Би- и триферментные системы, сопряженные с бактериальной люциферазой, в вязком микроокружении: биофизические характеристики и применение

Во введении представлена актуальность проблемы, обоснованы цели и задачи, определена
научная и практическая новизна проведенного научного исследования.
В главе 1 представлен обзор современных концепций и методов исследования
функционирования ферментов при переходе от экспериментов in vitro к моделированию
условий метаболических взаимодействий in vivo, показывающих, что положения классической
биохимии о функционировании ферментативных реакций, полученные в условиях in vitro,
некорректно отражают метаболические процессы во внутриклеточных условиях клетки.
Описаны современные подходы к экспериментальному моделированию внутриклеточной среды
с использованием различных агентов краудинга или осмолитов для создания эффектов
внутриклеточного окружения — исключенного объема или изменения вязкости реакционной
среды. На основе существующих и подтвержденных экспериментальных моделей и гипотез
приводится подробная информация о чувствительности моноферментных систем к изменению
величины вязкости реакционной среды. Особое внимание уделено информации о влиянии
вязкости реакционной среды на энергетические составляющие ферментативного катализа.
Обсуждается возможность использования ферментов светящихся бактерий и сопряженных с
люциферазой ферментативных реакций в качестве модельных систем для конструирования и
исследования функционирования полиферментных систем в вязких средах, имитирующих
внутриклеточную гиалоплазму.
Глава 2 диссертации посвящена описанию материалов, аппаратуры и методов. В работе
использовали: лиофилизированный препарат высокоочищенных ферментов, входящий в
комплект реактивов аналитической биолюминесценции (КРАБ) (Институт биофизики, ФИЦ
КНЦ СО РАН «Красноярский научный центр СО РАН», Россия), содержащий 0,5 мг
люциферазы (Л) EC 1.14.14.3 из рекомбинантного штамма Escherichia coli (Photobacterium
leiognathi) и 0,15 ед. активности НАДН:ФМН-оксидоредуктазы (Р) EC 1.5.1.29 (Vibrio fischeri);
препарат L-лактатдегидрогеназы из мышц кролика (ЛДГ, тип XI, Sigma Aldrich), НАДН
(AppliChem), ФМН (Serva), тетрадеканаль (С14) (Merck), НАД+ (AppliChem); DL-лактат (Sigma
Aldrich), 0,05М калий-фосфатный буфер рН 6,9.
Активность биферментной системы Р + Л измеряли в реакционной смеси, содержащей 300
мкл буфера рН 6,9; 5 мкл раствора препарата ферментов Р + Л (пенициллиновый флакон
содержащий КРАБ растворяли в 5 мл калий-фосфатного буфера рН 6,9); 50 мкл 0,0025 %
раствора С14 в буфере; 50 мкл 0,4 мМ раствора НАДН в буфере; 10 мкл 0,5 мМ раствора ФМН в
дН2О.В кювету вносили последовательно все компоненты реакционной смеси, быстро
перемешивали, помещали кювету в люминометр (Terner BioSystems, США) и регистрировали
величину максимальной интенсивности свечения (I м). Реакцию свечения инициировали
добавлением раствора ФМН.
Активность триферментной системы ЛДГ + Р + Л измеряли в реакционной смеси
следующего состава: 300 мкл 0,05 М буфера рН 6,9; 5 мкл раствора ЛДГ (0,5 мг ЛДГ
растворяли в 1 мл калий-фосфатного буфера рН 6,9); 10 мкл раствора Р + Л; 50 мкл 0,0025 %
раствора С14 в 0,05 М калий-фосфатном буфере рН 6,9; 50 мкл 15 мМ раствора лактата в дН2О;
10 мкл 0,5 мМ раствора ФМН в дН2О; 50 мкл 0,5 мМ раствора НАД+. В кювету вносили
последовательно все компоненты реакционной смеси, быстро перемешивали, помещали кювету
в люминометр (Terner BioSystems, США) и регистрировали величину максимальной
интенсивности свечения (Iм). Реакцию инициировали добавлением раствора НАД +.
Кинетические и термодинамические параметры ферментативных систем измеряли при
добавлении в реакционную среду глицерина и сахарозы в концентрациях от 5 до 50 об. %. О
влиянии вязкости реакционной среды на исследуемые ферментативные системы судили по:
величинеостаточнойинтенсивностисвеченияферментативнойсистемы(Iостаточное=
(Iэкс/Iк)•100%, где Iэкс– величина интенсивности свечения ферментативной системы в
присутствии глицерина/сахарозы; Iк – величина интенсивностисвечения ферментативной
системы в присутствии буферного раствора); по величине константы спада светоизлучения (kdec
= (lnI80 – lnI20)/∆t); и по величине общего количества высвеченных квантов света (Q = Iм/kdec)
[5,17].
Значения энергии термоинактивации сопряженных полиферментных систем с люциферазой
определяли графически способом (в координатах lnkdec от 1/T, где lnkdec – логарифм константы
спада биолюминесценции при определенной температуре, Т – заданная температура,
выраженная в кельвинах) [17].
Спектры флуоресценции ферментов регистрировали на сканирующем cпектрометре Aminco-
Bowman Series 2 (Thermo Spectronic, США) с шириной щели 2–4 нм в диапазоне длин волн 300–
500 нм, длина волны возбуждения 295 нм.
Методологияоценкитермодинамическойкооперацииферментоввисследуемых
ферментативных системах была основана на оценки изменения термостабильности системы и
величины энергии активации ферментативной реакции в присутствии вязких агентов [6-7].
Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета прикладных
программ EXCEL («Microsoft», США) и Origin 8 («OriginLab Corporation», США), а также
управляющей программы спектрофотометра Amino-Bawman Series 2. Ошибка экспериментов не
превышала 15%.
В главе 3 представлены результаты экспериментального изучения изменений кинетических
параметров Р + Л системы в присутствии различных значений вязкости реакционной среды,
созданных добавлением водных растворов глицерина и сахарозы. На рисунке 3.1. представлена
временная кинетика изменения интенсивности свечения биферментной системы в буфере и при
значениях вязкости реакционной среды 1,26 и 1,31 сП, которые имитировались добавлением
10% сахарозы и 10% глицерина соответственно.
Из рисунка 3.1. видно, что при моделировании значения вязкости реакционной среды η =
1,26 сП водным раствором 10% сахарозы, происходит значительное изменение профиля
кинетики биферментной Р + Л системы. В то время как при вязкости реакционной среды η =
1,31 сП, созданной водно-глицериновым раствором, существенного изменения профиля
кинетики ферментативной Р + Л системы не происходит.
В дополнение, следует отметить, что величина Iм в биферментной системе зависит от
вязкости реакционной среды так, что чем выше значение вязкости реакционной среды, тем
меньше значение Iм. Например, при вязкости реакционной среды η = 6 сП, моделируемой
водно-глицериновым раствором, величина Iм биферментной Р + Л системы составляла 17% от
величины Iм зарегистрированной в буфере. В присутствии вязкости реакционной среды η = 6,20
сП, моделируемой водным раствором сахарозы, величина I м биферментной Р + Л системы
составляла 36% относительно величины Iм в буферном растворе.

