Роль атерогенных липопротеидов в развитии дегенеративного стеноза аортального клапана

Исследование выполнено в соответствии с принципами Хельсинкской декларации по правам человека. Протокол исследования одобрен Локальным этическим комитетом ФГБУ «НМИЦ кардиологии» Минздрава России (No200 от 27.10.2014г.). Критерии включения: мужчины и женщины старше 18 лет, подписанное информированное согласие. Критерии исключения: врожденный двустворчатый аортальный клапан, ревматическая болезнь сердца в анамнезе, инфекционный эндокардит аортального клапана, онкологические заболевания, сопровождавшиеся лучевой и химиотерапией, системные заболевания соединительной ткани, хроническая болезнь почек 4 и 5 стадии. Всего было включено 313 пациентов (Рисунок 1).
Рисунок 1. Дизайн исследования. В исследование было включено 313 человек, проходивших обследования в отделениях «НМИЦ кардиологии», у 164 был диагностирован аортальный стеноз разной степени тяжести, 44 пациента без аортального стеноза и ИБС были включены в группу контроля. Пациенты с аортальным стенозом были разделены на две группы в зависимости от наличия или отсутствия ИБС. Дополнительно была введена группа сравнения, куда вошли пациенты без аортального стеноза, но с ИБС. АС – аортальный стеноз, ИБС – ишемическая болезнь сердца, «+» – наличие заболевания, «-» – отсутствие заболевания.
Общеклинические методы исследования: сбор жалоб, анамнеза, физикальное обследование.
Инструментальные методы исследования. Всем пациентам проводилась регистрация ЭКГ покоя в 12 стандартных отведениях, трансторакальная двухмерная эхокардиография и допплер-эхокардиография. Исследование проводилось по стандартному протоколу с использованием следующих методик: двухмерная эхокардиография, режим М – моde, допплер-эхокардиография (режим импульсно- и постоянно – волнового допплера), режим цветного 40 допплеровского картирования кровотока на ультразвуковых аппаратах системы “Phillips” IE 33 (Германия) и GE Vivid 7 (США) в отделе ультразвуковых методов исследования НИИ клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центра кардиологии» Минздрава России (рук. отдела – проф. М.А. Саидова). Максимальная скорость кровотока на аортальном клапане (Vmax),
средний (GPmean) и максимальный (GPmax) градиент давления на аортальном клапане, а также площадь отверстия аортального клапана (AVA) использовались с целью оценки тяжести аортального стеноза [Nishimura RA, 2017]. По показаниям проводилась коронарная ангиография.
Лабораторные методы обследования. Всем пациентам выполнено взятие венозной крови натощак из кубитальной вены. Общий клинический анализ крови выполнен на приборе Cell-Dyn 3700 (Abbott, США) в клинико-диагностической лаборатории ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии» Минздрава России (рук. – проф. Титов В.Н.). Биохимический анализ крови, включивший определение общего холестерина (ОХС), триглицеридов (ТГ), холестерина липопротеидов высокой плотности (ХС ЛВП), аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, креатинина и глюкозы выполнялся на приборе «Architect С-8000» («Abbott», США), используя тест- наборы компании «Abbott» (США) в клинико-диагностической лаборатории ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии» Минздрава России (рук. – проф. Титов В.Н.). Концентрация ХС ЛНП рассчитывалась по формуле Фридвальда: ХС ЛНП = ОХС – ХС ЛВП – ТГ/2,2 (ммоль/л). Также был рассчитан уровень корригированного ХС ЛНП (ЛНПкорр), учитывающего холестерин, входящий в состав Лп(а): ХС ЛНПкорр = ХС ЛНП – 0,3×Лп(а)/38,7 (ммоль/л), где Лп(а) — концентрация липопротеида(а) в мг/дл [Dahlen GH, 1990]. Определение концентрации аутотаксина, СРБ и Лп(а) в сыворотке крови, а также фенотипирование апо(а), выполняли в лаборатории проблем атеросклероза Института экспериментальной кардиологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии» Минздрава России (рук. – проф. С.