Белок-белковые взаимодействия в системе передачи цитокининового сигнала

К генам, кодирующим белки, взаимодействие которых требуется изучить, с помощью линкеров пришивали комплементарные фрагменты гена, кодирующего желтый флуоресцентный белок (YFP). Далее плазмидами, содержащими данные конструкции, трансформировали агробактерии, после чего парами агробактериальных клонов, несущих гены белков, взаимодействие которых исследуется, сшитых с комплементарными половинами YFP, транзиентно трансформировали листья табака Nicotiana benthamiana, в которых осуществлялась экспрессия данных генов гибридных белков. Уровень транзиентной экспрессии оценивали с помощью иммуноблоттинга с антителами против прикрепленных к фрагментам YFP Myc- и HA-тэгов. Степень взаимодействия гибридных белков в листьях табака оценивали по флуоресценции с помощью конфокального микроскопа Leica TCS SP5. В случае, если исследуемые белки взаимодействовали друг с другом, части белка YFP также соединялись и можно было наблюдать флуоресценцию.
Сайт-направленный мутагенез. Сайт-направленный мутагенез проводили с помощью метода трехстадийной ПЦР. Первая стадия заключалась в создании на основе исходного гена двух фрагментов ДНК с комплементарными концами. В реакциях для обоих фрагментов использовали один общий концевой праймер, а второй праймер содержал требуемые для замены аминокислоты замены нуклеотидов. Вторая стадия представляла ПЦР-реакцию по объединению двух фрагментов. В этой реакции праймеры не использовали, так как в качестве праймеров выступали ПЦР- продукты, полученные в результате ПЦР на первой стадии. В ходе третьей стадии осуществляли амплификацию ПЦР-продукта. Затем осуществляли вставку полученной последовательности в соответствующий вектор либо с помощью рестрикции и лигирования, либо с помощью GATEWAY-технологии. Наличие и точность мутации подтверждали секвенированием ДНК. В качестве матриц для двойных мутантов использовали плазмиды с одиночными мутациями, а для тройного мутанта – с одной из двойных мутаций.
Pull-down анализ. Целевые белки получали при их экспрессии в бактериях E. coli, трансформированных плазмидами pDESTTM15 (GST-тэг) или pET30(a)+ (His-тэг) с целевыми генами с последующей тэг-зависимой аффинной очисткой. Полученные
белки вводили в инкубационную смесь (на основе фосфатного буфера) в концентрации 5 мкг/мл AHK3 и 25 мкг/мл AHP2, с добавлением 5 мМ MgCl2 во все варианты, кроме одного. Из каждого варианта отбирали контрольную часть смеси (input), после чего в них добавляли глутатион-агарозные бусы и проводили инкубацию при +4 ̊С в течение двух часов. Далее проводили трехкратную отмывку буфером, а затем элюировали буфером с редуцированным глутатионом. Полученные образцы разделяли электрофорезом в 12% полиакриламидном геле, после чего переносили на мембрану и детектировали методом иммуноблоттинга, с использованием анти-His и анти-GST антител. Изображения, полученные с помощью анализатора LI-COR, исследовали в программе ImageJ.
Молекулярное моделирование по гомологии. Поиск шаблонных структур для моделирования по гомологии осуществляли с использованием веб-сервиса SWISS-MODEL. Выравнивание последовательностей выполняли с помощью NCBI BLAST и Clustal X 2.1. Моделирование белковых структур выполнено в программе Modeller 9.20 с использованием класса моделирования automodel. Лучшие модели выбирали в соответствии со значением показателя DOPE (дискретная оптимизированная энергия белка), рассчитанного Modeller. Фосфоакцептирующие остатки модифицировали с использованием веб-сервера Vienna-PTM, в тех вариантах, где это требовалось. После добавления атомов водорода модели энергетически минимизировали в UCSF Chimera 1.13.1 с использованием силового поля AMBER ff14SB. Стереохимическое качество моделей оценивали с помощью ProCheck, реализованного в веб-сервисе PDBsum, ProSA-web и сервера QMEAN. Дополнительно, для H-АТФазных доменов также были получены модели методом de novo, с использованием сервиса IntFOLD.
Исследование свойств интерфейсов в моделях белковых комплексов.
Аланиновое сканирование выполнено с использованием программы Rosetta, реализованной в веб-сервисе Robetta. Серверы Mitchell Lab KFC2 и PPCheck использовали для дополнительного прогнозирования горячих точек. Визуализацию и наложение моделей выполняли с помощью UCSF Chimera. Параметры интерфейса получены с использованием инструмента QtPISA. Сервер PRODIGY использовали для получения расчетных значений аффинности связывания и констант диссоциации комплексов MSP.
