Биохимические и молекулярные особенности пероксидаз мха Dicranum scoparium Hedw.

1.1. Объекты исследования. Побеги мхов Dicranum scoparium Hedw., Pleurozium schreberi (Brid.) Mitt., Hylocomium splendens (Hedw.) B.S.G. были собраны в Айшинском лесничестве в окрестностях г. Казани, Татарстан, Россия (55°53′21.3′′N48°38′14.3′′E). Изоферментный состав и активность редокс-ферментов анализировали во внутриклеточной растворимой фракции белков (C) и фракциях клеточной стенки (КС). Фракция С – супернатант, полученный после гомогенизации с трис-HCl буфером побегов. Белки клеточной стенки (КС) выделяли, используя, фосфатный буфер Соренсена, дигитонин и NaCl (Li et al., 2010). В результате получали фракции белков, связанных с КС: B1 – водородными связями, B2 – ван-дер- ваальсовыми силами и гидрофобными взаимодействиями, B3 – ионными связями.
1.2. Стрессовые воздействия. Сухие побеги гидратировались в дистиллированной H2O в течение 1 ч. Обезвоживание проводили в эксикаторе над раствором 35% CaCl2 (0-168 ч, медленное обезвоживание) или силикагелем (0-72 ч, быстрое обезвоживание). Регидратацию побегов проводили в течение 0,5-2 ч. Относительное содержание воды (ОСВ) определяли по формуле: (масса мха после обезвоживания – сухая масса) / (масса мха после гидратации – сухая масса) х 100%. Воздействие CdCl2 и параквата на мох осуществляли путем инкубации побегов в растворах 100 мкМ CdCl2 или 100 мкМ параквата (1,1′-диметил-4,4′-дипиридила дихлорида) в течение 1 и 12 ч. При температурном воздействии образцы мха помещали в термостат (+30° или +50°С) или в морозильную камеру (-20°С) на 2, 12 и 24 ч.
1.3. Определение активности окислительно-восстановительных ферментов. Активность POD класса III и фенолоксидазы определяли с использованием о-дианизидина, субстратную специфичность POD с – ABTS, p-кумаровой и кофейной кислотами, активность APX определяли по окислению аскорбиновой кислоты в присутствии Н2О2, активность каталазы определяли по разложению Н2О2. Активность ферментов измеряли спектрофотометрически на UV-1900 («Shimadzu», Япония). Электрофорез проводили в 7 и 10 % полиакриламидном геле (ПААГ) в модифицированной системе (Laemmli, 1970) на Mini-PROTEAN Tetra Cell («Bio-Rad», США) в нативных и полу-нативных (с добавлением 1% SDS) условиях. Активность POD III класса в ПААГ визуализировалась с помощью о-дианизидина и H2O2, а активность APX раствором, содержащим аскорбат, ТЕМЕД, NBT, H2O2.
1.4. Анализ образования АФК. Интенсивность образования O2•– оценивали спектрофотометрически с использованием 2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-2H- тетразолий-5-карбоксанилида (XTT, Sutherland, Learmonth, 1997, Chasov et al., 2015). Визуализация образования O2•– в геле проводилась с использованием NBT и NADH. Образование •ОН оценивали по скорости окисления дезоксирибозы в присутствии 2,6- диметокси-1,4-бензохинон (DMBQ), FeCl3, щавелевой кислоты в фосфатном буфере, рН 5,0 (Gómez-Toribio et al., 2009). Уровень образования •ОН оценивали в эквивалентах малонового диальдегида (MDA) (Devasagayam et al., 2003). Измерение H2O2 проводили с использованием ксиленолового оранжевого (Mayaba et al., 2002). Содержание H2O2 рассчитывали по стандартной калибровочной кривой концентрации Н2О2.
1.5. Очистка белка с помощью ионообменной хроматографии. Растворимые белки гомогената побегов D. scoparium осаждали с использованием (NH4)2SO4 (30–80%). Белки были частично очищены с использованием колонки Hi-Trap Q FF (GE Healthcare, Sweden), уравновешенной 25 мМ Трис-HCl буфером, рН 7,5, на Сhromatography System (ÄKTATM Start). Белки элюировали NaCl с 0–1 М линейным градиентом концентрации.
1.6. Выделение РНК и синтез двухцепочечной кДНК. Для выделения тотальной РНК мха использовали GeneJET Plant RNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Lithuania). Одно- и двухцепочечная кДНК были синтезированы с использованием набора Evrogen Mint 2 для синтеза двухцепочечной кДНК, согласно протоколу производителя.
1.7. Идентификация генов POD и APX в D. scoparium. Метатранскриптомные данные D. scoparium были извлечены из базы данных архива чтения последовательностей с целью идентификации POD класса III. Для клонирования гена APX из D. scoparium использовалась кодирующая последовательность GpAPX из Grimmia pilifera. Клонирование POD в вектор pAL2-T и APX в pGEM-T Easy проводили согласно протоколам производителей (Евроген,
Россия и Promega, США, соответственно). Нуклеотидные последовательности определяли с помощью ДНК-анализатора ABI 3130 Genetic Analyser (Applied Biosystems, США).
