Фотохромные реакции ретинальсодержащих белков – зрительного родопсина и бактериородопсина – в фемто- и пикосекундном диапазоне времен

Во введении охарактеризована тема работы, обоснована ее актуальность, определены цели и задачи исследований, положения, выносимые на защиту, научная новизна работы и ее научно-прикладное значение.
ГЛАВА 1. Обзор литературы. Дана характеристика структуры и функции, а также физико-химических свойств Р и БР. Описан процесс фотолиза Р и фотоцикл БР. Особое внимание уделено первичным реакциям исследуемых белков, их экспериментальному и теоретическому исследованию. Приведен обзор по исследованию фотохромных свойств Р и БР.

ГЛАВА 2. Материалы и методы. В данном разделе приведено описание методов получения образцов, содержащих Р и БР, а также описаны методы исследования физико- химических свойств исследуемых белков.
2.1 Исследуемыми объектами являлись детергентный экстракт Р и суспензия пурпурных мембран, содержащих БР. Р был выделен из наружных сегментов палочек глаз быка Bos taurus в составе детергентных мицелл с концентрацией 3–7 мг/мл и коэффициентом чистоты (A280/A500) – 1,6–1,9. Суспензии пурпурных мембран были получены на основе штамма ET1001 галоархеи Halobacterium salinarum и любезно предоставлены ЦНИТИ “Техномаш” (121108, РФ, Москва, ул. Ивана Франко, д. 4). Концентрация БР составила 1–2 мг/мл, а коэффициент чистоты – 1,8. Образец был обработан ультразвуком и свето-адаптирован.
2.2 Стационарная абсорбционная спектроскопия. Стационарные спектры поглощения исследуемых белков регистрировали на спектрофотометре “Shimadzu UV– 1601PC» (Япония) в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 0,1 и 1 см.
2.3 Метод фемтосекундной абсорбционной лазерной спектроскопии. Время- разрешенные спектры фотоиндуцированного (ф/и) поглощения исследуемых белков были зарегистрированы с помощью фемтосекундной установки, созданной в лаборатории био- и нанофотоники ФИЦ ХФ им. Н.Н. Семенова РАН для выполнения экспериментов методами «возбуждение-зондирование» и «возбуждение-возбуждение-зондирование» фемтосекундной абсорбционной лазерной спектроскопии с временным разрешением 20– 30 фс.
Изучение прямой фотореакции Р и БР проводили методом «возбуждение- зондирование». Для возбуждения использовался импульс Гауссовой формы с энергией 70–220 нДж и длиной волны 500 (Р) и 560 нм (БР). В качестве зондирующего импульса использовали суперконтинуум с энергией 10нДж, спектральным диапазоном 400– 900 нм, поляризацией относительно возбуждающего под «магическим углом» (54,7°) и временной задержкой до 10 пс. Были зарегистрированы сигналы дифференциального ф/и поглощения Р и БР А(λ;t). В общем виде сигнал можно выразить как: ΔA(λ; t) = ΔAESA(λ; t) + ΔASE(λ; t) + ΔAGSA(λ; t) + ΔAGSB(λ; t), где ΔAESA > 0, ΔAGSA > 0, ΔASE <0иΔAGSB <0. Изучение фотохромизма Р и БР проводили методом «возбуждение-возбуждение- зондирование». Для изучения Р/БР использовался первый возбуждающий импульс I с длиной волны 500/560 нм и энергией 70/100 нДж, и второй возбуждающий импульс II с длиной волны 620/680 нм, энергией 700/560 нДж и временной задержкой tII = 0,2–3,775 (1–5) пс. Зондирование осуществлялось импульсом суперконтинуума. В зависимости от задержки tII, инициировалась обратная фотореакция либо из первого продукта прямой фотореакции фотородопсина (Фото570)/интермедиата J625, либо из второго продукта батородопсина (Бато535)/интермедиата K590. Энергия возбуждающих импульсов находилась в линейном диапазоне зависимости интенсивности сигнала. В результате были зарегистрированы сигналы ф/и поглощения Р и БР при действии импульса I (∆АI(λ; t)) и импульсов I и II (∆AI+II(λ; tII; t)). ГЛАВА 3. Результаты 3.1 Динамика прямой фотореакции родопсина Дифференциальные спектры и кинетические кривые фотоиндуцированного поглощения родопсина. На Рисунке 1 представлены дифференциальные спектры ΔA(λ) и кинетические кривые ΔA(t) ф/и поглощения Р, которые отражают выцветание основного состояния Р498 (ΔАGSB), а также образование возбужденного состояния Р*510 (ΔAESA и ΔАSE) и первых продуктов фотолиза – Фото570, Бато535 и колебательно-возбужденного исходного состояния Р498' (ΔАGSA). Рисунок 1 – Дифферен- циальные спектры (А) и кинетические кривые (Б) ф/и поглощения родоп- сина, зарегистрирован- ные на характерных временах задержки и длинах волн зондиро- вания. Кинетические кривые представлены в линейном (-0,1–1 пс) и логарифмическом (1– 10 пс) масштабах вре- мени Из Р*510 наблюдаются сигналы ΔAESA (Рисунок 1А, 410–480 нм, (2) и (3); Рисунок 1Б, 0–100 фс, (1–3)) и ΔАSE (Рисунок 1А, 630–720 нм, (2); Рисунок 1Б, -30–50 фс, (6)). На более поздних временах появляются сигналы ΔАGSA первого продукта цис-транс фотоизомеризации – Фото570 (Рисунок 1А, 560–720 нм, (4); Рисунок 1Б, 100–200 фс, (4– 6)) и следующего продукта Бато535 (Рисунок 1А, 540–680 нм, (6–8); Рисунок 1Б, 1–10 пс, (4) и (5)). Сигнал ΔАGSB (Рисунок 1А, 410–560 нм, (4); Рисунок 1Б, ~150 фс, (2) и (3)) значительно уменьшается за счет возвращения одной трети возбужденных молекул обратно в исходное состояние родопсина