Рисунок 3.1. – Зависимость динамики интенсивности свечения биферментной
системы НAДH:ФMН-оксидоредуктаза + люцифераза от времени в буферном
растворе и при значениях вязкости реакционной смеси η = 1,26 сП и η = 1,31 сП при
t=20C.
Таким образом, добавление водно-глицериновых растворов, для изменения вязкости
реакционной среды, в наибольшей степени приводит к уменьшению величины Iм по сравнению
с водно-сахарозными растворами, но при этом водно-глицериновые растворы существенно не
изменяют кинетический профиль биферментной системы Р + Л (рисунок 3.1). Поэтому
величина Iм не может быть использована в качестве информативного параметра при
исследовании влияния вязкости среды больше 3,2 сП, которая имитируется добавлением
сахарозы, на кинетические характеристики ферментативнойР + Л системы, из-за
невозможности определить какой фактор обладает наибольшим воздействием на Iм – природа
используемого агента или вязкость реакционной среды. Ранее было показано, что чем больше
значения вязкости реакционной среды, тем меньше каталитическая активность ферментативной
системы [5-7].
На рисунке 3.2. показано влияние водных растворов глицерина и сахарозы на величину
константы спада свечения (kdec) (рисунок 3.2.а) и общий выход квантов света (Q) (рисунок
3.2.б) биферментной системы Р + Л. На графике видно, что с увеличением вязкости
микроокружения Р + Л системы, путем добавления водно-глицериновых растворов, величина
kdec монотонно увеличивается, при достижении значения вязкости реакционной среды η = 6 сП
величина kdec увеличивается в 2 раза по сравнению с контролем. Для водно-сахарозных
растворов такого эффекта не наблюдается. Вероятнее всего, такое существенное изменение
величины kdec, при использовании водно-глицериновых растворов, в качестве агента
имитируемого значения вязкости реакционной среды, можно объяснить негативным влиянием
вязкости микроокружения на скорость диффузии субстратов и высвобождения продукта
реакции из активного центра фермента путем ограничения его структурной подвижности [5].

