Совершенствование профилактики желудочно-кишечных заболеваний у молодняка крупного рогатого скота в постнатальном онтогенезе

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования по диссертационной работе проводились в период 2018­
2022 гг. в СПК «Племзавод Вторая Пятилетка», ООО «ХЛЕБОРОБ», в научно­
испытательной лаборатории кафедры эпизоотологии и микробиологии факуль­
тета ветеринарной медицины ФГБОУ ВО «Ставропольский государственный
аграрный университет» и лаборатории ветеринарной медицины ВНИИОК – фи­
лиала ФГБНУ «Северо-Кавказский ФНАЦ».
Научно-исследовательская работа проведена в два этапа.
В рамках выполнения первого этапа исследований нами использованы паспор­
тизированные штаммы, депонированные во ВКПМ НИЦ «Курчатовский инсти­
тут» – ГосНИИгенетика, а также отечественный пребиотик лактулоза-премиум,
используемый согласно рекомендациям творческого коллектива академика РАН,
доктора технических наук, профессора Андрея Георгиевича Храмцова.
Микробиологические исследования по оптимизации процессов роста штамма
Lactobacillus acidophilus K-1-T проводили путём инкубации 24-часовых культур
лактобактерий с концентрацией 107 КОЕ/мл в бульоне MRS в присутствии пре-
биотика лактулозы в концентрациях 0,9 % (мас/объем), 2,7 % (мас/объем) и 4,4 %
(мас/объем). Контрольным образцом служила исследуемая культура без добавле­
ния лактулозы. Рост штамма исследовали через заданные интервалы (4, 8, 12, 18,
24 и 48 часов) во время совместной инкубации.
Определениеантагонистической активностиассоциации штаммов
Lactobacillus acidophilus K-1-T и Enterococcus faecium УДС 86 осуществляли пу­
тём совместного культивирования в отношении к тест-культурам Escherichia coli
K-12 J53, Citrobacter freundii ATCC 8090 и Staphylococcus aureus ATTCC 6538P
методом диффузии в лунках агара согласно МУ 2.3.2.2789-10.
В процессе выполнения диссертационного исследования нами было разрабо­
тано, апробировано и запатентовано синбиотическое средство (пат. № 2758066
от 26.10.2021).
Оценку основных свойств разработанного синбиотического средства осу­
ществляли согласно ГОСТ 32644-2014 методом внутрижелудочного введения
белым крысам (самцам) линии WISTAR средства в предельной дозе, назначенной
согласно руководству по проведению доклинических исследований лекарствен­
ных средств (2012).
Первичную апробацию опытного образца синбиотического средства на ми­
кробиоценоз кишечника проводили на 15 половозрелых морских свинках (сам­
цах) с массой тела 390-400 г, из которых сформировали три группы по пять го­
лов. В первой опытной группе с 3 по 10 день за 1,5-2 часа до утреннего кормле­
ния задавали перорально один раз в сутки опытный образец в количестве 1 мл на
1 кг живой массы тела. Во второй опытной группе согласно методике, задавали
перорально один раз в сутки опытный образец в количестве 2 мл на 1 кг живой
массы тела. В контрольной группе особям, задавали физиологический раствор из
расчёта 2 мл на 1 кг живой массы тела.
Содержание и уход за лабораторными животными выполняли согласно тре­
бованиям ГОСТ 33215-2014. При кормлении были применены стандартные ла­
бораторные диеты согласно ГОСТ Р 50258-92 с неограниченным количеством
питьевой воды.
Оценку влияния опытного образца синбиотического средства на микрофлору
желудочно-кишечного тракта морских свинок контрольной и опытных групп осу­
ществляли на 3, 7 и 10 день опыта путем отбора образцов фекалий через 2-3 часа
после утреннего кормления от всех животных из каждой группы. Полученные
свежие образцы каловых масс исследовали путём посева последовательных 10-
кратных разведений на агаризированные дифференциально-диагностические пи­
тательные среды поверхностным методом с последующим подсчётом количества:
ОМЧ – МПА, Lactobacillus spp. – MRS, Enterococcus spp. – М-17, БГКП – Эндо
(ООО «НПЦ «БИОКОМПАС-С», Россия), после чего проводили пересчет полу­
ченных значений в lg KOE/г.
В процессе выполнения второго этапа исследований проводили оценку фи­
зиологической адаптации телят с применением авторской программы для ЭВМ
«Программа мониторинга и прогнозирования физиологической адаптации мо­
лодняка крупного рогатого скота в раннем постнатальном онтогенезе с предупре­
ждением нарушений функции желудочно-кишечного тракта» (Свидетельство о
государственной регистрации программы для ЭВМ № 2020665892. Совмести­
мость ПК. ОС: Windows XP, Windows 7, Windows 8, Vista, Windows 10, язык про­
граммирования: Python 3.8 Module: Tkinter, Matplotlib).
Основной научно-производственный опыт выполнен в условиях СПК «Плем-
завод Вторая Пятилетка» Ипатовского района Ставропольского края. Объектом
исследования служили 36 клинически здоровых телят молочного направления
породы красная степная, разделённых на три группы по 12 голов (контрольная,
первая опытная и вторая опытная).
В первой опытной группе телятам с 3 по 10 день за 1,5-2 часа до утреннего
кормления задавали перорально один раз в сутки синбиотическое средство в ко-
личестве 1 мл на 1 кг живой массы тела. Во второй опытной группе телятам также
задавали средство в количестве 2 мл на 1 кг живой массы тела. В контрольной
группе особям, согласно применяемой методике, задавали физиологический рас­
твор из расчёта 2 мл на 1 кг живой массы тела.
Оценку влияния синбиотического средства на микрофлору желудочно-кишеч­
ного тракта телят всех групп осуществляли согласно методическим указаниям,
утверждённым министерством сельского хозяйства Российской Федерации от
27.07.2000 № 13-7-2/2117. Образцы каловых масс исследовали согласно ГОСТ 26669­
85. Расчёт микробного числа осуществляли с использованием авторской програм­
мы для ЭВМ «Программа вычисления общего микробного числа (ОМЧ) в биома­
териале» (Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ
№ 2021614399. Совместимость ПК. ОС: Windows XP, Windows 7, Windows 8, Vista,
Windows 10, язык программирования: Python 3.8. Module: Pyside 2).