Р498' (Рисунок 1А, 410–480 нм, (5–8); Рисунок 1Б, 0,15–10 пс, (1–3)). В кинетических кривых на временах до 2 пс в области поглощения продуктов Фото570 (Рисунок 1Б, (4–6)) и Р498' (Рисунок 1Б, (1–3)) наблюдаются осцилляции сигнала, которые отражают когерентный характер фотореакции. При действии фемтосекундного импульса на S1 поверхности потенциальной энергии (ППЭ) образуется волновой пакет, который быстро и безбарьерно двигается по S1 ППЭ вдоль координаты реакции, переходит на S0 ППЭ через коническое пересечение (CI) S1/S0 ППЭ и частично сохраняет свои когерентные свойства в продуктах фотореакции, что отражает их колебательно- возбужденный характер. Движение волнового пакета в процессе реакции наблюдалось непосредственно – вдоль S1 ППЭ Р498 по смещению сигнала ΔАSE(Р*510) в длинноволновую область на временах 0–50 фс (Рисунок 2, красная стрелка) и далее вдоль S0 ППЭ продукта Фото570 по смещению сигнала ΔAGSA(Фото570) в коротковолновую область на временах ΔА GSB + GSA(Р498) ΔА GSA(Фото570 и Бато535) λ, нм 430–490 λ, нм 560–650 τ1, фс 59 ± 12 τ1', фс 74 ± 9 a2 τ2, фс -0,96 84 ± 20 a2' τ2', фс 0,94 114 ± 20 a3 τ3, пс -0,04 2,35 ± 0,17 a3' τ3', пс 0,06 2,22 ± 0,1 50–200 фс (Рисунок 2, синяя стрелка). Смена сигнала ΔАSE на сигнал ΔAGSA характеризует момент достижения ансамблем молекул CI. Рисунок 2 – Двумерная диаграмма сигналов ф/и поглощения родопсина ΔA(λ; t) в зависимости от длины волны зондирования в диапазоне 570–720 нм и времени задержки в диапазоне -0,1–0,8 пс. Контуры 1–14 соответствуют возрастанию интенсивности сигнала от значений ΔA(λ; t) < 0 (контуры 1–2) до ΔA(λ;t)>0 (контуры 4–14). На Рисунке обозначена эволюция сигнала ΔASE родопсина (красная стрелка) и сигнала ΔAGSA продукта Фото570 (синяя стрелка)
Таким образом, полученные данные свидетельствуют об образовании ко времени задержки 30фс возбужденного состояния Р*510, которое за 50–100фс переходит в продукты Фото570 и Р498′. Эти переходы осуществляются через CI S1/S0 ППЭ. Динамика сигналов ΔАESA, ΔАSE и ΔАGSA отражает быстрый и направленный S1 → S0 переход волнового пакета в процессе реакции фотоизомеризации ретиналя в Р, подтверждая ее когерентный характер. Полученные данные хорошо согласуются с данными работ [1, 2].
Анализ кинетических кривых фотоиндуцированного поглощения родопсина. Для анализа сигналов ΔA(t), характеризующих динамику первичных реакций Р (Рисунок 1Б; Рисунок 3, (1–5)), были построены модельные экспоненциальные кривые (Рисунок 3, (8)), параметры которых приведены в Таблице 1. Усредненные времена затухания τ1–τ3 и τ1’– τ3′ были получены в спектральных диапазонах 430–490 и 560–650 нм, соответственно.
Таблица 1 – Усредненные параметры модельных экспоненциальных кривых, построенных для экспериментальных кинетических кривых ф/и поглощения родопсина во временном диапазоне 0,03–10 пс в спектральных диапазонах зондирования 430–490 и 560–650 нм
Время достижения волновым пакетом CI и образования продуктов Фото570 и Р498′ составило ~60 фс (τ1), время движения волновых пакетов по S1 ППЭ Фото570 и Р498′, отражающее колебательную релаксацию, происходящую при образовании этих продуктов, было оценено в ~70 фс (τ1′) и ~80 фс (τ2), соответственно. Характерное время перехода Фото570 → Бато535 составило ~2,2 пс (τ3′).
Основываясь на данных работы [3], можно предположить, что при возбуждении Р498, кроме реакционного возбужденного состояния, образуется дополнительное нереакционное состояние, которое ведет только к образованию исходного состояния белка. Время этого процесса было оценено в ~2,4 пс (τ3), а вклад нереакционного состояния в общую динамику распада – в 0,04 (Таблица 1).
Рисунок 3 – Кинетические кривые ф/и поглощения родопсина, зарегистрированные на длинах волн зондирования 430 (1), 480 (2), 580 (3),
620 (4) и
соответствующие
экспоненциальные
(пунктирные кривые), построенные в диапазоне времен задержки 0,03– 10 пс. На Рисунке также представлены осцилляционные составляющие кривых 2 (6) и 3 (7)
При построении модельных кривых не учитывалась осцилляционная динамика волнового пакета, связанная с когерентным характером реакции фотоизомеризации ретиналя в Р. Фурье-анализ осцилляционной составляющей кривых ΔA(t) (Рисунок 3, (6) и (7)) позволил определить частоты и амплитуды различных компонент волновых пакетов продуктов Р498′ (Рисунок 4А) и Фото570 (Рисунок 4Б).
Рисунок 4 – Спектры мощности Фурье- компонент, полученные при анализе осцилляций сигналов А(t) родопсина в интервале времен задержки 0,09–1 пс в диапазоне частот 0–500 см-1 на длинах волн зондирования 440–480 нм (А) и 560–620 нм (Б). Частоты пиков подписаны на Рисунке в [см-1]
650 нм им
(5), и модельные кривые

была изучена
динамика
обратного
фотоперехода Фото570 → Р498 при
В полосе поглощения Р498′ был получен следующий набор частот осцилляций: 39, 59, 136, 195, 234, 293 и 371 см-1, среди которых доминируют частоты 136 см-1 и в меньшей степени 39 и 59 см-1. В полосе поглощения Фото570 были получены частоты: 59, 117, 156, 234, 254, 332 и 352 см-1, с доминирующими частотами 59 см-1 и в меньшей степени 156 см-1.
