) (19,1-30,1) (1,19-4,93) (11,1-20,3) 50,2441,0424,21,12*14,4 ХРИотд. без ССЗ(0,001-0,530)(0,93-1,23) (20,2-26,8) (0,50-1,50) (10,5-15,7) 60,4271,1925,81,05*^17,2 ХРИотд. с ССЗ(0,269-0,905)(0,95-1,56) (21,1-29,0) (0,58-2,73) (12,7-25,1) р0,3160,0040,2220,00020,113 Примечание: р – уровень статистической значимости по ANOVA Краскела-Уоллиса (р0,05); * и ^- различия статистически значимы по U-критерий Манна-Уитни (р0,003) по сравнению с группой 1 и группой 2 соответственно. Изучениепоказателейлипидногообменапоказалоналичие дислипидемии у обследованных, сопровождавшейся увеличением содержания АТ к окЛПНП у 33-63% лиц. Среднее содержание ОХ было выше референсного уровня у всех пациентов с сопутствующими ССЗ. В то же время, наблюдались высокие значения ИА у стажированных рабочих и у лиц в отдаленном периоде интоксикации с ССЗ и без таковых (Таблица 4). Следует отметить, что у всех стажированных работников было выявлено снижение уровня серотонина по сравнению с таковым у пациентов с ХРИ. Также у стажированных без ССЗ было выявлено статистически значимое увеличение уровня sICAM-1, которое можно рассматривать как компенсаторный механизм сдерживания развития воспалительной реакции на эндотелии (Таблица 3). На следующем этапе исследования были выявлены особенности в содержании маркеров ЭД при ХРИ, которые заключались в следующем: в обеих когортах отдаленного периода ХРИ были установлены повышенные уровни sVCAM-1 и серотонина, а содержание hsCRP находилось на уровне пороговых значений риска развития ССЗ (Таблица 3). Среди показателей липидного обмена у лиц с ХРИ наиболее выраженные изменения касались уровня ТГ, отклонения в содержании которых отмечались у 25–55% обследуемыхсССЗ.Отмеченныенарушениялипидногообмена сопровождались компенсаторным увеличением уровня ФЛ во всех группах с ХРИ (Таблица 4). Полученные результаты свидетельствует о стимуляции процессов адгезии лейкоцитов на сосудистой стенке и ее повреждении у данных пациентов с ХРИ. Таблица 3 – Особенности в содержании маркеров эндотелиальной дисфункции у пациентов с хронической ртутной интоксикацией; Med (Q25-Q75) ПоказательСеротонинhsCRPsVCAM-1sICAM-1 ед. изм.нг/млмг/лнг/млнг/мл Референсный уровень40-4000,068 – 3300 – 1000150 – 500 1 группа58,81,9663657 Стажированные без ССЗ(23,2-151,5)(1,0-3,3)(366-1097)(499-758) 2 группа33,92,3791453 Стажированные с ССЗ(15,3-139,9)(0,7-3,5)(562-1006)(226-641) 3 группа298*2,51034302* ХРИ без ССЗ(50-957)(2,0-3,1)(923-1828)(190-468) 4 группа3042^2,3533351 ХРИ с ССЗ(234-6237)(1,5-4,0)(316-776)(241-494) 5 группа94,1^3,01438*416* ХРИотд. без ССЗ(74-217)(1,8-4,2)(709-1968)(353-499) 6 группа661*^2,91044373* ХРИотд. с ССЗ(107-6162)(1,6-4,3)(479-2244)(304-518) р0,00000,3090,0830,426 Примечание: см. табл. 2. Таблица 4 – Показатели липидного обмена у рабочих, экспонированных ртутью; Med (Q25-Q75) Общий Показатель,ХС ЛПВП,ХС ЛПНП,Триглицериды,ИндексФосфолипиды,АТ к окЛПНП, холестерин, ед. изм.мМоль/лмМоль/лмМоль/латерогенностимМоль/лЕд/мл мМоль/л Референсный уровень 5,17≥ 0,900,30 – 3,800,34 – 1,822,0 – 4,01,93 – 3,22≤ 30,0 1 группа4,800,993,260,974,12,825,8 Стажированные без ССЗ(4,20-5,40)(0,84-1,15)(2,78-3,83)(0,77-1,39)(2,9-5,1)(2,4-3,2)(18,2-37,6) 2 группа5,300,973,540,984,33,128,7 Стажированные с ССЗ(4,50-6,00)(0,89-1,12)(3,12-4,16)(0,77-1,52)(3,6-5,4)(2,5-3,5)(19,2-46,5) 3 группа5,401,193,521,24*3,33,238,6 ХРИ без ССЗ(5,10-6,00)(1,04-1,25)(3,31-3,70)(1,10-1,58)(3,0-3,5)(3,1-3,4)(26,4-50,5) 4 группа5,271,233,041,473,23,327,4 ХРИ с ССЗ(4,44-5,60)(0,93-1,49)(2,61-3,72)(1,31-2,37)(2,7-4,7)(3,1-3,5)(22,7-52,3) 5 группа4,901,063,181,56*4,03,125,9 ХРИотд. без ССЗ(4,20-6,00)(0,94-1,26)(2,54-3,95)(1,00-1,96)(3,2-5,1)(2,5-3,4)(21,3-42,8) 6 группа5,180,993,271,86^4,53,229,2 ХРИотд. с ССЗ(4,45-6,10)(0,80-1,24)(2,52-4,26)(1,19-2,34)(2,7-6,0)(2,6-3,9)(22,5-54,8) р0,0810,0120,3250,00000,2580,0160,156 Примечание: см. табл. 2. Для выявления диагностических критериев хронического воздействия ртути на формирование ЭД был проведен сравнительный анализ лиц с ССЗ из группы стажированных рабочихи группы сравнения.