(а)(б)

Рисунок 3.2. – Зависимость константы спада светоизлучения (а) и общего количества
высвеченных квантов света (б) биферментной Р + Л системы от вязкости реакционной
среды при t=20C.
В свою очередь, вязкость реакционной среды, имитируемая добавлением водно-сахарозных
растворов, не приводит к существенному изменению величины kdec биферментной системы. В
диапазоне значений вязкости реакционной среды от 1,26 до 6,2 сП наблюдаются некоторые
флуктуации величины kdec биферментной системы, но при достижении вязкости реакционной
среды η = 6,2 сП величина kdec системы Р + Л соответствует контрольным значениям. Исходя из
этого можно предположить, что наблюдаемые эффекты влияния водно-сахарозных растворов
на кинетические характеристики системы Р + Л зависят от природы используемого агента, а не
от вязкостных характеристик имитируемого сахарозой микроокружения.
Величина общего числа излученных квантов (Q) в биферментной системе Р + Л не является
информативным параметром для изучения влияния вязкости реакционной среды на
кинетические характеристики биферментной системы. По полученным зависимостям (рисунок
3.2.б.) сложно определить доминирующий фактор, который существенным образом влияет на
изменение величины Q биферментной системы Р + Л – природа модельного агента или вязкость
реакционной среды.
Проведенные исследования показывают, что система Р + Л проявляет активность в
исследованном диапазоне вязкости реакционной среды от 1,0 до 6,2 сП. При этом глицерин
является наиболее предпочтительным осмолитом для моделирования эффектов вязкости
реакционной среды в биферментной системе. В дополнение, величины Iм и kdec также являются
информативными параметрами системы Р + Л, по которым можно судить о степени влияния
вязкости реакционной среды, создаваемой водными растворами глицерина. В случае
использования сахарозы, в качестве эффектора вязкости реакционной среды, высока
вероятность неправильной интерпретации получаемых результатов из-за возможного большего
влияния природы агента.
Далее было изучено влияние вязкого микроокружения на триферментную систему ЛДГ + Р +
Л. Ранее было показано, что ЛДГ + Р + Л система имеет высокую чувствительность при анализе
метаболитов [16]. На рисунке 3.3. представлена динамика интенсивности свечения системы
ЛДГ + Р + Л во времени в буфере и в вязком микроокружении средах, имитируемым
растворами сахарозы и глицерина.

Рисунок 3.3. – Динамика интенсивности свечения триферментной ЛДГ + Р + Л системы
от вязкости реакционной среды при t=20C во времени в буфере и в вязких средах,
созданных растворами сахарозы и глицерина.
Видно, что изменение вязкости реакционной среды существенно изменяет динамику
свечения триферментной системы по сравнению с контрольным свечением. Стоит отметить,
что подобные зависимости влияния вязкости реакционной среды на кинетическую активность
триферментной системы были получены во всем исследованном диапазоне значений вязкостей
реакционной среды (от η = 1,26 сП до η = 6,2 сП). Следовательно, можно сделать вывод об
ингибирующемвлияниивязкостиреакционнойсредынаинтенсивностьсвечения
триферментной ЛДГ + Р + Л системы, при этом степень ингибирующего воздействия глицерина
и сахарозы, которыми моделируются вязкостные эффекты реакционной среды, практически
одинакова, что говорит о том, что система чувствительна именно к изменению вязкости
реакционной среды и не зависит от природы используемых осмолитов.
Зависимость величины kdec для ЛДГ + Р + Л системы от вязкости реакционной среды
(рисунок 3.4.а.) имеет сходную зависимость, полученную для Р + Л системы (рисунок 3.2.а.).
При добавлении в реакционную среду водно-глицериновых растворов, величина kdec для
триферментной системы ЛДГ + Р + Л монотонно увеличивается с увеличением вязкости
микроокружения, при η = 6 сП величина kdec увеличивается в 1,2 раза по сравнению с kdec в
контроле. Вероятно, такую зависимость можно также объяснить негативным влиянием вязкости
микроокружения на скорость диффузии субстратов и высвобождения продукта реакции из
активного центра фермента путем ограничения его структурной подвижности [1,5].
(а)(б)