Видовую идентификацию микроорганизмов осуществляли по определителю
бактерий Берджи (1997). Оценку их морфологических свойств осуществляли
методом микроскопии бактериальных препаратов, окрашенных по методу Гра-
ма. Для дифференциальной диагностики микроорганизмов использовали пита­
тельные среды: MПА – ОМЧ, MRS – Lactobacillus spp., М-17 – Enterococcus spp.,
Эндо – БГКП, Bifidobacterium spp. – в анаэробных условиях Бифидум-среда (ООО
«НПЦ «БИОКОМПАС-С», Россия).
Первичную дифференциацию бактерий группы кишечной палочки осущест­
вляли согласно ГОСТ 31747-2012. Для дополнительной идентификации E. coli­
lac. (-), Citrobacter spp. и Enterobacter spp. использовали цитратный агар Симонса,
среду с мочевиной (по Кристенсену) (ФБУН ГНЦ ПМБ, п. Оболенск, Россия), а
также альдегидный реактив Эрлиха (HIMEDIA).
В ходе исследовательских работ изучалось изменение морфологических, био­
химических показателей крови, естественной резистентности телят и изменение
хозяйственно полезных показателей под влиянием синбиотического средства. По­
___и______и/1UU
казатели сравнивали между контрольной группой (n = 12) и опытной группой
(n = 12), в которой телятам согласно методике задавали синбиотическое средство
в количестве 2 мл на 1 кг живой массы тела.
Взятие крови у экспериментальных животных и их взвешивание проводили
на 3, 7, 10 сутки в утренние часы перед кормлением. Отбор крови производился
от каждой группы путём применения двух видов пробирок: для получения сыво­
ротки S-Monovette 9 мл, для получения стабилизированной крови S-Monovette 1,2
ml (66×8 мм) КЗ-ЭДТА.
В стабилизированных образцах определяли морфологические показатели
крови. Исследования проводили на автоматическом гематологическом анализа­
торе UREIT-3020 (производство Китай). В работе учитывали показатели: WBC,
x109/L – количество лейкоцитов, RBC, x1012/L – количество эритроцитов, HGB,
g/L – количество гемоглобина, HCT, % – гематокрит.
В сыворотке крови экспериментальных животных определяли количество
глюкозы, мочевины, креатинина, альбуминовой белковой фракции, активность
ферментов переаминирования аланинаминотрансферазы (ALT) и аспартатами-
нотрансферазы (AST), содержание общего белка с использованием тест-системы
фирмы Плива-Лахема (Чехия) на фотоэлектроколориметре КФК3.
Состояние гуморального защитного звена оценивали по бактерицидной ак­
тивности сыворотки крови (БАСК) согласно методике Д. А. Петрачева (1981).
Лизоцимная активность сыворотки крови (ЛАСК) изучалась в соответствии с ме­
тодикой В. Я. Саруханова с соавторами (2012). Также исследовали фагоцитарную
активность крови (ФАК) по методу А. М. Горчакова с соавторами (2003).
Расчет экономической эффективности проводили согласно официальной ме­
тодике по определению экономической эффективности ветеринарных мероприя­
тий, утверждённой от 21 февраля 1997 г., начальником Департамента ветерина­
рии МСХ РФ В. М. Авиловым.
Для измерения статистической значимости различных парных значений,
экспериментальной и контрольной групп использовали программу «Primer of
Biostatistics 4.03. For Windows» методом критерия t – критерия Стьюдента. Из­
менения по сравнению с контролем считались достоверными при вероятности
р<0,05. 2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ АНАЛИЗ В разделе изложены результаты научных исследований, опубликованные в на­ учных статьях как самостоятельно, так и в соавторстве, они уточнены, расшире­ ны и содержат новые сведения. 2.2.1. Мониторинг заболеваний молодняка крупного рогатого скота на территории ставропольского края 2.2.1.1. Распространённость желудочно-кишечных заболеваний у молодняка крупного рогатого скота в Ставропольском крае Для определения распространенности желудочно-кишечных заболеваний у молодняка крупного рогатого скота в Ставропольском крае нами был проведён ре­ троспективный анализ заболеваемости сельскохозяйственных животных в период 2019-2021 гг. с учётом журналов первичного учёта и отчётной документации. Согласно отчётным данным ГБУ СК «Ставропольская краевая ветеринарная лаборатория» за 2017-2021 гг., у молодняка крупного рогатого скота было выде­ лено в двух хозяйствах два вида патогенных возбудителей колибактериоза (эше- рихиоз): E. ^ l i О9и E. ^ l i О20. При этом представленные возбудители превалиро­ вали преимущественно у телят в раннем постнатальном онтогенезе. Общий анализ ветеринарной отчетности по заболеваниям молодняка крупно­ го рогатого скота в хозяйствах Ставропольского края в течение 2019-2021 гг. по­ казал, что среди всех патологий заболевания желудочно-кишечного тракта наи­ более распространены и составили в 2019 году 32,77 %, в 2020 году - 18,44 %, в 2021 году - 20,37 % от общего числа заболевших животных. Уровень заболевшего поголовья молодняка до 10-суточного возраста в 2020 году составил 30,27 % со степенью летальности 35,35 %, а в 2021 - 35,12 и 36,63 % соответственно. 