Для изучения комплементарности интерфейсов по гидрофобности и электростатическому потенциалу в программе MolSurfer были получены 2D проекции интерфейсов. Файлы PQR были сгенерированы на сервере PDB2PQR версии 2.1.1 с силовым полем AMBER, выбранным для расчетов. PROPKA использовали для протонирования при заданном pH. Количественное определение степени электростатической комплементарности проводили с использованием исходных изображений карт электростатической комплементарности, полученных в MolSurfer, путем их анализа в веб-сервисе Pixel Color Counter.
Расчёт потенциалов и картирование свойств белков. Анализ консервативности и визуализация его результатов на молекулярной поверхности проводились на сервере ConSurf. Визуализацию результатов анализа консервативности проводили в UCSF Chimera. Гидрофобный потенциал картировали на молекулярной поверхности в UCSF Chimera с использованием команды «kdHydrophobicity», основанной на шкале гидрофобности Кайта и Дулиттла. Электростатический потенциал картировали на молекулярной поверхности также в UCSF Chimera, используя кулоновское окрашивание поверхности (при выборе опции «Coulombic Surface Coloring» UCSF Chimera вычисляет электростатический потенциал по закону Кулона).
Белок-белковый докинг. Слепой (свободный) белок-белковый докинг был выполнен в ClusPro и PatchDock. ClusPro также применяли для проверки возможности шаблонных структур быть биологическим димером (не кристаллографическим артефактом), используя опцию «Классификация димеров» (Dimer Classification).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Исследование белок-белковых взаимодействий компонентов сигналинга
цитокининов Arabidopsis thaliana методом BiFC
Для изучения субклеточной локализации предполагаемых взаимодействий
между рецепторами ЦК и фосфотрансмиттерами in planta, мы провели исследования методом бимолекулярной флуоресцентной комплементации (BiFC). Для этих экспериментов гены рецепторов арабидопсиса AHK2, AHK3 и AHK4 и гены фосфотрансмиттеров AHP1, AHP2 и AHP3 были встроены в векторы pSPYNE-35S и
pSPYCE-35S для получения гибридных белков с фрагментами eYFP-метки на C- 8

концах (Walter et al., 2004). Гены рецепторов и фосфотрансмиттеров были ко- экспрессированы в листьях табака, а взаимодействие белков было проверено с помощью лазерной конфокальной микроскопии. Специфическая флуоресценция eYFP обнаружена для всех комбинаций AHK–AHP без видимых количественных различий в излучении сигнала (Рис. 1). В контрольных экспериментах при тестировании взаимодействия продуктов экспрессии векторов, в которых отсутствуют гены рецептора ЦК и/или фосфотрансмиттера, флуоресценция eYFP не регистрировалась (Рис. 1 – нижний ряд).
Рис. 1. Взаимодействие цитокининовых рецепторов с фосфотрансмиттерами in planta, определенное с помощью BiFC. В нижнем ряду представлены контрольные варианты. В четных столбцах представлены светлопольные изображения, соответствующие флуоресцентным изображениям слева от них. Белые стрелки указывают на ядра.
Субклеточный паттерн взаимодействия рецепторов и фосфотрансмиттеров включал сильный перинуклеарный сигнал, что является отличительной чертой локализации в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР). При большем увеличении флуоресценция отчетливо видна не только вокруг ядер, но и непосредственно в сети ЭР. Объединение при микроскопировании нескольких слоев ткани показало, что
меченая сеть ЭР заполняет весь объем клетки. Контрольное окрашивание ядер с помощью DAPI подтвердило перинуклеарное происхождение флуоресценции BiFC. Чтобы найти дальнейшее подтверждение того, что взаимодействия цитокининовых рецепторов с фосфотрансмиттерами локализуются на мембране ЭР, была протестирована ко-экспрессия взаимодействующих пар AHK–AHP методом BiFC с маркером ЭР WAK2-mCherry-HDEL. В результате анализа получены перекрывающиеся сигналы, согласующиеся с их совместной локализацией. Напротив, перекрытие сигнала с плазматическими мембранами, которые были окрашены FM4- 64, было минимальным или отсутствовало. Субклеточный характер взаимодействия AHK–AHP in planta соответствовал инициации передачи сигналов ЦК от ЭР (Рис. 2).