1.8. Анализ аминокислотных и нуклеотидных последовательностей. Физико-химические свойства белков анализировали с помощью ProtParam ExPASy (Gasteiger et al., 2005). Структуры доменов белков были предсказаны с помощью CDD (Marchler-Bauer et al., 2017), а TBtools использовался для перестройки карты домена (Chen et al., 2020). Вторичная и третичная структуры белков были предсказаны с помощью NPSA-PRABI (Geourjon, Deléage, 1995) и SWISS-MODEL (Waterhouse et al., 2018), соответственно. Филогенетическое древо было построено и модифицировано в MEGA X (Kumar et al., 2018).
1.9. Анализ экспрессии генов. Тотальную РНК D. scoparium выделяли с помощью набора RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Германия). В качестве источника матриц для ПЦР-РВ использовали полученную комплементарную ДНК (кДНК).
1.10. Статистическая обработка данных. Статистическую обработку результатов проводили с помощью Теста Тьюки в программе R. При анализе экспрессии генов все реакции проводили в трех биологических и шести аналитических проворностях. Различия в экспрессии генов оценивали по нормализованной экспрессии (∆∆Cq) в Bio-Rad CFX MaestroTM.
2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
2.1. Образование АФК в D. scoparium. Обнаружено, что побеги D.scoparium могут образовать внеклеточный •OH (рис. 1А, Б). Уровень •ОН после гидратации сухого мха был почти в два раза выше (рис. 1Б), чем в предварительно гидратированных побегах за те же промежутки времени инкубации с акцептором (рис. 1А). Образование •ОН может происходить как неферментативно в реакции Фентона, так и ферментативно с помощью редокс-ферментов (Gechev et al., 2006; Hasanuzzaman et al., 2020). В частности, реакция Фентона в среде, содержащей ионы железа, стимулируется H2O2, образующейся в результате окислительного
взрыва, происходящего после обезвоживания и последующей гидратации. Так, нами показано, что в
1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0
АБ
1,0 0,8
*** 0,6 *** 0,4
***
* ***
***
10 20 30 60 120 Время, мин
0,2 0,0
Рис. 1. А – образование •ОН предварительно регидратированным побегом D. scoparium. Б – образование •ОН при гидратации сухого мха. Здесь и далее разница достоверна при P ≤ 0,05 (*), P ≤ 0,01 (**), P ≤ 0,001 (***).
10 20 30 60 Время, мин
происходило увеличение H2O2 после гидратации в течение 1 ч сухих побегов мха, при этом дальнейшее обезвоживание приводило к постепенному снижению содержания H2O2 (рис. 2А). Регидратация мха после 72 ч обезвоживания также приводила к увеличению содержания H2O2 (примерно в 2 раза в
D. scoparium
значительное содержания
сравнении с контрольным вариантом (рис. 2А)). Анализ восстановления XTT показал, что D. scoparium может образовать O2•– в присутствии NADH (рис. 2Б). Добавление SOD почти на 7
МДА, ммол/г сухой массы
МДА, ммол/г сухой массы

60
30
***
3,5 3 2,5
*** *** 2 1,5
***
15 *** 0
0 1 2 24 72 0,5 2 Время, ч
1 0,5 0
АБ
**
Рис. 2. А – Содержание H2O2 в D. scoparium при обезвоживании над силикагелем и после регидратации. Черный столбик – сухой мох (контроль), столбик с точками – 1 ч гидратации до обезвоживания, белые столбики – обезвоживание, заштрихованные столбики – регидратация. Б – Внутриклеточное образование O2•− во мхе D. scoparium в присутствии 0,1 мM NADH в качестве восстановителя. Образование O2•− детектировалось с помощью XTT в присутствии или в отсутствие 250 ед/мл SOD в натрий-цитратном буфере, pH 7,8.
-SOD +SOD
50% ингибировало степень восстановления, что указывает на то, что некоторое восстановление XTT происходило за счет других радикалов. Значительное ингибирование восстановления XTT с помощью SOD в ферментативной вытяжке мха подтверждает образование O2•– (рис. 2Б). Таким образом, при стрессе в клетках бриофитов так же, как и у сосудистых растений, может происходить повышение уровня АФК.
