Патологоанатомическая и комплексная гистобактериоскопическая характеристика отдельных форм туберкулёза, в том числе в сочетании с ВИЧ-инфекцией

Исследовано три группы: 1 – контрольная группа, представленная пациентами свпервые выявленным посмертно туберкулѐзом (на базе городского бюро судебно-медицинской экспертизы), 2 – пациенты с сочетанием туберкулѐза и ВИЧ-инфекции (на базе СПб ГБУЗ «Больница Боткина»), 3 – пациенты с длительно протекавшим фиброзно-кавернозным туберкулѐзом (на базе СПб ГБУЗ «Туберкулѐзная больница No 8»).
Кусочки лѐгких для гистологического исследования фиксировались в 10 %-ом нейтральном формалине с последующей проводкой в спиртах (аппарат Thermo Fisher Scientific STP 120) и заливкой в парафин (аппарат Thermo Fisher Scientific EC 350) по общепринятым методикам. Срезы вручную окрашивались гематоксилином-эозином, карболовым фуксином по Цилю – Нильсену (приготовленным по классической прописи Циля c использованием основного фуксина (C.I. 42510) производства Panreac, Испания), аурамином-родамином (приготовленным по классической прописи Купера с использованием Аурамина О (C.I. 41 000) и Родамина В (C.I. 45 170) производства Merck, Германия) с последующим исследованием с помощью флюоресцентного микроскопа Nikon Eclipse 50i. Также производилось иммуногистохимическое исследование с использованием поликлональных антител PA1-7231 к антигену РАВ (Protein antigen B), производства Thermo (США), в разведении 1 к 250.
Исследование включало в себя оценку выраженности морфологических изменений в области каверн и активности туберкулѐзного процесса по классификации Б. М. Ариэля (Ариэль Б. М., Ковальский Г. Б., Блюм Н. М., Беллендир Э. Н., 2009) (5степеней воспаления: от 1-й, минимальной (затихший туберкулѐз), до 5-й, максимальной (остро прогрессирующий туберкулѐз), подсчѐт количества микобактерий на площади 1 кв. см при увеличении ×400 (диаметр поля зрения 0,50 мм) и количества полей зрения, в которых они визуализируются, соотношения между различными морфологическими формами возбудителя (палочковидными, кокковидными, булавовидными и ветвящимися), а также их локализации (внутриклеточно, внеклеточно либо в виде адгезированных на поверхности фагоцитов).
Статистическая обработка выполнена в программах Statistica 6.0 (StatSoft, США) и Microsoft Excel 2010. Она включала в себя оценку нормальности распределения и значимости различий.
Оценка нормальности выборки выполнялась посредством вычисления критерия согласия Пирсона. Наблюдаемое значение критерия Пирсона сравнивалось с критической областью и, в случае, если Кнабл < Kkp, считалось справедливым предположение о том, что данные выборки имеют нормальное распределение. После доказательства нормального характера распределения и оценки соотношения различных морфологических форм микобактерий подсчитывалось среднее значение и вычислялось стандартное отклонение. Значимость различий между методами исследования оценивалась путѐм вычисления критерия Стьюдента. Полученный результат сравнивался с критическими значениями с доверительной вероятностью d = 0,95. В случае, если tнабл > tkp, различия признавались значимыми.
Пациенты с впервые выявленным посмертно туберкулёзом. В качестве контрольной группы выбраны пациенты с впервые выявленным посмертно туберкулѐзом.
Критерии включения: туберкулѐз в качестве первоначальной причины смерти, отсутствие пациента на учѐте в противотуберкулѐзном диспансере, отсутствие ранее проведѐнного специфического лечения.
Критерии исключения: наличие ВИЧ-инфекции или иных иммуносупрессивных состояний, инфицирование M. Avium или M. Bovis.
На базе городского бюро судебно-медицинской экспертизы было изучено 12(9мужчин и 3женщины) аутопсийных наблюдений. Средний возраст составил (61,25 ± 11,62) года. У всех пациентов туберкулѐз был впервые выявлен посмертно, научѐте в противотуберкулѐзном диспансере ни один не состоял, следовательно, не получал противотуберкулѐзную терапию. Отсутствие сочетания с ВИЧ-инфекцией во всех исследованных случаях было установлено в ходе проходившего параллельно исследования случаев посмертной диагностики ВИЧ-инфекции. Иных заболеваний или состояний, сопровождающихся иммуносупрессией, в частности сахарного диабета либо терапии глюкокортикостероидами, ни в одном из наблюдений при анализе поликлинических статкарт отмечено не было. На вскрытии во всех случаях были обнаружены каверны, однако в четырѐх наблюдениях картина фиброзно-кавернозного туберкулѐза дополнялась признаками генерализации процесса, проявившимися в виде поражения внутригрудных лимфоузлов, почек и селезѐнки.
