Ответные реакции растений Nicotiana tabacum L. и Zinnia elegans Jacq. на длительное действие ионов меди в среде

Глава 1. Обзор литературы
Рассмотрена роль меди как эссенциального микроэлемента и как стрессора. Охарактеризовано токсическое действие ионов меди в растениях, роль антиоксидантной системы растений в акклимации к их избытку в среде на биохимическом и анатомо-морфологическом уровне и влияние ионов меди на состав и структуру КС. Описана роль фенольных соединений и лигнина в формировании устойчивости растений к действию абиотических факторов, участие транскрипционных факторов, гормонов и ферментов в регуляции их биосинтеза.
Глава 2. Материалы и методы
Объекты исследования и условия культивирования. Объекты исследования –
табак Nicotiana tabacum L. сорта Petite Havana линии SR1 и цинния Zinnia elegans Jacq. сорта Красная шапочка. В предварительном эксперименте семена проращивали в чашках Петри с водными растворами CuSO4 (50–1000 μM). Контроль – вода.
Биология – наука ХХI века: 23-я
Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых»
В длительном эксперименте растения табака культивировали в смеси из перлита и вермикулита (1 : 1) на среде Кнопа с добавлением 100 или 300 μM CuSO4 в течение 40 дней. Контроль – среда Кнопа.
Растения циннии в течение 20 дней культивировали в сосудах объемом 200 мл с почвенной смесью, состоящей из почвогрунта и кокосового субстрата (3 : 1) с добавлением водных растворов 100 или 200 μM CuSO4. Контрольные растения в течение всего эксперимента поливали дистиллированной водой. Растения культивировали при 23°С и фотопериоде свет / темнота – 16 / 8 часов.
Анатомо-морфологические параметры корня и побега измеряли на 40 день роста у растений табака, на 20 день у циннии. Анатомические характеристики корня и стебля на поперечных срезах, окрашенных солянокислым флороглюцином (Liljegren, 2010), определяли с помощью ПО SimagisMesoplant (ООО «СИАМС», Россия) для Windows 96 после визуализации с использованием светового микроскопа Meiji MT 4300L («MeijiTechno», Япония).
Содержание меди в субстратах (валовая и доступная формы) и растительных тканях измеряли методом атомно-эмиссионной спектроскопии (ICP-AES, iCAP 6500 Duo, ThermoFisher, США) после «мокрого» озоления материала.
Количество пероксида водорода определяли спектрофотометрически по Bellincampi (2000), интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) – по образованию ТБК-реагирующих продуктов (ТБК-РП) по Uchiyama и др. (1978). Содержание фенольных соединений измеряли в спиртовом экстракте (80% этанол) с использованием реактива Фолина-Чокалтеу в пересчете на галловую кислоту (Денисенко и др., 2015). Количество лигнина определяли по методу Класона (Оболенская, 1965).
Активность ферментов оценивали в грубом экстракте (0,05 М Tris-HCl буфере, pH 7,0). Активность СОД определяли по Beauchamp и Fridovich (1971); бензидиновой пероксидазы (БПО) по Goldfischer и Essner (1969); гваяколовой пероксидазы (ГПО) и каталазы по Chance и Maehly (1955). Содержание белка определяли по Bradford (1976), используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин. Все измерения проводили на спектрофотометре Shimadzu UV-1800 («Shimadzu», Япония).
Белковый электрофорез проводили в неденатурирующих условиях в 10% полиакриламидном геле. Изоформы пероксидаз III класса выявляли по модифицированному методу (Lee et al., 2007). После сканирования гелей фотографии обрабатывали в программе ImageJ для Windows 10.
