Структура и антибиотическая активность циклических липопептидов и поликетидов, продуцируемых стрептомицетами

В связи с распространением антибиотикорезистентности в последние годы растет ин- терес к изучению антимикробных препаратов, не привлекших существенного внимания при их первичном исследовании. Эти соединения могут как проявлять активность в отношении резистентных патогенов, так и служить сырьем для получения полусинтетических производ- ных. В коллекции антибиотиков Института по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе была обнаружена запаянная ампула, содержащая образец кристалломицина, выделенного бо- лее 60 лет назад, для которого структура ранее не была установлена. Образец, хранившийся при температуре 0–5°С, представлял собой рассыпчатый желтоватый порошок (Рис. 1).
Рис. 1.а — фотография ампулы, ее подписи («Кристалломицин 0,4 г 7/I-57») и содержимого; б — оф-ВЭЖХ профиль образца кристалломицина
ВЭЖХ-анализ обнаруженного образца (Рис. 1) показал смесь двух основных и несколь- ких минорных компонентов. Оба основных компонента были выделены с помощью полупрепа- ративной ВЭЖХ; было получено 5.6 мг антибиотика 1 и 17.3 мг антибиотика 2. Данные масс- спектрометрии высокого разрешения (ESI-HRMS) показали следующие значения m/z: 1304.6731 [1 + H]+; 1326.6550 [1 + Na]+; 1348.6373 [1 – H + 2Na]+; 1318.6894 [2 + H]+; 1340.6703 [2 + Na]+.
Масса соединения 1 совпала с массой аспартоцина С (по литературным данным), а масса соединения 2 — с аспартоцинами A, B (отклонение не превышает 1 ppm). Аспартоцины относятся к классу анионных липопептидов структурного семейства амфомицина. Затем кри- сталломицины исследовали с помощью различных методов 1D и 2D ЯМР-спектроскопии. От- несение сигналов с помощью подхода, основанного на комбинации двумерных спектров TOCSY, COSY, NOESY 13C-HSQC, 15N-HSQC и 3D TOCSY-13C-HSQC. Исследование пока- зало идентичность соединения 1 аспартоцину C (A-1437 B/сушимицин A), a компонента 2 – аспартоцину B (A-1437 G/сушимицин B) (Рис. 2). Была обнаружена конформационная неод- нородность кристалломицинов в растворе, обусловленная конформацями пролина, суще- ственно осложнившая анализ спектров ЯМР.
Рис. 2. Структуры компонентов антибиотика-кристалломицина
Был изучен спектр активности каждого индивидуального компонента антибиотика кри- сталломицина. Соединения 1 и 2 показали активность в отношении грамположительных бак- терий, включая метициллин- и ванкомицин-резистентные штаммы и оказались неактивны против грамотрицательных бактерий, грибов и дрожжей. Оба соединения демонстрируют за- метное повышение активности в среде, содержащей ионы кальция (1.25 мM), для 1 МИК по- нижается с 16-32 мкг/мл до 2-8 мкг/мл; для соединения 2 МИК снижается с 4-16 мкг/мл до 1- 4 мкг/мл. Такое поведение характерно для кальций-зависимых липопептидных антибиотиков, что является дополнительным подтверждением принадлежности соединений 1 и 2 к этому классу антибиотиков.
2. Установление структуры
новых нафтохиноновых макролидных антибиотиков астолидов
Ранее из почвы в Саратовской области был выделен штамм стрептомицета (идентифи- цирован как Streptomyces hygroscopicus), обладающий высокой антифунгальной активностью. В рамках данной работы было показано, что активные вещества извлекаются бутанолом и ан- тибиотическая активность ассоциирована с фракциями, соответствующими пикам с време- нами удерживания 20.7 мин и 23.4 мин на профиле HPLC (Рис. 3). В результате обогащения и очистки были получены в индивидуальном виде соединения 3 и 4 в виде аморфных твердых соединений.
Рис. 3. Профиль оф ВЭЖХ астолидов А (3) и В (4)
Индивидуальные компоненты культуральной жидкости наработаны и охарактеризо- ваны на основании физико-химических и спектральных данных. Данные масс-спектрометрии высокого разрешения показали, что брутто-формулы соединений 3 и 4 C82H13O29 и C82H13O30, соответственно. Также были установлены физико-химические характеристики изучаемых со- единений:
3 —  2 5 -49.7 (c 0.2, MeOH); УФ (MeOH) λmax (log ε) 205 (4.26), 254 (4.11), 337 (2.88) нм; D
ИК νmax 3421, 2931, 1728, 1709, 1666, 1603 см-1;
4 —  2 5 -6.7 (c 0.2, MeOH); УФ (MeOH) λmax, нм (log ε) 05 (4.26), 254 (4.11), 337 (2.88);
ИК νmax 3412, 2931, 1728, 1709, 1666, 1603 см-1.