Н. Покровский). Концентрацию аутотаксина и СРБ определяли с использованием наборов для иммуноферментного анализа («Human ENPP-2/Autotaxin», «R&D», США и «СРБ-ИФА-Бест высокочувствительный» «Вектор-Бест», Россия, соответственно). Уровень Лп(а) определяли методом иммуноферментного анализа с использованием моноспецифических поликлональных антител барана против Лп(а) человека [Афанасьева О.И. и соавт., 1995] на анализаторе «Униплан» (Россия). Фенотипирование апо(а) в образцах сыворотки крови 124 пациентов проводили методом электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях с последующим иммуноблоттингом с использованием тех же антител [Афанасьева О.И., 2010]. Согласно принятой в большинстве подобных исследований классификации, низкомолекулярным

фенотипом (НМФ) апо(а) считали образцы, имеющие хотя бы одну полосу апо(а) с подвижностью S2 и более, к высокомолекулярному фенотипу апо(а) – с подвижностью менее S2. Генотипирование было выполнено всем пациентам в лаборатории медицинской генетики Института экспериментальной кардиологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центра кардиологии» Минздрава России (рук. – д.м.н. Собенин И.А.). Взятие венозной крови проводили в пробирки S-Monovette, SARSTED, объемом 2,7 мл, содержащие ЭДТА в качестве антикоагулянта. Выделение геномной ДНК из цельной крови проводили с использованием набора реактивов «ДНК-Экстран-1», ООО «Синтол» (Россия). Определение полиморфизмов rs3798220 и rs10455872 гена LPА проводилось методом Taq-man PCR в режиме «реального времени» на амплификаторе CFX-96 «Real-Time System» фирмы Bio-Rad (США) с использованием наборов реагентов для проведения ПЦР-РВ фирмы ООО «Синтол» (Россия). Для полиморфизма rs10455872 генотип АА – «дикий» тип, генотип GG – мутантный, AG – гетерозиготный. Для полиморфизма rs3798220 генотип ТТ – «дикий» тип, СС – мутантный, ТС – гетерозиготный.
Статистические методы исследования. Статистический анализ был выполнен с помощью пакета «MedCalc» (MedCalc, Mariakerke, Belgium). Применялись стандартные методы статистического анализа: тесты Колмогорова-Смирнова, Манна-Уитни, Краскела-Уоллиса, t-критерий Стъюдента, точный критерий Фишера, расчет отношения шансов (ОШ) с 95% доверительным интервалом (ДИ), логистической регрессии, кривые операционных характеристик. Различия считали значимыми при p<0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Атерогенные липопротеиды и аортальный стеноз В Таблице 1 представлены основные характеристики групп пациентов в зависимости от наличия или отсутствия аортального стеноза без учета сопутствующей ИБС. Сахарный диабет значимо чаще встречался у пациентов с аортальным стенозом, чем в контрольной группе, отличий по частоте артериальной гипертонии, ожирению и курению между группами не было. Концентрация ХС ЛНП, включая ХС ЛНПкорр, скорректированный по уровню ХС, входящего в состав Лп(а), между группами не отличалась. Концентрация Лп(а) была выше у пациентов с аортальным стенозом, чем в группе без аортального стеноза (таблица 2). При построении кривой операционных характеристик, концентрация Лп(а) более 15 мг/дл предсказывала наличие аортального стеноза с чувствительностью 56% и специфичностью 75%, площадь под кривой 0,68 (0,61-0,74), p <0,001. За пороговое значение, ассоциирующееся с повышенным риском развития ССЗ, принята концентрация Лп(а) ≥30 мг/дл. Вероятность наличия аортального стеноза при данной концентрации Лп(а) и классических факторах риска атеросклероза представлены на Рисунке 2. При проведении логистического регрессионного анализа, уровень Лп(а) явился независимым от других факторов риска атеросклероза предиктором наличия аортального стеноза, наряду с полом и возрастом. Таким образом, концентрация Лп(а) была связана с наличием дегенеративного аортального стеноза вне зависимости от возраста и других классических факторов риска атеросклероза, тогда как связи между ХС ЛНП и наличием аортального стеноза не установлено. Таблица 1. Общая характеристика больных в зависимости от наличия аортального стеноза Основная группа Показатель n=164 