2.2. Активность редокс-ферментов D.scoparium. Одним из ключевых компонентов стрессовой устойчивости растений является способность поддерживать редокс-статус клетки и контролировать уровень АФК, в том числе с помощью антиоксидантных ферментов. Активность редокс-ферментов в клетках зависит от комплементарных и/или конкурентных взаимоотношений, в том числе и с другими редокс-ферментами. Конкурировать с POD за субстраты могут фенолоксидаза, реагирующая с фенольными соединениями, и каталаза, элиминирующая H2O2. Было показано, что активность POD в D. scoparium была на 2 порядка выше активности каталазы и на 3 порядка выше активности фенолоксидазы. Аналогично, высокая активность POD в сравнении с активностью других редокс-ферментов наблюдалась у бриофита антоцерос A. natalensis (Chasov et al., 2015). Вероятно, что высокая активность POD D. scoparium связана с большой функциональной ролью, которую она играет в данном мхе. Кинетический анализ выявил, что POD D. scoparium окисляет как природные, так и синтетические субстраты. Сродство POD к субстратам (Km) увеличивалось в следующем порядке: p-кумаровая кислота < кофейная кислота < о-дианизидин < ABTS, тогда как максимальная скорость реакции повышалась в ряду: ABTS < p-кумаровая кислота < кофейная кислота < о-дианизидин. Сравнение активности POD в совместно произрастающих лесных мхах H. splendens, D. scoparium, P. schreberi показало, что у D. scoparium наблюдалась 8 Содержание H2O2, мкм/г сухой массы XTT Формазан, нмоль/(мин/г сухой массы) наивысшая активность POD, которая оставалась высокой в течение длительного времени хранения мха. Во всех видах мхов обнаруживалось большое разнообразие изоформ POD. 2.3. Активность POD в цикле обезвоживание/регидратация D. scoparium. Можно полагать, что класс III POD играют важную роль в формировании устойчивости к обезвоживанию мха D. scoparium. Было обнаружено, что активность POD повышалась как при медленном, так и при быстром обезвоживании D. scoparium, а также при последующей гидратации сухих побегов мха (рис. 3). Считается, что поддержание высокого уровня или увеличение активности POD при водном стрессе важно для предотвращения накопления АФК и окислительного повреждения (Wang et al., 2003). Обнаруженное нами повышение активности POD в ходе регидратации после длительного обезвоживания D. scoparium (рис. 3А, Б) согласуется с данными литературы об увеличении 6100 А 5 4 3 2 1 0 5 4 3 2 1 0 0 0 48 96 144 Время, ч *** *** ** 0 1/6 1 2 4 24 48 144 168 1 2 Время, ч 100 Б 50 0 24 48 72 96 Время, ч *** *** *** *** *** 0 1 2 24 72 0.5 2 Время, ч Рис. 3. А – POD активность в побегах мха D. scoparium при медленном обезвоживании над раствором 35% CaCl2 и регидратации. Б – При быстром обезвоживании над силикагелем и регидратации. Черный столбик – сухой мох (контроль), столбик с точками – 1 ч гидратации до обезвоживания, белые столбики – обезвоживание, заштрихованные столбики – регидратация. Относительное содержание воды (ОСВ, врезка). *** количества участвующих окислительного регидратации мха, устойчивого к обезвоживанию (Oliver et al., 2004). Таким образом, увеличение активности при медленном и быстрым обезвоживании и быстрое ее восстановление после регидратации позволяют предположить, что POD играют важную роль в устойчивости к обезвоживанию мхов, возможно, за счет снижения стрессиндуцируемых АФК. 2.4. Локализация пероксидазы класса III во фракции мха D. scoparium и возможная роль POD в образовании O2•−. Известно, что пероксидазы бриофитов активируются при стрессовых воздействиях и высокомобильны (Lehtonen et al., 2009, Chasov et al., 2015). С целью выявления зависимости активности POD от прочности связей фермента со структурными транскриптов POD, в защите от стресса при Активность пероксидазы, мккат/г сухой массы Активность пероксидазы, мкат/г белка ОСВ, % ОСВ, % 9 7 5 3 1 C B1 B2 B3 B3 B2 B1 C А Б pI 3,5 Рис. 4. А – Активность POD из фракций клеточной стенки C, B1, B2 и B3 и их изоферментный состав. С – внутриклеточная фракция. Фракции белков, связанных с клеточной стенкой: B1 – водородными связями, B2 – вандерваальсовыми силами и гидрофобными взаимодействиями, B3 – ионными связями. Б – ИЭФ изоформ POD из фракций C, B1, B2, B3. Изоформы POD указаны стрелками. Визуализация o-дианизидином. элементами клеточной стенки проводили фракционирование белков. Было показано, что несмотря на то, что активность POD во внутриклеточной фракции была выше, чем в других фракциях, существенная часть активности POD была связана с клеточной стенкой различными связями. (рис. 4А). При разделении белков с помощью ИЭФ во всех фракций было обнаружено 8 мажорных изоформ с pI 4,0, 4,3, 4,5, 4,6, 4,8, 5,1, 9,5, 9,8 (рис. 4Б). POD D. scoparium представлены, в основном, анионными изоформами. Известно, что POD высших сосудистых растений и POD бриофитов имеют сложный окислительно-восстановительный цикл и, в определенных условиях, могут переключаться на прооксидантный режим (Minibayeva et al., 2009; Chasov et al., 2015). Ранее