Рисунок 3.4. – Зависимость величины константы спада свечения (kdec) (а) и общего
количества квантов света (Q) (б) для триферментной ЛДГ + Р + Л системы от вязкости
микроокружения при t=20C.
В свою очередь, вязкость реакционной среды, создаваемая добавлением в систему водно-
сахарозных растворов, приводит к уменьшению величины kdec триферментной ЛДГ + Р + Л
системы. Например, величины вязкости реакционной среды (η = 6,2 сП) величина kdec для ЛДГ
+ Р + Л системы в 0,7 раз меньше контрольных значений. Исходя из этого можно сделать
вывод, что наблюдаемые процессы влияния водно-сахарозных растворов на кинетические
характеристики ЛДГ + Р + Л системы связаны с действием природы используемого вязкого
агента на ферменты, а не с вязкостными характеристиками микроокружения. Такой вывод
делается на основании того, что при увеличении вязкости реакционной среды за счёт
использования водно-сахарозных смесей должны изменяться скорости диффузионных
процессов [9] и, следовательно, увеличиваться константа спада триферментной системы, как в
случае для водно-глицериновой среды.
Величина общего количества квантов света (Q) в триферментной системе ЛДГ + Р+ Л, на
первый взгляд, зависит от химической природы используемых осмолитов. Так, в водно-
глицериновых средах величина Q уменьшается, а при использовании водно-сахарозных
растворов увеличивается (рисунок 3.4.б.). В связи с тем, что при расчете величины Q
используется величина kdec, можно предположить, что величина Q также не является
информативным параметром, по которому можно судить о степени воздействия вязкого
микроокружения в триферментной системе.
Уменьшение каталитической активности ЛДГ + Р + Л системы при варьировании вязкости
реакционной среды, вероятно, связано с высокой чувствительностью ЛДГ к вязкому
микроокружению [18]. При этом следует отметить, что интересным и требующим дальнейшего
исследования является тот факт, что активность ЛДГ напрямую зависела от добавляемой
концентрации глицерина или сахарозы [18]. В нашем случае, подобной концентрационной
зависимостимеждувязкостьюреакционнойсредыикаталитическойактивностью
триферментной системы ЛДГ + Р + Л выявлено не было.
Таким образом, показано, что биферментная Р + Л система менее чувствительна к вязкому
микроокружению по сравнению с триферментной ЛДГ + Р+ Л системой, что может быть
связано с различиями в пространственных структурах между Р, Л и ЛДГ. Водно-глицериновые
растворы являются более предпочтительными агентами для имитации вязкости гиалоплазмы,
чем водно-сахарозные смеси.
Глава 4 посвящена исследованию температурной стабильности сконструированных
биферментной и триферментной систем в присутствии глицерина и сахарозы, имитирующих
вязкостные характеристики гиалоплазмы.
Температурная зависимость активности биферментной Р + Л системы была исследована в
растворах повышенной вязкости, в присутствии сахарозы и глицерина, в диапазоне температур
20-45°C. Было установлено, что увеличение добавляемых концентраций глицерина и сахарозы
приводит к сдвигу температурного максимума свечения биферментной системы в сторону
более высоких температур, то есть увеличивается термостабильность биферментной системы
(рисунок 4.1.). При добавлении 50% глицерина и 40% сахарозы максимальные значения I м
биферменой системы были зарегистрированы при температуре 35°С. Интенсивность свечения Р
+ Л системы при указанных концентрациях глицерина и сахарозы была в 2 раза выше значений,
полученных в буфере при этой же температуре. При этом, известно, что температурный
оптимум бактериальной люциферазы находится в диапазоне 22-28°С [17]. При температурах
>30°С люцифераза начинает быстро терять активность, что свидетельствует о ограниченности
применения сопряженных ферментативных систем с бактериальной люциферазой при
температурах выше 30°С. Инактивация НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазы происходит при
температуре 37°С [17].
(а)(б)

