Диагностическое значение РНГА с сывороткой крови и молоком при диагностике бруцеллеза овец и коз

Исследования проводились с 2015 по 2021 гг. в лаборатории инфекционной патологии сельскохозяйственных животных Прикаспийского зонального НИВИ – филиал ФГБНУ «ФАНЦ РД», согласно утвержденным тематическим планам НИР по заданиям: «22. Молекулярно-биологические и нанобиотехнологические методы создания биопрепаратов нового поколения, технологии и способы их применения с целью борьбы с особо опасными инфекционными, паразитарными и незаразными болезнями животных» (No госрегистрации 7.721017821.11.8.001.7) и «Оптимизация методов профилактики и борьбы с наиболее распространенными и опасными хроническими инфекционными заболеваниями животных: лейкозом и туберкулезом крупного рогатого скота, бруцеллезом крупного и мелкого рогатого скота в условиях Прикаспийского региона России с применением научно- обоснованных ветеринарно-санитарных мероприятий и усовершенствованных способов диагностики» (No госрегистрации 0733-2019-0010).
При изготовлении бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для РНГА сенситин для нагрузки (сенсибилизации) стабилизированных эритроцитов извлекали из бакмассы бруцелл слабовирулентного высокоантигенного штамма B.abortus 19, выращенных на плотной питательной среде путем автоклавирования в гипертоническом 12%-ном растворе хлористого натрия, т.е. методом солевого извлечения.
Формалинизацию эритроцитов барана проводили по методу Weinbach в модификации Прикаспийского зонального НИВИ.
Исследования сывороток крови в РА, РСК, РБП, РИД с О-ПС антигеном проводили по общепринятым методикам, используя биофабричные антигены.
ИФА ставили с применением тест-системы производства фирмы ООО «Сиббиотест» на базе ГБУ «Крапоткинская краевая ветеринарная лаборатория» Краснодарского края, с участием автора диссертации.
Для изучения диагностического значения РНГА с испытуемым эритроцитарным диагностикумом исследовали сыворотки крови 6234 овец и коз разного возраста благополучных и неблагополучных по бруцеллезу хозяйств, а также 14 сывороток крови овце- и козематок, абортировавших на почве бруцеллеза, 41 сыворотку крови племенных баранов, положительно реагирующих в РДСК на инфекционный эпидидимит, пробы молока от 615 овец и коз благополучных и 443 овец и коз – неблагополучных по бруцеллезу хозяйств, а также молоко от абортировавших и свежеинфицированных 11 овец и коз.
2.2 Результаты исследований по разработке способа изготовления бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для РНГА
Диагностическое значение РНГА при бруцеллезе овец и коз начали изучать с применения эритроцитарного диагностикума, изготовленного по способу, разработанному Прикаспийским зональным НИВИ, ВГНКИ и ВНИИБТЖ – метода, обладающего высокой диагностической эффективностью при бруцеллезе животных, по сравнению с широко применяемыми в практике традиционными диагностическими тестами – РА, РСК, РБП.
Однако, в процессе работы по испытанию РНГА и изготовлению эритроцитарного диагностикума возникла непредвиденная проблема. Вскоре после развала Советского Союза Новочеркасский завод синтетических продуктов (НЗСП) – единственное в стране предприятие – производитель детергента – «Прогресс», необходимого для изготовления эритроцитарного диагностикума, был закрыт из-за банкротства и производство препарата «Прогресс» было прекращено.
В результате проведенной поисковой работы, нами установлена возможность замены препарата «Прогресс» НЗСП отечественными поверхностноактивными средствами: концентрированным поверхностно активным универсальным моющим средством «Прогресс», производства ООО «АМС Медиа» (г. Лосино-Петровский Московской области), в сочетании с препаратом додецилсульфатом натрия.
При сочетанном применении в оптимальных концентрациях для обработки суспензии бруцелл указанных детергентов и последующей сенсибилизации этой композицией формалинизированных эритроцитов не только улучшалось экстрагирование из бруцелл антигенных комплексов, как это было показано С.Г. Хаировым и А.А. Шахбановым (2001), но и повышались адсорбционные свойства эритроцитов, в связи с чем происходило полное насыщение рецепторов эритроцитов антигенными комплексами бруцелл, в результате чего повышалась активность диагностикума (таблица 1).
