Численное и экспериментальное исследование процессов, протекающих в ротационном биореакторе при выращивании костной ткани

Во введении описывается актуальность темы диссертации. Представлен краткий обзор литературы по теме диссертации, описано текущее состояние проблемы и перспективы исследований в данной области, сформулированы цель и задачи исследования. Показана научная новизна и практическая значи-
мость работы, сформулированы положения, выносимые на защиту.
Первая глава посвящена обзору литературы на тему применения биореак- торов для выращивания клеточного материала для костных имплантатов. В гла- ве приведено описание и сравнение методов лечения крупных костных дефек- тов с использованием различных видов трансплантатов, включая донорские и собственные костные ткани. Анализ и сравнение достоинств и недостатков каждого подхода позволили обосновать преимущества и перспективы исполь- зования тканеинженерных костных имплантатов, состоящих из костной ткани, выращенной на биоразлагаемом каркасе. Костные ткани выращиваются из кле- ток-предшественников – стволовых клеток, взятых у пациента, а затем сформи- рованный имплантат помещается в организм пациента на место повреждения. В обзоре литературы рассмотрены варианты стимуляции стволовых клеток к преобразованию в клетки кости. Известно, что воздействие касательным напряжением потока жидкости вызывает дифференцировку стволовых клеток, а также способствует эффективному нарастанию костной ткани. Поэтому эта ре- акция применяется для наращивания костной ткани во многих биореакторах. В главе представлен обзор технологий, применяемых при создании подобных тканеинженерных имплантатов. В частности, рассмотрены такие варианты ар- хитектуры каркасов, как трехмерные пористые образцы и объемные формы, со- стоящие из отдельных тонких слоев. Последний способ обладает преимуще- ствами, поскольку в нем возможно более равномерное наращивание слоев костных тканей на плоских поверхностях. Складывая объемы из отдельных ли- стов, покрытых живыми клетками, можно создавать более сложные трехмерные формы с равномерным распределением биоматериала внутри имплантата. Ис- ходя из обзора существующих технологий и методов создания каркасов, обос- нованы перспективы данного подхода при создании тканеинженерных им-
плантатов.
Для наращивания костного материала из стволовых клеток на тонкой по-
лимерной пленке в рамках данной технологии профессором П. М. Ларионовым был предложен прибор с новой конструкцией – ротационный биореактор. Предлагаемая конструкция нового биореактора представляет собой стеклянный сосуд, заполненный питательной культуральной средой, в которую соосно на трех тонких проволоках погружен жесткий каркас с закрепленной на нем поли- мерной пленкой с клетками. Каркас для пленки имеет форму пустой внутри
цилиндрической оболочки. Тонкую пленку, изготовленную на основе биоразла- гаемого полимера поликапролактона на установке электроспиннинга, заселяют стволовыми клетками и натягивают на внешнюю поверхность каркаса таким образом, чтобы заселенная поверхность была обращена к стенке стеклянного корпуса. При работе такого реактора течение жидкости возникает только вследствие вращения каркаса пленки, конструкция не имеет дополнительных приспособлений для перемешивания питательной среды. В литературе имеются сведения о положительном влиянии низкого касательного напряжения потока жидкости (около 10 мПа) на стимуляцию дифференцировки стволовых клеток в клетки кости и последующее нарастание костной ткани. При выращивании костной ткани на объемных каркасах в перфузионных биореакторах контроли- ровать потоки жидкости внутри сложной пористой структуры невозможно. В то же время в ротационном биореакторе становится возможным равномерно и контролируемо воздействовать потоком жидкости на стволовые клетки и эф- фективно наращивать костную ткань.
Поскольку условия наращивания ткани в новом биореакторе не изучены, для оптимизации данного метода создания имплантатов важно решить множе- ство отдельных задач. В разделе рассмотрены методы, применяемые при иссле- довании течения питательной среды в биореакторах. Обосновано применение численного моделирования течения жидкости в биореакторе для процесса оп- тимизации новой технологии, рассмотрены методы верификации численного решения. В условиях сложной геометрии реактора и малых характерных вели- чин касательных напряжений численные методы позволяют определить уро- вень механической нагрузки потока жидкости на клетки.