Анализ данных ЯМР показал, что изучаемые антибиотики принадлежат к структурному
семейству нафтохиноновых полиольных макролидов (Рис. 4). Для установления пространствен- ного строения этих соединений были применены различные методы 1D и 2D ЯМР. Сравнение стереохимических особенностей и биосинтетических кластеров сходных нафтохиноновых мак- ролидов, включая обнаруженные немного позже каниферолиды А и В, позволило установить абсолютные конфигурации всех представителей семейства, в том числе и астолидов.
D
Рис. 4. Структура астолидов
Астолиды А, B проявили выраженную антифунгальную активность (0.6–5.1 мкМ) в от- ношении тест-штаммов грибов и дрожжей, в то время как для их ближайших структурных аналогов (PM100117 и PM100118) такой активности не сообщалось. В то же время астолиды проявляют и относительно высокую цитотоксичность без заметной селективности в отноше- нии клеток млекопитающих (IC50=0.7–3.4 мкМ в отношении линий опухолевых клеток K562, HCT116 и постнатальных фибробластов человека).
3. Выделение и изучение 20-членных макролидов структурного семейства ирумамицина
Следующим объектом исследования стал оригинальный штамм-продуцент Streptomy- ces sp. ИНА-Ac-5812, проявляющий выраженную антибактериальную и антифунгальную ак- тивность. Антифунгальные свойства оказались обусловлены гидрофобными макролидными антибиотиками.
3. 1. Выделение, очистка и разделение смеси антифунгальных макролидов, yстановление структуры и пространственного строения макролидов
на основании данных ЯМР
Активные соединения были выделены экстракцией этилацетатом и очищены с помо- щью хроматографии на Sephadex LH-20 с последующей препаративной ВЭЖХ на обращенно- фазовом сорбенте (силанизированный силикагель C2). Были выделены три соединения: два основных компонента 5 и 6, и один минорный компонент 7 (Рис. 5).
Рис. 5. Профиль ВЭЖХ антифунгальной фракции после обогащения с помощью Sephadex LH-20
Рис. 6. Структуры ирумамицина 5, его изомера 7 и аналога X14952B 6. Оранжевым пунктиром отмечены фрагменты, конфигурация которых была установлена в рамках данной работы
Данные масс-спектрометрии высокого разрешения (ESI HRMS) показали, что соедине- ния 5 и 7 имеют одинаковый состав, совпадающий с антифунгальным антибиотиком ирума- мицином (C41H65NO12), в то время как компонент 6 имеет брутто-формулу C42H69NO12. Был получен полный набор ЯМР-спектров для всех трех этих соединений. Детальный анализ этих данных и сравнение с опубликованными спектрами показали, что основной компонент смеси 5 идентичен ирумамицину, а соединение 6 представляет собой ранее описанный антибиотик X-14952B. Третий компонент смеси 7, имеющий ту же молекулярную формулу, что и ирума- мицин, оказался новым, отличающимся от ирумамицина 5 размером цикла (Рис. 6). Подроб- ный анализ данных ЯМР позволил установить конфигурации стереоцентров 3, 7, 23, 24 иру- мамицина, ранее не описанные в литературе. Стереоконфигурацию изоирумамицина не уда- лось установить надежно из-за малого количества вещества.
3. 2. Биосинтез антибиотиков семейства ирумамицина
Для подтверждения стереоконфигурации хиральных центров ирумамицина и изучения его биосинтеза, был исследован биосинтетический генный кластер (biosynthetic gene cluster, BGC), предположительно ответственный за биосинтез этих соединений (Рис. 7).
Рис. 7. Предполагаемый путь биосинтеза антибиотика ирумамицина, доменная архитектура Iru PKS 8

Полногеномная последовательность штамма продуцента Streptomyces sp. INA-Ac-5812 была проанализирована с помощью программы AntiSMASH, обнаружен генный кластер, включающий гены, кодирующие поликетидсинтазу (PKS) I типа, и предположительно ассо- циированный с биосинтезом ирумамицина. Путь биосинтеза ирумамицина и родственных со- единений был предложен на основании in silico анализа модульной организации PKS и исходя из предположительного выполнения правила коллинеарности модульных PKS (Рис. 7а). Точ- ные границы биосинтетического генного кластера ирумамицина (Iru BGC) пока не известны, и для их установления требуются дополнительные эксперименты. Анализ последовательности позволил нам установить доменную архитектуру модульной PKS, включающей 12 модулей (Рис. 7б).
На схеме приведен биосинтез на примере образования ирумамицина 5; биосинтез дру- гих обнаруженных соединений может быть обусловлен особенностями замыкания с помощью TE-домена (для изоирумамицина 7) и гибкой субстратной специфичностью AT-домена модуля M1 (для X14952B 6).
Анализ доменной архитектуры Iru PKS указывает на ряд особенностей биосинтеза иру- мамицина. В том числе наблюдается аномалия субстратной специфичности ацилтрасфераз- ного домена в модуле M8. С точки зрения анализа последовательности, AT-домен модуля M8 представляет собой типичный домен с метилмалонатной субстратной специфичностью, кото- рый должен приводить к появлению метильной группы в положении С10. Тем не менее соот- ветствующих продуктов обнаружено не было, что говорит о нарушении предсказанной специ- фичности домена. Кроме того, ацилтрансферазный домен модуля M12 не содержит каталити- ческого центра, что говорит о том, что последний модуль Iru PKS не является элонгирующим. Поэтому для получения поликетидной цепочки требуемой длины предполагается механизм «заикания» предыдущего модуля.