Таблица 1 – Результаты проверки активности и специфичности диагностикума, изготовленного путем обработки суспензии бруцелл новыми детергентами
Количество антигена на 1мл 10% взвеси формалиниз ированных эритроцито в
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Титры РНГА со стандартным образцом сыворотки
антибруцелла абортус
с негативной сывороткой
– – – – – – – – – – – – – – –
1:200
1:400
1:800
1:1600
1:3200
1:50
1:100
1:200
++++ ++++
++++ ++++
++++ ++++
++++ ++++
++++ ++++ ++++ ++++ ++
+++ ++ – ++++ +++ – ++++ ++++ + ++++ ++++ ++
Как видно из данных, приведенных в таблице 1, вновь изготовленный диагностикум обладал специфичностью и высокой активностью, имел титр со стандартной сывороткой 1:1600 ++++, что соответствует требованиям ТУ.
В процессе работы по изготовлению диагностикума нами установлено, что оптимальными концентрациями, обеспечивающими получение специфичного и высокоактивного диагностикума являются: для средства «Прогресс» – 4,0-4,5%, додецилсульфата натрия – 0,2-0,25% к объему 70-80 миллиардной (в 1 мл) взвеси бруцелл в 12%-ном гипертоническом растворе хлористого натрия. Из методов стабилизации эритроцитов наиболее простым и позволяющим получить высокоактивный препарат, при его серийном производстве, как показали наши исследования, является способ формалинизации эритроцитов, предложенный Вайнбах в модификации Прикаспийского зонального НИВИ.
Что касается режима сенсибилизации эритроцитов, то наши исследования показали, что адсорбция антигена (сенситина) формалинизированными эритроцитами происходит наиболее интенсивно при более высокой температуре (45-50о С), что позволяет уменьшить время сенсибилизации эритроцитов с 16-18 до 2-х часов.
Немаловажное значение для получения высокоактивного и стандартного эритроцитарного диагностикума имело также применение сенситина в оптимальной дозе, которую следует определять путем титрации сенситина с использованием стандартного образца сыворотки антибруцелла абортус.
Таким образом, в результате проведенных исследований нами были определены основные технологические решения, позволяющие получить высокочувствительный эритроцитарный диагностикум для РНГА.

2.3 Результаты контрольных испытаний вновь изготовленного эритроцитарного диагностикума для РНГА, в сравнении с эритроцитарным
диагностикумом, изготовленным по известному способу
При контрольной проверке с применением стандартного образца сыворотки антибруцелла абортус было установлено, что эритроцитарный диагностикум, изготовленный с сочетанным применением новых детергентов, обладал такой же активностью, как эритроцитарный диагностикум, получаемый по известному способу Прикаспийского зонального НИВИ, ВГНКИ и ВНИИБТЖ, с применением поверхностно-активного средства «Прогресс» НЗСП. Активность обоих диагностикумов при исследовании в РНГА стандартного образца сыворотки антибруцелла абортус обеспечивал титр 1:1600 с интенсивностью в 4 креста, что соответствует требованиям, утвержденным ТУ.
При исследовании негативной сыворотки с обоими диагностикумами получена отрицательная РНГА, что свидетельствует о специфичности показаний диагностикумов.
Оба диагностикума были испытаны нами для исследования в РНГА, в сравнении с РА, РСК, РБП, РИД, сывороток крови 52 овец и коз из неблагополучного по бруцеллезу хозяйства. При этом с применением обоих диагностикумов получили одинаковые результаты. Испытуемый новый диагностикум, так же как диагностикум, изготовленный по известному способу, при использовании для постановки РНГА выявил всех животных, положительно реагирующих на бруцеллез в широко применяемых в ветеринарной практике серологических реакциях (РА, РСК, РБП, РИД с О-ПС антигеном).
С применением нового способа предприятие ООО «Ветмедсервис», созданное на базе Прикаспийского зонального НИВИ, изготовило в 2017 и 2018 гг. 771 и 710 «Наборов для серологической диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА)». Результаты испытания Наборов с целью контроля их качества были одобрены Отделом сертификации ФГБНУ «ВГНКИ» с выдачей Декларации о соответствии, что дает право для их реализации и практического применения. Все Наборы были использованы ветеринарными лабораториями Республики Дагестан и некоторых других субъектов РФ, рекламаций на них не поступило.