Пациенты с сочетанием туберкулёза и ВИЧ-инфекции. На базе СПб ГБУЗ «Больница Боткина» проведѐн анализ аутопсийного материала за 2018 год (736вскрытий): анамнез, клинические данные, результаты прижизненных и посмертных исследований.
Критерии включения: верифицированный туберкулѐз в сочетании с ВИЧ-инфекцией в стадии 4В.
Критерии исключения: наличие иных иммуносупрессивных состояний, кроме ВИЧ, инфицирование M. Avium или M. Bovis.
Подробно изучено 8 (5 мужчин и 3 женщины) аутопсийных наблюдений с сочетанием туберкулѐза (наличие M. Avium и M. Bovis исключено) и ВИЧ-инфекции. Средний возраст составил (38,25 ± 1,9) года. У всех пациентов была верифицирована ВИЧ-инфекция в стадии 4В с прогрессированием, сопровождавшаяся кахексией и орофарингеальным кандидозом. В трѐх случаях имелся хронический вирусный гепатит С, в остальных пяти – сочетание вирусных гепатитов В и С. В половине случаев АРВТ не проводилась (–), в половине – была начата (+/–), но самовольно прекращена пациентом, в связи с чем влияния на картину заболевания не оказала. Во всех случаях в анамнезе имела место наркотическая зависимость от опиатов. В 4 случаях туберкулѐз был выявлен ранее (давность составляла от 1 года до 3 лет, данных о полноценной противотуберкулѐзной терапии и еѐ результатах анамнестически не получено), и в 4 случаях туберкулѐз был выявлен впервые в данную госпитализацию.
У всех пациентов был клинически, рентгенологически и лабораторно верифицированный генерализованный туберкулѐз в фазе прогрессирования, указанный во всех случаях в качестве непосредственной причины смерти. Морфологические формы туберкулѐза значительно разнились, в различных сочетаниях встречался инфильтративный и фиброзно-очаговый туберкулѐз лѐгких, туберкулѐзный плеврит, туберкулѐз внутригрудных, надключичных, подмышечных, забрюшинных и мезентериальных лимфатических узлов, туберкулѐзный спондилит и сакроилеит, туберкулѐз почек, надпочечников, печени, селезѐнки, тонкой и слепой кишки.
В числе осложнений, как правило, встречалась анемия, гидроторакс, отѐк лѐгких, отѐк головного мозга, почечная и печѐночная недостаточность. В качестве сопутствующих заболеваний часто встречались хронический панкреатит и начальные стадии атеросклероза аорты. Иных заболеваний или состояний, сопровождающихся иммуносупрессией, в частности сахарного диабета либо терапии глюкокортикостероидами, ни в одном из наблюдений отмечено не было.
Пациенты с фиброзно-кавернозным туберкулёзом. Было изучено 24 аутопсийных случая клинически, рентгенологически и микробиологически (наличие M. Avium и M. Bovis исключено) верифицированного фиброзно-кавернозного туберкулѐза лѐгких.
Критерии включения: фиброзно-кавернозный туберкулѐз в качестве первоначальной причины смерти, проведение специфического лечения в стационаре.
Критерии исключения: наличие ВИЧ-инфекции или иных иммуносупрессивных состояний, инфицирование M. Avium или M. Bovis.
Большинство (22) пациентов – мужчины, средний возраст (49,67 ± 5,77) года. Во всех наблюдениях имело место длительное течение заболевания и продолжительное лечение в профильных стационарах. У большей части пациентов была зафиксирована широкая (14 случаев ШЛУ МБТ) либо множественная (5 случаев МЛУ МБТ) лекарственная устойчивость (т.е. невосприимчивость заболевания, соответственно, к четырѐм противотуберкулѐзным препаратам первой линии (изониазиду, рифампицину, фторхинолонам и аминогликозидам) или двум первым).
Ни в одном из случаев не имелось сочетания туберкулѐза с ВИЧ-инфекцией (в условиях стационара все пациенты в обязательном порядке проходили исследование на ВИЧ-инфекцию). Также не было отмечено иных заболеваний или состояний, сопровождающихся иммуносупрессией, в частности сахарного диабета либо терапии глюкокортикостероидами.
Непосредственной причиной смерти большинства пациентов стала интоксикация вследствие прогрессирования инфекционного процесса, также были зафиксированы случаи смерти от лѐгочного кровотечения, тромбоэмболии лѐгочной артерии и сердечно-лѐгочной недостаточности. На вскрытии диагноз фиброзно-кавернозного туберкулѐза во всех случаях подтверждѐн.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты исследования пациентов с впервые выявленным туберкулёзом. Все случаи туберкулѐза, впервые выявленного посмертно, характеризовались признаками фиброзно-кавернозного туберкулѐза (в четырѐх случаях – с явлениями генерализации). У всех пациентов туберкулѐз был впервые выявлен посмертно, следовательно ни один из них не получал противотуберкулѐзную терапию. На вскрытии во всех случаях были обнаружены каверны, однако в четырѐх наблюдениях картина фиброзно-кавернозного туберкулѐза дополнялась признаками генерализации процесса,
проявившимися в виде поражения внутригрудных лимфоузлов, почек и селезѐнки.