Установленный дисбаланс маркеров сосудистого тонуса у стажированных лиц с ССЗ, характеризовался повышенным содержанием ангиотензина II и сниженной концентрацией серотонина у рабочих с ССЗ, экспонированных ртутью, относительно группы сравнения (Таблица 5). Частота стажированных с низким уровнем серотонина составила 63% [ДИ 43-84] и статистически значимо различалась с частотой повышенного уровня серотонина в группе сравнения (р=0,03). В группе сравнения среднее содержание серотонина превышало референсный уровень у 90% [ДИ 72 – 108]. Таблица 5 – Основные результаты сравнительного анализа маркеров эндотелиальной дисфункции у лиц с сердечно-сосудистыми заболеваниями; Med (Q25-Q75) Группа 2Группа Референсный Показатель, ед. изм.Стажированныесравненияр уровень с ССЗ, n=30с ССЗ, n=21 Ангиотензин II,0,4810,012 0,01-0,06(0,000-0,261) 0,008 нг/мл(0,003-4,601) Серотонин,33,9631,7 40-4000,000 нг/мл(15,3-139,9)(492,4-853,8) sICAM-1,150 – 5004531770,09 нг/мл(226-641)(175-179) VEGF,10 – 700331860,01 пг/мл(189-547)(11-189) Фактор Виллебранда,0,5-1,50,950,530,000 Ед/мл(0,74-1,27)(0,40-0,57) ХС ЛПВП,≥ 0,900,971,290,003 мМоль/л(0,89-1,12)(1,00-1,49) 2,0 – 4,04,33,40,02 Индекс атерогенности (3,6-5,4)(2,6-4,3) Примечание: р – уровень статистической значимости различий, сравнение количественных показателей в группах по U-критерию Манна-Уитни (р0,05). Выявленные нарушения в содержании маркеров активации эндотелия в группах с ССЗ заключались в более высоких уровнях молекул sICAM-1 и VEGF в группе стажированных рабочих, чем в группе сравнения. В группе стажированных с ССЗ частота повышенного уровня sICAM-1 составила 46% [ДИ 20-71], при этом в группе сравнения не было выявлено лиц с высоким уровнем данного аналита (р=0,0003) (Таблица 5). Изучение липидного обмена в группах с ССЗ показало статистически значимое увеличение значения ИА и снижение уровня ХС ЛПВП у лиц, контактирующих с ртутью. Среднегрупповой уровень VWF был в 2 раза выше в когорте рабочих с ССЗ и статистически значимо различался с таковым в группе лиц, не экспонированных ртутью (Таблица 5). Назаключительномэтапеисследованиябылустановленвклад производственныхиотдельныхгенетическихфактороввразвитие наблюдаемых изменений. В результате этого было установлено, что два из диагностически значимых критериев хронического воздействия ртути на формирование ЭД – VEGF и ИА были ассоциированы с производственными факторами (стаж и экспозиционная нагрузка) в группах стажированных и у лиц сI,I-IIстадиейинтоксикации.УстажированныхбезССЗбыла зарегистрирована сопряженность уровней VEGF и ИА с количеством отработанных лет (R=0,30, р=0,02 и R=0,22, р=0,05 соответственно). У стажированных рабочих, имеющих ССЗ, была выявлена связь уровня АТ к окЛПНП с экспозиционной нагрузкой и количеством отработанных лет (R=0,66, р=0,00 и R=0,57, р=0,00). Корреляционные связи с экспозиционной нагрузкой и количеством отработанных лет в группах с ХРИ были выявлены только у лиц с ССЗ, с ней коррелировали уровни VEGF и эндотелина-1 (R=- 0,94, р=0,01, R=-0,81, р=0,05 и R=0,93, р=0,00, R=0,78, р=0,02 соответственно). Авпостконтактномпериодесвязьмеждупроизводственнымии биохимическими маркерами ЭД отсутствовала. Результаты исследования полиморфного варианта гена EDN1 (Lys198Asn) показали, что носительство мутантного генотипа приводило к увеличению