Рис. 2. Ко-локализация in planta цитокининовых рецептор–фосфотрансмиттерных комплексов (BiFC) с ЭР маркерным белком WAK2-mCherry-HDEL (верхний и средний ряд) и ПМ-маркером FM4-64 (нижний ряд). Цвет флуоресценции BiFC искусственно изменен с желтого на зеленый, для наглядности наличия или отсутствия пересечения сигналов при наложении на свечение маркеров ПМ или ЭР.
Далее, мы протестировали методом BiFC взаимодействие различных пар рецепторов ЦК арабидопсиса. В каждом случае получен флуоресцентный сигнал, указывающий на взаимодействие экспрессируемых белков. Некоторые особенности, в частности круговая флуоресценция вокруг ядра и перекрытие с маркером ЭР,
указывали на то, что эта флуоресценция возникла в ЭР. Паттерн флуоресценции, 10

локализованной в ЭР, контрастировал с паттерном, создаваемым взаимодействующими фосфотрансмиттерами, которые, как было показано, локализуются в цитоплазме и внутри ядра (Рис. 3).
Рис. 3. Результаты опытов BiFC по изучению димеризации рецепторов ЦК и фосфотрансмиттеров. Верхний ряд – крупные изображения флуоресценции в перинуклеарной области, характерной для димеров рецепторов (левые два изображения) и в ядрах, характерной для димеров фосфотрансмиттеров (правые два). Нижний ряд – коэкспрессия pSPYNE-35S-AHK3 х pSPYCE-35S-AHK2 с маркером ЭР белком WAK2- mCherry-HDEL. Цвет флуоресценции BiFC в нижнем ряду искусственно изменен на зеленый. Белые стрелки указывают на ядра.
Отметим, что комплексы фосфотрансмиттеров, окрашивающие нуклеоплазму, не окрашивали ядрышки. Показано, что AHP2, помимо гомодимера, может образовывать гетеродимер с AHP3 (Рис. 4).
Рис. 4. Результаты опытов BiFC по изучению димеризации фосфотрансмиттеров. Пример флуоресценции, локализованной в ядре, при димеризации фосфотрансмиттеров, где четко видно неокрашенное ядрышко.
Молекулярное моделирование структуры цитокининовых рецепторов, фосфотрансмиттеров и регуляторов ответа. Исследование свойств белок-
белковых интерфейсов в системе передачи цитокининового сигнала
Мы построили модели всех функциональных доменов рецепторов ЦК методом молекулярного моделирования по гомологии (Рис. 5). Как и ожидалось, наблюдалось высокое структурное сходство предсказанных рецепторов картофеля с их ортологами в Arabidopsis thaliana. Ключевые функциональные области, такие, как сайты связывания лигандов, сайты фосфорилирования, сайты связывания АТФ и интерфейсы димеризации, особенно консервативны.
Рис. 5. Модели функциональных доменов рецепторов ЦК картофеля. Сенсорные модули и HisKA домен представлены в виде димеров, где одна из субъединиц окрашена в серый цвет. Положения гормонов, АТФ и фосфоакцепторных остатков His/Asp выделены красным цветом. Зеленые сферы обозначают ионы Mg2+.
Сенсорный модуль (SM) рецептора ЦК является внецитозольной частью этого трансмембранного белка. SM содержит димеризационный субдомен (образованный длинной центральной α1-спиралью, короткой α2-спиралью и петлей между этими спиралями) и CHASE домен, включающий PAS и псевдо-PAS субдомены. Построены модели димерных структур SM A. thaliana (AHK2–4) и S. tuberosum monoploid (var. Phureja) (StHK2–4), проанализированы димеризационные интерфейсы гомо- и гетеродимеров SM арабидопсиса и гомодимеров SM картофеля (всего девять вариантов комплексов).
Рис. 6. Свойства поверхности сенсорного модуля AHK3, с выделенным интерфейсом димеризации. (А) консервативность; (Б) гидрофобность; (В) электростатический потенциал.
Только мембранно-дистальная часть димеризационного субдомена SM участвовала в формировании белок-белкового интерфейса (Рис. 6). Площадь интерфейса моделируемых комплексов варьировалась в диапазоне от 946 Å2 до 1044 Å2. Большая часть аминокислот димеризационного интерфейса SM консервативна и идентична у арабидопсиса и картофеля, но на периферии интерфейса находилось несколько вариабельных остатков (Рис. 6А). Интерфейсы SM включали гидрофобное ядро с по меньшей мере двумя ароматическими остатками (Phe и Tyr) в центре, в то время как периферия интерфейса в основном гидрофильна (Рис. 6Б). Этот тип
распределения гидрофобности, с гидрофобным ядром и гидрофильным ободком, 13

является одним из наиболее распространенных для белок-белковых интерфейсов. Изучено также распределение электростатических потенциалов по поверхности раздела (Рис. 6В). Интерфейсы димеризации имели 5–11 водородных связей и до пяти предполагаемых солевых мостиков согласно результатам, полученным в программе PISA.