Рисунок4.1.– Зависимость активности биферментной системы НАДН:ФМН-
оксидоредуктаза + люцифераза (Iм) от температуры среды при различном содержании
глицерина (а) и сахарозы (б). Нормировано на Iм свечения реакции в буфере.
В связи с этим, исследованы кинетические кривые термоинактивации биферментной Р + Л
системы при температуре 35°С. Были получены моноэкспоненциальные зависимости спада
активности Р + Л системы от времени экспозиции при различных концентрациях глицерина (5–
50 %) и сахарозы (10–40 %). Вид полученных зависимостей спада активности биферментной
системы во времени свидетельствует о том, что термоинактивация биферментной системы
является мономолекулярным процессом, а значение константы первого порядка скорости
инактивации биферментной системы является величиной, напрямую характеризующей
термостабильность люциферазы и (или) НАДН:ФМН-оксидоредуктазы в данных условиях.
Помимо степени воздействия вязкости реакционной среды на кинетику инактивации
биферментной системы, были рассчитаны значения энергии активации ферментативной
системы в присутствии сахарозы и глицерина при температуре t= 35 ºС. Полученные значения
энергии активации (Eа) составили: 40,2 ± 7,7; 6,5 ± 0,9 и 16 ± 0,8 кДж/моль, в присутствии
сахарозы, глицерина и буфера соответственно.
Анализируя значения Ea можно сделать предположение о том, что значения Eа не всегда
напрямую связаны с величиной уменьшения каталитической активности фермента. Например,
увеличение вязкости реакционной среды до величины 3,8 сП – 3,9 сП, путем добавления 40%
сахарозы и 50% глицерина, приводит как к увеличению значения Ea, в случае сахарозы, так и к
уменьшению значений Eа, в случае глицерина, по сравнению с контрольным значением.
Скорее всего полученные значения Eа характеризуют ограничение пространственной
подвижности белковых глобул в присутствии используемых осмолитов [7]. Следовательно, в
присутствии сахарозы происходит существенное ограничение пространственной подвижности
белковых глобул, необходимой для акта ферментативного катализа, по сравнению с буферными
и водно-глицериновыми растворами. Примечательно, что при добавлении водно-глицериновых
растворов происходит уменьшение величины Eа биферментной системы в 2,5 раза по
сравнению с контрольным значением, что, вероятнее всего, может быть объяснено тем, что
присутствиеводно-глицериновогораствораприводиткобразованиюособого
термодинамическогосостояниясистемыпутемформирования«оптимальной»
пространственной структуры фермента [5,7]. Полученный результат еще раз подтверждает факт
о том, что глицерин является предпочтительным осмолитом для моделирования вязкости
реакционной среды в биферментной Р + Л системе.
На рисунке 4.2. показана зависимость интенсивности свечения триферментной системы от
температуры в буфере и в растворах 5% глицерина и 10% сахарозы.

Рисунок 4.2. – Температурная зависимость максимальной интенсивности свечения
триферментной системы ЛДГ + Р + Л в присутствии 10% сахарозы и 5% глицерина.
Правая Y-ось показывает активность триферментной системы в присутствии
осмолитов, левая Y-ось – активность триферментной системы в буфере.
Из рисунка видно, что температурный оптимум триферментной системы составляет 30°С.
Также, как и в случае Р + Л системы, присутствие в реакционной среде небольших
концентраций глицерина и сахарозы (5-10%) не приводит к увеличению активности
триферментной системы при повышении температуры. Дальнейшее повышение содержания
водно-глицериновых и водно-сахарозных растворов (>10%) в реакционной среде не приводит к
повышению температурной резистентности триферментной ЛДГ + Р + Л системы, как это
наблюдалось ранее в случае Р + Л системы при температурах выше 25°С (рисунок 4.1.). Кроме
этого, как в присутствии водно-глицериновых растворов 20% и 50%, так и в присутствии
водно-сахарозных растворов 20% и 40%, в системе перестает наблюдаться явный пик
активности ферментативной ЛДГ + Р + Л системы при температуре 30°С (рисунок 4.3.),
который наблюдается в контроле и в присутствии 5% глицерина и 10% сахарозы (рисунок 4.2.).
Одинаковая степень воздействия различных концентраций глицерина и сахарозы на активность
триферментной системы при различных температурах, скорее всего, свидетельствует о
доминирующем воздействии вязкости реакционной среды на активность системы ЛДГ + Р + Л,
чем природы используемых осмолитов.
(а)(б)