концентрации ЭТ-1 в 100% случаев у лиц с ССЗ, экспонированных ртутью. В то же время доля обследуемых с повышенным уровнем ЭТ-1 среди носителей дикого генотипа в группах с ССЗ статистически значимо было выше, чем в группах лиц без таковых (Рисунок 1). %100100 80*68*6767 6050 4041 4033 AsnAsn LysAsn AsnAsn AsnAsn LysLys LysAsn LysAsn LysLys LysAsn LysLys LysLys AsnAsn Стажированные СтажированныеХРИХРИ без ССЗс ССЗбез ССЗс ССЗ Рисунок 1 – Частота отклонений от референсных значений в содержании эндотелина-1 в зависимости от полиморфного варианта гена EDN1 (Lys198Asn) Примечание: * - сравнение частот отклонений в группах с ССЗ и без ССЗ по χ2 Пирсона с поправкой Йетса, р<0,05. Исследование концентрации оксида азота в зависимости от генотипов гена NOS3 показало, что у лиц с ХРИ, носителей генотипа ТТ в 100% случаев был снижен уровень NOx, в то время как у стажированных рабочих в 65-71% случаев встречалось снижение данного аналита (Рисунок 2). %100100 8685 807172 67 6567 40 СС ТТ СТСС ТТ СТСС ТТ СТСС ТТ СТ Стаж ированные Стаж ированныеХРИХРИ без ССЗс ССЗбез ССЗс ССЗ Рисунок 2 – Частота отклонений от референсных значений в содержании NOx в зависимости от полиморфного варианта гена NOS3 (Т786С) Исследование полиморфных вариантов гена AGT в Thr174Met и в Met235Thr позициях показало, что количество обследованных с повышенным содержанием ангиотензина II при наличии диких генотипов была либо выше, либо сопоставима с частотой среди носителей мутантного и гетерозиготного генотипов, в том числе и у лиц без ССЗ (Рисунок 3). % 10088 838386 7675 6050174 MetMet MetMet MetMet MetMet ThrMet ThrMet ThrMet ThrMet ThrThr ThrThr ThrThr ThrThr Стажированные СтажированныеХРИХРИ без ССЗс ССЗбез ССЗс ССЗ %94100100 8178807979 8067 6967 60235 MetMet MetMet MetMet MetThr MetMet MetThr MetThr ThrThr MetThr ThrThr ThrThr ThrThr Стаж ированные Стаж ированныеХРИХРИ без ССЗс ССЗбез ССЗс ССЗ Рисунок 3 – Частота отклонений от референсных значений в содержании ангиотензина II в зависимости от полиморфных вариантов гена AGT (Thr174Met и Met235Thr) ЗАКЛЮЧЕНИЕ В главе четвертой представлены показатели и особенности развития ЭД, играющие ключевую роль в ее формировании у работающих, подвергающихся воздействию ртути, и у лиц с ХРИ различной степени выраженности. Учитывая полученныерезультаты,можноотметить,чтоприпроизводственном воздействии ртути у обследованных лиц наиболее выражены изменения в регуляциисосудистоготонуса,которыепроявляютсявнарушении эндотелийзависимого расслабления гладких мышц сосудов из-за уменьшенного синтеза оксида азота на фоне увеличенной продукции вазоконстрикторов (ангиотензинІІ,эндотелин-1,гистамин),имедиатороввоспаления (повышенный уровень ГЦ и hsCRP), в нарушениях липидного обмена, что может быть одними из факторов развития сосудистой патологии (рисунок 4). ПрогрессированиеЭДприХРИ,нарядусуказаннымивыше изменениями, заключается в повышении уровней серотонина, hsCRP, sVCAM- 1, и снижением содержания sICAM-1. Повышенные уровни содержания sICAM-1 у стажированных рабочих являются звеном патогенеза ЭД или сопутствующих сердечно-сосудистых заболеваний. Рисунок 4 – Критериально значимые показатели механизмов развития эндотелиальной дисфункции при воздействии ртути Корреляционные связи между биохимическимипоказателями ЭД различной направленности указывают на наличие сложных ассоциаций, образующихзамкнутуюсистемумеждуеёмаркераминаэтапедо формирования профессионального заболевания, в то время как в отдаленном периоде ХРИ наблюдается их разобщенность, особенно при наличии ССЗ. Кроме непосредственного воздействия ртути на изменение маркеров ЭД установлено ее эпигенетическое влияние на гены предрасположенности к ССЗ, которое