нами было показано, что ряд лишайников, мхов, а также печеночник и антоцерос обладают высокой редокс-активностью, в частности, при образовании O2•– (Minibayeva, Beckett, 2001). Было продемонстрировано, что POD класса III принимает участие в образовании O2•– в корнях T. Рис. 5. Электрофоретическое разделение белков из фракций: C, B1, B2 и B3 (7% ПААГ): А – изоформы POD мха D. scoparium отмечены треугольниками (гель был окрашен о- дианизидином), Б – образование NADH-зависимого O2•− (гель был окрашен NBT), В – гель, окрашенный NBT в отсутствие NADH (контроль). Активность пероксидазы, мкат/г сухой массы aestivum (Minibayeva et al., 2009), в семенах Castanea sativa и Trichilia (Roach et al., 2010; Whitaker et al., 2010), в печеночнике (Li et al., 2010) и в антоцеросе (Chasov et al., 2015). С помощью окрашивания гелей NBT нами было подтверждено участие POD D. scoparium в генерации O2•– (рис. 5А, Б). Было показано, что все изоформы POD с 0,01, 0,05, 0,08, 0,31, 0,35 внутриклеточной фракции и во фракции белков, связанных с клеточной стенкой, могут образовать O2•– в присутствии NADH (рис. 5А, Б). Электрофоретический анализ различных 100 80 60 40 20 0 Поглощение UV, mAU Градиент концентрации NaCl, % Активность пероксидазы, % А кДа 263 197 Б pI 3,5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 No фракции Рис. 6. Очистка POD дикранума с помощью анионообменной хроматографии (Hi-Trap Q FF 25 мМ Трис-HCl буфер, pH 7,5). Белки элюировались градиентом NaCl (0-1 M). клеточных фракций в 7% ПААГ показал, что визуализированные полосы изоформ POD из всех фракций: С, В1, В2 и В3 (рис. 5А), соответствовали полосам, визуализирующим образование O2•– в присутствие NBT и NADH (рис. 5Б). Кроме того, две полосы с O2•–-образующей способностью с Rf 0,2 и 0,42 из фракции C, не соответствовали полосам с POD активностью (рис. 5Б). Таким образом, O2•– в данной фракции мог образовываться еще и другими ферментами. Окрашивание 140 геля NBT в отсутствие NADH (рис. 5В) не выявило образования O2•–. 120 2.5. Очистка POD D. scoparium с 100 *** *** помощью анионообменной 80 хроматографии. Белки POD мха D. scoparium, осажденные сульфатом аммония, подвергались разделению с помощью ионообменной хроматографии (рис. 6). Изоформы из фракций, соответствующих пику элюции POD 60 40 20 220 180 *** *** *** Контроль -20°C +30°C +50°C *** *** Рис. 7. А – ИЭФ анионообменной хромотографии (фракции ∑ 10-14) с последующим разделением в 10 % ПААГ (2D-электрофоретическое разделение белков) (Б). 2 12 24 Время, ч Рис. 8. POD активность D. scoparium, выдержанного при - 20°С, +30°С, +50°С в течение 2, 12, 24 ч. белков после Активность пероксидазы, % при ионообменной хроматографии, в дальнейшем разделяли с помощью 2D гель- электрофореза: ИЭФ (рис. 7А) с последующим разделением в ПААГ (рис. 7Б). Анализ с помощью 2D гель-электрофореза выявил наличие 7 мажорных анионных изоформ: каждой полосе с pI 4,6, 4,8, 5,1 (рис. 7А) соответствовало по два белка с молекулярными массами 197 и 263 кДа, а полосе с pI 4,0 – один белок с молекулярной массой 263 кДа (рис. 7Б). Эти белки, вероятно, являются олигомерами, исходя из типичной массы мономерной POD класса III около 40 кДа (Hirata et al., 2000). 2.6. Влияние температуры на активность класс III POD D. scoparium. Было обнаружено, что активность POD дикранума повышалась после 2 ч воздействия как низких, так и высоких температур (рис. 8). Наибольшая активность фермента наблюдалась при +50°С. При охлаждении до -20°С активность POD значительно снижалась через 12 ч и 24 ч воздействия. Обнаружено, что длительное воздействие на мхи температуры +30°С не привело к изменению активности POD. Активность POD значительно подавлялась при длительном воздействии (12 ч и 24 ч) высокой температуры +50°С (рис. 8). Интересно, что POD мха D. scoparium была устойчива и при низких, и при высоких температурах, поскольку она сохраняла свою активность почти на 70–75% при -20°С и +50°С в течение 12 и 24 ч воздействия (рис. 8). 2.7. Идентификация генов и характеристика белков POD III класса в D. scoparium. В отличие от сосудистых растений, кодирующие гены POD у мохообразных идентифицированы недостаточно полно даже в секвенированных геномах. На сегодняшний день геном мха А Б Рис. 9. Анализ консервативных мотивов и домена пероксидаз класс III. А – распределение 10 предполагаемых консервативных мотивов в белках DsPOD. Консервативные мотивы представлены прямоугольниками разного цвета, пронумерованными от 1 до 10. Б – присутствие домена пероксидаз в DsPOD. Зеленый прямоугольник обозначает секреторную пероксидазу, желтый прямоугольник – надсемейство растительной пероксидазы. секреторные пероксидазы надсемейство пероксидазоподобных растений D. scoparium не секвенирован, и гены POD в базе данных отсутствуют. Мы идентифицировали 22 уникальных транскрипта POD дикранума из архива чтения последовательностей в NCBI (Chen et al., 2018, 2019). Для верификации идентифицированных in silico POD-транскриптов дикранума были клонированы