Эпидемиологическая оценка факторов, влияющих на эффективность вспомогательных репродуктивных технологий

В первой главе «Характеристика вспомогательных репродуктивных
технологий и наиболее значимых факторов, влияющих на их результативность
(Обзор литературы)» проведён анализ отечественных и зарубежных работ,
посвящённых проблеме бесплодия. Одной из основных демографических проблем
является старение населения, а также низкая рождаемость. Широкое
распространение бесплодия, патологий органов репродуктивной системы
усугубляет демографическую ситуацию.
В главе обобщены данные об эффективности вспомогательных
репродуктивных технологий в европейских странах. Описаны основные
предикторы неэффективности ВРТ, а также подчеркнута важность оптимизации
обследования пар перед проведением циклов ВРТ.
Во второй главе «Материалы и методы» описана методология и материалы
исследования.
Диссертационное исследование выполнено на кафедре эпидемиологии,
паразитологии и дезинфектологии ФГБОУ ВО СЗГМУ им. И.И. Мечникова
Минздрава России. Разделы, методы, объём и материалы проведённых
исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1 – Разделы, методы, объём и материалы исследований
Раздел научнойМетоды исследованияОбъем и материалы
работыпроведенных
исследований

Анализ эффективностиОписательныеЭлектронная база
вспомогательныхэпидемиологическиеданных пациентов,
репродуктивных технологий исследованияобращавшихся в центры
с 2013репродукции – 11998
по 2018 гг.человек.

Анализ структурыОписательныеМедицинские карты 844
патологии репродуктивнойэпидемиологическиепациентов. Выявление
системы и эффективностьисследования.факторов риска
лечения бесплодия уИсследование «случай-ненаступления
женщин, обратившихся законтроль»клинической
помощью в крупный центрбеременности: группа
репродукциислучаев – 305 женщин,
Санкт-Петербурга за периодконтрольная группа –
с 2014 по 2017 гг.305 женщин.
Выявление факторов
риска спонтанного
выкидыша: группа
случаев – 96 женщин,
контрольная группа –
209 женщин.
Продолжение таблицы 1
ЭпидемиологическаяИсследование«случай-Анкетированиеи
оценкафакторов,контроль».углубленное
влияющих на наступлениеМикробиологическиеметодылабораторное
клинической беременности(культуральныйметоддляобследование 129 пар,
в циклах ЭКО/ИКСИвыявления T. vaginalis).обратившихсяза
Молекулярно-генетическиепомощью в центры
методы (ПЦР-идентификациярепродукции.
C. trachomatis, T. vaginalis,Анализ данных 129
N. gonorrhea, H. simplex 1, 2,карт пациентов.
Cytomegalovirus,изучениеВыявлениефакторов
структурымикробиотырисканенаступления
влагалища).клинической
Серологическиеметодыбеременности: группа
(определение IgG и IgA кслучаев – 64 женщин,
C. trachomatis, иммуногло-контрольная группа – 65
булинов к предранним белкамженщин.
H. simplex 1, 2, Cytomegalovirus)
Оценка влияния измененийМолекулярно-генетическиеАнкетированиеи
микробиоценозовметоды:real-timeПЦР,обследование
влагалища и кишечника наметагеномныйанализ61 женщины.
рисквозникновениятаксономическогосостава
спонтанного выкидыша увлагалища и кишечника по
беременных женщингенам 16S рРНК.
Исследование случай-контроль,
биоинформатические,
статистические методы