3.2 Фотохромизм родопсина
Обратная фотореакция родопсина, инициированная из первых двух продуктов прямой фотореакции. На Рисунке 5 представлены сигналы А(λ), полученные при действии одного и двух возбуждающих импульсов при времени задержки импульса II tII = 200, 1025, 2675 и 3775 фс и зондирующего импульса t = 100 пс. При данной задержке t дифференциальный спектр состоит только из сигналов ΔАGSB(Р498) и ΔАGSA(Бато535). После действия на образец импульса II уменьшается темново́е образование продукта Бато535 и увеличивается поглощение исходного состояния Р498 (Рисунок 5, (2–5)). Это свидетельствует об обратных фотопереходах Фото570 → Р498 (при tII = 200 и 1025 фс) или Бато535 → Р498 (при tII = 2675 и 3775 фс), которые сопровождаются транс → 11-цис изомеризацией ретиналя. При этом форма дифференциальных спектров не меняется, что свидетельствует об отсутствии в обратной фотореакции побочных продуктов.
Рисунок 5 – Дифференциальные спектры ф/и поглощения родопсина ∆А(λ), полученные при действии одного возбуждающего импульса I (1) и двух возбуждающих импульсов I и II (2–5) при задержке импульса II tII = 200–3775 фс и зондирующего
Также
tII = 200 фс (Рисунок 6). Сравнение кинетических кривых ∆АI(t) и разностных кривых ∆A'(t) = ∆AI+II(t) – ∆АI(t) показало, что продукты обратной фотореакции, Р498 и Фото570, окончательно образуются уже к 200 фс после
Кривые ∆AI(t) и ∆A'(t) были аппроксимированы экспоненциальными модельными кривыми. Сравнение полученных времен τ1–τ3 приведено в Таблице 2. Время жизни возбужденного состояния Фото570 определить не удалось, но было показано, что времена колебательной релаксации в продуктах обратной фотореакции, Р498 (τ2 = 37 ± 7 фс) и Фото570 (τ1 = 29 ± 18 фс),
импульса
областях
данные
артефактного сигнала, связанного с рассеянием возбуждающих импульсов
t = 100 пс. В спектральных
480–520 нм
не представлены из-за
и 600–645 нм
действия импульса II (t = 400 фс), как и в
случае прямой фотореакции, продукты которой окончательно образуются к 200–300 фс
после действия импульса I (Рисунок 1Б, (3) и (4); Рисунок 6).
сравнимы с временами колебательной релаксации продуктов прямой фотореакции, Фото570 (τ1 = 42 ± 5 фс) и Р498 (τ2 = 63 ± 6 фс). Полученные данные свидетельствуют о том, что обратная фотореакция Фото570 → Р498 протекает крайне быстро без образования промежуточных продуктов, а ее скорость сравнима со скоростью прямой фотореакции.
Рисунок 6 – Нормированные кинетические кривые ф/и поглощения родопсина ∆AI(t) (1) и ∆AI+II(t) (2) и разностные кривые ∆А'(t) = ∆АI+II(t) – ∆AI(t) (3), представленные на длинах волн зондирования 490 (А) и 610 нм (Б). Временная задержка импульса II составила tII = 200 фс. Для кривых ∆AI(t) и ∆А'(t) приведены модельные экспоненциальные кривые (4)
λ, нм τ1, фс τ2, фс τ3, пс ∆AI(t) 490 26±4 63±6 2,2±0,03 ∆A'(t) 490-37±7- ∆AI(t) 610 42±5 92±12 2,3±0,04 ∆A'(t) 610 29±18 130±100 –
Таблица 2 – Сравнение параметров модельных экспоненциальных кривых, построенных для экспериментальных кинетических кривых ф/и поглощения родопсина ∆AI(t) и разностных кривых ∆А'(t) = ∆АI+II(t) – ∆AI(t) на длинах волн зондирования 490 и 610 нм
При варьировании времени задержки импульса II (tII) в соответствии с фазой осцилляций, присутствующих в сигналах поглощения продукта Фото570, наблюдается разная эффективность обратной фотореакции, которая оценивалась по падению сигнала ∆АI+II(λ=560нм;tII;t=100пс) и возрастанию сигнала ∆АI+II(λ=450нм;tII;t=100пс) относительно сигнала ∆АI (Рисунок 7, вверху). Если задержка импульса II соответствует максимуму осцилляций продукта Фото570 с основной частотой 59 см-1, то обратная фотореакция протекает более эффективно и ме́ньшее количество продукта Бато535 образуется ко времени t = 100 пс. Фотохромное переключение регистрируется в меньшей степени, когда импульс II приходит в момент противофазы движения волнового пакета, и совсем не регистрируется в минимуме осцилляций при времени задержки tII = 420– 475 фс.
Фотохромное переключение наблюдается как на временах жизни Фото570 (0,2–2 пс), так и на стадии образования Бато535 (2–3,775 пс). По мере затухания осцилляций во время- разрешенных сигналах поглощения Фото570 ∆АI(λ = 620 нм; t > 1,5 пс), происходит выход сигнала ∆АI+II(tII) на плато.
Рисунок 7 – Внизу – Кинетическая кривая ф/и поглощения родопсина ∆АI, зарегистрированная на длине волны 620 нм (нижняя ось абсцисс). Вверху – Значения ф/и поглощения родопсина ∆АI+II, зарегистрированные на длинах волн 450 и 560 нм на времени задержки зондирования t = 100 пс и представленные в зависимости от времени задержки импульса II tII = 0,2–3,775 пс (верхняя ось абсцисс). На времени задержки tII = 0 фс представлены контрольные значения ф/и поглощения родопсина ∆АI, зарегистрированные на длинах волн 450 и 560 нм на времени задержки t = 100 пс
Расчет квантового выхода обратной фотореакции родопсина. Квантовый выход обратной фотореакции Р рассчитывали для двух случаев, когда задержка импульса II составляла tII = 0,2 пс и протекала реакция Фото570 → Р498 c квантовым выходом φ2, и когда tII = 3,775 пс и протекала реакция Бато535 → Р498 c квантовым выходом φ3. Квантовый выход определяли, как долю возбужденных под действием импульса II молекул Фото570 (Бато535), возвратившихся в Р498.
Квантовый выход φ2 рассчитывали по соотношению φ2 = N2/N1*, где N2 – количество возбужденных импульсом II молекул Фото570, перешедших в Р498 в результате обратной фотореакции, а N1* – количество возбужденных импульсом II молекул Фото570 в объеме образца V, который подвергался действию импульсов I и II и зондирующего импульса. V = l Sprobe, где l – оптический путь, а Sprobe – площадь кюветы с образцом, через которую прошел зондирующий импульс.