Контроль нарастания костной ткани при культивировании в биореакторе является важной проблемой в процессе разработки новой технологии. Оптиче- ская диагностика методом ЛИФ представляется альтернативой существующим стандартным методам гистологии и может применяться без повреждения ис- следуемых образцов. Поскольку биологические образцы уже содержат в себе флуорофоры, которые излучают свет при их возбуждении в ультрафиолетовом диапазоне, не нужно использовать дополнительные окрашивающие вещества. В разделе представлен обзор применения метода ЛИФ в медицинских исследо- ваниях для диагностики множества заболеваний по спектрам флуоресценции.
В обзоре литературы описаны основные тканевые флуорофоры, особенно- сти спектров флуоресценции биологических тканей, в том числе для многоком- понентных оптически тонких образцов. Обосновано применение метода ЛИФ к анализу костных тканей, выращенных на тонкой пленке. В многоатомных био- логических молекулах спектры флуоресценции являются сплошными, а не ли- нейчатыми. Когда в образце присутствует несколько флуорофоров, их спектры флуоресценции могут перекрываться, в результате регистрируемый сигнал ста- новится сложным. Дополнительная проблема состоит в том, что некоторые флуорофоры в разных биологических тканях находятся в разном микроокруже- нии, и, соответственно, имеют разные спектры флуоресценции. В такой ситуа- ции невозможно заранее предсказать форму спектра флуоресценции. Поэтому
для того, чтобы корректно описать состав образца и изменения, которые проис- ходят в нем, нужен метод восстановления чистых спектров, который не требует априорную информацию о них.
В разделе приведен обзор алгоритмов анализа спектров флуоресценции биологических тканей, обоснованы перспективы применения для статистиче- ского анализа спектральных данных в виде матриц возбуждения–эмиссии. Существующие методы анализа спектральных данных не могут точно восста- новить чистые спектры для некоторых вариантов пресечений спектров флуо- ресценции. Поэтому до сих пор актуален поиск новых алгоритмов, позволяю- щих рассчитывать чистые спектры основных флуорофоров и определять их вклады в регистрируемый сигнал без использования априорной информации о спектрах.
В заключение в обзоре литературы кратко описаны проблемы, возникаю- щие в процессе разработки новой технологии создания тканеинженерных им- плантатов. По результатам обзора литературы сформулированы цели и задачи исследования.
Вторая глава посвящена численному моделированию течения жидкости в модели исходно предложенной конструкции ротационного биореактора. Для нового биореактора необходимо определить диапазон частот вращения каркаса пленки со слоем стволовых клеток, который позволит получить касательные напряжения на биоматериале на уровне, подходящем для стимуляции стволо- вых клеток (около 10 мПа).
В разделе подробно описаны математическая модель и постановка задачи для ротационного биореактора с исходным устройством. Область расчета тече- ния была трехмерной и соответствовала объему, который занимала питательная
Рис. 1. Образец ротационного биореактора (а) и каркас для полимерной пленки (б); принципиальная схема нового биореактора (в); геометрическая модель нового
биореактора (г).
Fe1, Fe2, Fe3 – внешние поверхности; Fi1, Fi2 – поверхности каркаса для пленки. Размеры ука-
заны в миллиметрах. 10

среда в применяемом на практике образце реактора (рис. 1). Поверхности стек- лянного корпуса моделировались цилиндрической поверхностью со скруглен- ным снизу дном. Граница с воздухом моделировалась плоскостью. Каркас пленки упрощенно моделировался отрезком трубы, его плоские торцевые по- верхности заменялись тороидальными поверхностями для упрощения расчета. Крепление каркаса пленки к оси двигателя не моделировалось. В исходной мо- дели ротационного биореактора рабочая поверхность, на которой размещается пленка с биоматериалом, соответствует внешней поверхности каркаса Fi1 (рис. 1,г).
В главе приведены постановка задачи, начальные и граничные условия. Численное моделирование проводилось в пакете программ ANSYS Fluent. Ре- шалась система уравнений Навье  Стокса для несжимаемой жидкости, тепло- обмен и гравитационные силы в поставленной задаче не учитывались. Движе- ние жидкости генерировалось вращающимися поверхностями за счет вязкости. Условие вращения ставилось только на поверхности каркаса пленки. Обосно- вано использование воды при комнатной температуре в качестве рабочей жид- кости (плотность 998,2 кг/м3 и динамическая вязкость 1 мПа∙с). При дискрети- зации применялась тетраэдрическая сетка. В пристеночных областях вблизи поверхностей каркаса применялись призматические элементы и дополнительно введено сгущение сетки. Проверялась сеточная сходимость: оптимальное число элементарных объемов 3,1·106 шт.