В ходе выполнения работы проведено углубленное лабораторное
обследование пар, прошедших предварительное обследование в соответствии с
приказом МЗ РФ № 107н от 30 августа 2012 г. “О порядке использования
вспомогательныхрепродуктивныхтехнологий,противопоказанияхи
ограничениях к их применению”. Данное обследование было сфокусировано на
выявлении маркеров инфекций, передающихся преимущественно половым путем
(ИППП) и изучении состава микробиоценозов влагалища. Для выявления в
клиническом материале ДНК возбудителей инфекций, передающихся
преимущественно половым путем (C. trachomatis, T. vaginalis, N. gonorrhea,
H. simplex 1, 2, Cytomegalovirus), применялись коммерческие наборы реагентов:
«Хламидия трахоматис» (ООО «Альфалаб», РФ), «Трихомонас вагиналис» (ООО
«Альфалаб», РФ), «Гонорея-тест» (ООО «Альфалаб», РФ), «АмплиСенс® HSV I,
II-EPh» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, РФ), «АмплиСенс®
CMV-EPh»(ФБУНЦНИИЭпидемиологииРоспотребнадзора,РФ).
Серологические исследования включали в себя определение иммуноглобулинов
классов IgA и IgG к Chlamidia trachomatis, а также иммуноглобулинов к
предранним белкам цитомегаловируса и Herpes simplex 1, 2 типа с помощью
наборов для иммуноферментного анализа «Вектор-Бест» (РФ), «NovaTec»
(Германия), Orgenics Ltd (Израиль), «Биосервис» (Россия). Определение
качественного и количественного состава микробиоценоза влагалища
проводилось методом real-time ПЦР («Фемофлор-16» («НПО ДНК-технология»,
Россия)). Выявление Trichomonas vaginalis в вагинальных мазках проводили
методом посева материала на селективную питательную среду Trichomonas
Modified CPLM (cysteine-pepton-liver infusion-maltose) Medium (HiMedia, Индия) с
дальнейшим подтверждением наличия трихомонад микроскопированием
неокрашенного препарата и с окрашиванием метиленовым синим.
Для поиска дополнительных факторов, влияющих на результативность ВРТ,
проведено исследование «случай-контроль». Пациентам было предложено пройти
анкетирование перед проведением ЭКО/ИКСИ. Специально разработанные
анкеты содержали вопросы о наличии экспозиции к ряду предполагаемых
факторов, влияющих на исходы ВРТ. Анкета предназначенная для женщин,
содержала вопросы, касающиеся антропометрических показателей (вес, рост
анкетируемых) и возраста на момент обращения за медицинской помощью;
перенесенных заболеваний (заболевания эндокринной и сердечно-сосудистой
систем, инфекционные заболевания, в т.ч. инфекции передаваемые половым
путем); акушерско-гинекологического анамнеза (характер менструальной
функции, количество предшествующих беременностей, аборты и выкидыши в
анамнезе, наличие гинекологических заболеваний); продолжительности
бесплодия; предыдущих попыток ЭКО (осложнения, количество попыток); образа
жизни женщин (особенности работы, питание, физическая активность,
эмоциональная нагрузка, профессиональные факторы вредности, вредные
привычки). Анкета для мужчин включала ряд вопросов, касающихся
антропометрических показателей (вес, рост анкетируемых), возраста;
перенесенных заболеваний, в том числе половых инфекций; андрологического
анамнеза; сексуального поведения (количество половых партнеров, частота
половых актов); образа жизни (физическая активность, питание, эмоциональная
нагрузка, профессиональные факторы вредности, вредные привычки). Также в
анализ были включены результаты углубленного обследования пар,
направленного на поиск маркеров урогенитальных инфекций (герпес-вирусные
инфекции, трихомониаз, хламидиоз) и оценка состояния микробиоценоза
влагалища.
Для выявления особенностей микробиоценозов влагалища и кишечника у
женщин со спонтанным выкидышем был проведен анализ данных, полученных с
помощью real-time ПЦР («Фемофлор-16» («НПО ДНК-технология», Россия),
«Колонофлор-8» (ООО «Альфалаб», Россия)) и высокопроизводительного
секвенирования ампликонов V3-V4 участка гена 16S рРНК (Illumina MiSeq
(США)).
Биоинформатическая обработка данных метагеномного секвенирования
включала в себя процедуру объединения полученных прямых и обратных
последовательностей с помощью программы FLASH 1.2.11 с параметрами
–min-overlap 100 и –max-overlap 170 (Magoč T., Salzberg S. L., 2011). Дальнейший
анализ проводился в среде QIIME 2 (Bolyen E. et al., 2018). Шумоподавление и
контроль качества существлялось методом q2-dada2 c параметрами –p-trim-left 0
и –p-trunc-len 439 –p-max-ee 2 (Callahan B.J., et al., 2016). Уникальные варианты
последовательностей ампликонов (ASV) были классифицированы методом
q2-feature-classifier classify-sklearn (Bokulich N. A. et al., 2018) с помощью
наивного байесовского классификатора таксономии, обученного на базе данных
Greengenes (McDonald D., et al., 2012). Показатели альфа-разнообразия
рассчитывались по индексу Шеннона и по индексу Faith’s PD методом
q2-diversity, значимость различий оценивалась с помощью критерия Краскела –
Уоллиса. Оценка бета-разнообразия произведена с использованием метода
«unweighted unifrac».
Для оценки достоверности различий в генетических дистанциях между
образцами групп исследования был проведен анализ PERMANOVA (permutational
multivariate analysis of variance). Статистическая обработка данных, полученных
при выполнении разных разделов работы, включала: построение таблиц,
графическоепредставлениеданных,расчетотносительныхвеличин
(экстенсивных и интенсивных), расчет медианы и показателей изменчивости (М ±
σ; Ме (25%,75%)) с помощью Microsoft Excel 2019 и R (RStudio). Оценка
статистической значимости взаимосвязи факторов риска неудач ВРТ (расчет
показателя отношения шансов, 95% доверительных интервалов по Фишеру, p-
уровень значимости), ассоциированных с репродуктивными потерями была
проведена с использованием программного пакета EpiInfo, версия 7.0, EpiCalc
2000. Критический уровень значимости при всех статистических сравнениях
принимался равным 0,05.
Втретьейглаве«Оценкаэффективностивспомогательных
репродуктивных технологий в Санкт-Петербурге» проведен анализ системы