Особенный интерес представляет тот факт, что в молекуле ирумамицина наблюдается смещение двойной связи, относительно встраиваемой классической поликетидсинтазой I типа (двойная связь наблюдается в положении С5-С6 вместо ожидаемого С4-С5), что говорит о наличии уникальной каталитической активности ферментов Iru BGC. Также необычным явля- ется формирование С23-С24-эпоксида, который образуется не из алкена, а из насыщенного поликетида с гидроксильной группой. Интересно, что при образовании родственного полике- тида X14952B 6, эпоксидирования не наблюдалось и был выделен исключительно продукт 6 с гидроксильной группой в положении 23.
Было подтверждено, что абсолютная конфигурация, предсказанная исходя из типов ке- торедуктазных доменов, полностью согласуется с установленной ранее на основании данных ЯМР-спектроскопии (Рис. 8).
Рис. 8. Сравнение абсолютной конфигурации и структуры агликона ирумамицина, предсказанной на основании биосинтеза (а) и известной ранее из ЯМР-исследований (б). Кеторедуктазные до- мены, определяющие стереохимию восстановления, отмечены синим. Следует отметить, что де- скриптор конфигурации центров С24 и С7 изменяется в связи с миграцией двойной связи,глико- зилированием и образованием эпоксида в конечной структуре
3. 3. Биологическая активность и механизм действия 20-членных макролидов Антибиотическая активность выделенных индивидуальных компонентов 5 и 6 в отно- шении ряда тест-штаммов микроорганизмов коррелирует с опубликованными данными. Ан- тифунгальные свойства изоирумамицина 7 оказались менее выраженными, чем у ирумами- цина 5, в отношении A. niger и F. oxysporum. Это свидетельствует о важности размера цикла выделенных соединений для свойств антибиотиков. В отношении остальных тест-культур все
три соединения проявили низкую активность.
Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) ирумамицина 5, X-14952B 6
и изоирумамицина 7 в отношении различных микроорганизмов
Микроорганизм Aspergillus niger ATCC 16404
Fusarium oxysporum VKM F-140 Candida albicans ATCC 14053 Cryptococcus humicolus ATCC 9949 Saccharomyces cerevisiae INA S-1 Bacillus subtilis ATCC 6633 Staphylococcus aureus ATCC 21027 Escherichia coli ATCC 25922
Ирумамицин 5 1–3
5 21–42 21–42 42 21 >42 >42
МИК, мкМ X-14952B 6
10–20 >41 41 41 >41 20–41 >41 >41
Таблица 1
Изоирумамицин 7 21–42
>42 42 42 >42 42 >42 >42
Были также получены цитотоксические характеристики выделенных соединений (Таб- лица 2) в отношении опухолевых и нормальных клеток. Все соединения показали умеренную или низкую цитотоксичность без существенной селективности. Интересно, что изомерия мак- ролактонного кольца не повлияла на взаимодействие соединения с клеточными линиями: иру- мамицин 5 проявляет цитотоксичность, близкую к таковой для изоирумамицина 7.
Таблица 2
Цитотоксичность (IC50) ирумамицина 5, X-14952B 6 и изоирумамицина 7
в отношении нескольких линий опухолевых клеток и постнатальных фибробластов человека
Клеточная линия
Ирумамицин 5 10.8±1.3 14.5±1.7 5.5±0.8 8.5±1.3
IC50, мкМ X-14952B 6
10.0±1.4 17.5±1.9 4.5±0.5 15.0±1.8
Изоирумамицин 7 11.0±1.5 18.7±1.9 4.5±0.5 14.0±1.4
HCT-116 MCF-7 K-562 HPF
Чтобы проверить гипотезу о том, что ирумамицин является ингибитором митохондри- альной АТФазы из грибов (как некоторые родственные 20-членные макролиды и олигоми- цин), были выделены субмитохондриальные частицы из Saccharomyces cerevisiae и проанали- зировано ингибирование АТФазы ирумамицином 5 по сравнению с олигомицином и X14953B 6. Действительно, было обнаружено, что IC50 всех трех соединений очень близки (ирумамицин — 0.067±0.02 мкМ, X14953B — 0.05±0.01 мкМ, олигомицин — 0.05±0.02 мкМ), что указывает на то, что ирумамицин и X14953B являются мощными ингибиторами дрожже- вой F1FO-АТФазы.
4. Выделение и установление структуры компонентов липогликопептидного антибиотического комплекса гауземицинов
Первичный скрининг выявил, что оригинальный штамм-продуцент Streptomyces sp. ИНА-Ac-5812 ВКПМ Ас1980 продуцирует перспективные соединения пептидной природы с антибактериальной активностью. В результате фракционирования было обнаружено, что наиболее интересными являются компоненты, обладающие голубой флуоресценцией. Новый антибиотик был назван гауземицином (в честь Г.Ф. Гаузе — основателя Института по изыска- нию новых антибиотиков).