Определение уровня транскриптов генов биосинтеза лигнина. Тотальную РНК выделяли из растительного материала с использованием тризола (TransGenBiotech, КНР), концентрацию РНК определяли спектрофотометрически (NanoDrop ND-1000, ThermoScientific, США). Для синтеза первой цепи кДНК использовали 100 нг тотальной РНК для каждого образца с праймерами Oligo(dT) 23VN и RandomHexamer, согласно инструкциям производителя (HiScript II 1st standart cDNAsynthesis kit, Vasyme, КНР). Количество мРНК оценивали с помощью метода Quantitive real-time PCR в оптическом 96-луночном амплификаторе qTOWER 2.0 (AnalytikJena, Германия) с использованием TransStartTipGreen qPCR SuperMix (TransGenBiotech, КНР). Специфические праймеры для генов PAL1 (номер доступа в NCBI: FM879196), C4H (FM880082), 4CL (AU294519), CAD (FM881026), PRX (AB023959), LAC (AU286008), MYB1 (FM880773), MYB2 (FM881238), ERF1 (FM879695), ERF2 (FM879410), 18S rRNA (AB089282) подбирали с помощью программы GeneRunner 4.0 (www.generunner.net/). Амплификацию проводили в стандартных условиях (1 цикл: 30 с при 94°C; 40 циклов:
5 с при 94°C, 15 с при 60°C и 10 с при 72°C; 5 с при 60°C). Уровень транскриптов определяли с помощью метода 2-ΔΔСt (Livak, Schmittgen, 2001). В качестве референсного гена использовали 18S rRNA.
Статистическая обработка данных. Опыты повторяли трижды. Анализ биохимических и молекулярно-генетических показателей проводили не менее чем в 3 биологических и 5 аналитических повторностях, используя для расчётов достоверности различий U-критерий Манна-Уитни. Для обработки данных о всхожести семян использовали критерий Фишера, для морфо-анатомических параметров объем выборки составил не менее 30 измерений для каждой группы – для расчета достоверности использовали t-критерий Стьюдента. Результаты считали статистически значимыми при p<0,05. Данные в работе представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения. Звездочкой обозначены статистически достоверные отличия. Глава 3. Результаты и их обсуждение 3.1. Реакция растений табака на избыток сульфата меди в среде Влияние сульфата меди на всхожесть семян. Внесение в среду 50–200 μM CuSO4 стимулировало прорастание семян табака. При 300 μM всхожесть не изменялась, тогда как при действии 500 и 1000 μM снижалась. Соотношение валовых и доступных форм меди в субстрате. Смесь перлита с вермикулитом эффективно связывала ионы меди. При внесении в субстрат растворов 100 и 300 μM CuSO4 количество доступных форм меди не превышало 0,2% от ее валового содержания и составило, соответственно, 0,15 и 0,49 мг/кг. Содержание меди в органах. Во всех вариантах опыта медь накапливалась преимущественно в тканях корня табака (рис. 1). Коэффициент транслокации (КТ) стебель/корень и лист/корень не превышал 0,5 – растениям исключателям. это позволяет отнести табак к Рисунок 1. Содержание меди в органах табака при 40- дневной обработке субстрата растворами 100 μM и 300 μM CuSO4 350 250 150 50 0 * * * * * * Р-р Кнопа корень 100 μM стебель 300 μM лист Влияние сульфата меди на анатомо-морфологические параметры. При добавлении в среду раствора сульфата меди в концентрации 100 μM наблюдали стимулирование роста стебля и листьев, а 300 μM – подавление роста корня в длину (табл. 1). В обоих вариантах опыта в сравнении с контролем происходило утолщение корня и стебля (табл. 1) за счет увеличения диаметра стелы и коры (рис. 2). При увеличении содержания меди в тканях (рис. 1) происходило неравномерное отложение лигнина в КС эндодермы, рост количества механических элементов и сосудов ксилемы в проводящем пучке (рис. 3). Эта реакция является неспецифической на действие ТМ (Abdelgawad et al., 2020). Cодержание меди мкг/орган Таблица 1. Масса и морфологические характеристики растений табака (возраст 40 дней) в условиях длительной обработки субстрата 100 μM и 300 μM CuSO4 