Рисунок 4.3. – Температурная зависимость активности триферментной системы ЛДГ +
НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктаза + люцифераза в присутствии различных концентраций
глицерина (а) и сахарозы (б).
Были рассчитаны значения энергии активации (Ea) ЛДГ + Р + Л системы в присутствии
сахарозы и глицерина при температуре t= 35ºС. Полученные значения энергии активации
составили: 85,7 ± 0,1; 35,1 ± 0,9 и 77,5 ± 0,8 кДж/моль в присутствии сахарозы, глицерина и
буфера, соответственно. Как было указано выше, значения Ea характеризуют ограничение
пространственной подвижности белковых глобул в присутствии модельных агентов,
моделирующих значения вязкости реакционной среды [7]. Следует отметить, что, во-первых, в
присутствии сахарозы происходит существенное ограничение пространственной подвижности
белковых глобул, входящих в состав триферментной системы, по сравнению с буфером и
глицерином. Такая же манера ограничения пространственной подвижности белковых глобул
наблюдалась и для Р + Л системы. Во-вторых, в присутствии водно-глицериновых растворов
происходит уменьшение величины Eа триферментной системы в 2,2 раза по сравнению с
контрольным значением, похожая зависимость изменения величины Eа в присутствии водно-
глицериновых растворов была получена и при исследовании биферментной системы.
Примечательно, что, несмотря на формирование более благоприятных, с точки зрения
термодинамики, условий в триферментной системе в присутствии глицерина в данной
ферментативной ЛДГ + Р + Л системе не наблюдается никаких изменений каталитической
активности триферментной системы. Скорее всего, лимитирующим фактором в триферментной
системе является активность ЛДГ. Как было показано ранее, значительное уменьшение
активности ЛДГ происходит при увеличении добавляемых в реакционную смесь концентраций
глицерина и сахарозы более 40 об. % [18]. Полученные нами результаты, показывают, что даже
присутствие в реакционной среде 10-20 об. % осмолитов негативно сказывается на
каталитической активности ЛДГ, что ведет к отклонению ферментативной системы от
стандартных условий [19]. Этим же, скорее всего, можно объяснить отсутствие максимумов
интенсивности свечения триферментной системы в присутствии концентраций глицерина и
сахарозы, превышающих 10%, при варьировании температурных условий.
Инактивация триферментной системы соответствует кинетике реакции второго порядка,
причем инактивация ЛДГ + Р + Л системы включает в себя два разных механизма, которые
последовательно сменяют друг друга и происходят с разными скоростями. Как известно, ЛДГ,
Р и Л имеют четвертичную структуру и представляют собой тетрамерный фермент, гомодимер
и гетеродимер, соответственно. Следовательно, первой стадией инактивации триферментной
системы, вероятно, является диссоциация ферментов на субъединицы. После диссоциации
происходит необратимая денатурация фермента, которой соответствует второй «линейный»
участоккинетическойкривойтермоинактивации.Такимобразом,термоинактивация
триферментной ЛДГ + Р + Л системы может быть объяснена диссоциативным механизмом,
который характерен для большинства олигомерных белков.
Проведенные исследования активности биферментной и триферментной систем при
варьировании значений вязкости реакционной среды и температуры показали: во-первых,
увеличение значений вязкости реакционной среды, путем добавления глицерина и сахарозы,
приводят к повышению термостабильности биферментной Р + Л системы. В Р + Л системе
наблюдается увеличение каталитической активности при температуре 35°С в присутствии 50%
глицеринаи40%сахарозы.Во-вторых,вязкоемикроокружениесказываетсяна
пространственной подвижности исследуемых ферментов. При этом на основании полученных
значений Еа, имитирование эффектов вязкости реакционной среды путем добавления водно-
сахарозных растворов ведет к более существенному ограничениюпространственной
подвижности ферментов в исследуемых системах, чем при добавлении водно-глицериновых
растворов. Существенное ограничение пространственной подвижности в присутствии сахарозы
скорее всего связано с высокой гидрофильностью молекулы сахарозы, что приводит к
увеличению общей фракции упаковки раствора. Таким образом, такой высоко упакованный
раствор, как «шуба» защищает пространственную структуру белков от воздействия
критических для них температур [9].
Отдельно стоит отметить несмотря на то, что в присутствии глицерина происходит снижение
значения Еа для триферментной ЛДГ + Р + Л системы в 2,2 раза по сравнению с контрольным
значением, в системе не наблюдается увеличение термостабильности ЛДГ + Р + Л системы, как
например, в случае Р + Л системы (рисунок 4.1). Другими словами, три сопряженных фермента
в системе не используют сформировавшееся энергетически выгодное положение для
реализации кооперативных взаимодействий, которые являются неотъемлемыми и представляют
собой часть коммуникационной сети в макромолекулярном ансамбле ферментов [20]. Данный
факт позволяет ввести новый критерий оценки адекватного конструирования ферментативных
систем по изменению параметра термостабильности сопряженных ферментативных систем.
Глава 5 содержит информацию о перспективах применения полиферментных систем с
люциферазой в биолюминесцентных ферментативных биотестах для оценки токсичности
наноматериалов, пестицидов и тяжелых металлов на основе анализа чувствительности
сконструированных Р + Л и ЛДГ + Р + Л систем к этим веществам.
Р + Л система была использована в качестве тест-объекта при определении потенциальной
токсичности одностенных углеродных нанотрубок (ОУНТ), многостенных углеродных
нанотрубок (МУНТ) и водного раствора гидратированного фуллерена С 60 (C60HyFn). Показано,
что МУНТ ингибируют активность ферментативной системы Р + Л, при этом МУНТ являются
более сильным ингибитором по сравнению с ОУНТ. Чувствительность Р + Л системы к МУНТ
составляет от 0,012 до 0,16 мг/л, в зависимости от типа МУНТ. В таблице 5.1. представлены
значения параметров ингибирования системы IC50 и IC20 для этих нанотрубок, вызывающие
ингибирование свечения Р+Л системы на 50 или 20 % по сравнению с контрольным уровнем
свечения.
Если предположить, что значения токсикологических параметров ЕС 50 и ЕС20 коррелируют с
полученными нами значениями IC50 и IC20, образцы МУНТ и ОУНТ могут быть
охарактеризованыкакчрезвычайнотоксичныеиоченьтоксичные,соответственно.
Биферментная система Р + Л оказалась более чувствительной к МУНТ, чем светящиеся
бактерии. Так, значения EC50 полученные на бактериальных клетках в 2-3 раза выше значений,
полученных с использованием системы Р + Л.
Чувствительность Р + Л системы к фуллерену C60HyFn мала, параметр IC20 равен 3,7 мг/л.
Параметр IC50 не удалось определить, так как его значение было за рамками максимальной
концентрации имеющейся пробы фуллерена C60, составляющей 7,5 мг/л. Таким образом,
биферментная система Р + Л может быть использована для оценки потенциальной токсичности
МУНТ, но чувствительность к разным типам наноматериалов может различаться.
Таблица 5.1. – Значения параметров ингибирования IC 50 и IC20 (мг/л) определенных во
время оценки влияния УНТ на интенсивность свечения растворимой Р + Л системы.
Растворимая биферментная Р + Л система
Анализируемый материал
IC50IC20
Наноматериалы на