4. 1. Выделение, анализ компонентного состава и флуоресцентных свойств
На первых стадиях разделение осуществлялось с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ, для которой были подобраны условия, обеспечивающие наилучшее разделение четырех групп пиков (Рис. 9). Наибольшую активность проявила первая группа пиков с временем удержива- ния 10–12 мин.
Рис. 9
а — профиль аналитической обращенно-фазовой ВЭЖХ концентрата в оптимизированных условиях; б — профиль нормальнофазовой ВЭЖХ первой группы пиков с обращенной фазы
Согласно данным масс-спектрометрического анализа, эта фракция содержит три ком- понента — соединения с массами 1847, 1916 и 1930 Да. Для наработки индивидуальных ком- понентов из первой группы пиков были подобраны условия для нормальнофазовой хромато- графии, при котором наблюдалось удвоение пиков каждого из соединений (Рис. 9). что может быть связано с наличием различных конформеров, взаимопревращение которых затруднено. Удалось выделить и наработать для структурной характеристики два компонента смеси с мас- сами 1847 Да и 1916 Да, названные гауземицинами А, B (8, 9) соответственно.
В результате исследования компонентного состава антибиотика было обнаружено, что индивидуальные соединения имеют пептидную природу и обладают собственной флуоресцен- цией. Для выяснения природы этой флуоресценции был изучен аминокислотный состав анти- биотика. Гидролиз антибиотического комплекса проводили по стандартному методу для гид- ролиза пептидов (нагрев в 6M HCl в запаянной ампуле при 110°С в течение 120 ч), флуорес- центная фракция была выделена с помощью препаративной ТСХ и оф-ВЭЖХ, что позволило получить флуоресцентную аминокислоту в индивидуальном виде. Масс-спектр высокого раз- решения этого соединения показал, что оно имеет точную массу 243.0536 Да и состав C10H11ClN2O3. Наличие одного атома хлора в молекуле дополнительно подтверждается харак- терным изотопным распределением в масс-спектре, обусловленным природным содержанием 35Cl и 37Cl. Выделенное соединение является α-аминокислотой H2N-CHR-CO2H, поэтому оно должно содержать боковой радикал R, имеющий состав C8H7ClNO и 5 степеней ненасыщен- ности. Учитывая наличие голубой флуоресценции, предположили, что соединение имеет структуру хлорзамещенного кинуренина (Рис. 10).
Рис. 10. Структурные формулы кинуренина его хлор-замещенных аналогов
4-Хлор-L-кинуренин (L-4-ClKyn) был ранее обнаружен только в одном природном пеп- тиде – таромицине, а 4-хлор-DL-кинуренин изучался в качестве антидепрессанта (Рис. 10). Тем не менее, флуоресцентные свойства L-4-ClKyn или DL-4-ClKyn ранее не были описаны ни для синтетических, ни для природных соединений. Был синтезирован 4-DL-ClKyn, который имел идентичные с выделенным соединением физико-химические характеристики: молекулярную формулу, время удерживания на ВЭЖХ и спектр флуоресценции. Используя метод Мерфи, была определена стереоконфигурация аминокислоты, полученной из гидролизата. Синтетиче- ский рацемический 4-DL-ClKyn был использован в качестве стандартного соединения в методе Мерфи, чтобы установить абсолютную конфигурацию природного соединения. Согласно ли- тературным данным, производное D-хлоркинуренина с реагентом Мерфи L-FDAA удержива- ется на ВЭЖХ дольше, чем производное L-аминокислоты. Время удерживания производных природных и синтетических образцов 4-DL-ClKyn выявило L-конфигурацию природного со- единения.
Спектральные и фотофизические свойства синтетического 4-DL-ClKyn были изучены в различных растворителях (Рис. 11).
Рис. 11. Спектры 4-хлоркинуренина в различных растворителях:
а — UV-Vis спектр;
б — нормализованный спектр возбуждения (пунктирная линия) и спектр флуоресценции, c 5·10-5 M, λem для возбуждения 448 нм, λex для испускания 360 нм
Собственная флуоресценция хлоркинуренина имеет низкую интенсивность. Было уста- новлено, что производные перилена являются лучшим акцептором флуоресценции L-4-ClKyn, чем красители на основе BODIPY из-за частичного тушения флуоресценции последних. В пер- спективе накопленные данные о флуоресцентных свойствах L-4-ClKyn могут служить основой для создания удобных инструментов для визуализации природных пептидов, включающих эту аминокислоту.
4. 2. Установление структуры индивидуальных компонентов антибиотического комплекса
Гауземицины A, B были получены в виде твердых веществ белого цвета, и с помощью ESI HRMS было определено, что их точные массы составляют 1845.788 Да и 1916.826 Да, что соответствует молекулярным составам C84H116ClN17O28 и C87H121ClN18O29, соответственно.