Вариант Сырая масса растения, г Высота стебля, см Длина главного корня, см Диаметр корня, μм (зона проведения) Диаметр стебля, μм (4-ое междоузлие) Площадь листа, см2 (5 ярус) Контроль (р-р Кнопа) 100 μM CuSO4 300 μM CuSO4 3,7 ± 0,4 4,2 ± 0,6 3,3 ± 0,5 11,1 ± 0,4 12,9 ± 0,5* 12,0 ± 0,6 10,5 ± 0,5 9,6 ± 0,8 7,3 ± 0,8* 1146 ± 58 1593 ± 45* 1764 ± 64* 2598 ± 13 2609 ± 29* 2787 ± 24* 61,0 ± 2,2 68,9 ± 2,4* 57,0 ± 2,3 Рисунок 2. Анатомо-морфологические параметры корня и стебля растений табака при длительной обработке растворами 100 и 300 μM CuSO4: А – диаметр стелы, Б – толщина коры, В – толщина ксилемы в стебле. Рисунок 3. Лигнификация стебля растений табака при 40-дневной обработке 100 и 300 μM CuSO4 (увеличение ×28). Энд – эндодерма, Пк – первичная кора, Кс – ксилема. Содержание фенольных соединений. Накопление меди в растениях табака при длительной обработке субстрата 100 и 300 μM CuSO4 (рис. 1) сопровождалось изменением содержания фенольных соединений в органах растения (табл. 2). В корне, несмотря на увеличение содержания меди в тканях, содержание фенольных соединений уменьшалось в варианте с обработкой 100 μM CuSO4 и не изменялось в варианте с обработкой 300 μM CuSO4. Содержание фенольных соединений в стебле росло, в листьях их концентрация увеличилась в варианте с обработкой субстрата раствором 300 μM CuSO4. Таблица 2. Содержание фенольных соединений (мг/г сухой массы) в тканях табака в условиях длительной обработки субстрата CuSO4 Орган Корень Стебель Лист Контроль (р-р Кнопа) 28,91 ± 0,6 8,76 ± 0,53 28,18 ± 1,57 100 μM CuSO4 23,94 ± 0,99* 11,94 ± 0,43* 25,41 ±1,86 300 μM CuSO4 28,31 ± 1,12 12,34 ± 1,07* 34,38 ± 1,74* Изменение содержания фенольных соединений может быть следствием их синтеза в ФП пути, или при участии хинон-редуктазы, а также их использованием как антиоксидантов и субстратов для лигнификации КС (Michalak, 2006). Содержание Н2О2 и продуктов ПОЛ при действии меди. При длительной обработке субстрата раствором 100 μM CuSO4 содержание пероксида водорода и продуктов ПОЛ в корнях и побеге уменьшалось относительно контроля (табл. 3), а в случае с 300 μM происходило их увеличение. Таблица 3. Количество Н2О2 и ТБК-РП в тканях табака на 40 день роста в условиях длительной обработки субстрата сульфатом меди Вариант Контроль (р-р Кнопа) 100 μM CuSO4 300 μM CuSO4 Н2О2, μM/г сухой массы ТБК-РП, μM/г сухой массы корень 7,7 ± 0,2 * 5,4 ± 0,2 12,3 ± 0,3* стебель 8,5 ± 0,3 5,4 ± 0,3* 9,5 ± 1,6 лист 37,2 ± 0,8 12,0 ± 0,2* 43,2 ± 0,6* корень 42,4 ± 1,6 35,5 ± 1,6* 49,9 ± 0,5* стебель 22,3 ± 1,0 23,8 ± 0,6 33,6 ± 1,7* лист 28,7 ± 2,3 25,8 ± 1,5 59,9 ± 2,7* Активность антиоксидантных ферментов. Длительное внесение в субстрат 100 μM CuSO4 мало изменяло активность СОД, тогда как добавление 300 μM CuSO4 вызывало рост ее активности во всех органах растений (рис. 4 А), что сопровождалось увеличением концентрации продукта реакции – пероксида водорода (табл. 3). Эффект был сильнее выражен в корнях и стеблях, чем в листьях. 1 60 50 40 0,5 30 20 10 00 Корень Стебель Листья Корень Стебель Листья Рисунок 4. Активность СОД (А) и каталазы (Б) в тканях табака в условиях длительной обработки субстрата растворами 100 и 300 μM CuSO4 * * А * * * * *Б * * р-р Кнопа 100 300 р-р Кнопа 100 300 р-р Кнопа 100 300 р-р Кнопа 100 300 р-р Кнопа 100 300 р-р Кнопа 100 300 Условн.единицы / мг белка мМ пероксида водорода/ мг белка×мин И в условиях опыта, и в контрольной группе растений активность каталазы (рис. 4 Б) была максимальной в листьях по сравнению с другими органами, что можно объяснить генерацией пероксида водорода в ходе фотосинтеза и фотодыхания и необходимостью их утилизации. При внесении в субстрат раствора 300 μM CuSO4 активность каталазы снижалась. В ответ на увеличение содержания меди в тканях корня происходило усиление активности ГПО (рис.5 А). Тотальная активность БПО была более высокой в корне в сравнении с другими органами (рис.5 Б). Это может быть связано с ролью фермента в лигнификации ксилемы и механических тканей в корне, а также утилизации пероксида водорода, образующегося в корне при накоплении ионов меди. В стебле и листьях активность фермента возрастала при избытке меди в среде в сравнении с контролем. 