2.2.1.2. Определение факторов, способствующих возникновению желудочно-кишечных заболеваний у телят, в хозяйствах центральной части Ставропольского края /-Ч••ии С учётом эпизоотологического районирования и анализа сведений о сель- хозорганизациях центральной части Ставропольского края приняли решение о проведении научно-исследовательских работ на базе СПК «Племзавод Вторая Пятилетка» Ипатовского района и ООО «ХЛЕБОРОБ» Петровского района Став­ ропольского края. Для определения факторов, способствующих возникновению желудочно-кишечных заболеваний у телят в период новорождённости, на базе выбранных хозяйств была проанализирована система воспроизводства. В СПК «Племзавод Вторая Пятилетка» за 5-7 дней перед ожидаемым отелом коровы переводились в предродовые секции. В родильном отделении соблюда­ лись все параметры микроклимата в пределах установленных нормативов. Коро­ вы после отела оставались с телятами в родильной секции площадью 5-6 м2 на 24 часа. На вторые сутки проводился отъем телят от коров и перевод их под навес в огороженные сеткой минимизированные площадки, где температура воздуха и влажность были динамично изменчивы, фиксировались сквозняки, сырость, телята испытывали температурный стресс. В совокупности изложенные нега­ тивные климатические воздействия могут явиться причинами дестабилизации микробиоценоза желудочно-кишечного тракта. В ООО «ХЛЕБОРОБ» роды осуществляются в секциях отёла, где соблюда­ ются все параметры микроклимата в пределах установленных нормативов. После отела новорождённого телёнка выпаивают молозивом с помощью атравматиче- ского зонда, задают исходя из расчёта 10 % от массы тела телёнка. Подвергаясь воздействиям, телята испытывают стресс, что приводит к нарушению физиологи­ ческого состояния. Со второго дня и до 10-суточного возраста телята содержатся на ограниченной территории с высокой плотностью расположения манежей, что может отразиться на бактериальном фоне. По результатам проведённого анализа установлено, что активизация негатив­ ных полигенных факторов способна выступать в качестве причины возникнове­ ния желудочно-кишечных заболеваний телят с явлениями диареи. Для выполне­ ния основного научно-производственного опыта определена база СПК «Племза- вод Вторая Пятилетка», где потери молодняка в раннем постнатальном онтогене­ зе составили 13,7 %, что на 6 голов больше, чем в условиях ООО «ХЛЕБОРОБ», где потери молодняка составили 9,6 %. 2.2.2.Разработка синбиотического средства на основе консорциума депанированных культур Lactobacillus acidophilus K-1-T и Еп1егососс^ faecium УДС 86 2.2.2.1. Оптимизация процессов роста депонированного пробиотического штамма Lactobacillus acidophilus K-1-T Для оптимизации процессов роста исследуемого штамма было изучено влияние пребиотика лактулозы в концентрациях 0,01 г/мл - 0,9 % (мас/объем), 0,03 г/мл - 2,7 % (мас/объем) и 0,05 г/мл - 4,4 % (мас/объем) на рост депонирован­ ной культуры микроорганизмов Lactobacillus acidophilus K-1-T. В результате проведённых исследований установлено, что пребиотик лакту- лоза как каталитический фермент оказывает благоприятное воздействие на про­ цессы роста выбранного штамма бактерий. Статистически значимые различия наблюдались между контрольными образцами и образцами с добавлением пре­ биотика в предложенных концентрациях. Так, штаммы контрольной, 1-й и 2-й опытных групп достигли стационарной фазы примерно через 24 часа, добавление пребиотика лактулозы в концентра­ ции 4,4 % (мас/объем) сократило время достижения максимальной стационар­ ной фазы до 18-20 часов с увеличением частоты клеточного деления и нарас­ танием числа клеток до 10,200+0,526 lg КОЕ/мл (Р<0,05), что в сравнении с 2-й опытной группой выше на 25,44 %, 1-й опытной группой - 34,31 % и контроль­ ной группой - 48,53 %. Полученные результаты имеют большое биотехнологи­ ческое значение. 2.2.2.2. Определение антагонистических свойств микроорганизмов Lactobacillus acidophilus K-1-T, Enterococcus faecium УДС 86 и их консорциума В ходе изучения антагонистических свойств in vitro микроорганизмов Lactobacillus acidophilus K-1-T, Enterococcus faecium УДС 86 и их консорциу­ ма в отношении к тест-культурам Escherichia coli K-12 J53, Citrobacter freundii ATCC 8090 и Staphylococcus aureus ATTCC 6538P было установлено, что иссле­ дуемые пробиотические штаммы способны комплексно взаимодействовать и проявлять ингибирующую активность в отношении исследуемых тест-культур, являющихся одними из основных бактериальных возбудителей заболеваний желудочно-кишечного тракта животных (таблица 1). Таблица 1 - Антагонистические свойства микроорганизмов Lactobacillus acidophilus K-1-T, Enterococcus faecium УДС 86 и их консорциума (n = 3), мм Lactobacillus Lactobacillus Enterococcus acidophilus K-1-T Тест-культураacidophilusfaecium и Enterococcus K-1-TУДС 86 faecium УДС 86 Escherichia coli K-12 J5322,0+1,020,0+0,625,0+1,2 Citrobacter freundii ATCC 809024,0+0,623,0+2,027,0+1,2 Staphylococcus aureus ATTCC 6538P13,0+0,616,0+1,017,0+1,5 Из данных таблицы 1 видно, что наиболее значимые результаты были установле­ ны в опыте с применением консорциума микроорганизмов Lactobacillus acidophilus K-1-T и Enterococcus faecium УДС 86. Зона задержки роста Escherichia coli K-12 J53 была равна 25,0+1,2 мм, Citrobacter freundii ATCC 8090 - 27,0+1,2 мм, а в от­ ношении Staphylococcus aureus ATTCC 6538P - 17,0+1,5 мм, что свидетельствует о проявлении их синергетического эффекта и антагонистической активности. Таким образом, консорциум пробиотических микроорганизмов Lactobacillus acidophilus K-1-T и Enterococcus faecium УДС 86 обладает высокой антагонистиче­ ской активностью в отношении тест-культур Escherichia coli K-12 J53, Citrobacter freundii ATCC 8090 и средней антагонистической активностью в отношении тест- культуры Staphylococcus aureus ATTCC 6538P, что может быть использовано при разработке новых средств для профилактики желудочно-кишечных заболеваний бактериальной этиологии у животных. 2.2.2.3.