и секвенированы две POD последовательности. Blast-сравнение выявило высокую гомологию секвенированных POD с POD других растений в базе данных NCBI (79–82%). Анализ консервативных мотивов и доменов показал, что все найденные аминокислотные последовательности, обозначенные соответствующим образом: DsPOD1- DsPOD22, содержат 10 различных консервативных мотивов длиной от 6 до 50 аминокислотных остатков и домен POD (рис. 9 А, Б). Предсказание субклеточной локализации показало, что большинство белков DsPOD являются экстраклеточными пероксидазами. Для дальнейшего анализа белков POD дикранума нами было выбрано восемь белков DsPOD с самой высокой гомологией к POD III класса P. nutans и P. patens. Нами предсказано, что у DsPOD имеются такие сайты посттрансляционных модификаций, как фосфорилирование, N- гликозилирование, N-миристоилирование и S-пальмитоилирование. В результате компьютерного анализа вторичной и третичной структуры белков DsPOD обнаружено, что POD дикранума состоят, в основном, из α-спиралей и неструктурированных петель. Филогенетический анализ показал, что белки DsPOD сгруппированы в разных ветвях древа (рис. 10). Вероятно, разнообразие изоформ POD может быть результатом дупликаций в геноме далеких предков мхов (Ramsey, Schemske, 1998; Liu et al., 2011). Расположение различных изоферментов POD одного вида растения в разных группах и одновременное расположение в этих же группах изоферментов других видов растений других классов и даже отделов может свидетельствовать о том, что дивергентность изопероксидаз возникла до разделения растений на две эволюционных ветви: сосудистые и несосудистые высшие растения (рис. 10). 2.8. Экспрессия генов DsPOD при действии абиотических стрессоров: CdCl2, параквата, неблагоприятных температур и обезвоживания/регидратации. Повышение активности POD во мхе D. scoparium в условиях водного (рис. 3) и температурного (рис. 8) стрессов может быть обусловлено как регуляцией активности белков, так и регуляцией активности генов. Анализ экспрессии генов DsPOD1–DsPOD8 показал, что четыре гена из восьми (DsPOD1, DsPOD2, DsPOD6 и DsPOD8) активировались в различной степени при воздействии хлорида кадмия (CdCl2), параквата, отрицательных и положительных температур, при обезвоживании/регидратации, что предполагает функциональное разнообразие этих генов. Установлено, что воздействие CdCl2 в течение 1ч значительно усиливало экспрессию всех четырех генов DsPOD1, DsPOD2, DsPOD6, и DsPOD8, более длительное (12 ч) выдерживание в CdCl2 приводило к снижению экспрессии этих генов до уровня контроля (DsPOD6), или ниже (DsPOD1, DsPOD8), за исключением DsPOD2, который остался активированным после 12 ч обработки хлоридом кадмия (рис. 11А). Действие прооксиданта параквата подавляло экспрессию генов в обоих исследуемых промежутках времени, за исключением DsPOD2, экспрессия которого усиливалась через 12 ч (рис. 11А). Показано, что воздействие низкой отрицательной температуры (-20°С) на побеги мхов значительно усиливало экспрессию DsPOD1, DsPOD2 и DsPOD6 через 1 ч (рис. 11Б), а через 12 ч экспрессия DsPOD2 снижалась, но у DsPOD6 экспрессия оставалась повышенной. Наблюдалось также небольшое, но значимое увеличение экспрессии DsPOD8 через 12 ч воздействия минусовых температур (рис. 11Б). Воздействие умеренных положительных температур +30°С на мхи либо не влияло, либо снижало экспрессию всех генов POD, за исключением DsPOD6. Обнаружено, что Рис. 10. Филогенетическое древо, показывающее взаимосвязь между аминокислотными последовательностями DsPOD и аминокислотными последовательностями POD III класса других видов растений. Масштабная линия представляет 10% расчетное расхождение последовательностей. кратковременное и длительное воздействие температур в +30°С на мхи приводило к усилению экспрессии DsPOD6 (рис. 11Б). При гидратации, обезвоживании и регидратация экспрессия генов DsPOD заметно варьировала (рис. 11В). Экспрессия DsPOD1 снижалась в условиях водного стресса. Обнаружено, что ген DsPOD2 активизировался при обезвоживании, причем максимальная экспрессия наблюдалась через 24 ч обезвоживания, а через 72 ч его экспрессия А 1 Б 1 В DsPOD1 Контроль CdCl2 Паракват ** ** Контроль +30°C -20°C ** 1 12 DsPOD2 DsPOD6 * DsPOD8 3 1 12 1 12 * 1 12 *** 1 12 ** * 1 12 ** * * *** 1 12 1 12 24 * *** 10 *** ** 1 2 5 *** *** *** 00*00 0 1 224720,52 0 1 224720,52 0 1 224720,52 0 1 224720,52 Время, ч Рис. 11. Относительный уровень экспрессии генов DsPOD при выдерживании побегов D. scoparium в А – CdCl2 (100 мкМ) и параквате (100 мкМ) в течение 2 и 12 ч. Белые столбики – контроль, столбики с прямоугольными коробками – мхи обработанные CdCl2, столбики с вертикальными линями – мхи обработанные паракватом. Б – воздействие неблагоприятных температур (-20°С) и (+30°С) в течение 2 и 12 ч. Белые столбики – контроль (+25°С), столбики со звездочками – +30oC, столбики с горизонтальными линиями – (-20°С). В – обезвоживание/регидратация. Черные столбики – сухой мох (контроль), столбики с точками - 1 ч гидратации до обезвоживания, белые столбики – обезвоживание над силикагелем (1 г мха/10 г силикагель), заштрихованные столбики – регидратация. ** 15 Относительный уровень Относительный уровень Относительный уровень экспрессии экспрессии экспрессии 90 80 70 60 50 40 30 20 10 100 50 0 А 72 144 216 288 Время, ч * ** ** *** * * 0 1 2 24 48 72 96 1201631872573310.17 1 80 70 60 50 40 30 20 10 Рис. 12. Активность APX и в побегах мха D. scoparium при обезвоживании, А – над парами 35% CaCl2, Б – над силикагелем и регидратации. Черный столбик – сухой мох (контроль), столбик с точками – 1 ч гидратации до обезвоживания, белые столбики – обезвоживание, заштрихованные столбики – регидратация. ОСВ (врезка). Время, ч Б ** 50 0 24 48 72 96 Время, ч *** *** *** *** * *** 0 1 2 24 72 0.5 2 Время, ч снижалась и оставалась низкой при регидратации. Небольшое экспрессии наблюдалось обезвоживании и ранней (0,5 ч) регидратации, а затем экспрессия снижалась при дальнейшей регидратации (2 ч). После 1 ч гидратации экспрессия DsPOD8 значительно усиливалась, оставалась повышенной в течение первого часа обезвоживания, затем снижалась через 24 и 72 ч обезвоживания, но поднималась до уровня контроля при последующей гидратации (рис. 11В). В целом, обнаружено, что изменения экспрессии были более значительными при обезвоживании, чем при регидратации после обезвоживания (рис. 11В). На увеличение в DsPOD6 при основании анализа DsPOD, предположить, что DsPOD1, DsPOD2 и DsPOD8 вовлечены в ранние ответы на воздействие стрессоров, а DsPOD6 участвует как в краткосрочных, так и долгосрочных ответах мха на воздействие всех агентов, индуцирующих окислительный стресс. 2.9. Аскорбатпероксидаза мха дикранум метловидный: влияние обезвоживания/регидратации. В клетках высших сосудистых растений одним из основных механизмов детоксикации H2O2 является ASC-GSH цикл, в котором ферменты APX играют ключевую роль, катализируя превращение H2O2 в H2O с использованием аскорбата в качестве специфического донора электронов (Caverzan et al., 2012; Sofo et al., 2015). Было показано, что APX дикранума имеет более высокое сродство к аскорбату (Km 9,5 мкМ), чем APX других фотосинтезирующих организмов. Например, Km неочищенного экстракта из Crocus sativus составляет 150 мкМ (Ghamsari, Keyhani, 2004), тогда как Km очищенных APX из различных результатов экпрессии генов можно Активность APX, нкат/г сухой массы ОСВ, % Активность APX, нкат/г сухой массы ОСВ, % видов растений составляет от 220–480 мкМ (Mittler, Zilinskas, 1991; Ishikawa et al., 1996; Takeda et al., 1998). Оптимальный pH для активности APX дикранума составляет 6-7, что типично для большинства APX сосудистых и несосудистых растений (Chen, Asada, 1989; Sajitha Rajan, Murugan, 2010). Обнаружено, что активность APX повышалась как при медленном, так и при быстром обезвоживании (рис. 12А, Б). 2.10. Влияние неблагоприятных температур на активность APX в D.scoparium. В сосудистых растениях показано, что при температурном стрессе происходит повышенное образование АФК и стимуляция активности антиоксидантных ферментов (Chakraborty, Pradhan, 2011; Kaushal et al., 2016). Результаты наших исследований показали, что активность APX увеличивалась только после кратковременного воздействия температуры +30°С (рис. 13), в то время как более длительное воздействие (12 и 24 ч) как низких отрицательных, так и повышенных температур снижало активность APX (рис. 13). Первоначальное повышение активности APX во мхе, выдержанного при +30°С, может быть обусловлено усилением активности фермента, нейтрализующего АФК, в то время как ингибирование после более длительных или более жестких температурных воздействий, вероятно, является отражением общего повреждения структуры белка, вызванного температурой. 2.11. Электрофоретическое разделение APX D. scoparium. В результате проведения полу-нативного градиентного гельэлектрофореза в D. scoparium были обнаружены две изоформы APX: мажорная с молекулярной массой 31 кДа и минорная с молекулярной массой 43 кДа (рис. 14). Возможно, что мажорная цитозольная изоформа APX является основной изоформой, а минорный изофермент может быть пластидным (Mittler, Zilinskas 1991; Madhusudhan et al., 2003). 3.3. Идентификация гена и характеристика белка APX D. scoparium. Используя последовательность APX 140 120 100 80 60 40 20 *** Контроль -20°C +30°C +50°C *** *** *** *** *** *** *** 2 12 24 Время, ч Рис. 13. Aктивность APX выдержанного при -20°С, +30°С и +50°С в течение 2, 12 и 24 ч. В качестве контроля использовали гидратированные побеги, которые хранили при комнатной температуре. Рис. 14. Электрофоретическое разделение APX D. scoparium. А – полу-нативный градиентный (SDS) электрофорез (3% - 12%), гели окрашивали раствором 50 мМ Na- фосфатного буфера pH 7,8 с 28 мМ ТЕМЕД, 2,4 мМ NBT, М – маркеры. Активность APX, % из G. pilifera (GpAPX, Song et al., 2012), близкого родственника D.scoparium, мы идентифицировали и секвенировали кодирующую последовательность APX из мха