12

Структуры гауземицинов A, B (Рис. 12) были определены из данных ЯМР-спектроскопии; экс- перименты проведены в DMSO-d6 при 30 и 45°C. Корректность определения состава компо- нентов подтверждена определением тонкой изотопной структуры для гауземицина B.
Рис. 12. Структуры индивидуальных компонентов антибиотического комплекса — гауземицинов A (8) и B (9)
Аминокислотный состав и предполагаемая структура подтверждались с помощью спек- тров масс-фрагментации. Метод MS/MS FTICR позволяет проверять структуру соединений с использованием CID-фрагментации родительского иона с идентификацией аминокислотной последовательности и необычных заместителей по точной массе. Предлагаемая фрагментация гауземицина B представлена ниже. Участки в пептидных связях, которые подвергаются фраг- ментации под действием CID, выделены пунктирными линиями. Ожидалась типичная картина y-фрагментации пептида.
Рис. 13. Фрагментация гауземицина B 9. X соответствует целой молекуле, Y — ее циклическому фрагменту; A, S соответствуют олефиновому и углеводному фрагментам соответственно. Пунк- тирные линии указывают места фрагментации в MS/MS
При низких энергиях обнаружено разделение циклического и линейного фрагментов. От- щепление углеводного фрагмента происходило при 10 эВ. Фрагментация циклического фраг- мента наблюдается только при высокой энергии столкновения. Расщепление цикла может проис- ходить почти по любой пептидной связи. Было обнаружено, что в основном цикл расщепляется по связи пролин-аланин (y8-y1), а дальнейшая идентификация последовательности по точной массе фрагмента и разнице масс позволила подтвердить предложенную структуру (Таблица 3).
ESI-MS/MS данные для соединения 9 (m/z, [M+2H]2+=959.41873). Фрагментация (CV = 10-40 eV) и структурное отнесение
Таблица 3
Структурное отнесение
X=[M+2H] [X-H2O] [X-S] [X-Y-y10] [X-Y-y10-H2O]
Масса фрагмента, m/z 959.41814 950.41295 893.39710 701.34925 683.33940 556.31265
538.30171
379.23335 665.32861 308.19620 1085.44421
922.38131 904.37063 851.34448 627.30942 570.28766 483.25553 426.23418
382.24483 311.20666
CV
0 еВ 10 еВ 10 еВ 25 еВ 25 еВ 25 еВ
25 еВ
25 еВ 30 еВ 30 еВ 30 еВ
40 еВ 40 еВ 40 еВ 40 еВ 40 еВ 40 еВ 40 еВ
40 еВ 40 еВ
Молекулярная формула
C87H123Cl1N18O29
C34H49N6O10 C34H47N6O9 C29H42N5O6
C29H40N5O5
C19H31N4O4 C34H45N6O8 C16H26N3O3 C48H66Cl1N12O15
Заряд, Родитель- z ский ион,
m/z
2 959.41818 2 959.41818 1
1 701.34925 1 683.33940
1 556.31265
1 556.31265 1 683.33965 1 379.23339 1 922.38131
Отщепленный фрагмент
18.01046
132.04216 C5H8O4
∆M, Да
H2O
18.00985 H2O
127.02675 C5H5NO3 [X-Y-y10-y11]
18.01094 H2O
177.07930 C10H11NO2 18.01104 H2O 71.03719 C3H5NO
[X-Y-y10-y11- H2O] [X-Y-y10-y11- y12] [X-Y-y10-2H2O] [X-Y-y10-y11- y12-y13] [Y+y10-S]
Y
Y-H2O Y-y1 Y-y1-y2 Y-y1-y2-y3 Y-y1-y2-y3-y4 Y-y1-y2-y3-y4-y5 Y-y1-y2-y3-y4- y5-CO2 Y-y1-y2-y3-y4- y5-y6
163.06390 C9H9NO2 Фрагментация циклопептидного фрагмента
C39H57Cl1N11O13 1 C39H55Cl1N11O12 1 C36H52Cl1N10O12 1
C26H43N8O10 1 C24H40N7O9 1 C21H35N6O7 1 C19H32N5O6 1
C18H32N5O4
C15H27N4O3 1
922.38131 922.38131 851.3448 627.30942 570.28766 483.25553
426.23418 426.23418
18.01068
H2O C3H5NO
71.03683
224.07548 C10H9ClN2O2
57.02176 87.03213 57.02135
43.98935
115.02752 C4H5NO3
C2H3NO C3H5NO2 C2H3NO
CO2
Дериватизация продуктов гидролиза индивидуальных компонентов по методу Мерфи позволила установить абсолютные конфигурации большинства аминокислотных остатков. 2- Амино-4-гидрокси-4-фенилмасляная кислота (Ahpb3) и гидроксиглутаминовая кислота (hGlu4) разлагались в условиях кислотного гидролиза (6M HCl, 110°C, 120 ч), другие амино- кислоты давали нормальные продукты дериватизации. D-Конфигурация была идентифициро- вана только для остатка Leu7. L-Конфигурация фрагмента арабинозы была идентифицирована с помощью мягкого кислотного гидролиза (2M TFA, 50°C, 6 ч) гауземицина A и последующего сравнения оптического вращения выделенного углеводного материала с D- и L-арабинозой.