Таким образом, в результате проведенных исследований нами был разработан способ изготовления высокоактивного специфичного и стандартного эритроцитарного диагностикума для РНГА, не отличающегося от диагностикума, получаемого по известному способу Прикаспийского зонального НИВИ, ВГНКИ и ВНИИБТЖ. На способ изготовления диагностикума получен патент на изобретение (RU 2667121 от 31.10.2016).
2.4 Результаты изучения диагностического значения РНГА с сывороткой крови и молоком при бруцеллезе овец и коз
2.4.1 Испытание эффективности РНГА с сывороткой крови, в сравнении с РА и РСК, для диагностики бруцеллеза овец и коз
Специфичность РНГА с применением изготовленного в лабораторных условиях испытуемого эритроцитарного диагностикума изучали путем
исследования на бруцеллез, в сравнении с РА и РСК, сывороток крови 323 овцематок, 165 ярок и 129 племенных баранов из благополучных по бруцеллезу хозяйств и 14 проб сывороток крови племенных баранов, положительно реагирующих в РДСК на инфекционный эпидидимит.
Ни в одном случае положительно или сомнительно реагирующих в РНГА на бруцеллез животных, так же как и по другим диагностическим тестам, не выявлено, что свидетельствует о специфичности РНГА с применением изготовленного нами в лабораторных условиях эритроцитарного диагностикума.
С целью изучения диагностического значения РНГА в одном неблагополучном по бруцеллезу хозяйстве (ЛПХ Кизилюртовского района РД) со свежезанесенной инфекцией, вскоре после регистрации первых случаев абортов исследовали сыворотки крови от 776 овцематок (таблица 2).
Таблица 2 – Результаты испытания РНГА, в сравнении с РА и РСК, для исследования сывороток крови овцематок неблагополучного по бруцеллезу хозяйства
РНГА РА, МЕ РСК
титр к-во отр 25 50 100 пол сом отр отр 635 635 – – – – – 635
РА+РСК пол сом отр 635
1:25 28 12 16 – – 2 3 23 2 16 10
1:50 46 24 12 10 – 3 3 40 13 8 25 1:100 32 18 8 5 1 8 5 19 18 4 10 1:200 15 2 3 7 3 14 1 – 15 – – 1:400 20 4 2 6 8 19 1 – 20 – – В т.ч.
пол113 40 46 68 %14,5 5,1 5,9 8,7 сом28 41 13 28
Всего 776 776 776 776
Как видно из приведенных в таблице 2 данных, РНГА является из всех испытанных методов наиболее чувствительной диагностической реакцией. Применение её позволило выявить 14,5% больных бруцеллезом овец, тогда как с помощью комплекса РА+РСК диагноз на бруцеллез был установлен у 8,7%
животных.
С целью испытания преимущества РНГА, по сравнению с РА и РСК, для
установления этиологии абортов и выявления свежеинфицированных бруцеллезом овец, были исследованы сыворотки крови 6 абортировавших вскоре после заноса в хозяйства возбудителя бруцеллеза и содержащихся с ними в одной отаре 24 нормально объягнившихся маток одной племенной овцеводческой бригады. При этом у 5 маток из 6 абортировавших и у 2-х из 24 нормально объягнившихся, получена положительная РНГА в титрах 1:100 – 1:800; положительно в РА реагировало 4, сомнительно – 3 овцематки. Положительная РСК получена у 5 овцематок. Эти данные свидетельствуют о преимуществе РНГА перед другими реакциями при исследовании на бруцеллез абортировавших и свежеинфицированных овцематок.

На этой же овцеводческой ферме в РНГА, в сравнении с РА и РСК, были исследованы сыворотки крови 318 племенных баранов (таблицы 3).
Таблица 3 – Результаты исследования сывороток крови племенных баранов неблагополучного по бруцеллезу хозяйства в РНГА, РА, РСК
Исследовано проб
РНГА РА РСК РА+РСК
пол. сом. пол. сом. пол. сом. пол. сом. 17 9 4 4 8 2 10 3
318
% 5,3 1,8 2,5 3,1
Из приведенных в таблице 3 данных видно, что наиболее эффективной из испытанных диагностических тестов является РНГА, которая выявила дополнительно к комплексу РА+РСК 7 положительно реагирующих на бруцеллез баранов, наименее чувствительным методом диагностики оказалась РА, с помощью которой бруцеллез установлен только у 4-х баранов.