Технология получения синбиотического средства на основе консорциума депонированных культур Lactobacillus acidophilus K-1-T и Enterococcus faecium УДС 86 Для получения синбиотического средства (патент на изобретение РФ № 2758066 от 26.10.2021) используются компоненты, подобранные с учётом их индивидуальных биологических свойств и способности комплексного взаимодей­ ствия. В качестве штаммов-продуцентов взяты депонированные паспортизиро­ ванные культуры микроорганизмов Lactobacillus acidophilus K-1-T и Enterococcus faecium УДС 86. Питательную основу составляет отечественный пребиотик лактулоза-премиум. Получение синбиотического средства осуществляется в три этапа: 1. Приготовление консорциума микроорганизмов. Депонированные пробиотические культуры Lactobacillus acidophilus K-1-T и Enterococcus faecium УДС 86 в условиях стерильной зоны ресуспендируют фос­ фатным буфером в отдельных пробирках на протяжении 20-30 минут. После чего определяют концентрацию клеток микроорганизмов в 1 мл жидкости по стан­ дарту мутности, равному 1:1000000000000 (в 1 мл ~ 1012 КОЕ). Из полученных разведений отбирают по 0,5 мл каждой культуры микроорганизмов в отдельную стерильную пробирку и смешивают полученный консорциум в разведении 1:1, в результате получают 1 мл жидкости. 2. Приготовление питательной основы. Для приготовления питательной основы раствора необходимо использовать лактулозу, разведённую теплой деминерализованной водой (32-37 °C) из расчёта 1,7 гр на 10 мл, перемешать. 3. Получение синбиотического средства. В 10 мл приготовленной питательной основы при температуре 32-37 °С вно­ сят полученный раствор на основе консорциума микроорганизмов Lactobacillus acidophilus K-1-T и Enterococcus faecium УДС 86 в количестве 1 мл. Комбиниро­ ванный раствор инкубируют в термостате (RedLine) при температуре 37 оС в тече­ ние 12-18 часов. После инкубации раствор необходимо остудить до температуры 4 °С. Данное средство готово к использованию. Разработанное синбиотическое средство предназначено для перорального вве­ дения (в 1 мл ~ Enterococcus faecium УДС 86 - 104-106КОЕ, Lactobacillus acidophilus (В-4107) K-ЬТ - 104-106 КОЕ и пребиотик лактулоза в количестве 170 мг). 2.2.2.4. Оценка основных свойств синбиотического средства Разработанное синбиотическое средство вводили здоровым крысам (самцы) линии WISTAR серии 33-34 (Свидетельство № 11742; Ветеринарное свидетель­ ство № 12125983222) с массой тела 180-200 г внутрижелудочно в виде суспензий через металлический атравматический зонд. В ходе эксперимента были сформированы две группы по трое животных в каждой. В опытной группе крысам вводили средство натощак один раз в день в предельной дозе, составляющей 15 мл/кг ~ 3 мл/крысу. В контрольной группе вводили согласно методике эквивалентные объемы дистиллированной воды. Животных обследовали индивидуально после введения дозы с особым кон­ тролем в первые 24 часа. В последующем наблюдение за подопытными живот­ ными осуществляли в течение 14 суток с регистрацией показателей: летальность, время гибели животных, симптоматика отравления, результаты ежедневного на­ блюдения общего состояния и поведения, взвешивания, данные контроля потре­ бления корма и воды. Результаты изучения динамики изменения массы тела лабораторных живот­ ных, получавших разработанное синбиотическое средство, в течение 14 суток наблюдения за ними позволили установить, что масса тела животных опытной и контрольной групп практически не различалась (таблица 2). Таблица 2 - Динамика изменения массы тела крыс, получавших разработанное синбиотическое средство Масса тела животных (г) через промежуток времени Группа животных Фон2 суток7 суток14 суток 193,8±3,8193,2±3,1195,2±3,2200,8±4,1 Контрольная группа 189,2±3,0189,4±3,1192,3±2,2200,3±3,1 189,1±3,9189,3±3,7196,3±4,0199,3±2,7 Опытная группа 188,9±3,7191,1±1,9194,3±2,2201,7±2,4 Введение разработанного синбиотического средства в максимально перено­ симых дозах не вызывало гибели подопытных животных. Не отмечали и какие- либо другие признаки негативного действия разработанного синбиотического средства. В частности, не отмечали какие-либо диспепсические явления. Во все дни наблюдения по общему состоянию и поведению животные опытной и кон­ трольной групп не отличались. Таким образом, полученные данные наблюдений за подопытными животными на протяжении 14 суток после введения предельных доз позволяют отнести раз­ работанное синбиотическое средство к V группе опасности по ГОСТ 32644-2014 или неклассифицированной. 2.2.3.Первичная апробация и определение оптимальной эффективной дозы опытного образца синбиотического средства на морских свинках Проведена первичная апробация с определением оптимально эффективной дозы опытного образца синбиотического средства в лабораторных условиях при включении его в рацион морским свинкам (самцы) с массой тела 390-400 г. Согласно схеме профилактики, в первой опытной группе морским свинкам с третьего по десятый день за 1,5-2 часа до утреннего кормления, задавали перо­ рально один раз в сутки опытный образец синбиотического средства в количестве 1 мл на 1 кг живой массы тела. Во второй опытной группе морским свинкам за 1,5-2 часа до утреннего кормления задавали перорально один раз в сутки опыт­ ный образец синбиотического средства в количестве 2 мл на 1 кг живой массы тела. В контрольной группе особям, согласно применяемой методике, задавали физиологический раствор из расчёта 2 мл на 1 кг живой массы тела. Результаты по сравнительной характеристике колонизационной активности основных групп микроорганизмов в содержимом фекалий морских свинок пред­ ставлены в таблице 3. Таблица 3 - Количественный и качественный состав микроорганизмов в зекалиях морских свинок, lg KOE/г КонтрольнаяПервая опытная Вторая опытная Микроорганизмыгруппагруппагруппа (n = 5)(n = 5)(n = 5) На 3-и сутки ОМЧ8,879±0,1398,735±0,0299,059±0,146 Lactobacillus spp.8,005±0,3068,323±0,0758,326±0,041 Enterococcus spp.7,732±0,5817,770±0,0907,451±0,184 БГКП4,074±0,0843,802±0,1423,849±0,169 На 7-е сутки ОМЧ8,798±0,2509,062±0,2259,318±0,107 Lactobacillus spp.7,865±0,1869,079±0,155*9,709±0,226* Enterococcus spp.7,636±0,1858,170±0,1688,360±0,196* БГКП4,235±0,1743,217±0,160*2,533±0,216* На 10-е сутки ОМЧ8,837±0,2269,114±0,2939,334±0,107 Lactobacillus spp.8,036±0,2519,221±0,196*9,927±0,177* Enterococcus spp.7,684±0,0408,339±0,2048,725±0,315* БГКП3,816± 0,1603,050±0,185*2,379±0,148* Примечание. *Р <0,05 - отличия достоверны (по отношению к контролю). Так, из данных таблицы 3 видно, что наиболее значимые показатели были уста­ новлены у морских свинок второй опытной группы, где на 10-е сутки отмечалось наибольшее повышение колонизационного потенциала представителей полезной микрофлоры, а именно, количество Lactobacillus spp. составило 9,927±0,177 lg KOE/г (Р<0,05), а содержание Enterococcus spp. - 8,725±0,315 lg KOE/г (Р<0,05), по сравнению с особями из первой опытной группы количество лактобактерий было выше на 7,1 % и контрольной группы - на 19 %; энтерококков - на 4,4 и 8,7 % со­ ответственно. Содержание бактерий группы кишечной палочки у морских свинок второй опытной группы было равно 2,379±0,148 lg KOE/г (Р<0,05) по сравнению с первой опытной группой. На 10-е сутки данное количественное значение было ниже на 22 %, в сравнении с контрольной группой - на 37,7 % соответственно. Полученные результаты свидетельствуют об увеличении колонизационного потенциала нормофлоры желудочно-кишечного тракта организма животного, способствующей снижению риска проявления желудочно-кишечных заболеваний бактериальной природы. 2.2.4. Производственные испытания синбиотического средства на телятах в раннем постнатальном онтогенезе 2.2.4.1. Прогнозирование физиологической адаптации новорождённых телят В процессе выполнения научно-производственных опытов осуществля­ ли прогнозирование адаптивности новорождённых телят путём мониторинга основных физиологических показателей с целью обеспечения научной основы для проведения профилактических мероприятий по снижению риска проявле­ ния желудочно-кишечных заболеваний бактериальной этиологии с помощью авторского программного комплекса (Свидетельство о государственной реги­ страции программы для ЭВМ № 2020665892 от 02.12.2020), предназначенного для выявления потенциальных сбоев физиологической адаптации новорождён­ ных телят. Разработанный алгоритм программы создан по принципу «весов- факторов», основывающийся на нормативных физиологических значени­ ях. Согласно критериям адаптационного потенциала считали устойчивы­ ми животных при показателе более 199 %, в случае снижения показателя определяли необходимым задавать разработанное синбиотическое средство с целью профилактики развития дисбактериозов. С помощью данного про­ граммного обеспечения мы контролировали физиологическое состояние организма животного и прогнозировали его изменения на основе индика­ торных показателей, разработанных с учетом современных достижений ве­ теринарии и клинической диагностики. 2.2.4.2. Влияние синбиотического средства на микробиоценоз желудочно-кишечного тракта телят Полученные положительные результаты научно-лабораторного опыта позво­ лили рассчитать оптимальные дозы и разработать схему профилактики по вклю­ чению синбиотического средства в рацион кормления телятам на производстве. Так, в первой опытной группе (n = 12) телятам с третьего по десятый день за 1,5-2 часа до утреннего кормления задавали перорально один раз в сутки син- биотическое средство в количестве 1 мл на 1 кг живой массы тела. Во второй опытной группе (n = 12) телятам также задавали синбиотическое средство в ко­ личестве 2 мл на 1 кг живой массы тела. В контрольной группе (n = 12) особям, согласно применяемой методике, задавали физиологический раствор из расчёта 2 мл на 1 кг живой массы тела. При оценке влияния синбиотического средства на микробиоценоз желудочно­ кишечного тракта молодняка крупного рогатого скота в раннем постнатальном онтогенезе в условиях производства нами получены следующие результаты (та­ блица 4). В результате проведённых исследований установлено, что наиболее значи­ мые показатели выявлены у телят второй опытной группы, которым, согласно разработанной схеме профилактики, с третьего по десятый день за 1,5-2 часа до утреннего кормления задавали перорально один раз в сутки синбиотическое средство в количестве 2 мл на 1 кг живой массы тела. Так, на 10-е сутки на­ блюдается увеличение содержания пробиотической микрофлоры в сравнении с телятами из первой опытной и контрольной групп, а именно: Enterococcus spp. выше на 22,6 и 29,9 %, Lactobacillus spp. - на 18,1 и 29,1 %, Bifidobacterium spp. - на 13,3 и 19,3 % соответственно. Содержание E. coli-lac. (-) по сравне­ нию с телятами из первой опытной группы было ниже на 18 % и контрольной группы - на 27,3 %. Количество бактерий рода C ^ r a b a ^ r spp. на 10-е сутки по сравнению с телятами из первой опытной группы было ниже на 14,4 %, а в сравнении с телятами контрольной группы - на 24,7 %. Введение в рацион кормления телят разработанного синбиотического средства способствует сни­ жению риска возникновения желудочно-кишечных заболеваний бактериаль­ ной этиологии. Таблица 4 - Показатели сыворотки крови телят, lg KOE/г Контрольная Первая опытная Вторая опытная Микроорганизмыгруппагруппагруппа (n = 12)(n = 12)(n = 12) На 3-и сутки E. coli-lac. (-)4,608±0,0154,488±0,011 