Рис. 7. Взаимодействия, образуемые основными горячими точками в интерфейсе димеризации сенсорного модуля гомодимера AHK3. Разные цвета обозначают две субъединицы гомодимера: цепи А и В, окрашенные в пурпурный и бежевый цвета, соответственно.
Чтобы найти ключевые для димеризации аминокислоты (горячие точки) и их взаимодействия в интерфейсах, определяющие силу и специфичность димеризации рецепторов ЦК, выполнено виртуальное аланиновое сканирование для SM арабидопсиса и картофеля. Аланиновое сканирование всех гомо- и гетеродимеров в программе Robetta выявило две аминокислотные позиции, которые были горячими точками в обеих субъединицах всех комплексов: F158 и Y175, согласно нумерации AHK3. Некоторые позиции были горячими точками в большинстве комплексов (но не во всех), по крайней мере, в одной субъединице: H147, K162, T171, R178 и E182. Белок-белковые связи, образованные горячими точками AHK3SM, показаны на Рис. 7. Стоит отметить, что, помимо водородных связей и солевых мостиков, одним из энергетически ключевых взаимодействия является π-π-стекинг, образованный ароматическими кольцами F158 обеих субъединиц.
Рис. 8. Зависимость относительной площади максимально электростатически комплементарных зон от pH, в процентах от общей площади интерфейса димеризации сенсорных модулей ЦК рецепторов.
В зависимости от локализации рецептора, его сенсорный модуль может находиться либо в кислом растворе апопласта, либо в слабощелочном содержимом ЭР. Для апопласта максимальная активность белков приходится на значения рН в районе 4.5–6, а пик активности белков, функционирующих внутри клетки (в частности, в ЭР), приходится на рН в интервале 7–8. Рецепторы ЦК отвечают критериям функционирования внутри клетки, в компартментах со слабощелочным рН (Romanov et al., 2018). pH-зависимым критерием может служить способность рецепторов образовывать устойчивые димеры, которые, как полагают, необходимы для их нормального функционирования. Расчеты, проведенные с помощью программы Molsurfer, показали, что электростатическая комплементарность поверхностей интерфейса сенсорных модулей рецепторов достаточно высока в растворах с рН выше 7 (что характерно для ЭР), но существенно уменьшается при закислении среды ниже рН 7 (что характерно для апопласта) (Рис. 8). Степень комплементарности поверхностей интерфейса положительно коррелирует с прочностью образованных димеров, поэтому полученные результаты моделирования
также свидетельствуют в пользу функционирования ЦК рецепторов в форме димеров в составе ЭР.
Цитозольные каталитические модули рецепторов ЦК включают в себя HisKA и H-АТФазные домены. H-АТФазные домены включают сайты связывания АТФ и не участвуют в димеризации рецепторов напрямую, тогда как домены HisKA непосредственно образуют димеризационные интерфейсы цитозольной части рецепторов. Набор из девяти димеров HisKA (DHpD) доменов A. thaliana и S. tuberosum был получен с теми же комбинациями белков, что и для SM. Домен HisKA состоит из длинной α1-спирали и меньшей α2-спирали, расположенной в мембранно- дистальной части интерфейса. Выявлены существенные различия между свойствами димеризации SM и HisKA. В отличие от SM, домены HisKA вовлечены в димеризацию по всей своей длине, их димеры относятся к извитому типу (twisted shape). Димеры HisKA имели большую площадь интерфейса (от 1977 Å2 до 2267 Å2) и более высокую среднюю энергию взаимодействия. Различия также очевидны в паттерне гидрофобности: димеры HisKA включали большую гидрофобную зону в дистальной части интерфейса. Несмотря на то, что димеры HisKA доменов имели большие площади интерфейса и много межмолекулярных контактов, число водородных связей было меньше, чем в других интерфейсах, а аланиновое сканирование Robetta выявило лишь небольшое количество горячих точек в этих комплексах. Не было никаких аминокислотных позиций, которые были бы определены как предполагаемые универсальные горячие точки для всех комплексов.