Значения N2 и N1* рассчитывали из экспериментальных данных прямого Р498 → Фото570 и обратного Фото570 → Р498 фотопереходов. Падение интенсивности импульса II после прохождения через образец можно представить, как ΔI = I0 2,303 εФОТО620 C l, где εФОТО620 – коэффициент экстинкции Фото570 на длине волны импульса II (1,25 107 см2 моль-1 [4]), а С – концентрация молекул Фото570 к моменту прихода импульса II. Величина ΔI может быть выражена через величину N1*: ΔI = ΔE/(Sprobe t) = N1* Eph/(Sprobe t), где ΔE – изменение энергии импульса II при прохождении через образец в объеме V, t – длительность импульса II, Eph – энергия фотона с длиной волны λ = 620 нм (3,21 10-19 Дж). Величина I0ꞏможет быть представлена аналогично: I0 = N Eph/(Sprobe t), где N – число фотонов в импульсе II, прошедших через площадь Sprobe. Величину N можно выразить как N = Epump2 Sprobe/(Eph Spump2), где Epump2 –
энергия импульса II (7 10-7 Дж), а Spump2 – площадь кюветы с образцом, через которую прошел импульс II (2,54 10-4 см2).
Используя приведенные выше выражения, величину N1* можно представить как: N1* = N (2,303 εФОТО620 C l) = 2,303 εФОТО620 Epump2 N1/(Eph Spump2 NA) = 0,41 N1, где N1 – число молекул Фото570 и, соответственно, Бато535, образованных в результате прямой фотореакции в объеме V, а NA – число Авогадро (6,02 1023 моль-1).
Величину N1 можно выразить как N1 = ∆AI560(λ = 560 нм; t = 100 пс)/k0, где ΔАI560 = 2,59 10-3 еоп., k0 = (εБАТО560 – εР560) l/(NA V), εБАТО560 и εР560 – коэффициенты экстинкции Бато535 и Р498, соответственно, на длине волны 560 нм. Величину N2 можно выразить аналогично: N2 = ǀ∆A’560(λ = 560 нм; tII = 200 фс; t = 100 пс)ǀ/k0 , где ǀ∆A’560ǀ = ǀ∆AI+II560 – ∆AI560ǀ = 1,5 10-4 еоп.
Таким образом, квантовый выход обратной фотореакции Фото570 → Р498 может быть представлен как: φ2 = ǀ∆А’560(tII = 200 фс)ǀ/(0,41 ∆АI560) = 0,14. Для фотореакции Бато535 → Р498 квантовый выход φ3 был вычислен аналогично, он составил φ3 = 0,15.
3.3 Динамика прямой фотореакции бактериородопсина
На Рисунке 8 представлены дифференциальные спектры ΔA(λ) и кинетические кривые ΔA(t) ф/и поглощения БР, которые отражают выцветание основного состояния БР568 (ΔАGSB), образование возбужденного состояния, называемого интермедиатом I460 (ΔAESA и ΔАSE), и первых фотопродуктов в основном состоянии – интермедиатов J625, K590 и исходного состояния БР568 (ΔАGSA).
Рисунок 8 – А – Дифференциальные спектры (А) и кинетические кривые (Б) ф/и поглощения бактериородопсина, зарегистрированные на характерных временах задержки и длинах волн зондирования. Кинетические кривые представлены в линейном (-0,2–2 пс) и логарифмическом (2–10 пс) масштабах времени
Сигналы ΔAESA и ΔАSE возникают к 100 фс после возбуждения в областях 450–490 нм и 700–900нм, соответственно (Рисунок 8А, (2–4)). Исчезновение этих сигналов сопряжено с образованием ко времени задержки 1 пс в области 650 нм полосы поглощения интермедиата J625 с изомеризованным ретиналем (Рисунок 8А, (5) и (6);

Рисунок 8Б, (5)). Дальнейший сдвиг этой полосы ΔАGSA в коротковолновую область отражает образование следующего интермедиата K590 (Рисунок 8А, (7) и (8)). Сигнал ΔАGSB, наблюдаемый в области 530–640нм, значительно уменьшается при t > 100 – 150 фс из-за перехода части возбужденных молекул в исходное состояние БР568 (Рисунок 8Б, (4)). Характерные времена наблюдаемых процессов были оценены путем построения модельных экспоненциальных кривых (Рисунок 9, пунктирные кривые; Таблица 3).
Рисунок 9 – Кинетические кривые ф/и поглощения бактериородопсина, представленные на длинах волн зондирования 450 (1), 500 (2), 590 (3), 630 (4) и 880 нм (5) в линейном (-0,2–2 пс) и логарифмическом (2– 10 пс) масштабах времени, и соответствующие им модельные экспоненциальные кривые (пунктирные кривые), построенные в диапазоне времен задержки 0–10 пс. На Рисунке также представлена осцилляционная составляющая кривой 5 (6)
Образование интермедиата I460 из ФК состояния происходит с характерным временем τ1 = 40 фс. Характерное время τ2 = 130 фс отражает коротковолновый сдвиг сигнала ΔАESA и длинноволновый сдвиг сигнала ΔАSE на временах задержки 50–200 фс.
Процесс с характерным временем τ3 = 480 фс является основным путем распада возбужденного состояния I460, происходящего с образованием интермедиата J625 и исходного состояния БР568. Следовательно, эту составляющую можно отнести к реакционному пути распада возбужденного состояния через S1/S0 CI.
Процесс с характерным временем τ4 = 2,4 пс, который можно наблюдать в полосах ΔАESA, ΔАSE и ΔАGSB, связан с дополнительным
3). Характерное время τ4′ = 1,8 пс отражает J625 → K590 переход, наблюдаемый в области поглощения ΔАGSA этих продуктов (Рисунок 9, (4)).