Контрольная группа n=44 Р Мужчины 73 (45%) 24 (55%) Возраст, лет 73±10 61±17 <0,001 Курение 37 (23%) 13 (30%) ИМТ, кг/м2 29,7±4,9 28,7±4,8 Артериальная гипертония 144 (88%) 42 (96%) Сахарный диабет 50 (31%) 6 (14%) <0,05 Ожирение 65 (40%) 12 (27%) ИБС 0,31 0,33 0,24 0,18 0,16 0,16 0,61 0,71 0,16 102 (62%) 0 (0%) <0,001 ОХС, ммоль/л ТГ, ммоль/л 5,1±2,0 5,6±1,9 1,5±0,7 1,8±1,6 ХС ЛВП, ммоль/л 1,2±0,3 1,3±0,4 <0,05 ХС ЛНП, ммоль/л 3,3±1,8 3,4±1,5 ХС ЛНПкорр, ммоль/л 3,0±1,8 3,2±1,4 Липопротеид(а), мг/дл 18,5 [6,2;47,6] 8,1 [6,2;11,2] <0,001 Примечание: данные представлены как медиана [25%; 75%] для показателей с распределением отличным от нормального, для показателей с нормальным распределением – средние значения ± стандартное отклонение или абсолютное число больных (%). ОХС- общий холестерин, ТГ- триглицериды, ХС ЛВП – холестерин липопротеидов высокой плотности, ХС ЛНП – холестерин липопротеидов низкой плотности, ХС ЛНПкорр – холестерин липопротеидов низкой плотности, корригированный по уровню холестерина, входящего в липопротеид(а), ИМТ – индекс массы тела Рисунок 2. Отношения шансов наличия аортального стеноза при концентрации Лп(а) более 15 мг/дл, более 30 мг/дл и при наличии классических факторов риска атеросклероза Дегенеративный аортальный стеноз и ишемическая болезнь сердца Среди лиц с аортальным стенозом (основная группа) были выделены пациенты с (n=102) и без ИБС (n=62). В группу сравнения вошли 105 пациентов с ИБС без аортального стеноза, в контрольную группу – больные без аортального стеноза и ИБС (n=44) (рисунок 1). У больных с ИБС концентрация ХС ЛНП была значимо выше при наличии аортального стеноза, чем без него. У пациентов без ИБС концентрация ХС ЛНП не отличалась в зависимости от наличия аортального стеноза (рисунок 3). ОШ наличия аортального стеноза у пациентов без ИБС при концентрации Лп(а) ≥30 мг/дл составляет 3,86 [1,28-11,42], p <0,05, ОШ сочетания аортального стеноза с ИБС - 5,34 [1,85-14,62], p <0,01. p<0,01 Рисунок 3. Концентрация холестерина липопротеидов низкой плотности у пациентов в зависимости от наличия или отсутствия ишемической болезни сердца и аортального стеноза Примечание: АС – аортальный стеноз, ИБС – ишемическая болезнь сердца, «+» - наличие заболевания, «-» - отсутствие заболевания, данные представлены как среднее ± стандартное отклонение У больных с ИБС, имеющих поражение аортального клапана, концентрация Лп(а) была несколько выше, чем у пациентов с ИБС без аортального стеноза, но различия не достигали статистической значимости. Напротив, у пациентов без ИБС концентрация Лп(а) достоверно отличалась в группах пациентов с аортальным стенозом и без него (рисунок 4). У лиц без ИБС концентрация Лп(а) ≥30 мг/дл достоверно чаще встречалась среди пациентов с дегенеративным аортальным стенозом, при этом доля больных с повышенным уровнем Лп(а) не отличалась в зависимости от наличия или отсутствия аортального стеноза на фоне ИБС (рисунок 5). Шансы наличия аортального стеноза при концентрации Лп(а) ≥30 мг/дл у пациентов на фоне исходной ИБС и у лиц без ИБС представлена на Рисунке 5. Концентрация ХС ЛНП, ммоль/л Концентрация ХС ЛНП, ммоль/л р=0,7 p<0,05 Рисунок 4. Концентрация липопротеида(а) в зависимости от наличия аортального стеноза и ИБС Примечание: сокращения как на рисунке 3. Данные представлены как медиана [25%; 75%] Лп(а) ≥30 мг/дл Лп(а) <30 мг/дл Рисунок 5. Доля пациентов с уровнем Лп(а) ≥30 мг/дл в зависимости от наличия у них аортального стеноза и ИБС Примечание: cсокращения как на рисунке 3 Не выявлено независимой связи между концентрацией Лп(а) и наличием аортального стеноза у пациентов с ИБС. У пациентов без ИБС увеличение возраста на 1 год (ОШ 1,10 (1,05-1,16), p <0,001) и концентрации Лп(а) на 1 мг/дл (ОШ 1,03 (1,00 - 1,06), p <0,05) независимо ассоциировались с наличием аортального стеноза. Итак, значимой роли Лп(а) в развитии аортального стеноза у пациентов с уже имеющейся ИБС не выявлено. Фенотип апобелка(а) у пациентов с дегенеративным аортальным