14 12 10 8 6 4 2 0 * * А * Корень Стебель Листья 14 12 10 8 6 4 2 0 * * Б * * Корень Стебель Листья Рисунок 5. Активность ГПО (А) и БПО (Б) в тканях табака в условиях длительной обработки субстрата растворами 100 и 300 μM CuSO4. В разных органах табака выявлены общие (А1 и А3) и специфические изоформы пероксидаз III класса (рис. 6). В корне обнаружены специфичные изоформы А5 – А7. Рисунок 6. Изоформы пероксидаз III класса в тканях табака. Стрелкой указано направление движения тока; 1 – контроль (раствор Кнопа); 2 – обработка 100 μM CuSO4; 3 – обработка 300 μM CuSO4. Увеличение активности изоформ А5 и А6 наблюдали во всех вариантах опыта в сравнении с контролем. Увеличение тотальной активности ГПО связано с большей активностью изоформ А1, А3 и А5, появлением изоформ А7 в варианте с длительным действием 300 μM сульфата меди в среде. В тканях стебля показан сопоставимый с контрольными растениями уровень активности изоформ пероксидаз во всех вариантах опыта. Уникальной изоформой являлась А4. р-р Кнопа 100 300 р-р Кнопа 100 300 р-р Кнопа 100 300 мМ гваякола/ мг белка×мин Условн.единицы / мг белка × мин р-р Кнопа 100 300 р-р Кнопа 100 300 р-р Кнопа 100 300 3.2. Реакция растений циннии на избыток сульфата меди в среде Влияние сульфата меди на всхожесть семян. Всхожесть семян циннии в вариантах с обработкой раствором 25 и 50 μM CuSO4 не изменялась, тогда как при действии 100 и 200 μM она снижалась на 11%, а при 500 и 1000 μM – более чем на половину. Соотношение валовых и доступных форм меди в субстрате. Компоненты почвосмеси связывали ионы меди: количество подвижных форм меди после внесения 100 и 200 μM CuSO4 составило 0,56% от ее валового содержания (0,65 и 1,12 мг/кг субстрата соответственно). Содержание меди в органах циннии. После 20 дней обработки депонирование меди происходило в основном в корнях, в побег они мало транспортировались (табл. 5). КТ стебель/корень и лист/корень не превышал 0,7 – это позволяет считать циннию растением-исключателем меди. Таблица 5. Содержание меди в органах циннии, КТ металла при 20-дневной обработке субстрата растворами CuSO4 Вариант Контроль (вода) 100 μM CuSO4 200 μM CuSO4 Содержание меди, мкг/г сухой массы КТ стебель/корень лист/корень корень 9,80 ± 0,49 22,12 ±1,11* 26,32 ±1,32* стебель 11,36 ± 0,56 12,32 ± 0,62 12,04 ± 0,60 лист 14,01 ± 0,30 1,16 1,42 14,56 ± 0,61 0,56 0,63 17,55 ± 0,46* 0,46 0,67 Влияние сульфата меди на анатомо-морфологические признаки. Обработка субстрата растворами 100 и 200 μM CuSO4 приводила к увеличению высоты растений циннии в сравнении с контролем (5,7±0,2 см) – 7,8±0,3 см и 7,6±0,3 см, соответственно. Толщина корня не изменилась, но происходило увеличение диаметра стелы в зоне проведения (табл. 6). Толщина стебля возрастала (2-е междоузлие от семядольных листьев) за счет утолщения коры и стелы. Уменьшение длины главного корня и его утолщение – неспецифические реакции растений на действие ионов ТМ (Elleuch et al., 2013; Ермошин и др., 2013; Abdelgawad et al., 2020). Таблица 6. Анатомические параметры корня и стебля циннии (единица измерения – μм) при 20-дневной обработке субстрата растворами CuSO4 Вариант Контроль (вода) 100 μM CuSO4 200 μM CuSO4 Корень Стебель Диаметр Толщина Толщина Диаметр Толщина Толщина Диаметр 1244 ± 14 1158 ± 16 1251 ± 21 коры 253 ± 4 224 ± 5 251 ± 6 стелы 768 ± 9 793 ± 13 782 ± 19 1076 ± 11 1152 ± 16* 1197 ± 17* коры 125 ± 4 142 ± 5* 132 ± 3* стелы 792 ± 11 891 ± 15* 951 ± 21* пучка 55 ± 1 54 ± 1 54 ± 2 В условиях обработки субстрата CuSO4 увеличивалось содержание лигнина Класона (рис. 7) в корне (для варианта с обработкой 200 μM CuSO4) и стебле циннии в сравнении с контрольным вариантом. Усиление лигнификации корня соотносится с барьерной функцией этого органа. В стеблях циннии в варианте с обработкой субстрата раствором 100 μM CuSO4 общее содержание лигнина росло в основном за счет увеличения количества лигнина Класона. 