В кинетических кривых ф/и поглощения БР ΔАSE(t) (Рисунок 9, (5)) также присутствует осцилляционная составляющая (Рисунок 9, (6)), но с амплитудой на порядок
нереакционным путем возбужденного
поскольку в этом временном диапазоне формируется только исходное состояние БР568 (Рисунок 9, (1–3) и (5)). Соотношение реакционного и нереакционного путей составило 0,96/0,04 (Таблица
распада состояния,
меньшей, чем в случае Р (Рисунок 3, (6) и (7)). Фурье-анализ показал в кинетических
кривых ΔАSE(t) наличие слабо выраженных осцилляций с частотами ~100 и 175 см-1.
Таблица 3 – Параметры модельных экспоненциальных кривых, построенных для экспериментальных кинетических кривых ф/и поглощения бактериородопсина во временно́м
диапазоне 0–10 пс в
ΔА
ESA
ESA
GSB +
+ GSA(БР568) ESA +
+ GSA(J625 и K590)
характерных спектральных диапазонах зондирования
λ, нм
440–460
490–510
585–600
620–640
a4 τ4′, пс 0,06 – 0,01 –
0,04 –
– 1,8 ± 0,6 0,04 –
0,04 1,8 ± 0,6
Обратная
бактериородопсина,
первых двух продуктов прямой фотореакции. Фотохромные свойства БР были исследованы в раннем пикосекундном диапазоне при задержке импульса II tII = 1, 3 и 5 пс. При tII = 1 пс импульс II возбуждает интермедиат J625, а при tII = 3 и 5 пс – интермедиат K590. Как видно из Рисунка 10, действие импульса II при tII = 5 пс приводит к уменьшению сигналов ΔАGSB(БР568) и ΔАGSA(K590) на времени зондирования t = 100 пс. Аналогичные данные были получены для tII = 1 и 3 пс. Это свидетельствует о том, что импульс II в части молекул БР прерывает фотоцикл и инициирует обратную фотореакцию со стадии интермедиатов J625 и K590 в исходное состояние БР568 без образования побочных продуктов, о чем можно судить по сохранению формы дифференциальных спектров. В отличие от Р, эффективность обратной фотореакции БР практически не зависит от величины tII.
τ1, фс τ2, фс τ3, фс а3 50±20 90±20 410±160 0,94 40±10 140±50 480±190 0,99
40±10 100±40 500±230 0,96
40±10 110±20 480±170 – 20±10 230±120 550±320 0,96
40±10 130±50 480±210 0,96 3.4 Фотохромизм бактериородопсина
τ4, пс
2,8 ± 0,8 2,8 ± 0,7
2,1 ± 0,6
–
1,7 ± 0,8
2,4 ± 0,7
SE
среднее значение
870–890
фотореакция инициированная из
Рисунок 10 – Дифференциальные спектры ф/и поглощения бактериородопсина, полученные при действии одного возбуждающего импульса I (1) и двух возбуждающих импульсов I и II (2) при задержке импульса II tII = 5 пс и зондирующего импульса t = 100 пс. В спектральных областях прохождения возбуждающих импульсов 530–590 и 660– 710 нм экспериментальные кривые были достроены модельными кривыми (пунктирные кривые)
Расчет квантового выхода обратной фотореакции бактериородопсина.
Квантовый выход обратной фотореакции БР рассчитывали для случая, когда задержка
импульса II tII = 5 пс и протекала фотореакция K590 → БР568 c квантовым выходом φ4. Расчет был выполнен аналогично, представленному в Пункте 3.2 для Р. Квантовый выход определяли, как долю возбужденных импульсом II молекул K590, возвратившихся в БР568. Было получено значение φ4 = 0,81.
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов
4.1 Динамика первичных фотопревращений родопсина
На основании спектрально-кинетических данных (П. 3.1), характеризующих первичные реакции Р, и модели 2-х состояний можно предположить следующую последовательность индуцированных светом событий (Рисунок 11А, красный цвет). После поглощения кванта света на S1 ППЭ Р498 образуется ФК состояние, которое к 30 фс переходит в возбужденное состояние Р*510 как результат движения волнового пакета вдоль С=С колебательных мод ретиналя. Из этого состояния наблюдаются сигналы ΔАESA и ΔАSE. Далее волновой пакет двигается вдоль реакционных колебательных мод, что видно по динамике сигнала ΔАSE (Рисунок 2, красная стрелка). К реакционным модам относятся торсионные моды ретиналя и внеплоскостные колебания атомов водорода (НООР). Волновой пакет с характерным временем ~60 фс достигает области CI S1/S0 ППЭ, разделяется на два подпакета, один из которых двигается по S0 ППЭ Фото570 в процессе колебательной релаксации этого продукта, происходящей с характерным временем ~70 фс, что видно по динамике сигнала ΔАGSA (Рисунок 2, синяя стрелка).
Время фотоизомеризации ретиналя в Р (~60 фс) было оценено по анализу сигналов ΔA(t). Это значение хорошо согласуется с литературными данными (50–100 фс) [2, 5]. Такая высокая скорость фотореакции Р возможна благодаря асинхронному движению С9=С10 и С11=С12 связей на 44° и -128°, соответственно [2], по механизму «велосипедных педалей» с сохранением занимаемого объема [6], что крайне важно в ограниченном объеме хромофорного центра. Предварительное скручивание С11=С12 связи на -13° [2] также способствует высокой скорости и селективности фотореакции.
Второй волновой подпакет через область CI переходит на S0 ППЭ исходного состояния Р498′ и движется далее с характерным временем ~80фс, что отражает колебательную релаксацию ретиналя в этом продукте. При образовании продукта Бато535 за время 2,2пс завершаются процессы колебательной релаксации и дефазировки различных колебательных мод ретиналя, вероятно связанные с перераспределением энергии между ретиналем и его белковым окружением.
Движение волнового пакета также можно проследить по осцилляциям во время- разрешенных сигналах ΔAGSA(Фото570) и ΔAGSA(Р498′) (Рисунок 1 и 3). Частоты осцилляций, полученные в настоящей работе (Рисунок 4), согласуются с данными работ [5, 7] и соответствуют в основном делокализованным торсионным колебаниям ретиналя. В то время как реакция фотоизомеризации требует торсионного движения, сильно локализованного в области С11=С12 связи (570см-1) [5], более масштабные и низкочастотные торсионные движения активируются уже после перехода на S0 ППЭ.