оказания помощи бесплодным парам, сложившейся к моменту начала
исследования.
Проанализированы данные о 11 998 пациентах, принявших участие в
программах ВРТ в репродуктивных центрах Санкт-Петербурга в течение 2013-
2017 годов. Оценивалась частота наступления клинической беременности
на 100 начатых циклов с овариальной стимуляцией в программах ВРТ («на цикл»)
или на 100 циклов с переносом эмбрионов («на перенос»). В перечень методов
лечения, процедур, относимых к ВРТ, согласно приказу МЗ РФ №107н
от 30 августа 2012 г., входят ЭКО, ИКСИ, криоконсервация, суррогатное
материнство, искусственная инсеминация спермой мужа (партнера) или донора. В
ходе исследования была проанализирована результативность циклов ЭКО/ИКСИ,
а также результативность искусственной внутриматочной инсеминации.
Установлено, что частота наступления клинической беременности в
результате проведения искусственной внутриматочной инсеминации является
достаточно низкой (в 2014 г. –14,04%, в 2018 г. – 15,85%) при этом по сравнению
с ЭКО/ИКСИ данная процедура применяется реже (например, в 2018 г. проведено
3969 циклов ЭКО/ИКСИ, и лишь 514 процедур ИОСД и ИОСМ), поэтому в
дальнейшем исследование было сфокусировано на группе пациентов, проходящих
циклы ЭКО/ИКСИ.
Установлено, что в репродуктивных центрах Санкт-Петербурга частота
наступления клинической беременности в циклах ЭКО/ИКСИ варьировала от
34,02 (95% ДИ 30,79 – 37,36) в 2013 г. до 31,65 (95% ДИ 30,20 – 33,12) в 2017 г. в
расчете на цикл и от 35,35 (95% ДИ 32,02 – 38,78) в 2013 г. до 37,62 (95% ДИ 35,97
– 39,28) в 2017 г. в расчете на перенос эмбриона. Таким образом, несмотря на
некоторые колебания показателей в период с 2013 по 2017 гг., достоверно
значимых изменений в результативности ЭКО/ИКСИ выявлено не было, часть
циклов не была завершена переносом эмбрионов. Следует отметить, что частота
наступления родов в результате проведения циклов вспомогательных
репродуктивных технологий (ВРТ) ниже частоты наступления клинической
беременности. В 2017 г. частоты наступления родов составила в расчете на цикл
24,0 (95% ДИ 22,83 – 25,19), а в 2013 г. – 28,21 (95% ДИ 25,16 – 31,41), в 2017 г.
частота наступления родов на перенос эмбриона составила 27,36 (95% ДИ 26,05 –
28,69), а в 2013 г. – 29,31 (95% ДИ 26,16 – 32,61). Обращает на себя внимание, что
на фоне увеличения количества циклов ЭКО/ИКСИ, проведенных в медицинских
организациях Санкт-Петербурга (в 2013 г. – 826 циклов; в 2018 г. – 3969 циклов)
частота наступления клинической беременности и родов не увеличилась,
достоверных различий в отдельных организациях выявлено не было.
В ходе представленной части исследования были также проанализированы
данные 844 карт пациентов, обратившихся за помощью в один из центров
репродукции. Была изучена взаимосвязь между продолжительностью бесплодия и
наступлением клинической беременности в циклах ЭКО/ИКСИ. Выявлено, что
клиническая беременность достоверно чаще наступает в группе пациенток до
36 лет, у которых с момента установления диагноза «бесплодие» прошло не более
6 лет (OR=1,6 (95% ДИ 1,1 – 2,29)). Увеличение риска ненаступления клинической
беременности ассоциировано с СПКЯ (OR= 2,7 (95% ДИ 1,5 – 5,0)
р = 0,0009), наличием кисты яичника (OR = 8,6 (95% ДИ 2,8 – 26,5) р = 0,00002), а
также инфекционно-воспалительными заболеваниями в анамнезе, в частности,
хроническим сальпингитом и оофоритом (OR = 4,9 (95% ДИ 3,3 – 7,5) р = 0,003),
хроническим эндометритом (OR=5,0 (95% ДИ 1,3 – 19,9) р = 0,009), а также
перенесенной микоплазменной инфекции (OR = 5,9 (95% ДИ 2,39 – 14,4)
р = 0,00002). Хронический сальпингит и оофорит в анамнезе (OR = 2,2
(95% ДИ 1,2 – 4,1) р = 0,01) был ассоциирован также с риском спонтанного
выкидыша при использовании ВРТ.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о значимости
хронических инфекционно-воспалительных заболеваний репродуктивных органов
женщин в качестве фактора риска неудач ВРТ, ассоциированных как с
наступлением беременности, так и с ее успешным разрешением. Данное
обстоятельство обосновывает необходимость более углубленных исследований
влияния отдельных инфекционных агентов на развитие беременности при
использовании ЭКО и ИКСИ, а также изучения феномена колонизационной
резистентности, создаваемой микробиомом репродуктивного тракта, в качестве
предиктора нормального течения беременности.
В четвертой главе «Предикторы неудачных исходов циклов
вспомогательныхрепродуктивныхтехнологий»описанырезультаты
исследования по оценке частоты обнаружения маркеров ИППП у пациентов,
обращающихся в центр репродукции, а также результаты исследования «случай-
контроль», направленного на выявление факторов риска неудачного исхода ВРТ.
В ходе выполнения данной части работы было показано, что система
обследования бесплодных пар в ходе подготовки к проведению циклов ВРТ не
обеспечивает полного выявления урогенитальных инфекций.
Маркеры возбудителей урогенитальных инфекций (трихомонадной,
хламидийной, герпетической) обнаруживались у бесплодных пар в 59,7% случаев
(учитывался факт обнаружения возбудителя у одного или обоих партнеров в
паре). Так, среди пар, обратившихся в центр репродукции и вошедших в
исследование, урогенитальная трихомонадная инфекция была выявлена
культуральным методом у 28,8% пар. У части пациентов (8,63 (95% ДИ 4,54 – 14,59)
на 100 обследованных женщин) были выявлены антитела классов IgA или IgA
совместно с IgG к C. trachomatis, что свидетельствует об активности
инфекционного процесса хламидийной инфекции. Частота выявления активной
вирусной герпетической инфекции, вызванной вирусами простого герпеса
1, 2 типа составила 9,4 (95% ДИ 5,07 – 15,46) на 100 обследованных,
цитомегаловирусная инфекция в фазе активации обнаруживалась с частотой
15,1 (95% ДИ 9,60 – 22,16) на 100 обследованных.
Обращает на себя внимание, что частота выявления маркеров
урогенитальных инфекций существенно выше среди пар, у которых клиническая
беременность не наступила (Рисунок 1).