20 15 10 5 0 * * * * вода Лигнин Класона 100 200 корень вода 100 200 стебель Кислоторастворимый лигнин Рисунок 7. Содержание лигнина (% от сухой массы) в условиях длительной обработки субстрата растворами 100 и 200 μM CuSO4 в корнях и стеблях растений циннии В варианте с обработкой субстрата раствором 200 μM CuSO4 количество кислоторастворимого лигнина снижалось, поэтому, суммарное содержание лигнина не изменялось по сравнению с контролем. Содержание Н2О2 и продуктов ПОЛ при действии меди. У циннии на 20 день эксперимента в опытных вариантах количество Н2О2 в корнях и листьях увеличилось в сравнении с контрольными (рис. 8 А). В стебле его содержание достоверно снизилось относительно контроля. В случае обработки субстрата раствором 200 μM CuSO4 во всех органах происходило усиление ПОЛ (рис. 8 Б) Рисунок 8. Содержание Н2О2 (А) и продуктов ПОЛ (Б), фенольных соединений (В) в тканях корня и побега растений циннии в условиях длительной обработки субстрата растворами 100 и 200 μM CuSO4 Содержание фенольных соединений. В корнях и стебле циннии при обработке субстрата 200 μM CuSO4 содержание фенольных соединений уменьшалось в сравнении с контролем (рис. 8 В). Вероятно, такие изменения являются следствием множественных механизмов регуляции образования и использования фенольных соединений, в том числе, как антиоксидантов и субстратов для синтеза лигнина за счет изменения активности ферментов ФП, пероксидаз III класса, лакказ и полифенолоксидаз в условиях действия стрессовых факторов (Herrigetal., 2002). В наших опытах увеличение количества лигнина Класона в корне и стебле циннии коррелировало со снижением содержания фенольных соединений (r= −0.83). 12 % от сухой массы Активность антиоксидантных ферментов. Внесение растворов CuSO4 в субстрат приводило к снижению активности СОД в тканях корня и стебля (рис. 9А). Такая реакция может являться результатом инактивации фермента при связывании Cu2+ с сульфгидрильными группами аминокислот или продуктом реакции дисмутации – Н2О2, а также снижения активности отдельных изоформ этого фермента (Chen et al, 2015; Abdelgawad et al, 2020; Gutiérrez-Martínez et al., 2020). Активность каталазы в условиях стресса мало менялась в тканях корня, не изменялась в стебле, возрастала листьях в варианте с обработкой 200 μM CuSO4 в сравнении с контрольным вариантом (рис. 9Б). Высокая тотальная активность каталазы в надземных органах циннии по сравнению с тканями корня может быть связана с участием этого фермента в нейтрализации Н2О2, образующегося в световой фазе фотосинтеза и при фотодыхании. 30 25 20 15 10 5 0 А * * * вода 100 200 корни вода 100 200 стебли вода 100 200 листья 120 Б* 100 80 60 40 20 0 * ** вода 100 200 корни вода 100 200 стебли вода 100 200 листья Рисунок 9. Активность СОД (А) и каталазы (Б) в тканях корня, стебля и листьев циннии в условиях обработки субстрата растворами CuSO4 на 20 день роста Корни циннии характеризовались высокой активностью БПО в сравнении с листьями и стеблем. При стрессе увеличение ее активности происходило во всех органах (рис. 10 А). По данным гистохимического анализа этот фермент локализован в эпидерме и эндодерме, формирующихся сосудах ксилемы корня и стебля (данные представлены в диссертации). Активность ГПО (рис. 10 Б) при стрессе возрастала в 4,5 раза в тканях корня, тогда как в стебле и листьях она мало изменялась относительно контроля. Фермент был локализован в ксилеме корня и стебля, склеренхиме стебля (данные представлены в диссертации). 