4,572±0,016 C itt'oba^r spp.3,599±0,0133,505±0,008 3,515±0,010* E nteroba^r spp.3,537±0,0093,556±0,007 3,381±0,012* Enterococcus spp.4,594±0,0304,605±0,021 4,638±0,044 Lactobacillus spp.6,227±0,0326,855±0,040* 6,693±0,060* Bifidobacterium spp.7,634±0,0297,787±0,080 7,523±0,019 На 7-е сутки E. coli-lac. (-)4,685±0,0274,297±0,006* 3,957±0,035* C itt'oba^r spp.3,779±0,0423,490±0,008 3,153±0,016* E nteroba^r spp.3,850±0,0263,405±0,011* 2,897±0,021* Enterococcus spp.4,153±0,0194,780±0,045* 5,847±0,046* Lactobacillus spp.6,537±0,0147,318±0,022* 8,150±0,023* Bifidobacterium spp.8,150±0,0228,358±0,025 9,643±0,071* На 10-е сутки E. coli-lac. (-)4,911±0,0114,175±0,01* 3,425±0,008* C itt'oba^r spp.3,709±0,0383,263±0,023* 2,794±0,053* E nteroba^r spp.4,145±0,0173,256±0,024* 2,382±0,010* Enterococcus spp.4,844±0,0425,346±0,034* 6,906±0,034* Lactobacillus spp.6,351±0,0447,332±0,027* 8,952±0,037* Bifidobacterium spp.7,790±0,0748,363 ±0,030 9,648±0,049* Примечание. *Р <0,05 - отличия достоверны (по отношению к контролю). 2.2.4.3.Гематологические, биохимические и иммунологические показатели у телят при добавлении в кормление синбиотического средства Минимальная дозировка препарата, оказавшая наиболее комплексный по­ ложительный эффект в условиях производства, считалась оптимальной и была выбрана для дальнейших исследований по определению гематологического, био­ химического и иммунологического статуса новорождённых телят при включении в рацион кормления синбиотического средства. Показатели сравнивали между контрольной группой (n = 12) и опытной группой (n = 12), в которой телятам, согласно разработанной схеме профилактики, с третьего по десятый день жизни от рождения дополнительно к основному рациону задавали синбиотическое сред­ ство в количестве 2 мл на 1 кг живой массы тела. В результате проведенных гематологических исследований у телят установ­ лено, что в процессе исследований количество эритроцитов, лейкоцитов, концен­ трации гемоглобина и гематокрита в крови телят всех исследуемых групп находи­ лись в пределах референсных значений (таблица 5). Таблица 5 - Морфологические показатели крови телят Показатель Сут­ ГруппаRBC,WBC, киHGB, g/LHCT, % x1012/Lx109/L 3Контрольная5,37±0,327,36±0,1689,2±2,436,48±0,01 Опытная6,03±0,346,39±0,22* 90,4±3,7533,27±0,02 7Контрольная6,07±0,427,53±0,1788,3±1,135,27±0,36 Опытная6,54±0,658,04±0,2189,7±1,736,55±0,36* 10Контрольная7,14±0,328,24±0,194,9±1,6236,63±0,28 Опытная7,72±0,159,49±0,19**96,7±1,8939,27±0,33** Примечание. *Р <0,05 - отличия достоверны (по отношению к контролю). ** Р <0,001 - отличия высоко достоверны (по отношению к контролю). По результатам проведенных исследований установлено, что концентрация исследуемых метаболитов в крови животных всех групп находится в пределах до­ пустимых физиологических норм. Анализируя показатели сыворотки крови телят, установили, что в опытной и контрольной группах имеется существенное отличие качественного состава, характеризующееся у животных опытной группы, получав­ ших вместе с принятым на производственном уровне кормлением опытный образец синбиотического средства, увеличением содержания общего белка к 7 и 10 суткам в сравнении с показателями у телят из контрольной группы на 9,4 и 11,5 % и белковых фракций, в частности альбуминовых, - на 15,0 и 13,2 % соответственно (таблица 6). Таблица 6 - Показатели сыворотки крови телят ПоказательАльбумин, Мочевина, я S ч AST, Ед/л ALT, Ед/л белок, г/л Сутки Глюкоза, ммоль/л ммоль/л Общий Группа г/л я § Й S К м 3,526±84,030±35,080±5,294±43,270±57,410±20,440± Контрольная 0,1280,5270,2720,1790,2490,3320,137 3,714±86,300±36,110±4,422±40,210±56,730±21,510± Опытная 0,1100,4420,4460,1220,4230,2680,249 3,168±38,000±31,530±4,440±46,540±63,030±27,130± Контрольная 0,1160,9060,9030,1270,2070,2000,224 3,254±52,190±33,190±4,550±52,000±69,58±31,900± Опытная 0,3170,713**0,8530,1251,012**0,214**0,115* 2,598±58,730±30,080±3,840±62,150±59,720±23,130± Контрольная 0,2970,4170,2660,0600,2090,2650,133 3,090±72,240±28,950±4,422±71,220±66,970±26,640± Опытная 0,1901,082**0,338*0,033**0,250**0,349**0,193* Примечание. *Р <0,05 - отличия достоверны (по отношению к контролю). ** Р <0,001 - отличия высоко достоверны (по отношению к контролю). Уровень активности лизоцима в наших исследованиях был стабильным, что может указывать на относительно хорошее здоровье животных. Более высокие показатели были зарегистрированы у новорождённых телят из опытной группы, связанные с включением в кормление разработанного синбиотического средства (таблица 7). Таблица 7 - Показатели иммунного статуса телят Контрольная группаОпытная группа Показатель (n = 12)(n = 12) На 3-и сутки БАСК, %55,52±0,24555,26±0,183 ЛАСК, %32,9±0,14632,40±0,087 Фагоцитарная активность крови, %31,20±1,3430,40±1,03 На 7-е сутки БАСК, %52,96±0,02356,80±0,064** ЛАСК, %31,66±0,20634,82±0,124 Фагоцитарная активность крови, %40,20±0,5544,2±0,86 * На 10-е сутки БАСК, %56,17±0,22760,72±0,212** ЛАСК, %32,38±0,20038,58±0,131 Фагоцитарная активность крови, %41,00±0,8346,20±0,98 * Примечание. *Р <0,05 - отличия достоверны (по отношению к контролю). ** Р <0,001 - отличия высоко достоверны (по отношению к контролю). Из данных таблицы 7 видно, что уровень лизоцимной активности, а также бактерицидной активности сыворотки крови на 10-е сутки у телят из опытной группы в сравнении с контрольной группой был выше на 6,2 % (ЛАСК) и 5,55 % (БАСК). Кроме того, на 7-е и 10-е сутки мы обнаружили, что фагоцитарная ак­ тивность крови у телят опытной группы была несколько усилена и составила 44,20±0,86 % (Р<0,05) и 46,20 ± 0,98 % (Р<0,05) в сравнении с особями из кон­ трольной группы, где данный показатель на 7-е сутки был равен 40,20±0,55 %, а на 10-е сутки - 41,00±0,83 %, выше на 3,2 и 5,2 %, что свидетельствовало об устойчивости телят к инфекционным агентам. Таким образом, обнаруженные нами изменения в крови свидетельствуют об улучшении функциональной системы крови, отражают высокую реакцию бел­ кового метаболизма, улучшение обменных процессов. Это указывает на более стабильную систему неспецифического клеточного иммунитета, повышающую устойчивость животных в опытной группе к возможной инфекции. 