Рисунок 11 – Строение S0 и S1 поверхностей потенциальной энергии родопсина (А) и бактериородопсина (Б), иллюстрирующее их фотохромные реакции в фемто- и пикосекундном временном диапазоне. Красным цветом обозначены параметры прямой фотореакции, синим – обратной фотореакции
Полученные результаты подтверждают нестационарный когерентный характер фотореакции ретиналя в Р. В других РСБ, как и в протонированном ШО ретиналя в растворе, эта реакция также имеет когерентный характер [8].
4.2 Фотохромизм родопсина
Строение S0 и S1 ППЭ Р в рамках модели 2-х состояний, а также отсутствие побочных и промежуточных продуктов в процессе обратной фотореакции, позволяет предположить следующую схему ее протекания (Рисунок 11А, синий цвет), которая имеет много общего со схемой прямой фотореакции. Импульс II, пришедший в образец через tII = 0,2–2 пс, инициирует S1 ← S0 переход из колебательно-возбужденного состояния Фото570, эволюционирующего во времени, на правую ветвь той же S1 ППЭ, которая участвовала в прямой фотореакции. Импульс II создает на S1 ППЭ волновой пакет, который двигается в область того же CI S1/S0 ППЭ [9], где также разделяется на два подпакета, которые переходят на S0 ППЭ продукта обратной фотоизомеризации, Р498, и исходного состояния, Фото570. Если задержка импульса II tII = 2–3,775 пс, то обратная фотореакция инициируется из продукта Бато535. Можно предположить, что обратная фотореакция Р также протекает в когерентном режиме.
В работе было показано, что скорость фотоперехода Фото570 → Р498 при tII = 200 фс сравнима со скоростью прямой фотореакции (Рисунок 6; Таблица 2), что согласуется с теоретическими данными работы [10]. Известно, что транс → цис фотопереход в ретинале протекает медленнее, чем цис → транс фотопереход (П. 4.3 и 4.5). Столь высокая скорость обратной фотореакции свидетельствует о том, что конформация

ретиналя не успевает сильно измениться при образовании продукта Фото570. Согласно теоретическим расчетам [2] С11=С12 связь в этом продукте скручена на 39° в сторону цис изомера, что должно сильно облегчить обратную фотореакцию именно по 11-транс связи.
Квантовый выход обратных фотореакций Фото570 → Р498 и Бато535 → Р498 довольно низкий и составляет 0,15. В работе также было показано, что эффективность фотореакции Фото570 → Р498 напрямую зависит от динамики волнового пакета в продукте Фото570 (Рисунок 7). В данном случае эффективность связана с количеством молекул Фото570, принявшим участие в обратной фотореакции.
4.3 Динамика первичных фотопревращений бактериородопсина
Для описания первичных реакций БР часто применяют модель 3-х состояний, которая предполагает влияние S2 ППЭ на S1 ППЭ, что приводит к созданию небольшого барьера (Рисунок 11Б), замедляющего фотореакцию и влияющего на ее когерентный характер. На основании модели 3-х состояний и спектрально-кинетических данных, характеризующих первичные реакции БР (П. 3.3), можно предположить последовательность индуцированных светом событий (Рисунок 11Б, красный цвет), которая имеет много общего с Р. Остановимся на особенностях первичных реакций БР. Первые два процесса, наблюдаемые после поглощения кванта света, отражают динамический сдвиг Стокса, который возникает из-за баллистического движения волнового пакета в возбужденном состоянии в сторону барьера на S1 ППЭ. Эти процессы связаны с образованием возбужденного состояния, интермедиата I460, за время 40 фс и последующей колебательной релаксацией, занимающей ~130 фс. Распад возбужденного состояния по реакционному пути занимает 480фс, а по нереакционному – 2,4пс. Процессы колебательной релаксации на стадии J625 → K590 перехода завершаются за 1,8 пс.
В процессе прямой фотореакции БР, как и в случае Р, изомеризация ретиналя протекает по типу асинхронного движения «велосипедных педалей» с сохранением занимаемого объема в хромофорном центре. При этом изначальное скручивание ретиналя по С13=С14 связи на 20° по направлению к 13-цис конфигурации [11] сильно облегчает изомеризацию и делает ее такой селективной.
Наличие нескольких путей распада возбужденного состояния, некоторые из которых могут быть нереакционными, в целом характерно для родопсинов 1 типа [12]. Это связывают с разделением путей реакции в ФК состоянии или с исходной гетерогенностью белка. Последнее предположение было подтверждено для натриевого насоса бактерии Krokinobacter eikastus [12] и для протонного насоса протеородопсина [13].
4.4 Фотохромизм бактериородопсина
В работе была впервые продемонстрирована обратная фотореакция БР, инициированная из первых продуктов прямой фотореакции J625 и K590 в диапазоне времени 1–5 пс при комнатной температуре. Строение S0 и S1 ППЭ БР (модель 3-х состояний), а также отсутствие побочных продуктов в процессе обратной фотореакции,
позволяет предположить следующую схему ее протекания (Рисунок 11Б, синий цвет), во многом повторяющую схему обратной фотореакции Р. Импульс II, пришедший в образец через tII = 1 пс, инициирует S1 ← S0 переход из интермедиата J625 на правую ветвь той же S1 ППЭ, которая участвовала в прямой фотореакции. Образованный импульсом II волновой пакет двигается вдоль этой ветви вероятно к той же области CI, которая участвует в прямой фотореакции, после чего происходит переход на S0 ППЭ с образованием как БР568, являющегося продуктом этой фотореакции, так и исходного состояния, интермедиата J625. Поскольку время образования интермедиата K590 составляет 1,8 пс, то импульс II, следующий с задержкой tII = 3 и 5 пс, будет инициировать фотореакцию K590 → БР568, механизм которой можно описать аналогично.
При образовании интермедиатов J625 и K590 двугранный угол С13=С14 связи поворачивается на 140° (от -160° до -20°) [11]. Таким образом, при инициировании обратной фотореакции ретиналь, как и в случае прямой фотореакции, скручен на 20° по направлению к полностью-транс изомеру, что должно облегчить обратную фотореакцию. Вероятно, фотореакция J625(K590) → БР568 будет протекать быстрее, чем фотореакция БР568 → J625, поскольку она инициируется из цис изомера ретиналя. В работе [14] было показано, что время жизни возбужденного состояния интермедиата K590 составляет ~100 фс. Можно предположить, что обратная фотореакция J625(K590) → БР568 протекает безбарьерно и по своей динамике напоминает прямую фотореакцию Р и БР, содержащего 13-цис ретиналь в темно-адаптированном состоянии [15].