В другой неблагополучной по бруцеллезу отаре в РНГА, в сравнении с РА и РСК, исследовали сыворотки крови 946 овцематок и ярок (таблица 4).
Таблица 4 – Результаты исследования на бруцеллез сывороток крови овцематок и ярок различными методами диагностики
Исследовано проб 946
РНГА РА РСК РА+РСК пол. сом. пол. сом. пол. сом. пол. сом.
85 5 17 18 45 3 46 14 100% 9,0% 1,8% 4,7% 4,8%
Из таблицы 4 видно, что РНГА выявила на 4,2 % больше реагирующих на бруцеллез овец, чем РА и РСК, вместе взятые.
Пробирочная РА, по сравнению с РНГА, недовыявила 68 больных бруцеллезом овец, что составляет 7,1% от числа исследованных животных.
Результаты изучения диагностического значения РНГА с применением испытуемого эритроцитарного диагностикума дают основание рекомендовать широкое применение этой реакции для раннего и более полного выявления зараженных бруцеллезом овец и коз и контроля благополучия овцеводческих хозяйств по бруцеллезу.
Что касается диагностического значения пробирочной РА, то проведенные исследования показали, что эта реакция является наименее чувствительным и малопригодным для практического применения методом диагностики бруцеллеза.
2.4.2 Результаты испытания РНГА с сывороткой крови для диагностики бруцеллеза овец и коз, в сравнении с Роз-бенгал пробой (РБП)
С применением РНГА и РБП на бруцеллез исследовали, в сравнении с РА и РСК, сыворотки крови 210 овцематок, 165 ярок, 129 племенных баранов благополучных по бруцеллезу хозяйств, а также 27 плембаранов, больных инфекционным эпидидимитом. Со всеми сыворотками во всех реакциях получены отрицательные результаты, что свидетельствует о специфичности показаний испытанных реакций.
Поскольку РБП, по данным многих отечественных и зарубежных исследователей (М.И. Искандаров, 2009; Л.В. Дегтяренко, 2011; Д.М. Мирзоев,

2012; С.А. Расулов, 2018; D.G. Croft, 1972; W.I. Brinlay – Morgan, 1974; M.J. Ductoroy, 2017;), улавливает в сыворотке крови животных специфические антитела, в большинстве случаев, в более ранние сроки после заражения бруцеллезом, чем традиционные серологические реакции, нами впервые была испытана эта реакция, в сравнении с РНГА с применением изготовленного предприятием ООО «Ветмедсервис» с нашим участием эритроцитарного диагностикума и в РА и РСК, для установления этиологии абортов и выявления свежеинфицированных бруцеллезом овец и коз.
С этой целью в РНГА, РБП, РА и РСК на бруцеллез были исследованы сыворотки крови 8 абортировавших овцематок и 3-х коз, а также 32 нормально объягнившихся овце-, козематок, содержащихся с ними в одной отаре с остропротекающей инфекцией и высокой зараженностью животных бруцеллезом. При этом РНГА выявила специфические бруцеллезные антитела у всех абортировавших и 4-х нормально объягнивших овец и коз. Эта реакция позволила установить этиологию абортов у всех абортировавших и выявить 4-х свежеинфицированных бруцеллезом овец и коз (из 32 гол.)
Второе место по количеству выявленных бруцеллезных животных среди абортировавших и нормально объягнившихся овец и коз занимала РБП.
В неблагополучном по бруцеллезу хозяйстве, где была зарегистрирована острая вспышка бруцеллеза, сопровождавшаяся массовыми абортами, в РНГА, в сравнении с РБП и другими серологическими реакциями (РА, РСК), были исследованы сыворотки крови 580 овцематок (таблица 5).