проявляется в нарушении концентрации кодируемых генами продуктов не только у носителей неблагоприятных, но и протективных генотипов. Данный факт установлен в отношении генов эндотелина, синтазы оксида азота, а также ангиотензина. Таким образом, выявленные изменения уровня биохимических показателей ЭД являются патогенетическими факторами развития ДЭ и, как следствие,развитиясердечно-сосудистойпатологииприхроническом воздействии ртути. В соответствии с целью настоящей работы, были выявлены особенности развития и показатели ЭД, играющие ключевую роль в формировании ЭД у работающих, подвергающихся воздействию ртути, и у лиц сХРИразличнойстепенивыраженности.Былиполученыданные, характеризующие особенности изменений биохимических показателей и механизмов развития ЭД при воздействии ртути у лиц без ССЗ и с сопутствующей сердечно-сосудистой патологией при хроническом воздействии ртути, и установлена этапность изменения показателей ЭД в патогенезе ХРИ. Данные изменения составляют часть патогенеза ЭД. При этом формирование ЭД имеет значение в патогенезе сопутствующих ССЗ и ХРИ. ВЫВОДЫ 1. У стажированных работников, экспонированных ртутью, нарушение функционального состояния эндотелия характеризуется дисбалансом регуляции сосудистоготонусазасчетактивациимеханизмоввазоконстрикции (увеличение концентрации ангиотензина II и гистамина) и ослаблением вазодилятации (снижение уровня серотонина и оксида азота), а также начальными проявлениями дислипидемии. 2. Основным проявлением эндотелиальной дисфункции при хронической ртутной интоксикации без сопутствующих сердечно-сосудистых заболеваний являетсягиперпродукцияsVCAM-1.ОсобенностьюДЭприразвитии коморбидной сердечно-сосудистой патологии на фоне хронической ртутной интоксикацииявляютсяповышенныеуровнисеротонина,sVCAM-1, триглицеридов и фософолипидов. 3. Установлены особенности в изменении маркеров ЭД у лиц с ССЗ при воздействии ртути: низкий уровень серотонина и ХС ЛПВП, высокая концентрация ангиотензина II, VWF, sICAM-1, VEGF и индекса атерогенности. 4. Наличие ассоциации между экспозиционной нагрузкой и концентрацией биохимических маркеров эндотелиальной дисфункции у рабочих без диагноза профессионального заболевания, подвергшихся воздействию ртути, и у лиц с I, I-II стадией интоксикации ртутью свидетельствует о роли производственных факторов в формировании ЭД в период контакта с токсикантом, в то время как в постконтактном периоде данная связь отсутствует. 5. В случае хронического воздействия ртути, лица-носители генотипа полиморфизма Met235Thr гена AGT находятся в группе риска ранних изменений уровня ангиотензина II, а наличие неблагоприятного генотипа полиморфизма Lys198Asn гена EDN1 является фактором риска повышения содержания эндотелина-1. 6. Определение биохимических маркеров эндотелиальной дисфункции у лиц, экспонированных ртутью, имеет прогностическое (оксида азота, ангиотензин II, гистамин, индекс атерогенности, антитела к окисленным липопротеидам низкойплотности)идиагностическое(серотонин,триглицеридыи фосфолипиды) значение для обоснования производственно-обусловленной патологии. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Разработан способ прогнозирования значений индекса атерогенности у стажированныхработающихвусловияхэкспозицииртутью,который обеспечит своевременное выявление и коррекцию факторов риска раннего развитияатеросклерозаустажированныхработающих,чтобудет способствовать профилактике сердечно-сосудистых заболеваний. 2. Для научных исследований в диагностический комплекс обследования лиц, экспонированных ртутью с сопутствующими ССЗ, рекомендуется включить определение уровней серотонина, ХС ЛПВП, ангиотензина II, VWF, VEGF и индекса атерогенности.