2.2.5. Экономическая эффективность применения разработанного синбиотического средства для профилактики желудочно-кишечных заболеваний у телят в раннем постнатальном онтогенезе Экономическая эффективность апробированной схемы профилактики желудочно-кишечных заболеваний за период производственного опыта в усло­ виях СПК племзавод «Вторая Пятилетка» и ООО «ХЛЕБОРОБ» на рубль затрат составила 6 рублей 2 копейки, предотвращённый ущерб составил 28336 рублей. Включение синбиотического средства в рацион новорождённым телятам, со­ гласно предложенной схеме профилактики, повышает экономический статус от­ расли животноводства, в частности скотоводства, и может выступить в качестве альтернативной стратегии профилактики желудочно-кишечных заболеваний бак­ териальной этиологии. 3. ЗАКЛЮ ЧЕНИЕ Новорождённые телята характеризуются высоким уровнем заболеваемости и смертности по сравнению с другими возрастными группами животных, что связа­ но с недостаточно сформированным иммунитетом. Желудочно-кишечный тракт молодняка крупного рогатого скота в период новорождённости особенно уязвим для патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Нарушения бактери­ ального гомеостаза организма находятся в прямой зависимости от нормофлоры желудочно-кишечного тракта, что приводит к дисбактериозу и снижению имму­ нологической реактивности организма. Главной альтернативой в вопросе профилактики данной патологии является использование специальных комплексных средств, разработанных на основе кон­ сорциума пробиотических микроорганизмов с включением питательной основы в виде пребиотика. Проведены комплексные исследования по изучению заболеваемости молод­ няка крупного рогатого скота в Ставропольском крае на базе СПК «Племзавод Вторая Пятилетка» Ипатовского района и ООО «ХЛЕБОРОБ» Петровского райо­ на Ставропольского края. В данных хозяйствах уточнены этиологические факто­ ры желудочно-кишечных заболеваний телят, в том числе вызываемые условно­ патогенными микроорганизмами. Впервые оптимизированы процессы роста штамма микроорганизма Lactobacillus acidophilus K-1-T, депонированного во Всероссийскую коллекцию промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт»-ГосНИИгенетика, методом добавления пребиотика лактулозы в концентрации 4,4 % (мас/объем), что позволило сократить время достижения максимальной стационарной фазы роста микроорганизмов с увеличением частоты клеточного деления и нарастанием числа клеток. Результаты, полученные в ходе исследования, применены в разработке син- биотического средства. При этом были использованы депонированные паспортизи­ рованные культуры микроорганизмов Lactobacillus acidophilus K-1-T и Enterococcus faecium УДС 86, подобранные с учётом их антагонистических и индивидуальных биологических свойств. Так, оценку антагонистических свойств микроорганизмов Lactobacillus acidophilus K-1-T, Enterococcus faecium УДС 86 и их консорциума про­ водили в отношении к тест-культурам Escherichia coli K-12 J53, Citrobacter freundii ATCC 8090 и Staphylococcus aureus ATTCC 6538P. Наиболее значимые результаты установлены в опыте с применением консорциума микроорганизмов, что свиде­ тельствует о проявлении их синергетического эффекта и высокой антагонистиче­ ской активности. Включение в кормление морским свинкам опытного образца син- биотического средства позволило снизить содержание бактерий группы кишечной палочки и увеличить количество лактобактерий и энтерококков. Анализ основных свойств опытного образца позволяет отнести разработанное синбиотическое сред­ ство к безвредным веществам. В ходе проведённых комплексных исследований в условиях производства на телятах была доказана его высокая эффективность в качестве нового профилакти­ ческого средства. При включении в рацион кормления животных разработанного синбиотического средства на 7-е и 10-е сутки повышается колонизационный по­ тенциал нормофлоры желудочно-кишечного тракта молодняка крупного рогатого скота, улучшаются гематологические и биохимические показатели, а также пока­ затели естественной резистентности. У телят, получавших средство перорально 1 раз в сутки за 1,5-2 часа до утреннего кормления из расчёта 2 мл на 1 кг живой массы тела, на 10-е сутки отмечается увеличение пробиотической микрофлоры в сравнении с телятами из контрольной группы, что свидетельствует о повыше­ нии колонизационного потенциала нормофлоры желудочно-кишечного тракта те­ лят. Установили существенное отличие качественного состава сыворотки крови, характеризующееся у животных опытной группы, получавших вместе с приня­ тым на производственном уровне кормлением опытный образец синбиотического средства, увеличением общего белка и альбуминовых белковых фракций к 7-м и 10-м суткам в сравнении с телятами из контрольной группы. На 7-е и 10-е сут­ ки выявили, что фагоцитарная активность нейтрофильных клеток крови у телят опытной группы была усилена в сравнении