Таблица 5 – Результаты испытания РНГА для диагностики бруцеллеза овец, в сравнении с РБП и другими серологическими реакциями, в остром очаге бруцеллезной инфекции
РНГА РБП титр кол
1:25 26 24
1:50 52 40 1
1:100 21 14 1:200 18 12 2 1:400 27 20 1:800 11 8
РА+РСК
5 2 7 5 1 12 6 4 6 28 7 1 2 4 3 9 18 64622410 18 7117219 25 254 10 11
РА,МЕ РСК
25 50 100 200 1:5 1:10 1:20 1:40
1:160063 6 66
Итого 161 121 3 27 22 23 21 14
пол 135 121 % 23,2 20,8
сомит. 26 отриц. 419 459
Всего 580 580
Проведенный сравнительный анализ результатов исследований показал, что
все овцы как с положительными, так и сомнительными показаниями РА, РСК, РБП, реагируют и в РНГА. Вместе с тем, РНГА выявила дополнительно к
13 108
60 114 114 19,6
72 12.4 3 505 580
18,6 – 472 580
3 463 580

РА+РСК – 21 (3,7%), РБП – 14 (2,4%) положительно реагирующих на бруцеллез овец.
С помощью Роз-бенгал пробы бруцеллез установлен у 121 (20,8%) овцематки и эта реакция уступила по количеству выделенных больных бруцеллезом овец только РНГА. Исследования подтвердили высокую чувствительность РБП и пригодность её для диагностики бруцеллеза у мелкого рогатого скота.
2.4.3 Испытание РНГА с сывороткой крови для диагностики бруцеллеза у овец и коз, в сравнении с РИД с О-ПС антигеном
По имеющимся данным, мнения исследователей (В.М. Чекишев, 1993; П.К. Аракелян, 1996; Л.В. Дегтяренко, А.А. Новицкий и др. 2002; Н.А. Морозова, 2002; С.Г. Хаиров, 2007; Е.Г. Бондарев, 2017 и др.) в отношении диагностического значения РИД с О-ПС антигеном расходятся и несмотря на это, ветеринарные лаборатории продолжают широко применять её в своей работе, особенно для дифференциации поствакцинальных реакций у крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма 82 от реакций зараженного бруцеллезом.
Учитывая, что объективная оценка широко применяемых в ветеринарии методов диагностики бруцеллеза имеет большое научное и практическое значение, нами проведены специальные исследования по изучению диагностического значения РИД с О-ПС антигеном, в сравнении с РНГА и другими официально принятыми серологическими реакциями, при бруцеллезе мелкого рогатого скота.
С этой целью исследовали сыворотки крови 600 овцематок неблагополучной по бруцеллезу отары, ЛПХ Ногайского района, где была зарегистрирована острая вспышка бруцеллеза, сопровождавшаяся массовыми абортами и высокой заболеваемостью маток (таблица 6).
Таблица 6 – Результаты испытания РНГА для диагностики бруцеллеза овец и коз, в сравнении с РИД и другими серологическими реакциями, в остром очаге бруцеллезной инфекции
РНГА титр кол-
во 1:25 26 1:50 62 1:100 26 1:200 23 1:400 27 1:800 11
РИД РА,МЕ РСК РА+ 25 50 100 200 400 1:5 1:10 1:20 1:40 РСК
3 1 1
2 2
11 8
7 4 6 33 3920 4 10 23 22126 2531 1011
5 1 12 6 71 35 6 4 7 2 2 71161
1:1600 6 4
Итого 225 30 3 27 22 18 6 22 15 13 62 126
в т.ч.
пол. 155 30 73 112 126
2 4 6 6
% 25,8 5,0 12,0 18,7 21,5

РНГА РИД тирт кол-
во сомн. 26 –
отриц. 419 570 Всего 600 600
Продолжение
РА,МЕ РСК РА+
25 50 100 200 400 1:5 1:10 1:20 1:40 РСК
3 – 3 524 488 471 600 600 600
Проведенный сравнительный анализ результатов исследований (таблица 6) показал, что все овцы как с положительными, так и сомнительными показаниями РА, РСК и РИД, реагируют и в РНГА и эта реакция выявляет дополнительно к РИД 125 (20,8%), РА+РСК – 29 (4,8%) положительно реагирующих на бруцеллез овец. Вместе с тем, РИД с О-ПС антигеном, по сравнению с РНГА, недовыявила 125 больных бруцеллезом овец. Причем, отрицательные результаты РИД с О-ПС антигеном были получены с сыворотками крови 17 овец, реагировавших в РНГА в титрах 1:400-1:1600 и одновременно в РСК – 1:40, а также 23-х овец, реагировавших в РНГА 1:200 и РСК в высоких титрах (1:20 – 1:40), т.е. даже в тех случаях, когда животные заболели острым бруцеллезом в генерализованной форме и инфицированность животных возбудителем бруцеллеза не вызывает сомнений.