Рисунок 1 – Выявление маркеров инфекций, передающихся половым путем
среди пар обратившихся в репродуктивные центры с различными исходами ВРТ,
на 100 обследованных пар

В значительной мере эти различия обусловлены более высокой
пораженностью T. vaginalis пациентов, у которых клиническая беременность в
результате ЭКО/ИКСИ не наступила (Рисунок 2).
Рисунок 2 – Частота выявления маркеров инфекций различной этиологии,
передающихся половым путем среди пар обратившихся в
репродуктивные центры в зависимости от исхода ВРТ,
на 100 обследованных пар

Выявленная нами высокая частота маркеров возбудителей ИППП, включая
маркеры активного инфекционного процесса, при отсутствии положительных
результатов ПЦР-идентификации указанных патогенов позволяют поставить
вопрос о необходимости совершенствовании диагностических алгоритмов,
применяемых при оказании медицинской помощи бесплодным парам.
Исследование «случай-контроль», в котором были использованы
результаты углубленного обследования пар и информация о потенциальных
факторах риска, полученная как из медицинских карт, так и из специально
разработанных нами анкет, позволило выявить ряд факторов неинфекционной
природы, влияющих на эффективность ВРТ (Таблица 2).
Таблица 2 – Потенциальные факторы риска ненаступления клинической
беременности в циклах ВРТ