дикранума, обозначив его как DsAPX. С помощью Blast в базе данных NCBI было обнаружено, что нуклеотидная последовательности DsAPX имеет высокую гомологию (90,79%) с нуклеотидной последовательности GpAPX. Идентичность нуклеотидных последовательностей DsAPX с другими растениями составляла 64,4–79,9%. В результате in silico анализа показано, что DsAPX кодирует цитозольную APX, содержит 256 аминокислот, имеет молекулярную массу – 28,35 кДа и pI – 5,71. Анализ вторичной структуры белков DsAPX показал, что белок состоит, в основном, из α-спирали и неструктурированных петель и очень похож на другие APX мха из баз данных, что указывает на высокую консервативность этих белков. В APX полностью отсутствует - поворот, что может негативно влиять на стабильность белка (Marcelino, Gierasch, 2010). Филогенетический анализ показал, что DsAPX сгруппирована вместе с APX из других видов мхов c одним общим предком, в отличие от DsPOD (рис. 10, 15). Оказалось, что APX из M. polymorpha находится в одной кладе с предком, от которого произошли APX сосудистых растений, и располагается между APX мхов и сосудистых растений (рис. 15). При этом, M. polymorpha занимает критическое положение в эволюционном развитии наземных растений от водорослей, возможно, сохраняя черты предков наземных растений (Bowman et al., 2017). Рис. 15. Филогенетическое древо, показывающее взаимосвязь между аминокислотными последовательностями DsAPX и APX других растений. Масштабная линия представляет 5% расчетное расхождение последовательностей. 3.4. Экспрессия гена DsAPX при температурном воздействии, обезвоживании/регидратации, действии CdCl2 и параквата. Для сосудистых растений показано, что экспрессия гена APX увеличивается при абиотическом и биотическом стрессе, кроме того, экспрессия зависит от стадий развития растения и условий стрессового воздействия (Mittler, Zilinska, 1992; Agrawal et al., 2003; Park et al., 2004; Pandey et al., 2017). Для выявления особенностей активности гена DsAPX нами был проведен анализ уровня экспрессии c помощью ПЦР-РВ при воздействии CdCl2, параквата, положительных и отрицательных температур и при обезвоживании/регидратации побегов D. scoparium. Было обнаружено, что экспрессия гена DsAPX не менялась после 1 ч воздействия CdCl2, но увеличивалась после 12 ч воздействия. Обработка побегов мха прооксидантом паракватом приводила к незначительному снижению уровня экспрессии после кратковременного (1 ч) воздействия, однако длительное (12 ч) воздействие паракватом повышало уровень экспрессии гена DsAPX почти в два раза (рис. 16А). При 1 ч действии положительных температур (+30°С) наблюдалась тенденция к увеличению экспрессии DsAPX, которая сохранялась и при длительном воздействии (12 ч) (рис. 16Б). При низкотемпературном воздействии (-20°С) экспрессия DsAPX недостоверно снижалась к 12 ч воздействия (рис. 16Б). Можно предположить, что снижение экспрессии гена DsAPX при действии отрицательных температур, может приводить и к снижению активности APX (рис. 13), и соответственно к усилению образования АФК. Кроме того, было обнаружено, что экспрессия А3 Б2 Контроль Контроль +30°C -20°C 1 12 Время, ч CdCl2 Паракват 2 1 00 1 12 Время, ч В 5 4 3 2 1 0 Рис. 16. Относительный уровень экспрессии генов DsAPX при выдерживании побегов D. scoparium в А – CdCl2 (100 мкМ) и параквате (100 мкМ) в течение 2 и 12 ч. Белые столбики – контроль, столбики с прямоугольными коробками – мхи обработанные CdCl2, столбики с вертикальными линями – мхи обработанные паракватом. Б – воздействие неблагоприятных температур (-20°С) и (+30°С) в течение 2 и 12 ч. Белые столбики – контроль (+25°C), столбики со звездочками – +30oC, столбики с горизонтальными линиями – (-20°С). В – обезвоживание/регидратация. Черные столбики – сухой мох (контроль), столбики с точками - 1 ч гидратации до обезвоживания, белые столбики – обезвоживание над силикагелем (1 г мха/10 г силикагель), заштрихованные столбики – регидратация. *** * ** *** ** *** 0 1 2 24 72 0.5 2 Время, ч 19 Относительный уровень экспрессии Относительный уровень экспрессии Относительный уровень экспрессии DsAPX увеличивается при прохождении побегов мха через цикл обезвоживание/регидратация мха D. scoparium (рис. 16В), что коррелировало с увеличением активности фермента при обезвоживании над силикагелем с коэффициентом 0,7 (рис. 12Б). Аналогичные результаты были получены для мха G. pilifera, где обезвоживание активировало экспрессию GpAPX (Song et al., 2012). Корреляция между содержанием H2O2 (рис. 2А), активностью APX (рис. 12Б) и экспрессией гена DsAPX (рис. 16В) в наших экспериментах в цикле обезвоживание/регидратация у D. scoparium свидетельствует о вовлечении аскорбатпероксидазы в контроль уровня АФК, накапливаемых при стрессе соответственно. Возможно, что изменение активности фермента при быстром обезвоживании связано с синтезом фермента de novo, поскольку на протяжении всего эксперимента активность APX кореллировала с экспрессией DsAPX (рис. 12Б, 16В). Изменения уровня экспрессии DsAPX при обезвоживании и тепловом стрессе подтверждают нашу гипотезу о том, что APX участвует в защите мха D. scoparium от стресс-индуцируемого окислительного стресса. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Нами показано, что пероксидазы высших несосудистых растений, таких как мхи, обладают функциями и свойствами, подобными таковым у пероксидаз высших сосудистых растений. Мох D. scoparium характеризуется наивысшей пероксидазной активностью среди совместно произрастающих лесных мхов. Можно полагать, что пероксидазы являются ключевыми факторами ответа D. scoparium на действие абиотических стрессоров. Наши данные демонстрируют, что высокая конститутивная активность пероксидазы может еще больше повышаться при абиотическом стрессе, в том числе, индуцированном обезвоживанием, регидратацией и неблагоприятными температурами. Обнаружено, что пероксидазы класса III в D. scoparium представлены множеством изоформ, проявляющих как анти-, так и прооксидантную активность. Прооксидантная активность некоторых пероксидаз класса III была ранее показана и для высших сосудистых растений (Bolwell et al., 2002; Minibayeva et al., 2009). Таким образом, образование АФК пероксидазами – эволюционно древний защитный механизм, способствующий повышению адаптации высших растений, их приспособлению к изменяющимся условиям внешней среды и, как следствие, успешной колонизации различных экологических ниш. В настоящей работе с помощью биоинформатического анализа впервые идентифицированы 22 гена DsPOD, кодирующих пероксидазы III класса в D. scoparium. Показано, что два клонированных и секвенированых гена DsPOD, высокогомологичных по отношению к генам P. patens, характеризовались наибольшей стресс-индуцированной экспрессией. Биоинформатический анализ показал, что все белки DsPOD имеют классическую структуру пероксидазного домена. Увеличение активности фермента и повышение уровня экспрессии DsPOD в ответ на действие различных стрессоров предполагает, что пероксидазы III класса играют одну из ключевых ролей в формировании устойчивости мха D. scoparium к абиотическим стрессам. Нами впервые идентифицирована и секвенирована кодирующая последовательность цитозольной аскорбатпероксидазы DsAPX из мха D. scoparium, имеющая высокую гомологию с нуклеотидными последовательностями APX других растений. Изменение экспрессии гена DsAPX и уровня активности DsAPX, коррелирующее с содержанием H2O2 при абиотических воздействиях, свидетельствует о вовлечении аскорбатпероксидазы в контроль уровня АФК, накапливаемых при стрессе. Стресс- индуцируемая активность ферментов и обнаруженные в результате in silico анализа консервативные элементы в структуре генов и белков пероксидаз I и III класса D. scoparium, а также филогенетический анализ свидетельствуют о сохранении этих последовательностей в геноме растений в ходе эволюции ввиду важности пероксидаз в поддержании окислительно- восстановительного статуса в клетках растений. ВЫВОДЫ 1. Обнаружено образование гидроксильного радикала, супероксидного анион-радикала и перекиси водорода в побегах мха Dicranum scoparium. Впервые показано, что в D. scoparium в образовании супероксидного анион-радикала принимают участие изопероксидазы класса III. Установлено, что пероксидазы класса III мха проявляют как анти-, так и прооксидантные свойства. 2. Показано, что D. scoparium обладает наивысшей пероксидазной активностью среди совместно произрастающих лесных мхов. Обнаружено, что пероксидазы III класса и аскорбатпероксидазы вовлечены в стрессовые ответы D.scoparium после воздействия обезвоживания/регидратации и неблагоприятных температур, что предполагает важные роли пероксидаз в формировании устойчивости мха дикранума к абиотическому стрессу. 3. Впервые идентифицированы гены пероксидаз III класса DsPOD дикранума. С использованием биоинформатического анализа в DsPOD кодируемых белках обнаружено наличие консервативных доменов, характерных для типичных пероксидаз III класса. 4. Впервые в D. scoparium идентифицирован ген аскорбатпероксидазы DsAPX, имеющий высокую степень гомологии с APX G.pilifera и P.patens. С помощью in silico анализа показано, что белок аскорбатпероксидазы D. scoparium содержит несколько высококонсервативных сайтов, важных для ферментативной активности. На основании биоинформатического анализа DsAPX выявлено, что идентифицированный ген APX кодирует типичную цитоплазматическую аскорбатпероксидазу. 5. Изменение уровня экспрессии генов DsPOD и DsAPX при воздействии обезвоживания/регидратации, CdCl2, параквата и неблагоприятных температур предполагает, что эти белки могут играть защитную роль для предотвращения окислительных повреждений в дикрануме при стрессе. Стресс-индуцируемая активность и наличие консервативных элементов в структуре генов и белков пероксидаз D. scoparium свидетельствуют о сохранении этих последовательностей в геноме растений в ходе эволюции ввиду важности пероксидаз в поддержании окислительно-восстановительного статуса в клетках растений.