Таким образом, проведенные исследования показали непригодность использования РИД с О-ПС антигеном в качестве метода диагностики бруцеллеза овец.
2.4.4 Диагностическое значение РНГА с сывороткой крови при бруцеллезе овец и коз, в сравнении с ИФА
Учитывая высокую диагностическую эффективность ИФА и РНГА при бруцеллезе, нами проведены специальные исследования по сравнительному испытанию этих диагностических тестов при бруцеллезе овец и коз.
Для изучения специфичности РНГА с испытуемым эритроцитарным диагностикумом и ИФА с применением тест-системы производства Сиббиотест под контролем РА, РСК, РБП и РИД были исследованы сыворотки крови 50 овец и коз из благополучного по бруцеллезу хозяйства.
По всем реакциям получены отрицательные результаты.
С целью выявления естественного бруцеллеза, РНГА, в сравнении с ИФА, была испытана для исследования сывороток крови 54 голов мелкого рогатого скота одного неблагополучного по бруцеллезу фермерского хозяйства (таблица 7).
Таблица 7 – Результаты испытания РНГА, в сравнении с ИФА, для исследования на бруцеллез сывороток крови мелкого рогатого скота неблагополучного по бруцеллезу хозяйства
П/П к-во Результаты исследования
No овец РНГА ИФА РА, РСК РБП РИД
1:25 1:50 1:100 1:200 1:400 МЕ
1 1 # # # +++ ++ сом. – 1:5 пол. – 2 1 # # +++ ++ – сом. – 1:5 – – 3 1 # # +++ ++ – сом. – 1:20 пол. –

Продолжение
П/П к-во РНГА ИФА РА, РСК РБП РИД
No овец 1:25 1:50 1:100 1:200 1:400 МЕ
4 1
5 1
6 1
7 1
8 1
9 1
Итого пол. 10 2 2 7 6 1 сомн. 2 813–
отр. 42 44 51 44 48 53 Как видно из приведенных в таблице 7 данных, при исследовании на бруцеллез сывороток крови 54 овец и коз, положительная РНГА в тирах 1:50 – 1:400 получена у 10 (18,5%), сомнительная – 2-х (3,7%) голов, положительная ИФА – 2-х (3,7%), сомнительная – 8 (14,8%). Из остальных серологических реакций положительный диагноз на бруцеллез был установлен с помощью РСК – у 7 (13%), РА – 2-х (3,7%), РБП – 6 (11,1%) и РИД с О-ПС антигеном – у одной
головы (1,9%).
Всего в РНГА реагировало 12, ИФА – 10 овец и коз. Причем, из
реагировавших в РНГА 12 животных, 3 имели высокий титр гемагглютининов, тогда как из реагировавших в ИФА 10 овец в 8 случаях был сомнительный результат.
Таким образом, проведенные исследования показали, что РНГА по диагностической эффективности значительно превосходит все остальные тесты, в том числе и ИФА. Однако, несмотря на эти результаты, мы не делаем окончательный вывод о том, что РНГА, по сравнению с ИФА, при диагностике бруцеллеза овец и коз обладает более высокой чувствительностью. Для изучения этого вопроса требуется проведение дальнейших специальных исследований с применением других тест-систем ИФА и на большем количестве животных.
2.4.5 Диагностическое значение нового экспресс-метода диагностики бруцеллеза у лактирующих овец и коз с применением РНГА с молоком
В связи с тем, что при бруцеллезе овец и коз возбудитель часто локализуется в вымени и длительное время сохраняется в нем, изыскание метода выявления специфических антител в молоке для диагностики бруцеллеза заслуживает большего внимания. Для этого предложен целый ряд реакций. Из них наиболее демонстративной и простой в выполнении является кольцевая реакция с молоком (КР). Она официально применяется для исследования на бруцеллез коровьего молока.