Отношение95% ДИ
Потенциальные факторы рискар
шансов (OR)(по Фишеру)

Курение обоих партнеров5,01,4 – 17,80,01

Факторы со стороны мужчины

Возраст старше 35 лет1,10,4 – 3,00,54

Избыточный вес и ожирение1,90,9 – 4,40,07
Посещение бани/сауны (4 и более раза в
2,00,7 – 5,70,15
месяц)
Регулярное курение*2,51,02 – 6,30,04
Регулярное курение (20 и более сигарет в
2,81,1 – 7,70,03
день)*
Спортом не занимается1,60,7 – 3,70,20

Факторы со стороны женщины

Возраст старше 35 лет*2,61,2 – 6,00,01

Избыточный вес и ожирение2,60,8 – 7,90,08

Регулярность менструального цикла2,20,9 – 5,30,05

Регулярное курение*2,61,0 – 6,50,05
Работа связана с большой
3,41,3 – 9,20,01
психоэмоциональной нагрузкой*
Спортом не занимается1,50,5 – 4,70,33

Примечание: * – статистически значимые факторы

Проведенное обследование участников исследования на маркеры ИППП и
нарушения состава микробиоты влагалища позволило установить взаимосвязь
между выявлением T.vaginalis и ненаступлением клинической беременности
(Таблица 3). Полученные нами результаты согласуются с данными о том, что
бессимптомно протекающие инфекции в репродуктивном тракте женщин могут
приводить к нарушению имплантации эмбриона (Falcone T., 2004).
Таблица 3 – Потенциальные факторы риска ненаступления клинической
беременности в циклах ВРТ, связанные с инфекционными заболеваниями и
микробиотой репродуктивного тракта
Отношениер
95% ДИ
Потенциальные факторы рискашансов
(по Фишеру)
(OR)
Выявление T. vaginalis*2,61,1 – 6,40,01
Нарушение состава нормальной (индигенной)
7,51,04 – 54,120,02
микробиоты влагалища*
Активная вирусная инфекция, вызванная H. simplex
2,30,48 – 10,820,09
1, 2 типа
Активная цитомегаловирусная инфекция1,970,92 – 4,250,07

Активная урогенитальная хламидийная инфекция2,50,52 – 11,570,17
Перенесенная урогенитальная хламидийная
2,10,43 – 9,830,44
инфекция (выявление IgG к C. trachomatis)