При окраске гематоксилином и эозином во всех наблюдениях выявлены характерные для туберкулѐза изменения, соответствующие прогрессированию инфекционного процесса (активность IV-V степени по классификации Б. М. Ариэля): крупные каверны с широкой фиброзной капсулой, в стенках каверн и в окружающей лѐгочной ткани определялись гранулѐмы и более крупные очаги отсева, представленные округлыми эозинофильными фокусами казеозного некроза с мелкими фрагментами клеточного детрита различного размера, окружѐнными клеточным валом, представленным лимфоцитами, плазмоцитами и, в большей степени, макрофагами с эпителиоидоклеточной трансформацией и тенденцией к слиянию с формированием единичных гигантских многоядерных клеток Лангганса типичного строения
с примесью единичных нейтрофильных гранулоцитов.
При окраске карболовым фуксином по Цилю – Нильсену в патологических очагах
обнаружены единичные скопления внеклеточно расположенных кислотоустойчивых бактерий в среднем менее чем в 10 полях зрения общим числом 608,33 ± 78,79 (от 400 до 800). Подавляющее большинство, в среднем (96,42 ± 0,88) % (95–99 %) возбудителей, имело палочковидную форму, также встречались кокковидные формы, в среднем (3±0,61)% (1–4%), на прочие морфологические формы, вместе взятые, приходилось менее 1 % наблюдаемых микобактерий.
При окраске аурамином-родамином и последующем исследовании во флюоресцентном микроскопе обнаружены очаговые скопления внеклеточно расположенных микобактерий в 10–50 полях зрения, общим числом 3 208,33 ± 478,13 (от 2000 до 4500), преимущественно палочковидных, в среднем (92,58±1,07)% (90–95 %), а также кокковидных (5,25 ± 0,55) % (4–7 %), гранул (1,58 ± 0,33) % (1–2 %) и булавовидных (0,58 ± 0,33) % (0–1 %) форм микобактерий.
При ИГХ-исследовании обнаружены множественные скопления внеклеточно расположенных микобактерий более чем в 50полях зрения общим числом 6 916,67 ± 632,96 (от 6 000 до 9 000), характеризовавшихся чуть большим разнообразием форм: на палочки приходилось в среднем (84,58 ± 2,04) % (77–88 %), на кокковидные (9,17 ± 1,21) % (7–14 %), на гранулы (2,83 ± 0,53) % (2–4 %), на булавовидные (1,83 ± 0,37) % (1–3 %) и на ветвящиеся (1,58 ± 0,33) % (1–2 %).
В результате общее число выявленных микобактерий при окраске аурамином-родамином значимо (tнабл = 12,5; tКр (0,05) = 2,07) больше, чем при окраске по Цилю–Нильсену. Общее число выявленных микобактерий при помощи ИГХ значимо (tнабл = 21,8; tКр (0,05) = 2,07) больше, чем при окраске по Цилю – Нильсену и значимо (tнабл = 10,3; tКр (0,05) = 2,07) больше, чем при окраске аурамином-родамином.
Доля типичных палочек, выявленных посредством классической окраски по Цилю – Нильсену, значимо (tнабл = 6,2; tКр(0,05) = 2,07), но ненамного, больше таковой, выявленной при окраске аурамином-родамином, и значимо (tнабл = 11,8; tКр (0,05) = 2,07) больше, чем при проведении ИГХ. Показатели для атипичных морфологических форм микобактерий при сравнении методов разнятся незначительно.
Результаты исследования пациентов с сочетанием туберкулёза и ВИЧ-инфекции. Проанализированы результаты 736 вскрытий, проведѐнных впатологоанатомическом отделении СПб ГБУЗ «Больница Боткина» за 2018 г. Наиболее часто (357 наблюдений) в качестве основного заболевания рассматривали ВИЧ-инфекцию. Ведущим было сочетание ВИЧ-инфекции и туберкулѐза, установленное в 86 (24,1 %) случаях. Среди других вторичных заболеваний наиболее частыми были случаи пневмоцистоза лѐгких (51 или 14,3 %), лимфом (31 или 8,7 %, в том числе головного мозга 9 или 2,5 %), токсоплазмоза головного мозга (36 или 10,1 %) и пневмонии различной смешанной этиологии (36 или 10,1 %),
менингоэнцефалитов и энцефалитов различной этиологии (30 или 8,4%), прогрессирующей мультифокальной лейкоэнцефалопатии (25 или 7,0 %), нетуберкулѐзного микобактериоза и криптококкоза (по 17 или 4,8 %).