ОСУНТ0,16 ± 0,030,04 ± 0,01
основе углерода

МСУНТ0,012 ± 0,0030,004 ± 0,001

Фуллеренын/о3,7 ± 0,7

Вторая часть главы 5 посвящена оценке возможности использования ферментативных
систем разной сложности в качестве биотестов для оценки степени загрязнения почв. Для этого
определяли чувствительность моно- (Р), би (Р + Л)- и три (ЛДГ + Р + Л)- ферментных систем к
пестицидам (малатион и диазинон) и хлориду меди (II) в воде и водных экстрактах из почв,
различающихся гранулометрическим составом и содержанием гумуса. Объектом исследования
являлись 5 эталонных образцов почв (песок, легкий суглинок, средний суглинок, тяжелый
суглинок, чернозём), отобранных и охарактеризованных в соответствии с ГОСТ 17.4.4.02-84
(2008). Для каждого тестируемого образца определяли параметр ингибирования IC20,
отражающий предел чувствительности тест-системы к загрязнителю.
На первом этапе исследовали действие водных растворов почвенных токсикантов на
активность трех ферментативных систем (Р, Р + Л, ЛДГ + Р + Л) (таблица 5.2., образец дН2О).
По параметру IC20 установлено, что моноферментная система Р малочувствительна к
воздействию водных растворов малатиона (IC20>>ПДК), поэтому в экспериментах по оценке
чувствительности Р к токсикантам, содержащимся в экстрактах из почв, малатион был
исключен.
Далее исследовали влияние на ферментативные системы пяти незагрязненных образцов почв
(песка, легкого суглинка, среднего суглинка, тяжелого суглинка и чернозёма) с различным
содержанием гумуса. Из пяти почвенных экстрактов на активность Р существенное
ингибирующеевоздействиеоказываеттолькоэкстрактизчернозема.Активность
биферментной системы Р + Л существенно снижалась в присутствии легкого суглинка,
среднего суглинка и чернозема. На активность триферментной системы ЛДГ + Р + Л
наибольшее ингибирующее воздействие оказали экстракты из песчаной почвы, тяжелого
суглинка и чернозема. В дальнейшем для исключения влияния компонентов незагрязненной
почвы на результаты ферментативного тестирования в качестве контроля использовали водный
экстракт из почвы соответствующего типа.
Таблица5.2.– Параметр IC20 (мг/кг) для исследованных загрязнителей при
использовании ферментативных тест-систем Р, Р + Л и ЛДГ + Р + Л.
ОбразецМалатионДиазинонХлорид меди (II)

РР+ЛЛДГ+Р+ЛРР+ЛЛДГ+Р+ЛРР+ЛЛДГ+Р+Л

дН2О44003923501,30,350,40,060,004
Песок-30115001,150,15169,80,210,004
Легкий
-60020300936,350,120,004
суглинок
Средний
-1302018002,40,5170,030,16
суглинок
Тяжелый
-18,5830016,50,1521,250,550,04
суглинок
Чернозем-39130001,70,32550,70,0045