Важнейшим условием для передачи «горячего фосфата» является взаимодействие рецепторов с фосфотрансмиттерами. Были построены модели для всех комбинаций комплексов фосфотрансмиттеров арабидопсиса AHP1–3, связанных с ресиверными доменами (HKRD, RD) рецепторов ЦК арабидопсиса AHK2–4, а также модель AHK5RD-AHP1 в качестве контроля (для сравнения с кристаллической структурой AHK5RD-AHP1, PDB ID: 4EUK). Ресиверные домены рецепторов ЦК S. tuberosum StHK2–4 смоделированы в комплексах с фосфотрансмиттером StHP1a. Структура ресиверных доменов цитокининовых рецепторов включает β-лист,
состоящий из пяти параллельных β-цепей и окруженный пятью основными (и часто одной дополнительной) α-спиралями. Фосфотрансмиттеры содержат шесть α- спиралей и не имеют β-цепей. В комплексе α1-спираль ресиверного домена находилась ближе всего к фосфотрансмиттеру, образуя преобладающую часть интерфейса рецептор-фосфотрансмиттер. Фосфорилируемый остаток Asp (D941 в AHK3RD) непосредственно не входил в димеризационный интерфейс, и располагался на краю β3-цепи AHKRD, примыкающей к петле L5. Этот сайт доступен для фосфоакцепторного остатка His (H82 в AHP2) фосфотрансмиттера. В фосфотрансмиттере три α-спирали (α2, α3 и α4) из шести вовлечены в формирование интерфейса взаимодействия.
Рис. 9. Свойства интерфейса AHK3RD–AHP2. (А) консервативность; (Б) гидрофобность; (В) электростатический потенциал. Цветовые условные обозначения такие же, как на рисунке 6.
Почти половина остатков HKRD и большинство остатков интерфейса HPt высоко консервативны. Примечательно, что область интерфейса является наиболее консервативной частью обоих взаимодействующих белков (Рис. 9А). Распределение гидрофобных и гидрофильных областей в интерфейсах всех исследованных комплексов HK–HPt очень сходно. В интерфейсах HKRD и HPt гидрофобное ядро окружено гидрофильными остатками с дополнительной небольшой гидрофобной областью на периферии (Рис. 9Б). Паттерны электростатического потенциала поверхности показали комплементарность интерфейсов взаимодействия HKRD и HPt (Рис. 9В). Высокая электростатическая комплементарность, а также высокий уровень консервативности остатков в интерфейсе (особенно в HPt) могут объяснить
неизбирательность взаимодействия HK–HPt, показанную в наших экспериментах ранее.
Все 13 комплексов HKRD–HPt исследованы методом аланинового сканирования. Для HKRD три позиции, являющиеся горячими точками, четко выявлены во всех исследованных комплексах – это K1013, N898 и N901 (нумерация AHK3), а две дополнительные предполагаемые горячие точки, V900 и R903, обнаружены более чем в двух, но не в всех комплексах. Для HPt обнаружены две высококонсервативные горячие точки, Q83 и S87, а также две менее консервативные, D54 и S90 (нумерация AHP2). K1013 не образовывал никаких межмолекулярных водородных связей или солевых мостиков, но хорошо известно, что его внутримолекулярный солевой мостик с D941 стабилизирует активную конформацию и обеспечивает связывание Mg2+, необходимое для фосфорилирования (Pekárová et al., 2011). N898 и N901 AHK3 образовали по меньшей мере три водородные связи с боковыми цепями остатков AHP2. N898 взаимодействовал с Q83 и S87 AHP2, N901 образовывал водородную связь с S90 (Рис. 10).
Рис. 10. Взаимодействия, образованные горячими точками в интерфейсе комплекса AHK3RD–AHP2.
Следующим этапом работы стало изучение интерфейсов взаимодействия фосфотрансмиттеров между собой. Структура OsHP1, которая выбрана как потенциальный шаблон для моделирования димеров HPt, содержит две идентичные цепи (A и B), соответствующие двум субъединицам HP, однако заявлена в базе как мономер. Результаты проверки в сервисе ClusPro показали, что эта структура с 80% вероятностью имеет биологически релевантную конформацию, а не просто димерную форму как кристаллографический артефакт. Этот результат подтвержден свободным докингом мономеров HPt. В этой конформации области поверхности HPt, образующие интерфейсы белок-белкового взаимодействия, в случае HPt-гомодимера и в случае HPt–HKRD гетеродимера в значительной степени перекрываются (Рис. 11).