Большинство пациентов, умерших при сочетанных поражениях ВИЧ + туберкулѐз (52 или 60,4 %), были в возрасте от 31 года до 40 лет, 27 (31,4 %) пациентов – от 41 года до 50 лет, 6(7,0%) – от 21года до 30 лет, 1(1,2%) – от 51года до 60лет. Среди пациентов преобладали мужчины (61 мужчина или 71%; 25 женщин или 29%). Пациенты (55 или 64 %) провели в стационаре более 7 койко-дней, причѐм длительность госпитализации некоторых превышала 2–3 месяца (два наибольших показателя – 143 и 288 койко-дней), 14 (16,3 %) пациентов провели от 1 до 3 суток, 12 (14,0 %) – от 4 до 7 суток, 4 пациента умерли, находясь в стационаре менее суток.
У всех пациентов на момент летального исхода стадия ВИЧ-инфекции расценивалась как 4В. В 64 (74,4 %) случаях в анамнезе имелась зависимость от наркотиков, однако при анализе оставшихся 22 случаев обращали на себя внимание часто встречавшиеся косвенные признаки длительного приема инъекционных опиатов, которые по объективным или субъективным причинам не трактовались лечащими врачами как достаточный повод для постановки диагноза наркомании.
Давность диагностики ВИЧ-инфекции сильно варьировала: наряду с 19 (22,1 %) случаями заболевания, впервые выявленного при последней госпитализации, имелись 33 (38,4 %) случая, когда диагностированное заболевание длилось в течение 10–19 лет. Полноценная АРВТ проведена лишь 10(11,6%) пациентам, 29(33,7%) пациентов лечились не систематически, оставшиеся 47 (54,7 %) – лечения не получали. Уровень CD4+ Т-лимфоцитов у 42(48,8%) пациентов составлял менее 50кл/мл, у 26 (30,2 %) – менее 100 кл/мл (у прочих данный показатель неизвестен).
Туберкулѐз в 62 (72,1 %) случаях был выявлен впервые при данной госпитализации, причѐм в 16 из них лишь при патологоанатомическом исследовании, как правило, при кратковременном пребывании пациента в стационаре. Из оставшихся 24случаев только в 16 имеется упоминание о противотуберкулѐзной терапии (длительность от 1 года до 17 лет), но без уточнения еѐ полноценности и систематичности. В 4 случаях известно о формировании множественной лекарственной устойчивости и в 1 – о широкой лекарственной устойчивости возбудителя.
Помимо лѐгких, внутригрудных лимфатических узлов и плевры наиболее часто отмечалось туберкулѐзное поражение селезѐнки (57 или 66,3 %), почек (47 или 54,7 %), оболочек и вещества головного мозга (26 или 30,2 %), печени (25 или 29,1 %), тонкой и толстой кишки, особенно в области илеоцекального угла (20 или 23,3 %, как правило, сразвитием перитонита). Реже встречался туберкулѐзный эпинефрит, спондилит, ретинит, аднексит, перикардит. Во всех наблюдениях выявлено прогрессирование туберкулѐзного процесса, при этом характер воспалительных изменений представлен
альтеративным и гранулематозным компонентами с преобладанием альтерации. В 14 случаях (16,3 %) гранулематозная реакция была практически не выражена.
У 44 (51,2 %) пациентов имелось сочетание с хроническими вирусными гепатитами (ХВГ) В и С, у 30 – ХВГ С, у 4 – ХВГ В. Во всех случаях были описаны умеренные структурные изменения печени, при этом ни в одном из них ХВГ не сыграл существенную роль в танатогенезе. Среди вторичных заболеваний наиболее часто (66 или 76,7 %) выявлялся кандидоз (локализация варьировала от орофарингеального поражения и эзофагита до тотального энтероколита). Реже встречались псевдомембранозный колит (3 или 3,5 %), цитомегаловирусная инфекция (3 или 3,5 %), сальмонеллѐз (2 или 2,3 %) и аспергиллѐз (1 или 1,2 %).
Из сопутствующих заболеваний наиболее часто регистрировался хронический панкреатит (33 случая), вероятно, связанный с алкогольной зависимостью многих умерших. В старших возрастных группах изредка имелись умеренно выраженные признаки гипертонический и ишемической болезни сердца, желчнокаменной болезни и хронического пиелонефрита. Описан один случай неходжкинской лимфомы.
В одном наблюдении смерть женщины, связанная с прогрессированием туберкулѐза легких, плевры, внутригрудных лимфатических узлов и селезѐнки на фоне ВИЧ-инфекции 4В стадии, произошла вскоре после самопроизвольного выкидыша на 17-й неделе гестации.
Проведено более подробное комплексное морфологическое исследование 8аутопсийных наблюдений (5мужчин и 3женщины) с сочетанием туберкулеза и ВИЧ-инфекции.