Примечание: * – статистически значимые факторы

Наше исследование не выявило достоверной связи ненаступления
клинической беременности в циклах ВРТ с другими факторами инфекционной
природы, в частности с активной урогенитальной хламидийной и герпетической
инфекциями.
В тоже время, изменения состава микробиоты влагалища, нередко
сопутствующие урогенитальным инфекциям, оказались значимым фактором
риска ненаступления беременности (OR = 7,5 (95% ДИ 1,04 – 54,1)).
С учетом вышеуказанного нами представилось целесообразным провести
углубленные исследования по оценке влияния изменений структуры микробиома
репродуктивного тракта на течение беременности и эффективность ВРТ.
Учитывая данные о влиянии микробиома кишечника на течение
беременности (Edwards S.M., Cunningham S.A., Dunlop A.L., Corwin E.J., 2017),
часть нашего исследования была посвящена оценке структуры микробиоты
кишечника у женщин при физиологической и патологической беременности.
В пятой главе «Состав микробиоты влагалища и кишечника в качестве
маркера репродуктивных неудач» описаны результаты исследования
микробиоценозов кишечника и влагалища женщин с различными исходами
беременности. В нашем исследовании было показано, что предиктором
ненаступления клинической беременности при применении ВРТ является
нарушение нормоценоза влагалища. Применение метода real-time ПЦР, позволило
определить конкретные различия в количественных соотношениях отдельных
микроорганизмов, отличающих микробиоценозы влагалища беременных женщин
и женщин, у которых беременность не наступила.
Так, например, в группе женщин, у которых наступила клиническая
беременность, количество микоплазм, а также бактерий – представителей родов
Mobiluncus spp./ Corynebacterium spp. и Gardnerella vaginalis/ Prevotella bivia /
Porphyromonas spp. в среднем оказалось ниже, чем среди женщин, у которых
беременность не наступила. В то же время, Mycoplasma hominis, а также группа
Sneathia spp. /Leptotrichia spp. /Fusobacterium spp. были выявлены только у
женщин с неудачным исходом ВРТ.
Таким образом, дисбиоз влагалища, ассоциируемый с ненаступлением
беременности при использовании ВРТ, определяется как снижением количества
микроорганизмов отдельных таксономических групп, так и появлением (или
увеличением количества до определяемого уровня) других микроорганизмов.
Частота наступления клинической беременности в циклах ЭКО/ИКСИ
ниже, чем завершение беременности родами. В связи с этим мы более детально
решили остановиться на изучении факторов риска невынашивания беременности,
связанных с изменениями микробиоты влагалища и кишечника. Данная часть
работы включала в себя сравнение состава микробиоты указанных биотопов у
женщин с прогрессирующей беременностью и женщин со спонтанным
выкидышем (на 6-14 неделе беременности) двумя методами: real-time ПЦР и
методом метагеномного секвенирования генов 16S рРНК.
При сравнении кишечного микробиоценоза женщин с различным течением
беременности методом real-time ПЦР значимых различий не было выявлено. В
обоих группах преобладал аэробный дисбактериоз.
В тоже время использование данного метода позволило выявить различия в
структуре вариантов вагинального микробиоценоза в сравниваемых группах.
Аэробный дисбактериоз (39,0%, n=11) был выявлен только в группе пациенток с
невынашиванием беременности, грибково-бактериальный дисбиоз влагалища не
был выявлен в обеих группах женщин. Следует отметить, что в группе женщин с
прогрессирующей беременностью нормоценоз был выявлен в 84,8% (n=28), а в
группе женщин со спонтанным выкидышем – 46,4% (n=13).
Дисбиотические нарушения микробиоты влагалища у беременных женщин
ассоциированы с риском спонтанного выкидыша (OR =6,0 (95% ДИ = 1,8-20,2)
р=0,03). При сопоставлении типов микробиоценозов биотопов влагалища и
кишечника было выявлено, что сочетание дисбиоза кишечника и дисбиоза
влагалища ассоциировано с повышенным риском спонтанного выкидыша в
первом триместре беременности (OR = 6,5 (95% ДИ 1,32-31,6)
р ˂0,005).
Метагеномное исследование микробиома обоих биотопов позволило
получить дополнительную информацию о различиях в составе микробиоты
женщин со спонтанным выкидышем и женщин с прогрессирующей
беременностью.
В частности, сделан вывод об обеднении состава микробиоты кишечника у
пациенток из группы «случаев». Показатель альфа-разнообразия для микробиоты
данного биотопа был статистически значимо выше для женщин с
прогрессирующей беременностью (критерий Краскела-Уоллиса для индекса
Шеннона составил 28,98 (p = 7,27е-8)). В то же время, статистически значимых
различий между показателями альфа-разнообразия микробиоты влагалища в
исследуемых группах женщин не было выявлено (критерий Краскела-Уоллиса
0,99 (p = 0,32)).
Оценка бета-разнообразия микробиоценозов влагалища и кишечника с
использованием метода «unweighted unifrac» и анализа главных компонент
(PCoA – principal components analysis) позволяет предположить наличие типов
микробиоты, характерных для нормального течения беременности и для
состояний, приводящих к спонтанному выкидышу. Как видно на рисунке 3,
микробные сообщества влагалища женщин с невынашиванием беременности и
женщин с прогрессирующей беременностью формируют два отдельных кластера,
различия в генетических дистанциях, между которыми достоверны
(PERMANOVA р = 0,001), аналогичным образом кластеризуется кишечная
микробиота (Рисунок 4).