Рис. 11. Сравнение структур комплекса AHK3RD–AHP2 и гомодимера AHP2. (А) наложение структур; синий – модель димера AHP2; красный – модель комплекса AHK3–AHP2; (Б) пересечение интерфейсов AHP2: синий – остатки, участвующие только во взаимодействии AHP–AHKRD; розовый – остатки, участвующие только во взаимодействии AHP–AHP; желтый – общие остатки для обоих типов взаимодействия.
Всего построено семь моделей димеров HPt–HPt: гомо- и гетеродимеры AHP1–
3 A. thaliana и гомодимер StHP1a S. tuberosum. Результаты MolSurfer показали, что
комплексы HPt–HPt в выбранной конформации демонстрируют только умеренную
гидрофобную комплементарность на уровне аминокислотных остатков, но
гидрофобная комплементарность на атомном уровне довольно высока, равно как и
комплементарность электростатического потенциала. Аланиновое сканирование
комплексов HPt–HPt показало, что основными горячими точками были Q83 и D54
(нумерация AHP2), расположенные в центре интерфейса взаимодействия. Таким
образом, по крайней мере одна горячая точка была той же, что и во взаимодействии AHKRD–AHP. Однако тенденции детерминант взаимодействия HPt–HPt не столь однозначны, как при взаимодействии HKRD–HPt, и положения горячих точек варьировались у разных димеров, а также в разных субъединицах димера (в гомодимере AHP2 были выявлены также Q76 и Q46).
Последним этапом передачи сигнала ЦК, белок-белковые интерфейсы которого изучены в настоящей работе, стало взаимодействие фосфотрансмиттеров с ресиверными доменами регуляторов ответа типа B. Ресиверные домены ARR 1, 2, 10 и 11 A. thaliana моделировали в комплексе с AHP2, тогда как StRR 1a и 11 S. tuberosum моделировали в комплексе с StHP1a (всего шесть комплексов). Часть поверхности RRRD, образующая интерфейс взаимодействия, была более вариабельной по сравнению с HKRD. Интерфейсы RRRD имели аналогичное распределение заряда по поверхности, но положительно заряженная область была более выраженной, особенно в ARR11 и StRR11. Гидрофобные участки были менее выражены, без четких границ. Площадь интерфейсов RRRD–HPt варьировалась от 881 до 1013 Å2, что, в среднем, немного больше, чем у HKRD–HPt. Интерфейсы включали до девяти водородных связей и до 10 предполагаемых солевых мостиков. Аланиновое сканирование выявило три позиции – D45, T47 и K138 (нумерация ARR1), которые можно рассматривать как горячие точки как минимум в трех комплексах RRRD–HPt. Результаты MolSurfer показали высокий уровень гидрофобной и электростатической комплементарности для всех изученных комплексов RRRD–HPt.
Для изучения влияния специфического фосфорилирования на взаимодействие HKRD–HPt построены модели димера AHK3RD–AHP2 с различными вариантами фосфорилирования остатков и присутствия ионов Mg2+. Проанализировано пять вариантов комплекса: один дикого типа, не содержащий Mg2+, и четыре со связанным Mg2+ (дикий тип, димер с фосфорилированным D941 в AHK3RD, димер с фосфорилированным H82 в AHP2 и димер с обоими фосфорилированными фосфоакцептирующими остатками). Кроме того, смоделированы два димера с мутациями, имитирующими фосфорилирование в AHK3RD (D941E) и в AHP2 (H82E),
также в присутствии Mg2+. Показано, что партнеры MSP, связанные с Mg2+, заметно увеличивали свое взаимное сродство по сравнению с апоформой (Рис. 12А). Дальнейшее увеличение сродства было получено, когда D941 AHK3RD был переведен в фосфорилированное состояние в присутствии ионов магния. В противоположном случае, когда фосфорилирован только H82 AHP2, аффинность связывания RD-HPt упала до уровня даже более низкого, чем у апоформ. Стоит отметить, что расчетная Kd для этих зеркально фосфорилированных форм различается более чем на порядок. Фосфорилирование обоих фосфоакцептирующих остатков приводило к снижению аффинности по сравнению с Mg2+-связанной нефосфорилированной формой, хотя аффинность оставалась несколько выше, чем у апоформы. Имитирующая фосфорилирование мутация D941E слегка увеличивала сродство, тогда как мутация H82E уменьшала его.