Окончательное подтверждение структуры проводилось на основании данных ЯМР. Ха- рактерный паттерн сигналов в спектрах 2D TOCSY, NOESY и естественного содержания 15N- HSQC. Спиновые системы отдельных остатков и соответствующие типы остатков были иден- тифицированы в спектрах 13C-HSQC 2D TOCSY, COSY. Также использовалась информация из спектров 13C-HMBC и 13C-HSQC. На основании полученных данных ЯМР была обнаружена и описана конформационная неоднородность гауземицинов в растворе, обусловленная кон- формационной изменчивостью пролина.
Таким образом, было обнаружено, что гауземицины представляют собой макроцикли- ческие пептиды, содержащие 14 аминокислот, включая непротеиногенные остатки, в том числе и остатки с D-конфигурацией. Некоторые структурные мотивы в молекулах гауземицина очень редки для биологически активных природных продуктов. Гликозилирование остатка ти- розина довольно необычно для природных пептидов, и нет примеров гликозилирования пен- тозой. Сама по себе арабиноза представляет собой редкий фрагмент для природных гликопеп- тидов и в основном встречается в виде производных O-гидроксипролина. Таким образом, гли- козилирование тирозина арабинозой в гауземицинах является уникальной структурной осо- бенностью среди природных продуктов. β-Гидроксиглутаминовая кислота (hGlu4, Рис. 12) яв- ляется редкой в природных пептидах и встречается в виде различных диастереомеров. 3- Амино-4-гидрокси-4-фенилбутановая кислота (Ahpb3) и Nε-(β-аланиноил)орнитин (Orn2) (Рис. 12) ранее в составе природных пептидов не обнаруживали.
4. 3. Биосинтез гауземицинов
Изучение биосинтеза гауземицинов представляло интерес в связи с высокой структур- ной новизной выделенных соединений. Анализ генома выявил большой (68 ORF) кластер био- синтетических генов NRPS (BGC), который был назван Gau BGC (Рис. 14). Была проанализи- рована общая архитектура и сходство белков в кластере Gau, сравнив его с известными кла- стерами родственных соединений. Четыре основных гена NRPS гауземицина BGC содержат 14 модулей, ответственных за введение β-Ala1-Orn2-Ahpb3-hGlu4-Tyr5-D-Leu7 (gauA), Dab6 (gauB), аминокислоты Asp8-Gly9-Ser10-Gly11-ClKyn12 (gauC) и Ala13-Pro14 (gauD). В целом анализ доменной архитектуры Gau BGC коррелирует со структурными данными по гауземи- цинам, что подтверждает их структуру, а также содержит ряд особенностей.
Как и многие гомологичные кластеры, Gau BGC имеет специальный модуль, взаимо- действующий in trans с соответствующими дидоменом A-T (GauB), включающими остаток 2,3-диаминобутановой кислоты, участвующий в образовании макролактама. Биосинтез 2,3- Dab кодируется в геноме за пределами Gau BGC. Тем не менее, эти открытые рамки считыва- ния сходны с генами, обеспечивающими биосинтез 2,3-Dab в родственных BGC малацидина, фриулимицина и ласпартомицина.
Последний модуль в белке GauC, интегрирующий остаток 4-Cl-кинуренина, содержит домен эпимеризации, что позволяет предположить D-конфигурацию этой аминокислоты, что расходится с предыдущими данными. Не было обнаружено производного Мерфи, соответ- ствующего D-4-Cl-Kyn в спектрах LCMS дериватизата продуктов гидролиза гауземицинов ни для отдельных компонентов, ни для концентрата антибиотика. Так как домен эпимеризации обеспечивает смесь конфигураций, можно предположить, что нижележащий домен C пред- ставляет собой LCL-катализатор и избирательно реагирует с цепями, заканчивающимися хло- рированным кинуренином в L-конфигурации, обеспечивая наблюдаемый стереохимический результат.
Рис. 14
а — фрагмент предсказанного Gau BGC (Orf1–Orf62) с некоторыми из предложенных функций; б — модульная архитектура линии сборки гауземицина NRPS и предлагаемый биосинтез (на примере гауземицина A 8).