Во всех случаях протекания туберкулѐза в сочетании с ВИЧ-инфекцией в стадии 4В была выявлена генерализация туберкулѐзного процесса при значительном разнообразии его морфологических форм (инфильтративный и фиброзно-очаговый туберкулѐз лѐгких, туберкулѐзный плеврит, туберкулѐз внутригрудных, надключичных, подмышечных, забрюшинных и мезентериальных лимфатических узлов, туберкулѐзный спондилит и сакроилеит, туберкулѐз почек, надпочечников, печени, селезѐнки, тонкой и слепой кишки).
При окраске гематоксилином и эозином во всех наблюдениях выявлена крайне разнообразная и неоднородная картина, значительно отличающаяся от «классического» гранулематозного воспаления при туберкулѐзе (Рисунок 1). Эозинофильные фокусы казеозного некроза различной формы (округлой либо неправильной) и размера (от мелких до субтотально замещающих ткань лѐгкого на микропрепарате) в различном количестве зачастую сочетались с очагами гнойного расплавления ткани, вызванного, наиболее вероятно, сочетанной микробиотой. В одном случае были обнаружены фрагменты мицелия грибов (предположительно – рода Candida), не вовлечѐнные в вызванное основным возбудителем воспаление.
Рисунок 1 – Туберкулѐз в сочетании с ВИЧ-инфекцией. Скудный клеточный компонент туберкулѐзной гранулѐмы. Окраска гематоксилином и эозином. ×100
По периферии очагов казеозного некроза обнаруживался порой крайне скудный клеточный вал, представленный немногочисленными эпителиоидными клетками и единичными лимфоцитами, а также значительным количеством нейтрофильных гранулоцитов. Выраженность гранулематозной реакции не коррелировала с объѐмом некроза и даже в пределах одного микропрепарата колебалась от едва заметной доумеренно выраженной, изредка – с формированием одной-двух гигантских многоядерных клеток Лангганса, многие из которых были сравнительно небольших размеров.
Значимого фиброза в области очагов туберкулѐзного поражения не выявлено, что не позволило достоверно судить о длительности течения процесса.
При окраске карболовым фуксином по Цилю–Нильсену в патологических очагах обнаружены единичные скопления внеклеточно расположенных кислотоустойчивых бактерий в среднем менее чем в 10 полях зрения общим числом в среднем 475 ± 139,54 (от 300 до 800). Подавляющее большинство (93,13 ± 2,16) % (90–95 %) возбудителей имело палочковидную форму, также встречались кокковидные формы (5,39 ± 2) % (2–9 %), на прочие морфологические формы, вместе взятые, приходилось менее 3 % наблюдаемых микобактерий.
При окраске аурамином-родамином и последующем исследовании во флюоресцентном микроскопе обнаружены очаговые скопления внеклеточно
расположенных микобактерий в 10–20 полях зрения, общим числом в среднем 1 462,5 ± 189,26 (от 1 100 до 1 800), преимущественно палочковидных (86,75 ± 2,4) % (83–89 %), а также кокковидных (8,13 ± 2,34) % (5–12 %), гранул (2,88 ± 0,7) % (2–4 %), булавовидных (1,63 ± 0,43) % (1–2 %) и ветвящихся (до 1 %) форм микобактерий.
При ИГХ-исследовании обнаружены скопления внеклеточно расположенных микобактерий более чем в 10–30 полях зрения общим числом в среднем 2 487,5 ± 121,87 (от 2 300 до 2 700), характеризовавшиеся чуть большим разнообразием форм: на палочки приходилось (79 ± 2,64) % (75–83 %), на кокковидные (12,75 ± 2,13) % (10–16 %), на гранулы (4,13 ± 0,7) % (3–5 %), на булавовидные (2,75 ± 0,39) % (2–3 %) и на ветвящиеся (1,38 ± 0,43) % (1–2 %).
Важно отметить, что морфологическая картина туберкулѐза, протекающего на фоне ВИЧ-инфекции, зафиксированная во всех наблюдениях, характеризовалась как выраженной альтерацией (вплоть до субтотальной казеозной трансформации тканей), так и значительным разнообразием морфологических форм.
Фактически в каждом исследованном случае было зафиксировано сочетание двух и более традиционно описываемых форм. Наиболее часто отмечалось соседство фокусов поражения по типу очагового туберкулѐза с относительно чѐтко очерченными контурами (когда по периферии имелись элементы эпителиоидоклеточной гранулѐмы) и фокусов казеозной пневмонии, когда сливающиеся очаги некроза практически ничем не были отграничены от окружающих тканей.
Дополнительно к этому обнаружены инкапсулированные очаги казеозного некроза, подпадающие под характеристику туберкулѐмы, а также образовавшиеся в результате распада ткани полости, по сути представляющие из себя каверны. Все перечисленные элементы дополнялись отмеченными во всех наблюдениях поражениями внутригрудных лимфатических узлов и плевры.