# # +++ – # #
## – – ++ – +++ – – – +++ – – –
# сом. 200 1:40 пол. пол. – – – – – –
– – – – – –
– сом. – 1:20 – –
– – – 1:20 – – – сом. 25 1:5 пол. – – сом. – 1:5 – –
+++ пол. – 1:40 пол. – – сом. 50 – – – +++ пол. – 1:20 пол. – – – – – – –
# # – – # # +++ – # #
10 1
11 1
12 1
13 1
14 41 – – – –
## # +++ ++ – ####

Однако, у исследователей нет единого мнения о пригодности её для исследования молока овец и коз и, видимо, по этой причине она не входит в число официально принятых методов диагностики бруцеллеза мелкого рогатого скота и не используется в практике.
Одним из существенных недостатков КР с молоком овец и коз является недостаточная чувствительность этой реакции, из-за низкого содержания в молоке специфических антител и слабой серологической активности, по сравнению с антителами, содержащимися в коровьем молоке (G. Kolar, 1984; П.А. Триленко, 1954). В связи с этим, для их выявления возникает необходимость в применении более чувствительного метода диагностики. С этой целью нами была испытана РНГА с применением эритроцитарного диагностикума, изготовленного с нашим участием в ООО «Ветмедсервис».
Для этого в РНГА, в сравнении с КР с молоком и РА и РСК, были исследованы пробы молока от 615 овец и коз из благополучных и 443 овец и коз – неблагополучных по бруцеллезу хозяйств Республики Дагестан.
При исследовании в РНГА молока от овец и коз благополучных по бруцеллезу хозяйств, нереагирующих в РНГА, РА и РСК с сывороткой крови, во всех случаях получены отрицательные результаты, т.е. неспецифические реакции не получены.
Результаты исследования в РНГА с молоком овец и коз неблагополучных по бруцеллезу хозяйств приведены в таблице 8.
Таблица 8 – Результаты испытания РНГА для исследования молока овец и коз неблагополучных по бруцеллезу хозяйств
Исследовано
овец и коз РНГА с
Реагировало положительно в
КР с молоком РНГА с сывороткой РА+РСК
крови
100% 7,2% 2,7% 7,2% 5,6%
Как видно из приведенных в таблице 8 данных, РНГА с молоком, по сравнению с КР с молоком и РА и РСК, является более чувствительной реакцией, которая выявила дополнительно к КР с молоком – 20 и дополнительно к комплексу РА+РСК – 7 больных бруцеллезом овец и коз, что составляет, соответственно, 4,5% и 1,5% к числу подвергнутых исследованию животных.
При испытании РНГА с молоком для исследования на бруцеллез сывороток крови абортировавших 8 коз и 3-х овцематок, также установлено большое преимущество этой реакции по сравнению с КР с молоком и РА и РСК с сывороткой крови и целесообразность применения её для установления этиологии абортов и выявления свежеинфицированных бруцеллезом овце-, козематок в острых очагах инфекции.
молоком
443 32 12 32 25

3 ВЫВОДЫ
1. Анализ имеющихся литературных источников по изучению особенностей течения бруцеллеза овец и коз, разработке и испытанию различных методов диагностики свидетельствует о необходимости изыскания для исследования на бруцеллез животных данного вида эффективных методов и средств диагностики и целесообразность испытания для этой цели реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с применением высокоактивного эритроцитарного диагностикума.
2. Разработан новый способ изготовления специфичного и высокочувствительного бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для РНГА, с применением в качестве детергентов поверхностно-активного средства «Прогресс» производства ООО «АМС Медиа» (г. Лосино-Петровский Московской области), в сочетании с поверхностно-активным препаратом – додецилсульфатом натрия. На способ изготовления диагностикума получен патент на изобретение (RU 2667121).
3. Экспериментально доказано что новый способ позволяет изготовить такой же высокоактивный, специфичный, стандартный и стабильный бруцеллезный эритроцитарный диагностикум для РНГА, получаемого по известному способу предложенному Прикаспийским зональным НИВИ, ВГНКИ и ВНИИБТЖ, имеющий такой же титр (1:1600 с оценкой в четыре или три креста) со стандартным образцом сыворотки антибруцелла абортус.