Рис. 12. Влияние фосфорилирования и Mg2+ на взаимодействие HKRD–HPt. (А) Расчетные константы диссоциации, полученные с использованием сервера Prodigy, символом (P) обозначены контрпартнеры в фосфорилированном состоянии; (Б) Влияние фосфорилирования на электростатический потенциал поверхностей AHK3RD и AHP2. Синий – положительный электростатический потенциал (+10), белый – нейтральный (0), красный – отрицательный (-10).
Влияние фосфорилирования на аффинность связывания можно объяснить изменениями электростатического потенциала поверхности (Рис. 12Б). Фосфорилирование D941 в AHK3 увеличило отрицательно заряженную зону
ресиверного домена, тогда как фосфорилирование H82 в AHP2 изменило заряд 21

соответствующей области интерфейса с положительного на отрицательный, что привело к снижению электростатической комплементарности и снижению аффинности. Эти изменения аффинности имеют четкое биологическое значение: HPt должен отделиться от рецептора после фосфорилирования H82, чтобы начать движение в ядро.
Валидация расчетных данных о детерминантах белок-белковых взаимодействий компонентов сигналинга цитокининов Arabidopsis thaliana
Значение связей, образованных горячими точками в интерфейсах взаимодействия рецепторов и фосфотрансмиттеров, было проверено экспериментально. AHK3 и AHP2 были выбраны в качестве партнеров для взаимодействия. В этой паре белков данные связи образованы аспарагинами 898 и 901 со стороны AHK3, глутамином 83 и серинами 87 и 90, со стороны AHP2. С помощью сайт-направленного мутагенеза эти аминокислоты, выбранные на основе расчетных данных, меняли на аланин для устранения трех водородных связей. Таким образом созданы одиночные, двойные и тройной мутанты AHP2, а также одиночные и двойной мутанты AHK3.
Анализ взаимодействия методом BiFC показал, что одиночные мутации в AHP2, взаимодействующем с AHK3-N901A, не вызывают значительных изменений в интенсивности взаимодействия, по сравнению с диким типом обоих белков. Тройной же мутант AHP2 при взаимодействии с AHK3 дикого типа отличается значительным ослаблением интенсивности флуоресценции, а также ее характера относительно общего поля клеток – она проявляется фрагментарно. В случае взаимодействия тройного мутанта AHP2 с AHK3-N901A, флуоресценция, за исключением неспецифической, практически пропадает.
Дальнейшие результаты опытов BiFC подтвердили, что мутации в фосфотрансмиттере снижают флуоресцентный сигнал в эксперименте (Рис. 13). Тройная мутация (Q83A-S87A-S90A) снижала его практически до уровня нетрансформированного листа табака, вне зависимости от наличия или отсутствия мутации в ресиверном домене AHK3. В определенной степени, это подтверждает
наше предположение о ключевой роли данных трех водородных связей во взаимодействии AHKRD–AHP. Однако в случае ко-экспрессии мутантов AHK3 с диким типом AHP2, только мутация N898A в AHK3 снижала уровень флуоресценции, в то время как N901A и двойная мутация увеличивали его до уровня более высокого, чем в контрольном взаимодействии между дикими типами (Рис. 13А). При нормировании этих данных на уровень экспрессии белков, картина взаимодействия мутантов AHK3 с диким типом AHP2 менялась, и мутация N898A показывала значения немного выше, чем у дикого типа, а N901A и двойной мутант более чем в два раза ниже (Рис 13В). Примечательно, что даже двойная мутация в рецепторе (N898A-N901A) не приводила к отсутствию взаимодействия с диким типом AHP2.
Рис. 13. Эффект точечных мутаций на взаимодействие цитокининового рецептора AHK3 с фосфотрансмиттером AHP2 in planta. (A) Результат BiFC – флуоресцентная конфокальная микроскопия; изображения получены при одинаковых условиях (мощность лазера, время экспозиции, контрастность и пр.). (Б) Иммуноблоттинг для взаимодействующих белков. (В) Интенсивность флуоресценции в % от контроля (AHK3wt–AHP2wt), нормированная на уровень экспрессии.
Одним из объяснений того, почему тройная мутация в AHP2 ингибировала
взаимодействие с AHK3 в опытах BiFC в значительно большей степени, чем двойная 23

мутация в AHK3 – это потенциальное (неспецифическое) взаимодействие AHP2 с другими интерфейсами AHK3, например, с псевдоресиверным доменом. Это предположение связано с тем, что для опытов BiFC мы использовали полноразмерный белок AHK3, а не отдельный ресиверный домен.