Столь полиморфная картина туберкулѐзного поражения, при которой имеется сочетание инфильтративной, очаговой, кавернозной, диссеминированной форм заболевания, казеозной пневмонии, туберкулѐм, лимфаденита и плеврита, демонстрирует несовершенство используемой классификации туберкулѐза, предполагающей чѐткое разграничение и стадийность морфологических форм.
При стандартной гистобактериоскопии число кислотоустойчивых палочек оказалось сравнительно небольшим, несмотря на очевидные морфологические признаки чрезвычайно высокой активности туберкулѐзного процесса. При этом количество обнаруженных микобактерий при использовании альтернативных методов превышало таковое при классической окраске по Цилю – Нильсену.
Тем не менее, в отличие от ранее исследованных случаев длительно протекавшего фиброзно-кавернозного туберкулѐза, сопровождавшегося многолетней
терапией (с формированием лекарственной устойчивости различной степени выраженности), у пациентов с сочетанием туберкулѐза и ВИЧ-инфекции, практически не имевших в анамнезе специфической терапии, разнообразие морфологических форм возбудителя было сравнительно небольшим, хотя и имелась тенденция к увеличению доли атипичных форм микобактерий при окраске аурамином-родамином и иммуногистохимическом исследовании. Так же, как и в ходе исследования пациентов с длительно протекавшим фиброзно-кавернозным туберкулѐзом, не удалось достоверно зафиксировать внутриклеточного расположения микобактерий при всех использованных нами методах.
В результате общее число выявленных микобактерий при окраске аурамином-родамином значимо (tнабл = 9,9; tКр (0,05) = 2,14) больше, чем при окраске по Цилю – Нильсену. Общее число выявленных микобактерий при помощи ИГХ значимо (tнабл = 25,7; tКр (0,05) = 2,14) больше, чем при окраске по Цилю – Нильсену, и значимо (tнабл = 10,8; tКр (0,05) = 2,14) больше, чем при окраске аурамином-родамином.
Доля типичных палочек, выявленных посредством классической окраски по Цилю – Нильсену, значимо (tнабл = 4,7; tКр (0,05) = 2,14), но ненамного больше таковой, выявленной при окраске аурамином-родамином, и значимо (tнабл = 9,8; tКр (0,05) = 2,14) больше, чем при проведении ИГХ. Показатели для атипичных морфологических форм микобактерий при сравнении методов разнятся незначительно.
Результаты исследования пациентов с фиброзно-кавернозным туберкулёзом без сочетания с ВИЧ-инфекцией. Во всех изученных наблюдениях в качестве основного заболевания был подтверждѐн фиброзно-кавернозный туберкулѐз лѐгких, при этом анамнез, возраст, длительность заболевания, клинико-морфологические особенности протекания заболевания у пациентов существенно варьировали.
Одни пациенты на момент поступления относились к категории лиц без определѐнного места жительства (6 наблюдений), в то время как другие были в той или иной степени социально адаптированы, официально трудоустроены и т.д. В дополнение к вопросу о социальных аспектах заболевания необходимо отметить, что ряд пациентов имел в анамнезе нахождение в местах лишения свободы.
Сильно разнились осложнения основного заболевания: в одних случаях они развивались лишь в терминальной стадии непосредственно перед летальным исходом, вдругих же, напротив, имелась развѐрнутая картина хронической дыхательной недостаточности II-III степени с формированием хронического лѐгочного сердца, кахексия, энцефалопатия и кардиомиопатия вследствие выраженной длительной интоксикации, амилоидоз почек.
Неоднородной была и рентгенологическая картина заболевания у разных пациентов: варьировали размер, количество и локализация каверн, наличие и выраженность фокусов перикавитарной, ацинарной и лобулярной инфильтрации,
степень периваскулярного, перибронхиального и диффузного пневмосклероза (с наличием или отсутствием межплевральных спаек), выраженность внутригрудной лимфаденопатии (преимущественно паратрахеальных, бифуркационных и бронхопульмональных лимфатических узлов).
В качестве сопутствующих заболеваний чаще всего встречался атеросклеротический кардиосклероз (у пациентов старческого возраста), хронический индуративный панкреатит (у асоциальных, злоупотребляющих алкоголем пациентов), и различные формы хронической обструктивной болезни лѐгких.
На вскрытии во всех случаях инфекционный процесс был неоднородным: классическая картина фиброзно-кавернозного туберкулѐза дополнялась другими изменениями в самых различных сочетаниях. Описывались одиночные и сливающиеся очаги инфильтрации, обширные поля некроза по типу казеозной пневмонии, мелкие милиарные фокусы диссеминации, старые щелевидные полости, кальцификаты.
Таким образом, можно сделать вывод, что встречающиеся в практике случаи часто не укладываются в привычную классификацию, предполагающую строгое деление вторичного туберкулѐза на определѐнные формы.