В работе было показано, что эффективность обратной фотореакции J625 → БР568 практически не зависит от времени задержки второго возбуждающего импульса, что связано с отсутствием ярко выраженных когерентных эффектов в интермедиате J625, образованном в процессе прямой фотореакции, в отличие продукта Фото570 в случае Р.
Квантовый выход обратной фотореакции K590 → БР568 (φ4) был рассчитан как часть возбужденных импульсом II молекул (tII = 5 пс), вернувшихся в исходное состояние БР568. Он составил φ4 = 0,81, что в целом близко к значениям, полученным ранее методом низкотемпературной спектрофотометрии и время-разрешенной спектроскопии (0,93– 0,96) [16].
4.5 Сравнение фотохромных реакций родопсинов 1 и 2 типа на примере бактериородопсина и родопсина
Сравнение прямых фотореакций бактериородопсина и родопсина. На основе данных, полученных в настоящей работе (П. 3.1 и 3.3), с учетом литературных данных, можно предложить следующие модельные кинетические схемы (Рисунок 12), описывающие первичные реакции Р и БР. Эти схемы имеют много общего и отражают предположение, что гетерогенность возбужденных состояний исследуемых белков связана с гетерогенностью их начальных состояний. В Р и БР в процессе реакции образуются аналогичные по своим свойствам интермедиаты: Р*510, Фото570, Бато535 и I460, J625, K590, соответственно. Элементарный акт изомеризации ретиналя протекает в возбужденном состоянии путем перехода через CI S1/S0 ППЭ, и время этого перехода находится в фемтосекундном диапазоне. Первые продукты с изомеризованным
ретиналем (Фото570 и J625) образуются в основном (S0) состоянии и являются колебательно-возбужденными предшественниками следующих продуктов (Бато535 и K590, соответственно), образующихся в масштабе нескольких пикосекунд. На этом этапе завершается изомеризация ретиналя, а в напряженной структуре продуктов Бато535 и K590 запасается часть энергии кванта света. Квантовый выход прямых фотореакций Р и БР практически совпадает (~0,65) [16, 17]. Реакция фотоизомеризации ретиналя в Р и БР, как и в других РСБ и в растворе, протекает когерентно, что является внутренним свойством хромофора. Особенностью когерентных реакций является возможность управления ими путем создания различной топологии ППЭ, участвующих в реакции, что активно используется биологическими молекулами РСБ.
Рисунок 12 – Кинетические схемы прямых фотореакций родопсина (1) и бактериородопсина (2), отражающие гетерогенность исходных состояний этих белков, среди которых можно выделить реакционные (r) и нереакционные (nr) состояния. В скобках приведены времена колебательной релаксации, наблюдаемой при образовании продуктов Фото570, Р498′ и интермедиата I460
Основные отличия динамики прямых фотореакций Р и БР связаны со строением S0, S1 и S2 ППЭ реакционных форм этих белков (Рисунок 11), которое определяется как конформацией ретиналя, так и влиянием специфического белкового окружения на ретиналь. В случае Р, как и других родопсинов 2 типа, прямая фотореакция описывается моделью 2-х состояний (S0 и S1). S1 → S0 переход волнового пакета в процессе фотореакции происходит быстро, направленно и безбарьерно с сохранением значительной доли когерентности. Такой тип динамики называется баллистическим или
импульсным. В случае БР, как и других родопсинов 1 типа, прямая фотореакция описывается моделью 3-х состояний (S0, S1 и S2), постулирующей наличие небольшого барьера на пути распада S1 возбужденного состояния из-за взаимодействия с S2 ППЭ, что сильно влияет на динамику реакции. В результате волновому пакету для S1 → S0 перехода требуется больше времени (480 фс), чем в случае Р (~60 фс), а различные компоненты волнового пакета сильно теряют свои когерентные свойства. Такой тип динамики называется диффузным.
Конформация ретиналя влияет на динамику фотореакции посредством системы сопряженных π-связей [18], длина которой значительно отличается в полностью-транс-
6-s-транс ретинале (родопсины 1 типа) и 11-цис-6-s-цис ретинале (родопсины 2 типа). Чем больше сопряжение π-связей в основном состоянии ретиналя, тем больше барьер на S1 ППЭ и тем труднее проходит фотоизомеризация. Нарушение системы π-связей в 11- цис и 6-s-цис положении приводит к созданию безбарьерной S1 ППЭ ретиналя и значительному ускорению фотореакции.
На динамику фотореакции РСБ также может влиять различная структура хромофорного центра в основном посредством скручивания ретиналя и изменения положения противоиона для протона Шиффова основания (ШО). Взаимодействие ретиналя с белком в целом увеличивает скорость и квантовый выход фотореакции по сравнению с наблюдаемыми в газовой фазе и в растворе, а селективность увеличивает до 100%. Можно предположить, что наиболее тонкая регуляция этих параметров осуществляется в родопсинах 2 типа, в которых фотореакция имеет более выраженный когерентный характер. Хромофор-белковые взаимодействия также могут быть причиной возникновения гетерогенности начального состояния белка, поскольку в газовой фазе она не наблюдается [19].
На основе проведенного сравнения можно заключить, что различия в динамике фотохимических реакций родопсинов 1 и 2 типов в основном связаны с различиями исходных изомерных форм их хромофоров, электронные свойства которых оптимизированы посредством взаимодействия с белковым окружением, которое может быть гетерогенным.
Уменьшение системы сопряженных π-связей в 11-цис ретинале по сравнению с транс изомером также приводит к сдвигу максимума поглощения белка в синюю область и к увеличению барьера тепловой 11-цис → транс изомеризации ретиналя. Первый эффект активно используется родопсинами 2 типа как один из факторов для спектральной настройки, а второй эффект имеет большое значение для уменьшения «темнового шума» фоторецепторной клетки, чему также сильно способствует ограниченный объем хромофорного центра. В случае БР и некоторых других родопсинов 1 типа, хромофорный центр достаточно просторный и не препятствует теплово́й транс → 13-цис изомеризации, происходящей в процессе темново́ й адаптации.