Рисунок 3 – Бета-разнообразие микробиоты влагалища пациенток со
спонтанным выкидышем и прогрессирующей беременностью

Рисунок 4 – Бета-разнообразие микробиоты кишечника пациенток со спонтанным
выкидышем и прогрессирующей беременностью

Сравнение представленностиотдельных таксонов в составе вагинального
микробиоценоза свидетельствует оважной протективной функции лактобацилл:
снижение доли Lactobacillus spp. вструктуре микробиома влагалища до уровня
менее 90% от общего числавыявленных таксонов, ассоциировано с
невынашиванием беременности (OR= 5,28 (95% ДИ=1,2-23,2)). На фоне этого
снижения у пациенток из группы «случаев» возрастает доля условно-патогенной
микробиоты влагалища, что, по-видимому, в совокупности со снижением доли
Lactobacillus spp. может приводить к негативным последствиям для плода.
С другой стороны, метагеномный анализ микробиоты кишечника в
сравниваемых группах свидетельствует в пользу наличия компонентов
микробиома, ассоциируемых с нормальным течением беременности
(Таблица 4).
Таблица 4 – Представители микробиома кишечника, ассоциированные с
нормальным течением беременности
Пациентки соПациентки сOR95% ДИр
спонтаннымпрогрессирующей(по
ТаксонвыкидышембеременностьюФишеру)
(n=23)(n=23)
выявленовыявлено
(абс.)(абс.)
Akkermansia sp.13220,060,007 –0,002
0,52
Faecalibacterium sp.1823∞–

Bifidobacterium sp.12220,050,01-0,430,001

Methanobrevibacter3180,040,01-0,190,001
sp.
Lactococcus sp.1140,030,003-0,260,001