с особями из контрольной группы, что свидетельствует об устойчивости телят к инфекционным агентам. На основании проведённых расчётов по экономической эффективности уста­ новлено, что экономический эффект на 1 рубль затрат равен 6,2 рублям. Макси­ мальная прибыль была зафиксирована в опытной группе - 19913 рублей, которая на 13067 рублей выше, чем в контрольной группе, где данный показатель был ра­ вен 6846 рублей. Полученные результаты способствуют оптимизации производ­ ственных затрат за счет применения разработанного синбиотического средства. Включение разработанного синбиотического средства в кормление ново­ рождённым телятам повышает экономический статус отрасли животноводства, в частности скотоводства, и может выступить в качестве альтернативной стратегии профилактики желудочно-кишечных заболеваний бактериальной этиологии. Выводы 1. Заболевания желудочно-кишечного тракта у молодняка крупного рогатого скота на территории Ставропольского края наиболее распространены и составили в 2019 году 32,77 %, в 2020 году - 18,44 %, в 2021 году - 20,37 % от общего числа заболевших животных с высокой летальностью в период новорождённости. 2. Культивирование Lactobacillus acidophilus K-1-T и пребиотика лактулозы в концентрации 4,4 % (мас/объем) на среде MRS сокращает время достижения мак­ симальной стационарной фазы до 18-24 часов с увеличением частоты клеточного деления и нарастанием числа клеток до 10,200+0,526 lg КОЕ/мл (Р<0,05), что в сравнении контрольной группой выше на 48,53 %. 3. Консорциум пробиотических микроорганизмов Lactobacillus acidophilus K-1-T и Enterococcus faecium УДС 86 обладает высокой антагонистической ак­ тивностью в отношении тест-культур Escherichia coli K-12 J53, Citrobacter freundii ATCC 8090 и средней антагонистической активностью в отношении тест- культуры Staphylococcus aureus ATTCC 6538P5. 4. Включение разработанного синбиотического средства в рацион кормления морским свинкам к 10 суткам снижает содержание бактерий группы БГКП во вто­ рой опытной группе на 37,7 %, увеличивает количество лактобактерий на 23,5 % и энтерококков на 13,5 % в сравнении с контрольной группой. 5. Наиболее значимые показатели микробиоценоза желудочно-кишечного тракта были выявлены у телят второй опытной группы, где на 10-е сутки уста­ новлено увеличение количества пробиотической микрофлоры в сравнении с те­ лятами из первой опытной и контрольной групп: Enterococcus spp. выше на 22,6 и 29,9 %, Lactobacillus spp. - на 16,4 и 21,1 % и Bifidobacterium spp. - на 6,8 и 11,4 %. Снижается количество условно-патогенных микроорганизмов - E. coli­ lac. (-) на 18,0 и 27,3 %. 6. Синбиотическое средство оказывает положительное влияние на качествен­ ный состав сыворотки крови, характеризующееся увеличением общего белка к 7 и 10 суткам на 9,4 и 11,5 % и альбуминовых белковых фракций - на 15,0 и 13,2 % в сравнении с контрольной группой. 7. Фагоцитарная активность нейтрофильных клеток крови на 7-е и 10-е сутки у телят опытной группы составила 44,20±0,86 % (Р<0,05) и 46,20±0,98 % (Р<0,05) в сравнении с особями из контрольной группы, выше на 3,2 и 5,2 %, что свиде­ тельствует об устойчивости телят к инфекционным агентам. 8. Расчётами по экономической эффективности установлено, что максималь­ ная прибыль в опытной группе составила 19913 рублей, что на 13067 рублей выше, чем в контрольной группе. Экономический эффект на 1 рубль затрат равен 6,2 рублям. Практические предложения 1. Для профилактики желудочно-кишечных заболеваний у новорождённых телят рекомендуется применять синбиотическое средство (патент на изобретение РФ № 2 758 066 от 26.10.2021) за два часа до утреннего кормления перорально один раз в сутки из расчёта 2 мл на 1 кг живой массы тела с первого дня жизни в течение 10 дней. 2. Внедрение в ветеринарную практику СПК «Племзавод Вторая Пятилет­ ка» и ООО «ХЛЕБОРОБ» программы для ЭВМ «Мониторинг и прогнозирова­ ние физиологической адаптации молодняка крупного рогатого скота в раннем постнатальном онтогенезе с предупреждением нарушений функций желудочно­ кишечного тракта» (Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2020665892 от 02.12.2020), предназначенной для выявления потен­ циальных сбоев физиологической адаптации новорождённых телят с нарушени­ ем функций желудочно-кишечного тракта в животноводческих комплексах, будет способствовать снижению риска появления патологических состояний у телят и оптимизирует работу ветеринарных специалистов. 3. Внедрение в ветеринарную практику программы для ЭВМ «Программа вы­ числения общего микробного числа (ОМЧ) в биоматериале» (Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2021614399 от 24.03.2021), предназначенной для вычисления общего микробного числа (ОМЧ) с учётом тра­ диционной микробиологической методики. 4. Результаты научных исследований могут быть использованы для составле­ ния методических рекомендаций и учебных пособий, чтения лекций и проведе­ ния лабораторно-практических занятий в учебных заведениях биологического и ветеринарного профиля, а также в научно-исследовательской работе. Перспективы дальнейшей разработки темы Предполагается совершенствование разработки биологически активных средств на основе пробиотических культур микроорганизмов, повышение их био­ логической активности, обеспечение антагонистического эффекта в отношении более широкого спектра условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, проведение широких производственных испытаний эффективности полученных средств для профилактики желудочно-кишечных заболеваниях животных.