A — домен аденилирования; C — домен конденсации; E — домен эпимеризации; Т — тиоляционный домен;
TE — домен тиоэстеразы. NDP указывает, что нуклеотид не может быть определен
Особенный интерес представляет биосинтез неизвестной ранее в природных пептидах аминокислоты — 2-амино-4-гидрокси-4-фенилбутановой кислоты (Ahpb3). Ahpb3 не подвер- гался хлорированию ни в одной из полученных структур, включая те второстепенные компо- ненты, которые были обнаружены с помощью масс-спектров. Следовательно, Ahpb весьма ве- роятно не является продуктом модификации триптофана. В таком случае наиболее вероятно, что предшественником Ahpb является фенилаланин и биосинтез протекает с образованием го- мофенилаланина. Чтобы подтвердить участие фенилаланина в качестве субстрата для биосин- теза гауземицинов, в культуральную жидкость при культивировании Streptomyces sp. INA-Ac-
5812 были добавляли фторированные производные фенилаланина (2-F-Phe, 4-F-Phe). Действи- тельно, анализ LCMS показал, что в молекулы гауземицинов включался один атом фтора, для каждого из компонентов наблюдалось появление монофторированного аналога (Рис. 15). Включение было проиллюстрировано появлением интенсивных ионов с m/z 932.9 и 968.4 (по сравнению с исходными значениями m/z 923.9 и 959.4), соответствующих монофторирован- ным молекулам гауземицинов A и B, соответственно. Положение включения фтора было под- тверждено с помощью фрагментации пептидов с помощью LCMS/MS. Прирост массы 19F на 18 Да наблюдался в ионе фрагмента FA-βAla1-Orn2(βAla)-[F]Ahpb3, но не в последующем фрагменте FA-βAla1-Orn2(βAla).
Рис. 15. Сравнение ключевых областей масс-спектра экстракта культуральной жидкости штамма-продуцента Streptomyces sp.
а — INA-Ac-5812 при культивировании без добавок модифицированных аминокислот;
б — с добавлением в среду при культивировании фтор-фенилаланина до конечной концентрации 2 мM
4. 4. Антибиотическая активность гауземицинов
Гауземицины — это циклические липогликопептиды, похожие на анионные липопеп- тиды, но с существенно отличающейся пептидной последовательностью. Более того, гауземи- цины не содержат классического Са2+-связывающего мотива DXDG, характерного для каль- ций-зависимых антибиотиков. Было обнаружено, что при добавлении 0.45 мМ Ca2+ МИК не претерпевает существенных изменений. Гауземицины обладают выраженной активностью в отношении некоторых грамположительных бактерий (на уровне 0.25–1 мкг/мл), в том числе метициллин-резистентного Staphylococcus aureus (MRSA), но они оказались неактивными в отношении грамотрицательных бактерий и энтерококков. Интересно, что гауземицины не про- являли антибактериальной активности против как ванкомицин-резистентных, так и чувстви- тельных к ванкомицину Enterococcus sp. штаммов.
Для дальнейшей оценки клинических перспектив полученных соединений была проте- стирована активность гауземицинов против 62 клинических изолятов Staphylococcus sp., в не- которых случаях наблюдалась МИК значительно ниже, чем у гликопептидов и даже даптоми- цина (0.125–1.0 мкг/мл). Коагулазонегативные стафилококки, включая метициллин-чувстви- тельные (MSSA) и метициллин-резистентные штаммы (MRSA), также чувствительны к гау- земицину. Существенной разницы в активности гауземицинов А и В против MSSA и MRSA не наблюдалось. Цитотоксическую активность гауземицинов А и В анализировали на панели клеток млекопитающих (опухолевые клетки COLO357, EL-4, Colon26, HT-29 и нормальные клетки J774) с использованием теста МТТ. Измеренные значения IC50 (5–10 мкг/мл) были зна- чительно выше МИК, что указывает на относительно большой терапевтический индекс.
Чтобы получить общее представление о механизме действия гауземицинов, был ис- пользован подход BCP (бактериальное цитологическое профилирование) (Рис. 16). Первона- чально этот метод был разработан для штамма Escherichia coli в качестве тестового микроор- ганизма. Поскольку гауземицины неактивны в отношении E. coli дикого типа, ΔtolC E. coli и
даже мутантного штамма lptD с проницаемым внешним барьером, применяли модифициро- ванный подход с использованием в качестве тест-микроорганизма Bacillus subtilis. Тестовый штамм обрабатывали 2.5 МИК различных антибиотиков, включая ингибиторы репликации ДНК (рифампицин и ципрофлоксацин), ингибиторы биосинтеза клеточной стенки (ванкоми- цин, бензилпенициллин), ингибитор синтеза белков (хлорамфеникол), мембраноактивные со- единения (грамицидин S, даптомицин, низин) и гауземицином в течение 2 ч. В этом экспери- менте обработка гауземицином, а также мембраноактивными антибиотиками (грамицидин S, даптомицин, низин), приводила к почти полному лизису клеток с обнаружением только еди- ничных клеток с видимым разрушением мембраны (Рис. 16). При этом в случае обработки культуры другими антибиотиками были заметны характерные морфологические изменения, лизиса клеток не наблюдалось.