Полученные данные согласуются с результатами проведенных ранее
исследований, свидетельствующих о протективных в противовоспалительных
эффектах, связанных с данными представителями нормоценоза кишечника
(Yassour M., et al., 2016; Sokol H., et al., 2008).
В заключении подведены итоги проведённого исследования, которое
показало, что в современный период эффективность вспомогательных
репродуктивных технологий существенно не меняется в течение ряда лет, что
может быть связано с недостаточной эффективностью системы обследования
бесплодных пар, не позволяющей исключить наличие у них инфекций,
передающихся преимущественно половым путем.
Настоящее исследование, в целом, подтвердило значимость изменений
микробиома женской репродуктивной системы, включая дисбиотические
состояния, обусловленные инфекциями, передающимися преимущественно
половым путем (трихомониаз) в качестве фактора риска ненаступления
беременности при процедуре ЭКО.
Кроме того, в работе продемонстрировано протективное значение
отдельных типов микробиома влагалища и кишечника в качестве необходимого
условия для нормального протекания беременности и снижения риска
репродуктивных потерь. Метагеномные исследования позволяют в значительной
степени определить конкретные таксономические группы микроорганизмов,
участвующие в создании феномена «колонизационной резистентности», в
частности существенна роль представителей рода Lactobacillus, снижение
представленности которых в составе микробиоты влагалища ассоциировано с
невынашиванием беременности.
Оптимизация обследования пар за счет включения в диагностические
алгоритмы определения дополнительных маркеров ИППП и изменений
микробиоценоза влагалища позволит минимизировать количество неудачных
циклов ВРТ и увеличить их эффективность. Кроме того, с учетом выявленных
модифицируемых факторов риска, представляется, что при реализации
государственных программ, направленных на профилактику репродуктивной
патологии, следует учитывать важность формирования у населения
приверженности здоровому образу жизни (включающему, в частности, отказ от
курения).
ВЫВОДЫ
1. Эффективность вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) при
оказании медицинской помощи бесплодным парам в Санкт-Петербурге в 2013 –
2018 годы не претерпела существенных изменений. Показатель частоты
наступления родов в данный период находился на низком уровне и не превышал
28,21 (95% ДИ 25,16 – 31,41) на цикл экстракорпорального оплодотворения.
2. Факторами риска ненаступления клинической беременности
неинфекционной природы является возраст женщины старше 35 лет
(OR = 2,6 (95% ДИ 1,2 – 6,0)) , регулярное курение женщины (OR = 2,6 (95% ДИ
1,0 – 6,5)) и мужчины (OR = 2,5 (95% ДИ 1,02 – 6,3)), наличие у женщины работы,
связанной с большой психоэмонациональной нагрузкой (OR = 3,4 (95% ДИ 1,3
– 9,2)).
3. У значительной части (59,7%) бесплодных пар, обращающихся за
медицинской помощью в отделение ВРТ, обнаруживаются маркеры
урогенитальных инфекций. Частота выявления активной урогенитальной
хламидийной инфекции 8,63 на 100 обследуемых женщин (95% ДИ 4,54 – 14,59);
активной урогенитальной инфекции, вызванной вирусом простого герпеса
1 и 2 типов – 9,35 (95% ДИ 5,07 – 15,46); цитомегаловирусной инфекции в фазе
активации – 15,11(95% ДИ 9,60 – 22,16). У 28,78% обследованных
культивационным методом было установлено наличие урогенитальной инфекции,
вызванной Trichomonas vaginalis.
4. Выявление урогенитальной трихомонадной инфекции только у одного
или одновременно у обоих партнеров в составе бесплодной пары является
фактором риска ненаступления клинической беременности при ВРТ
(OR = 2,6 (95% ДИ 1,12 – 6,4)).
5. Дисбиоз влагалища, установленный методом real-time ПЦР, ассоциирован
с риском ненаступления клинической беременности при ВРТ (OR = 7,5 (1,04 – 54,12)).
6. Сочетание дисбиоза влагалища и дисбиоза кишечника ассоциировано с
повышенным риском спонтанного выкидыша в первом триместре беременности
(OR = 6,5 (95% ДИ 1,32 – 31,6) р ˂0,005). Дисбиоз кишечника не являлся
самостоятельным фактором риска развития спонтанного выкидыша.
7. Микробные сообщества влагалища женщин с невынашиванием
беременности и женщин с прогрессирующей беременностью формируют при
проведении анализа методом главных компонент два отдельных кластера,
различия в генетических дистанциях, между которыми значимы (PERMANOVA
р = 0,001). Микробиоценозы кишечника в данных группах также образуют
отдельные кластеры (PERMANOVA р = 0,001).
8. Выявлен ряд таксономических групп микроорганизмов, характеризующих
особенности состава микробиома влагалища и кишечника женщин с
невынашиванием беременности. Установлено, что снижение доли Lactobacillus
spp. в структуре микробиома влагалища до уровня менее 90% от общего числа
выявленных таксонов ассоциировано с данной патологией (OR= 5,28 (95% ДИ 1,2-
23,2)), при этом увеличивается удельный вес условно-патогенных
микроорганизмов. Кишечные микробиоценозы женщин со спонтанным
выкидышем характеризуются меньшим таксономическим разнообразием, чем
микробиом кишечника у женщин с прогрессирующей беременностью. При этом
некоторыепредставителикишечногомикробиома(Akkermansiasp.,
Faecalibacterium sp., Bifidobacterium sp., Methanobrevibacter sp., Lactococcus sp.)
чаще встречаются у женщин с прогрессированием беременности.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
На этапе подготовки бесплодных пар необходимо проводить углубленное
обследование обоих партнеров. С целью выявления T. vaginalis предпочтительно
исследовать отделяемое из вагины и эякулят культуральным методом с
использованием селективных питательных сред и последующей микроскопией.
Длявыявленияурогенитальнойхламидийнойинфекции
(C. trachomatis) определять специфические IgG и IgA к хламидиям в сыворотке
крови – маркёры хронической персистирующей восходящей инфекции. Для
оценки активации урогенитальной вирусной герпетической инфекции (Herpes
simplex 1, 2, и Cytomegalovirus) целесообразнее использовать серологический
метод, позволяющий определить иммуноглобулины к предранним белкам в
сыворотке крови. У женщины – проводить оценку состояния микробиома
влагалища и кишечника и выявление маркеров инфекций, передающихся
преимущественно половым путем молекулярно-биологическими методами
(real-time ПЦР, метагеномное секвенирование). В системе профилактических
мероприятий, направленных на снижение риска репродуктивных потерь,
необходимо предусмотреть использование средств коррекции дисбиотических
состояний планирующих беременность женщин и / или возникающих у
беременных.
Рекомендуется усиление просветительской работы со стороны женских
консультаций, направленной на ознакомление бесплодных пар с возможностью
коррекции факторов образа жизни, что внесет свой вклад в повышения
эффективности программ ВРТ.
ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ
Перспективы дальнейшей разработки темы, по нашему мнению, в
значительной мере связаны с изучением роли микробиома женской половой
системы в качестве одного из главных факторов, определяющих репродуктивное
здоровье. Представляется целесообразным проведение проспективных когортных
исследований с использованием современных методов метагеномного анализа,
которые бы позволили наиболее детально оценить причинно-следственные связи
между изменениями состава микробиоты различных биотопов организма
человека и наступлением беременности при использовании вспомогательных
репродуктивных технологий. Данные исследования позволят уточнить ключевые
мишени для таргетной терапии бесплодия, разработать рациональные принципы
коррекции дисбиотических состояний, приводящих к бесплодию, что, в
частности, имеет важное значение при разработке новых пробиотических
препаратов.