При окраске гематоксилином и эозином во всех наблюдениях выявлены характерные для туберкулѐза изменения, соответствующие прогрессированию инфекционного процесса (активность IV-V степени по классификации Б. М. Ариэля): крупные каверны с широкой фиброзной капсулой, в стенках каверн и в окружающей лѐгочной ткани определялись гранулѐмы и более крупные очаги отсева, представленные округлыми эозинофильными фокусами казеозного некроза с мелкими фрагментами клеточного детрита различного размера, окружѐнными клеточным валом, представленным лимфоцитами, плазмоцитами и, в большей степени, макрофагами с эпителиоидоклеточной трансформацией и тенденцией к слиянию с формированием единичных гигантских многоядерных клеток Лангганса типичного строения (сориентацией ядер по периферии) с примесью единичных нейтрофильных гранулоцитов. В других полях зрения отмечалось утолщение межальвеолярных перегородок за счѐт фиброза, дистелектазы, очаговый антракоз, умеренный интерстициальный и альвеолярный отѐк, паретическое полнокровие сосудов, очаговые диапедезные кровоизлияния. Бронхи малого и среднего размера характеризовались лимфоцитарной инфильтрацией, склерозом, гипертрофией мышечного слоя, очаговой атрофией мерцательного эпителия.
При окраске карболовым фуксином по Цилю–Нильсену в патологических очагах обнаружены единичные скопления внеклеточно расположенных кислотоустойчивых бактерий в среднем менее чем в 10 полях зрения общим числом в среднем 558,33 ± 62,16 (от 300 до 800). Подавляющее большинство (88,13 ± 2,14) % (85–95 %) возбудителей имело палочковидную форму, также встречались кокковидные
формы (9,33 ± 1,17) % (5–13 %), на прочие морфологические формы, вместе взятые, приходилось менее 3 % наблюдаемых микобактерий (Рисунок 2).
Рисунок 2 – Кислотоустойчивые палочки. Окраска карболовым фуксином по Цилю – Нильсену. ×1000
При окраске аурамином-родамином и последующем исследовании во флюоресцентном микроскопе обнаружены очаговые скопления внеклеточно расположенных микобактерий в 10–50 полях зрения, общим числом в среднем 5583,33±796,5 (от 3000 до 9000), преимущественно палочковидных, в среднем (64,38 ± 4,24) % (50–85 %), а также кокковидных (27,29 ± 3,84) % (10–45 %), гранул (6 ± 1,09) % (2–10 %), булавовидных (1,96 ± 0,6) % (1–5 %) и ветвящихся (до 1 %) форм микобактерий (Рисунок 3).
Рисунок 3 – Палочковидные и атипичные формы микобактерий. Окраска аурамином-родамином. Флюоресцентная микроскопия. ×1000
При ИГХ-исследовании обнаружены множественные скопления внеклеточно расположенных микобактерий более чем в 50 полях зрения общим числом в среднем 12 916,67 ± 834,52 (от 10 000 до 16 000), характеризовавшиеся большим разнообразием форм: на палочки приходилось в среднем (57,29 ± 2,78) % (50–70 %), на кокковидные (28,71 ± 2,31) % (20–39 %), на гранулы (9,04 ± 1,04) % (5–13 %), на булавовидные (3,71 ± 0,64) % (1–7 %) и на ветвящиеся (1,25 ± 0,47) % (1–3 %) (Рисунок 4).
Рисунок 4 – Атипичные морфологические формы микобактерий. ИГХ. ×1000
В результате общее число выявленных микобактерий при окраске аурамином-родамином значимо (tнабл = 13, tКр (0,05) = 2,01) больше, чем при окраске по Цилю – Нильсену. Общее число выявленных микобактерий при помощи ИГХ значимо (tнабл = 30,6; tКр (0,05) = 2,01) больше, чем при окраске по Цилю – Нильсену, и значимо (tнабл = 13,2; tКр (0,05) = 2,01) больше, чем при окраске аурамином-родамином.
Доля типичных палочек, выявленных посредством классической окраски по Цилю – Нильсену, значимо (tнабл = 10,4; tКр (0,05) = 2,01) больше таковой, выявленной при окраске аурамином-родамином, и значимо (tнабл = 18,2; tКр (0,05) = 2,01) больше, чем при проведении ИГХ. Столь же сильно разнятся показатели для атипичных морфологических форм микобактерий, выявляемых при окраске по Цилю – Нильсену вминимальном количестве, и обнаруживаемых в большом количестве при флюоресцентном исследовании и ИГХ-исследовании.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
У всех исследованных групп пациентов при использовании окраски аурамином-родамином и иммуногистохимическом исследовании количество обнаруженных микобактерий превышало таковое при классической окраске по Цилю – Нильсену.
В отличие от вошедших в третью группу случаев туберкулѐза, сопровождавшегося многолетней терапией (с формированием лекарственной устойчивости различной степени выраженности), у пациентов с впервые выявленным туберкулѐзом и сочетанием туберкулѐза и ВИЧ-инфекции, не имевших в анамнезе специфической терапии, разнообразие морфологических форм возбудителя было сравнительно небольшим.