Все перечисленные выше особенности 11-цис ретиналя могут быть использованы родопсинами 2 типа для создания высокой светочувствительности, что крайне важно для функционирования этих белков, выполняющих фотоинформационную функцию. Возможно именно поэтому 11-цис ретиналь был выбран в ходе эволюции в качестве хромофорной группы для родопсинов высших животных.
В рамках теории конвергентной эволюции родопсинов 1 и 2 типа можно предположить, что белковые структуры этих двух групп развивались независимо путем оптимизации электронных свойств хромофорной группы, конформация которой различается, что привело к созданию разных аминокислотных последовательностей. При этом сходство структуры и механизма работы такой сложной биологической структуры может явиться результатом давления отбора при биофизических ограничениях, связанных с общностью выполняемой функции, поскольку в конвергентных структурах общие структурные сходства жизненно важны для функционирования.

Рисунок 13 – Кинетические схемы обратных фотореакций родопсина (1 и 2) и бактериородопсина (3 и 4), инициированных из продуктов прямой фотореакции: Фото570 (1), Бато535 (2), J625 (3) и K590 (4). Знаком * отмечены возбужденные (S1) состояния
В рамках теории дивергентной эволюции предполагается наличие общего предка для родопсинов 1 и 2 типа. Им мог бы быть родопсин 1 типа, который стал использовать 11-цис ретиналь в качестве хромофорной группы, возможно пройдя через стадию потери фоторецепторной функции. При этом оптимизация электронных свойств хромофора, которая влияет на эффективность фотоизомеризации и барьер тепловой изомеризации, также рассматривается как ключевой фактор эволюции родопсинов 2 типа и появления поразительного расхождения аминокислотных последовательностей, наблюдаемого при сравнении с родопсинами 1 типа [18].
Сравнение обратных фотореакций бактериородопсина и родопсина. В работе были подробно исследованы обратные фотопереходы из первых продуктов прямой фотореакции Р (Фото570 и Бато535) и БР (J625 и K590) в фемто- и раннем пикосекундном масштабе времени (П. 3.2 и 3.4, соответственно), кинетические схемы которых представлены на Рисунке 13. Было высказано предположение, что эти фотопереходы осуществляются с участием тех же S1 ППЭ и CI, которые участвовали в прямой фотореакции, как представлено на Рисунке 11.
сравнению с БР является преимуществом, способствующим более надёжному осуществлению прямой реакции, запускающей процесс фототрансдукции.
Поглощение света родопсинами 1 типа в основном служит фотоэнергетической функции, как в случае БР, и обратные фотореакции вполне вероятно не могут существенно повлиять на ее эффективность. Однако в случае родопсинов 2 типа, которые
Несмотря на то, что квантовые выходы прямой фотореакции Р и БР
совпадают выходы
(~0,65), обратных первых
практически
квантовые
фотореакций
фотопродуктов сильно отличаются (~0,15 и 0,81, соответственно). Видимо определяющим фактором является влияние белкового окружения на динамику обратных фотопереходов полностью- транс → 11-цис ретиналь в Р и 13- цис → полностью-транс ретиналь в БР, поскольку в растворе метанола эти фотореакции идут с квантовыми выходами, близкими по значению (0,14 и 0,11, соответственно [20]). Можно отметить, что с функциональной точки зрения столь маленький квантовый выход обратной фотореакции Р по
из
являются G-белок-связывающими рецепторами, 11-цис ретиналь действует как эффективный лиганд-антагонист, поддерживающий низкий тепловой «темново́й шум» фоторецепторной клетки. Поглощение света этими рецепторами инициирует процесс фототрансдукции, и изомеризованный полностью-транс ретиналь действует как мощный агонист. В этом случае вероятность возникновения обратной фотореакции может значительно снизить эффективность процесса фототрансдукции. Таким образом, ме́ньшая эффективность обратной фотореакции Р, повышающая надежность прямой фотореакции, может рассматриваться как один из аргументов в пользу отбора в ходе эволюции 11-цис изомера в качестве хромофорной группы всех родопсинов 2 типа.
Можно предположить, что фотобиологический механизм преобразования света в информационный процесс в эволюционно более «молодых» зрительных родопсинах (родопсины 2 типа) должен быть надежнее, нежели механизм преобразования света в фотоэнергетический процесс в эволюционно более «древних» микробиальных родопсинах (родопсины 1 типа), что и отражается в низком значении квантового выхода обратной реакции, протекание которой можно рассматривать как потерю информации. Это свидетельствует о более совершенном строении хромофорного центра Р и выборе в процессе эволюции такого хромофора (11-цис ретиналь), взаимодействие с которым позволяет эффективно осуществлять процесс фототрансдукции.
ВЫВОДЫ
1. В процессе прямой реакции фотоизомеризации 11-цис ретиналя в зрительном родопсине волновой пакет достигает области конического пересечения за время ~60 фс. Это позволяет заключить, что к этому времени система переходит из возбужденного в основное состояние первого фотопродукта – Фото570.
2. Когерентный характер прямой реакции фотоизомеризации полностью-транс ретиналя в бактериородопсине слабо выражен, время протекания реакции составляет 480 фс.
3. Время протекания обратной фотореакции зрительного родопсина из продукта Фото570 сравнимо со временем протекания прямой фотореакции. Подтверждена гипотеза о влиянии когерентного характера прямой фотореакции зрительного родопсина на эффективность обратной фотореакции из продукта Фото570. Квантовый выход обратной фотореакции из продуктов Фото570 и Бато535 составляет 0,15.
4. Показана возможность инициирования обратного фотоперехода из продуктов прямой фотореакции бактериородопсина, J625 и K590, в раннем пикосекундном диапазоне времени. Квантовый выход обратной фотореакции из продукта K590 составляет 0,81.
5. Сравнительный анализ прямых и обратных фотореакций зрительного родопсина и бактериородопсина показал, что зрительному родопсину, в отличие от бактериородопсина, присущи ярко выраженный когерентный характер и высокая скорость прямой фотореакции, а также низкий квантовый выход обратной фотореакции, что повышает надежность и эффективность осуществления основной физиологической функции этого белка – инициации процесса фототрансдукции.