Рис.16. Культура Bacillus subtilis после обработки 2.5 МИК различных антибиотиков. Морфологические изменения визуализировали с помощью флуоресцентных красителей (FM4-63, красный, окрашивает мембраны и DAPI, синий, окрашивает нуклеиновые кислоты). В случае мембраноактивных соединений наблюдался полный лизис культуры
Связывание с прекурсорами биосинтеза клеточной стенки, в том числе и с липидом II, приводит к накоплению последнего растворимого в цитоплазме предшественника — UDP-N- AcMur-PP. Изучено накопление этого соединения под действием гауземицина (Рис. 17). В слу- чае ванкомицина наблюдается отчетливое накопление пика с временем удерживания 29 мин по сравнению с контролем и гауземицином B. Природа детектированного вещества подтвер- ждена с помощью LCMS, масса соединения с временем удерживания 29 мин совпала с расчет- ной массой для UDP-N-AcMur-PP ([M+H]+ = 1150.4). Этот результат подтверждает выводы, сделанные из цитологического профилирования, что гауземицин не влияет на пул предше- ственников биосинтеза клеточной стенки.
Рис. 17. Профиль ВЭЖХ экстракта культуры S. aureus при обработке ванкомицином и гауземицином B. Красным отмечено время удерживания UDP-N-AcMur-PP
Таким образом, гауземицины обладают сходным механизмом действия с мембраноак- тивными соединениями, такими как даптомицин. Клетки B. subtilis обрабатывали антибиоти- ком с более низкой концентрацией (1 МИК) и визуализировали после различных периодов обработки (Рис. 18). Был использован краситель SYTOX Green, окрашивающий нуклеиновые кислоты, но не способный проходить через неповрежденную мембрану, и FM 4-64, окрашива- ющий мембраны с красной флуоресценцией. Скорость мембранной проницаемости при обра- ботке гауземицином была аналогична таковой в случае даптомицина, тогда как низин, кото- рый не только связывает молекулы липида II, но также образует мультимерные трансмембран- ные поры в комплексе с липидом II, вызывает более быстрое повреждение мембраны, что при- водит к полному лизису клеток через 60 мин после обработки. Таким образом, среди мем- бранно-активных соединений наиболее сходным с гауземицинами по кинетике оказался дап- томицин.
Рис. 18. Культура B. subtilis после обработки мембраноактивными антибиотиками в концентрации 1 МИК через указанные промежутки времени после обработки. Морфологические изменения визуализировали с помо- щью флуоресцентных красителей (FM4-63, красный, окрашивает мембраны и SYTOX Green, зеленый, окрашивает нуклеиновые кислоты, но не проникает через неповрежденные мембраны).
Было изучено влияние гауземицина B на ионную проницаемость в плоских липидных бислоях, состоящих из DOPE/DOPG (1:1) и DOPC/DOPG (1:1). Сравнение пороговых концен- траций в модельных мембранах с типичным диапазоном концентраций антибиотической ак- тивности показало, что гауземицин B нарушает целостность мембраны и формирует ионные каналы только при высоких концентрациях. Вероятно, гауземицин специфически взаимодей- ствует с какой-то молекулярной мишенью в мембранах чувствительных микроорганизмов, и это взаимодействие значительно увеличивает его порообразующую активность (снижает по- роговую концентрацию на порядок). Помимо относительно низкой порообразующей способ- ности, гауземицины обладают другим спектром активности по сравнению с даптомицином. В отличие от гауземицинов, даптомицин имеет сопоставимые МИК в отношении стафилококков и энтерококков.
ВЫВОДЫ
1. Показано, что антибиотик, продуцируемый S. griseorubens INA 00887, ранее извест- ный как кристалломицин, является двухкомпонентным и идентичен аспартоцинам B, C, что подтверждено как совпадением спектральных данных, так и схожестью биологических свойств.
2. Обнаружено, что антифунгальные вторичные метаболиты штамма S. hygroscopicus ВКПМ Ac2079 представляют собой близкие к известным макролиды, содержащие два агликона: 36-членный полиольный макролид и производное 1,4-нафтохинона, названные астолидами.
3. Наряду с известными 20-членными антифунгальными макролидами (ирумамицином и X14952B), из антифунгальной фракции продуцента Streptomyces sp. ИНА-Ac-5812 ВКПМ Ас1980 был выделен минорный компонент, названный изоирумамицином, с уменьшенным размером макролактонного цикла (18-членный цикл вместо 20-членного), который демон- стрирует снижение антифунгальной активности при сохранении цитотоксичности.
4. Выделено два принципиально новых антибиотика из культуральной жидкости штамма Streptomyces sp. ИНА-Ac-5812 ВКПМ Ас1980, названные гауземицинами, содержа- щих ряд структурных особенностей: редкие непротеиногенные аминокислоты (2-амино-4-гид- рокси-4-фенилбутановая килота, 4-Cl-кинуренин), большой экзоциклический фрагмент, угле- водный фрагмент. Особенности антимикробной активности гауземицинов говорят об ориги- нальном механизме действия этих пептидных антибиотиков.
5. In silico анализ полногеномной последовательности штамма-продуцента Streptomyces sp. ИНА-Ac-5812 ВКПМ Ас1980 выявил предполагаемые пути биосинтеза 20- членных антифунгальных макролидов семейства ирумамицина и нового пептидного антибио- тика гауземицина.