Оба диагностикума были равноценны по диагностической эффективности и выявляли в неблагополучном по бруцеллезу стаде одинаковое количество больных бруцеллезом овец и коз.
4. На большом фактическом материале установлено, что РНГА с применением нового диагностикума является наиболее эффективным диагностическим тестом, по сравнению с применяемыми в практике методами серологической диагностики бруцеллеза (РА, РСК, РБП, РИД), заслуживающим широкого применения в качестве самостоятельного метода диагностики для исследования сывороток крови овец и коз на бруцеллез в системе профилактических и оздоровительных противобруцеллезных мероприятий и пригодным для массовых исследований животных с целью осуществления эпизоотического контроля за благополучием отар по бруцеллезу.
5. В результате сравнительных исследований на бруцеллез сывороток крови овец и коз разными диагностическими тестами доказано, что РНГА практически во всех случаях полностью поглощает показания РА, РСК, РБП и РИД, в связи с чем одна эта реакция может заменить все широко применяемые для диагностики бруцеллеза серологические методы.
6. Установлено большое преимущество РНГА с применением сконструированного нами нового эритроцитарного диагностикума, которое заключается в том, что она выявляет зараженных бруцеллезом овец и коз в более ранние сроки, чем РА, РСК и РБП, после инфицирования B.melitensis, что имеет важное практическое значение.
7. Предложен новый экспресс-метод диагностики бруцеллеза у лактирующих овце-, козематок с применением РНГА со сконструированным нами
эритроцитарным диагностикумом для исследования овечьего и козьего молока. Установлена специфичность и более высокая чувствительность его по сравнению с КР с молоком и широко применяемыми в практике традиционными серологическими реакциями (РА, РСК с сывороткой крови) при диагностике бруцеллеза.
8. Определены диагностические титры РНГА с молоком овец и коз, с использованием для постановки этой реакции нового бруцеллезного эритроцитарного диагностикума.
Доказано, что наличие титра РНГА в разведениях молока 1:8 и выше, с оценкой в четыре или три креста, является достоверным показателем бруцеллезной инфекции у овце-, козематок. РНГА с оценкой в четыре или три креста с цельным молоком и разведениями молока – 1:2-1:4 следует считать сомнительным результатом.
9. РНГА с молоком с использованием нового эритроцитарного диагностикума выявляет больных бруцеллезом овец и коз в более ранние сроки после заражения, чем кольцевая реакция с молоком (КР) и РА и РСК с сывороткой крови, что дает основание рекомендовать применение её для исследования абортировавших и свежеинфицированных маток и контроля благополучия отар по бруцеллезу.
4 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
Результаты наших исследований дают основание широко применять в практике разработанный нами эритроцитарный диагностикум для массового исследования овец и коз в РНГА в качестве самостоятельного экспресс – метода диагностики бруцеллеза, в системе профилактических и оздоровительных противобруцеллезных мероприятий и для эпизоотического контроля благополучия овцеводческих хозяйств по этой болезни.
Результаты испытания РНГА с молоком для диагностики бруцеллеза у лактирующих овец и коз, дают основание рекомендовать применение этой реакции для раннего выявления инфицированных бруцеллезом овец и коз и при осуществлении контроля за благополучием хозяйств по бруцеллезу.
Предложен «Способ получения бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации» (патент на изобретение No 2667121 от 31.10.2016 г.).
Результаты испытания диагностикума для исследования овец и коз на бруцеллез в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) вошли в:
– «Ветеринарные правила осуществления профилактических, диагностических, ограничительных и иных мероприятий, установления и отмены карантина и иных ограничений, направленных на предотвращение распространения и ликвидацию очагов бруцеллеза (включая инфекционный эпидидимит баранов)», утвержденные приказом министерства сельского хозяйства РФ No 533, 08.09.2020 г.;
– методические рекомендации «Диагностика бруцеллеза овец и коз с применением реакции непрямой гемагглютинации (РНГА)», утвержденные
Ученым советом Прикаспийского зонального НИВИ – филиал ФГБНУ «ФАНЦ РД» 31.07.2019 г.;
– методические рекомендации «Применение РНГА с усовершенствованным антигеном в «Наборе для серологической диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота в РНГА», утвержденные Управлением ветеринарии Ростовской области 08.04.2020 г.