стенозом Частота аортального стеноза в группах пациентов с различным фенотипом апо(а) не отличалась (рисунок 6). При разделении пациентов с аортальным стенозом на подгруппы в зависимости от наличия ИБС, отмечено, что НМФ апо(а) чаще определяется у больных с ИБС (рисунок 7). У пациентов без ИБС НМФ апо(а) не ассоциируется с наличием аортального стеноза (ОШ 1,2 (0,5-3,0), p=0,7), в то время как, у лиц с аортальным стенозом, НМФ апо(а) связан с наличием ИБС с ОШ 2,4 (1,1-4,9), p <0,05, при сравнении с пациентами с ВМФ апо(а). Следовательно, наличие низкомолекулярного фенотипа апо(а) не ассоциируется с аортальным стенозом, но связано с наличием ИБС у пациентов с аортальным стенозом. НМФ ВМФ Рисунок 6. Частота фенотипов апобелка(а) в зависимости от наличия аортального стеноза Примечание: НМФ – низкомолекулярный фенотип апобелка(а), ВМФ – высокомолекулярный фенотип апобелка(а) Рисунок 7. Фенотипы апобелка(а) при аортальном стенозе в зависимости от наличия ишемической болезни сердца в сравнении с контрольной группой Примечание: cсокращения как на рисунке 6 Роль мутаций гена LPA при дегенеративном аортальном стенозе Для полиморфизма rs10455872, аллель G была определена как минорная, тогда как для полиморфизма rs3798220 – аллель С. Частота генотипов по данным полиморфизмам представлена в Таблице 2. Таблица 2. Частота генотипов rs3798220 и rs10455872 в зависимости от наличия аортального стеноза Вариант полиморфизма rs3798220 Наличие аортального стеноза n=164 Отсутствие аортального стеноза n=44 p TT 151 (92%) 44 (100%) 00 p=0,07 13 (8%) 0 TC CC rs10455872 АА 146 (89%) 39 (89%) Примечание: для полиморфизма rs10455872 генотип АА – «дикий» тип, генотип GG – мутантный, AG – гетерозиготный. Для полиморфизма rs3798220 генотип ТТ – «дикий» тип, СС – мутантный, ТС – гетерозиготный p=1,0 AG 18 (11%) 5 (11%) GG Доля пациентов, % В связи с малым количеством пациентов с данными мутациями, различия в группах являются недостоверными, однако имеется тенденция к ассоциации полиморфизма rs3798220 с аортальным стенозом (р=0,07). Концентрация Лп(а) была существенно выше у пациентов с гетерозиготным генотипом rs3798220 (TC) и rs10455872 (AG) (рисунок 8). p<0,001 p<0,001 Рисунок 8. Концентрация липопротеида(а) у пациентов с гетерозиготным (ТС) и диким (ТТ) генотипом rs3798220 и гетерозиготным (AG) и диким (АА) генотипом rs10455872 Примечание: данные представлены как медиана [25%; 75%] У пациентов как с гетерозиготным генотипом ТС, так и с «диким» генотипом ТТ полиморфизма rs3798220 частота низкомолекулярного и высокомолекулярного фенотипов апо(а) не различалась. Отношение шансов наличия низкомолекулярного фенотипа апо(а) у больных с гетерозиготным генотипом AG составила 3,2 (1,2-8,4), p <0,05, при сравнении с «диким» генотипом АА. Аутотаксин и маркёры воспаления при аортальном стенозе В качестве маркёров воспаления нами были использованы такие простые и доступные для определения показатели как СРБ, НЛИ и СОЭ. Среди пациентов с уровнем НЛИ выше или равном медиане распределения (≥1,75) доля лиц с аортальным стенозом составила более 90%. ОШ наличия аортального стеноза Липопротеид(а), мг/дл Липопротеид(а), мг/дл при НЛИ ≥1,75 составило 5,2 (2,3-11,6), p <0,001, при сравнении с пациентами со значением НЛИ ниже медианы распределения (рисунок 9). Рисунок 9. Частота аортального стеноза в зависимости от показателя нейтрофильно-лимфоцитарного индекса Примечание: - без аортального стеноза, - аортальный стеноз СОЭ у пациентов с аортальным стенозом (медиана 20 [7;39] мм/час) была выше, чем в контрольной группе (8 [3;20] мм/час), р <0,001. Медиана концентрации СРБ была выше у пациентов с аортальным стенозом 7,6 [3,7;15,7] мг/л против 5,2 [2,1;14,2] мг/л среди лиц без аортального стеноза, p <0,05. Частота аортального стеноза у пациентов с уровнем СРБ выше или ниже медианы представлена на Рисунке 10. p=0,4 Рисунок 10. Частота аортального стеноза в зависимости от концентрации С- реактивного белка Примечание: - без аортального