ПДК1,0 [21]0,1 [21]3,0 [22]

На финальном этапе исследования были проведены модельные эксперименты оценки
чувствительности ферментативных систем по параметру IC20 к воздействию токсических
веществ при их внесении непосредственно в экстракты из почв (таблица 5.2.). Для большинства
исследуемых образцов почвенных токсикантов наблюдалось снижение их ингибирующего
воздействия на ферментативные системы. Так, чувствительность Р и Р + Л систем к экстрактам
чернозема с хлоридом меди упала на три и один порядок соответственно, и в 10 раз при его
тестировании в экстракте из среднего суглинка с помощью ЛДГ + Р + Л системы.
Сравнительный анализ активности ферментных систем в присутствии загрязненных и
незагрязненных экстрактов почв показал, что моноферментная система не позволяет
фиксировать загрязнение почв хлоридом меди на уровне, близком к ПДК для данного вещества.
Также, с использованием языка программирования JavaScript, был разработан программный
алгоритм для ферментативного биосенсора для решения задач, связанных с анализом
загрязнения почвы. Созданный алгоритм для хранения, анализа и визуализации данных основан
на сопоставлении данных анализа 51 некоммерческих стандартных образцов почвы и их
ингибирующего воздействия на три ферментативные системы различнойсложности
(моноферментная система – бутирилхолинэстераза; биферментная система – Р + Л;
триферментная система – ЛДГ + Р + Л). Разработанный программный алгоритм позволяет
выявить влияние химических свойств образцов почвы, не содержащих токсичных агентов, на
ферментные биосенсоры. Такое программное обеспечение может найти широкое применение в
мониторинге окружающей среды.
Заключение
Результаты проведенного исследования влияния вязкости реакционной среды на активность
би- и триферментной систем позволили установить, что биферментная Р + Л система является
потенциальнопригоднойдлясозданияэкспериментальноймоделиисследования
внутриклеточного поведения ферментов. Исследованная Р + Л система удовлетворяет
большинству предъявляемых, в настоящее время, требований к ферментативным системам для
исследования их поведения во внутриклеточных условиях. Предложенный критерий оценки
эффективности взаимодействия сопряженных ферментов по изменению термостабильности
показал, что в триферментной системе ЛДГ + Р + Л теряется сопряжение по НАДН при
увеличении вязкости микроокружения, в то время как эффективность сопряжения ферментов в
биферментной системе Р + Л сохраняется.
Практические аспекты проведенного исследования показали возможность применения
биферментной Р + Л системы в качестве тест-системы для определения потенциальной
токсичности использования наноматериалов и наночастиц. Кроме этого, были заложены основы
для формирования концепции комплексной оценки загрязнения почв, основанной на
использовании набора ферментативных тестов. Были установлены закономерности воздействия
разных классов токсикантов на активность отдельных моноферментных и олигоферментных
цепей сопряжения, выбранных в качестве потенциальных тест-объектов и маркеров
загрязнения.
Выводы:
1. Изменение кинетических и термодинамических параметров биферментной (НАДН:ФМН-
оксидоредуктаза + люцифераза) и триферментной (лактатдегидрогеназа + НAДH:ФMН-
оксидоредуктаза + люцифераза) систем в растворах повышенной вязкости реакционной среды
показало, что для моделирования физико-химических характеристик клеточной гиалоплазмы
предпочтительнее использовать водные растворы глицерина.
2. Показано, что присутствие в реакционной среде глицерина и сахарозы ведет к повышению
термостабильности биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза + люцифераза при
температурах выше +30°С. Увеличение термостабильности системы в растворах повышенной
вязкости можно интерпретировать как интегральный показатель эффективности работы
ферментов сопряженных с бактериальной люциферазой для оценки возможности образования
мультиферментного комплекса в конструируемых системах.
3. Показано, что сочетание биферментной (НАДН:ФМН-оксидоредуктаза + люцифераза)
системы с субстратами (НАДН, ФМН, тетрадеканаль) и глицерином или сахарозой может быть
использовано для построения экспериментальной модели эффективного взаимодействия
ферментов в метаболических фрагментах в условиях вязкости реакционной среды,
стилизующей внутриклеточные значения.
4. На примере биолюминесцентного биотеста для оценки степени загрязнения почвенных
экосистем и оценки потенциальной токсичности наноматериалов показано, что повышение
сложности системы (от моно- до триферментной) увеличивает чувствительность биотеста,
поэтомууправлениечувствительностьюферментативныхбиотестоввозможнопри
использовании ферментативных комплексов разной сложности.