Атипичное строение микроорганизмов и их нестандартные тинкториальные свойства наиболее вероятно являются следствием активации целого каскада генетически детерминированных факторов вирулентности, которые за счѐт модификации метаболизма, клеточной стенки и жизненного цикла туберкулѐзных микобактерий позволяют им демонстрировать резистентность к лекарственным препаратам и другим неблагоприятным факторам.
Иммуногистохимическое исследование следует считать наиболее информативным, т. к. если следовать теории, что явление дормантности возбудителя сопровождается полной или частичной потерей им клеточной стенки для последующей внутриклеточной персистенции, то отсутствие окрашивания внутриклеточно расположенных микобактерий карболовым фуксином по Цилю – Нильсену можно было бы объяснить именно структурными изменениями клеточной стенки. Однако ИГХ-исследование не зависит от состояния и компонентов клеточной стенки, следовательно, обеспечивает выявление микобактерий, находящихся на любом этапе жизненного цикла, в т. ч. с изменением своих тинкториальных свойств.
Для оптимизации прижизненной и посмертной морфологической диагностики туберкулѐза наряду с использованием более высококачественного оборудования и расходных материалов целесообразно также помимо классической окраски по Цилю – Нильсену внедрять флюоресцентную микроскопию, желательно в сочетании с ПЦР, для которой с успехом может быть использован фиксированный в формалине и залитый в парафин материал. Существующие сыворотки для иммуногистохимического исследования в настоящее время могут быть рекомендованы для изучения патогенеза заболевания, но не для диагностических целей.
Многие вопросы патогенеза и морфогенеза туберкулѐза нуждаются в комплексном мультидисциплинарном изучении с использованием современных методов.
ВЫВОДЫ
1. Во всех случаях сочетания туберкулѐза и ВИЧ-инфекции в стадии4B зафиксирована тенденция к значительному преобладанию альтеративного компонента над гранулематозным, хотя и без полной утраты способности к формированию гранулѐм. В каждом исследованном случае было зафиксировано сочетание двух и более традиционно описываемых морфологических форм заболевания. Наиболее часто
отмечалось соседство фокусов поражения, где по периферии имелись элементы эпителиоидноклеточной гранулѐмы, и фокусов казеозной пневмонии, когда сливающиеся очаги некроза практически ничем не были отграничены от окружающих тканей. В 16,3 % случаев гранулематозная реакция практически отсутствовала. Помимо поражения внутригрудных лимфатических узлов и плевры в различных сочетаниях встречалось поражение селезѐнки (66,3 % случаев), почек (54,7 % случаев), печени (29,1 % случаев), толстой и тонкой кишки (23,3 % случаев), реже – вещества и оболочек головного мозга, надпочечников, позвоночника.
2. Во всех случаях, когда заболевание протекало на фоне многолетней противотуберкулѐзной терапии с формированием лекарственной устойчивости, отмечена атипичная морфология возбудителя: в зависимости от конкретного метода исследования на кокковидные формы приходилось до 45 %, на гранулы – до 13 %, на булавовидные – до 7 %, на ветвящиеся – до 3 % микобактерий.
3. Во всех случаях впервые выявленного туберкулѐза и сочетания туберкулѐза и ВИЧ-инфекции в условиях отсутствия специфической противотуберкулѐзной терапии морфология возбудителя не претерпевала значительных изменений, в связи с чем большинство (от 79 % до 96 %) микобактерий имели типичную палочковидную морфологию.
4. Туберкулѐзные микобактерии могут иметь различную морфологию, при этом наибольшая доля атипичных форм микобактерий обнаруживается при флюоресцентном (от 7,42 % при впервые выявленном до 35,62 % при длительно протекающем фиброзно-кавернозном туберкулѐзе) и иммуногистохимическом (от 15,42% при впервые выявленном до 42,71 % при длительно протекающем фиброзно-кавернозном туберкулѐзе) исследованиях.
5. Результаты исследования демонстрируют более высокую чувствительность люминесцентной микроскопии и иммуногистохимической реакции по сравнению с окраской по Цилю – Нильсену.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Встречающийся в практике отрицательный или слабоположительный результат окраски по Цилю – Нильсену при одновременном наличии других явных морфологических признаков туберкулѐза не может расцениваться как повод поставить под сомнение диагноз заболевания.
2. Использование флюоресцентного и иммуногистохимического методов позволяет с большей долей вероятности выявлять туберкулѐзные микобактерии в тканях, особенно если речь идѐт об атипичных формах микроорганизмов.
3. Полученные результаты, демонстрирующие атипичную морфологию возбудителя в тканях у пациентов с многолетней противотуберкулѐзной терапией и формированием лекарственной устойчивости, могут быть использованы для
прижизненной диагностики на операционном материале (лоб-, билоб-, пульмонэктомия) с перспективой возможности оценки эффективности лечения.