25 15 0,4 10 00 вода 100 200 вода 100 200 вода 100 200 корни стебли листья вода 100 200 вода 100 200 вода 100 200 корни стебли листья 0,8 0,6 *А * * * * * * * Б * 5 0,2 Рисунок 10. Активность БПО (А) и ГПО (Б) в тканях корня, стебля и листьев циннии в условиях обработки субстрата растворами CuSO4 на 20 день роста Условные единицы / мг белка×мин Условные единицы / мг белка мМ гваякола / мг белка×мин мМ пероксида водорода / мг белка×мин Мы предполагаем, что усиление активности пероксидаз III класса в корнях при стрессе может быть связано с увеличением активности ранее образованных изоформ или усилением их синтеза de novo, что могло приводить к снижению количества пероксида водорода и увеличению, соответственно, доли фенольных соединений, используемых в биосинтезе лигнина, а не на гашение АФК. Таким образом, совместная работа антиоксидантных ферментов обеспечила поддержание роста растений циннии в условиях обработки субстрата CuSO4. Экспрессия генов, кодирующих ферменты и ТФ, участвующие в биосинтезе лигнина. В корнях и стеблях циннии было определено относительное содержание транскриптов некоторых генов путей биосинтеза фенольных соединений и лигнина. В условиях избытка сульфата меди в среде уровень транскриптов гена PAL, С4H, PRX и LAC мало изменялся в корне, но увеличивался в стебле при выращивании растений на субстрате, обработанном раствором 100 μM CuSO4 (табл. 7). Рост относительного содержания транскриптов гена CAD был сильнее выражен в стебле по сравнению с корнем. В варианте с 200 μM CuSO4 уровень транскриптов гена 4CL в 7–8 раз возрастал и в стебле, и в корне, а относительное содержание транскриптов генов CAD и PRX в стебле возрастало почти в 2,5 раза в сравнении с контролем. Таблица 7. Относительное содержание транскриптов генов ФП пути, синтеза лигнина и ТФ в корнях и в стебле циннии на 20 день роста в условиях обработки субстрата растворами CuSO4 Вариант Контроль (вода) 100 μM CuSO4 200 μM CuSO4 Контроль (вода) 100 μM CuSO4 200 μM CuSO4 PAL C4H 4CL CAD PRX LAC ERF1 ERF2 MYB1 MYB2 Корень 1111111111 0,82 1,04 1,14 0,65 1,43 8,87 2,23 1,19 1,63 1,81 Стебель 0,56 0,34 0,72 0,92 0,59 0,74 0,54 0,46 1,34 0,67 1111111111 9,84 8,34 1,70 17,3 1,78 0,74 7,62 2,45 28,05 7,59 2,46 0,77 14,27 1,73 1,26 0,13 10,48 5,17 0,65 0,57 Усиление экспрессии гена пероксидазы (PRX) у циннии при стрессе, вероятно, приводило к изменению состава лигнина. Количество лигнина Класона положительно коррелировало с уровнем экспрессии этого гена в тканях стебля (r = +0,81). Рост количества транскриптов генов PAL и CAD положительно коррелировал с общим содержанием лигнина в стебле (r = +0,73). В литературе обсуждается роль ТФ семейства ERF и MYB в регуляции ФП. Их экспрессия может активироваться в ответ на увеличение этилена, пероксида водорода при действии стрессоров (Li et al., 2018; Wessels 2019). В корнях опытных растений в сравнении с контрольными количество транскриптов генов ERF1, ERF2 и MYB2 несколько снижалось, а MYB1 практически не изменилось, тогда как в стебле в варианте со 100 μM CuSO4 уровень транскриптов генов ERF1, MYB1 и MYB2 возрастал. В опыте с 200 μM CuSO4 относительное содержание транскриптов генов ERF2, MYB1 и MYB2 мало изменялось в сравнении с контролем. Корреляционный анализ показал, что содержание транскриптов генов ERF1, MYB2 положительно коррелировало с содержанием транскриптов генов С4H (r= +0.94 и +0.90) и LAC (r= +0.92 и +0.89), что предполагает вероятное участие этих ТФ в регуляции экспрессии генов С4H и LAC. Усиление экспрессии генов биосинтеза фенилпропаноидов (4CL, CAD) и лигнина (PRX и LAC) при стрессе, вероятно, обеспечивает рост содержания лигнина в корне и стебле. Увеличение экспрессии гена PRX и ферментативной активности пероксидаз III класса также могло привести к усилению лигнификации КС корня циннии, что обусловило снижение содержания фенольных соединений в корне при стрессе. Усиление лигнификации КС могло способствовать связыванию ионов меди и ограничению их транспорта в надземную часть растения. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Проведенные исследования показали, что при добавлении в субстрат растворов сульфата меди в течение продолжительного периода (20 и 40 дней) значительная часть меди находилась в связанном состоянии. Несмотря на низкую доступность ионов меди в субстрате, они накапливались в тканях корня табака и циннии, и в меньшей степени транспортировались в побег. В этих условиях в корнях и побеге происходило увеличение количества таких маркеров стресса как Н2О2 и ПОЛ. Вызванное стрессом повышение активности СОД и пероксидаз III класса способствовало поддержанию роста корня и побега при обработке субстратов растворами 100 μM и 200 μM CuSO4, но оказалось недостаточным для нормального роста растений табака при обработке 300 μM CuSO4. Увеличение содержания меди в листьях также приводило к окислительному стрессу и усилению активности каталазы и пероксидаз в них. Одной из реакций циннии и табака на увеличение содержания меди являлось утолщение корня и стебля и усиление лигнификации тканей, что могло приводить к частичной иммобилизации меди в КС и ограничению ее транспорта по растению. Усиление экспрессии генов ФП – PAL, C4H, 4CL, CAD, предположительно, приводило к увеличению содержания фенольных соединений в тканях корня и стебля, которые расходовались на гашение активных форм кислорода и синтез лигнина. Усиление экспрессии гена PRX и активности пероксидаз способствовало лигнификации КС. Общая схема предполагаемых эффектов представлена на рисунке 11. Рисунок 11. Предполагаемые эффекты действия сульфата меди (100–300 μM в среде) на физиолого-биохимические и анатомо-морфологические характеристики растений ВЫВОДЫ 1. Показана способность субстратов удерживать ионы меди при их длительной обработке растворами CuSO4. Содержание доступных форм меди в среде не превышало 0,2% от ее валового содержания в случае использования смеси перлита и вермикулита и 0,56% – почвосмеси. 2. Длительная обработка субстратов 100 μM сульфатом меди приводила к стимулированию роста табака и циннии: увеличивалась их высота, биомасса, площадь листа. При обработке субстратов как низкими (100 μM), так и высокими дозами (300 μM для табака и 200 μM для циннии) происходило утолщение корня и стебля и усиливалась лигнификация тканей. 3. Увеличение содержания меди в органах растений табака и циннии приводило к росту количества пероксида водорода и продуктов ПОЛ в них, что свидетельствует об развитии окислительного стресса при выращивании растений на субстратах с добавлением сульфата меди. 4. В условиях стресса в сравнении с контролем изменялась активность ферментов антиоксидантной защиты (СОД, каталазы и пероксидаз III класса). Увеличение тотальной активности пероксидаз происходило за счет изменения активности существующих изоформ. 5. Содержание фенолов в тканях различалось в зависимости от органа растения и внесенной в среду дозы сульфата меди. Оно, по-видимому, определялось уровнем транскриптов генов, кодирующих ферменты биосинтеза фенолов (PAL, C4H, 4CL и CAD), активностью пероксидаз и использованием фенолов как субстратов для лигнификации КС. 6. Увеличение относительного содержания транскриптов генов PAL, CAD и PRX при стрессе положительно коррелировало с количеством лигнина в тканях стебля циннии. 7. Относительное содержание транскриптов ERF1 и MYB2 коррелировало с содержанием транскриптов генов С4H (r= +0.94 и +0.90) и LAC (r= +0.92 и +0.89) в стебле, что предполагает участие этих ТФ в регуляции экспрессии генов ФП и синтеза лигнина в условиях стресса, вызванного медью.