стеноза, - аортальный стеноз Концентрация аутотаксина не отличалась в группах пациентов с аортальным стенозом и без него, и составила 340,0 [250,8;447,0] нг/мл и 377,0 [316,3;465,3] нг/мл, соответственно, р=0,07. Согласно результатам логистического регрессионного анализа, возраст, а также НЛИ независимо связаны с наличием аортального стеноза с поправкой на пол, артериальную гипертонию, сахарный диабет, курение, а также концентрацию Лп(а). Таким образом, нейтрофильно-лимфоцитарный индекс в отличии от концентрации аутотаксина и СРБ явился независимым маркером наличия аортального стеноза. Связь аортального стеноза с липидами, Лп(а) и факторами воспаления у пациентов в возрасте до 70 лет В связи с выявленной разницей в возрасте между основной и контрольной группой, нами также было выполнено дополнительное исследование, ограничивающее максимальный возраст пациентов с аортальным стенозом 69 годами. В результате больные основной группы (n=54) и контрольной (n=42) не отличались по возрасту, медиана составила 65 [64;66] лет и 61 [52;69] год, соответственно, p=0,3. Пациенты с аортальным стенозом чаще страдали ожирением и сахарным диабетом, чем больные контрольной группы. Медиана концентрации ХС ЛНП у пациентов с аортальным стенозом и в контрольной группе не отличалась и составила 2,9 [2,3;4,1] и 3,1 [2,3;4,0] ммоль/л соответственно (рисунок 11). p=0,9 p=0,9 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 АС+ АС- Рисунок 11. Концентрация ХС ЛНП в зависимости от наличия аортального стеноза Примечание: данные представлены как медиана [25%;75%] Концентрация ХС ЛНП, ммоль/л Концентрация Лп(а) была выше среди пациентов с дегенеративным аортальным стенозом (17,2 [11,2;36,4] мг/дл), чем в контрольной группе (8,7 [5,8;11,5] мг/дл) (рисунок 12). 40 30 20 10 5 0 p<0,01 p<0,01 АС+ АС- Рисунок 12. Концентрация липопротеида(а) в зависимости от наличия аортального стеноза Примечание: данные представлены как медиана [25%;75%] Согласно логистическому регрессионному анализу, Лп(а) явился независимым фактором риска наличия аортального стеноза с поправкой на классические факторы риска и возраст пациентов, что соответствует результатам основного исследования. Как и в основном исследовании значение НЛИ было выше в группе пациентов с аортальным стенозом, чем в контрольной (2,0±1,1 и 1,5±0,5 соответственно), p<0,001. Следовательно, результаты проведенного анализа, исключающего разницу в возрасте между пациентами с аортальным стенозом и контрольной группой, не отличаются от данных основного исследования. Липопротеид(а), мг/дл ВЫВОДЫ 1. Повышенная концентрация липопротеида(а) ≥30 мг/дл, но не уровень холестерина липопротеидов низкой плотности, ассоциировалась с наличием дегенеративного аортального стеноза на фоне ИБС с ОШ 5,3 (1,9-14,6), p=0,01, а без ИБС с ОШ 3,9 (1,3-11,4), p <0,05. 2. Встречаемость низкомолекулярного фенотипа апо(а) у пациентов с аортальным стенозом была выше при наличии ИБС, чем без нее: 51% и 29% соответственно, p <0,05. 3. Гетерозиготный генотип для полиморфизма гена LPA rs3798220 был выявлен только у 8% пациентов с аортальным стенозом, отмечена тенденция связи данного полиморфизма с наличием аортального стеноза, р=0,07. Частота гетерозиготного генотипа для полиморфизма LPA rs10455872 составила 11% и не зависела от наличия аортального стеноза. 4. Нейтрофильно-лимфоцитарный индекс ассоциирован с наличием аортального стеноза с ОШ 9,0 (2,8-28,9), p <0,001, связи концентрации С-реактивного белка и аутотаксина с аортальным стенозом не установлено. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Концентрацию липопротеида(а)≥30 мг/дл можно использовать в качестве показателя, указывающего на необходимость обследования пациентов с целью выявления дегенеративного аортального стеноза на ранних стадиях заболевания. 2. Нейтрофильно-лимфоцитарный индекс, как простой расчетный показатель, следует использовать для обоснования проведения эхокардиографии у пациентов с целью выявления аортального стеноза.