Следующим этапом экспериментальной валидации расчётно определенных аминокислот-детерминант взаимодействия AHK3–AHP2 стало проведение опытов с использованием метода pull-down. Условия опыта предполагали, как минимум, два ключевых отличия от BiFC. Во-первых, метод подразумевает взаимодействие белков in vitro, в контролируемых условиях, а во-вторых, вместо полноразмерного рецептора был взят отдельный ресиверный домен AHK3RD, что исключало возможность связывания фосфотрансмиттера с другими доменами рецептора, если такой тип взаимодействия возможен.
Рис. 14. Эксперименты по изучению эффекта точечных мутаций на взаимодействие цитокининового рецептора AHK3 с фосфотрансмиттером AHP2 in vitro методом pull-down анализа. (А) иммуноблоттинг результатов pull-down анализа; (Б) иммуноблоттинг контрольных проб смесей до эксперимента (input); (В) уровни интенсивности бендов после обработки anti-His антителами, соответствующие связанным фосфотрансмиттерам, нормированные на уровень интенсивности anti-GST бендов, соответствующих AHK3RD- ловушкам, и дополнительно нормированные по интенсивности бендов в контрольном тесте (input) исходной смеси; (Г) – электрофореграмма белков, исследуемых в эксперименте.
AHK3RD в двух вариантах (дикий тип и двойной мутант N898A-N901A) экспрессировали в плазмиде pDESTTM15 c GST-тэгом. AHP2 также в двух вариантах (дикий тип и тройной мутант Q83A-S87A-S90A) экспрессировали в плазмиде pET30a(+) с 6-His-тэгом. Взаимодействие проверяли во всех четырех возможных вариантах с добавлением MgCl2, кроме того, контрольный вариант с двумя дикими типами проверяли в отсутствие MgCl2. Результат pull-down анализа после нормирования данных показал, что отсутствие MgCl2 негативно влияет на взаимодействие диких типов AHK3RD и AHP2 (Рис. 14). Тройная мутация в AHP2 снижала интенсивность взаимодействия с диким типом AHK3RD почти в два раза. Двойная мутация в AHK3RD снижала интенсивность взаимодействия с диким типом AHP2 более, чем в 4 раза. Интенсивность взаимодействия между двумя мутантными белками снижалась почти до нуля.
ВЫВОДЫ
1. Методом BiFC установлено, что цитокининовые рецепторы – сенсорные гистидинкиназы (HK) – образуют в клетке как гомо-, так и гетеродимеры, локализованные, в основном, в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР). Взаимодействие рецепторов с фосфотрансмиттерами (HPt) регистрируется также, в основном, в ЭР, тогда как димеры самих HPt локализованы большей частью в ядре клетки. Цитокининовые рецепторы арабидопсиса (AHK2–4) взаимодействуют со всеми изученными HPt арабидопсиса (AHP1–3) без видимой избирательности.
2. С помощью методов молекулярного моделирования построены модели структуры белков, участвующих в передаче цитокининового сигнала в клетке, и детально охарактеризованы их взаимодействия.
3. Неизбирательность во взаимодействии рецепторов и HPt объясняется высокой консервативностью интерфейсов взаимодействия (особенно у HPt), с выраженной гидрофобной и электростатической комплементарностью.
4. Локализация димеров рецепторов в ЭР благоприятствует высокой электростатической комплементарности димеризационных интерфейсов сенсорных модулей при значениях pH, близких к нейтральному и выше. Уровень комплементарности, а следовательно, и стабильность димеров снижается в
кислой среде (pH ниже 7), характерной для апопласта. 25

5. Детерминантами специфического взаимодействия ресиверного домена рецептора с фосфотрансмиттером (HKRD–HPt) являются не акцептирующие фосфат консервативные Asp и His, а Asn898, Asn901 и Lys1013 со стороны HKRD (нумерация по AHK3) и Gln83, Ser87 и Ser90 со стороны HPt (нумерация по AHP2).
6. Фосфорилирование консервативного His фосфотрансмиттера уменьшает электростатическую комплементарность его взаимодействия с рецептором. Фосфорилирование консервативного Asp ресиверного домена рецептора (HKRD) усиливает взаимодействие HKRD–HPt. Отсутствие Mg2+ негативно влияет на взаимодействие HKRD–HPt.
7. Основные результаты молекулярного моделирования получили подтверждение в опытах in planta и in vitro по взаимодействию изучаемых белков, имеющих точечные замены отдельных аминокислот.