Верификация математической модели проводилась на задаче определения поля течения в зазоре между вращающимися коаксиальными цилиндрами, по- скольку принципиально новый биореактор состоит из двух цилиндрических поверхностей. Сравнение окружной скорости показало, что численное решение хорошо повторяет аналитические решения для плоского и ламинарного течения Куэтта в зазоре цилиндров.
Расчеты проводили при частотах вращения каркаса пленки 0,083, 0,125, 0,167, 0,2 и 0,233 Гц. Из литературы известно, что в системе коаксиальных ци- линдров при вращении внутреннего цилиндра образуется течение с чередую- щимися вихрями Тейлора. Расчеты течения в новом реакторе подтвердили, что в зазоре между стенкой корпуса реактора и каркасом возникает течение в виде двух вихрей с противоположным направлением вращения (рис. 2). Для под- тверждения данной структуры проводились эксперименты по оптической визу- ализации течения жидкости в зазоре реактора с помощью лазерного ножа. Экс- перименты подтвердили наличие вихрей Тейлора в зазоре. По фотографиям была оценена максимальная скорость течения жидкости в зазоре и показано, что она близка к рассчитанной скорости при той же частоте вращения каркаса.
Далее в главе приведены результаты визуализации течения и распределе- ния величины механической нагрузки потока жидкости на поверхность с клет- ками в указанном диапазоне частот вращения каркаса. Было показано, что вих- ри Тейлора приводят к неравномерному распределению касательного напряже- ния в зоне их сопряжения: в центре рабочей поверхности его значение ниже, чем на краях (рис. 3,а). В разделе приведен количественный анализ распределе-
Рис. 2. Визуализации течения жидкости в зазоре между стенкой и вращающимся кар- касом (а) и общая картина течения в плоскости симметрии биореактора (б).
Частота вращения каркаса f = 0,083 Гц.
Рис. 3. Касательное напряжение на рабочей поверхности в исходной модели ротационного биореактора: распределение вдоль образующей поверхности (а), зависимость средней вели- чины от частоты вращения каркаса (б).
ния механической нагрузки по рабочей поверхности, на которой культивиру- ются клетки. Показано, что 28–46 % зоны культивирования клеток имеют хорошую однородность распределения касательного напряжения (разброс в 10 % относительно среднего значения) при частоте вращения 0,083–0,233 Гц. На рис. 3,б представлена зависимость усредненного по рабочей поверхности касательного напряжения от частоты вращения каркаса. При частоте вращения от 0,083 до 0,233 Гц на стволовые клетки будет действовать среднее касатель- ное напряжение от 4 до 17 мПа. Можно заключить, что данные частоты враще- ния подходят для стимуляции стволовых клеток, поскольку известно, что каса- тельное напряжение порядка 10 мПа способно стимулировать их дифференци- ровку. Дополнительно в разделе приведен анализ распределения статического давления по рабочей поверхности. Показано, что клетки на ней находятся в зоне разрежения, а характерные величины давления не значительны для влия- ния на стволовые клетки. Полученные результаты далее были использованы
12

для определения оптимального режима работы реактора в последующих меди- цинских экспериментах по выращиванию костной ткани.
В главе кратко описаны установочные эксперименты по определению оп- тимального уровня нагрузки потока жидкости на стволовые клетки в новом ре- акторе. Анализ биоматериала, выращенного при частотах вращения каркаса от 0,083 до 0,33 Гц, показал, что оптимальной для стимуляции стволовых клеток является частота 0,133 Гц (8 об/мин), которая соответствовала среднему каса- тельному напряжению 8 мПа. В разделе приведены изображения поверхности фрагментов пленки при гистологическом исследовании. Гистологический ана- лиз подтвердил, что после трех недель культивирования в реакторе плотность клеток кости на 36 % выше по сравнению с образцами контроля, которые вы- ращивались статически в культуральном планшете. Уровень коллагена (белка, который сигнализирует о нарастании межклеточного вещества) был выше на 53 % относительно контрольных образцов. Таким образом, на практике было подтверждено, что новый биологический реактор можно применять для выра- щивания костной ткани для тканеинженерных имплантатов, и определена оп- тимальная величина для стимуляции стволовых клеток.
В третьей главе описываются методы улучшения условий культивирова- ния биологического материала на тонкой полимерной пленке и перспективные изменения для дальнейшего развития технологии. Поскольку в исходной кон- струкции ротационного биореактора из-за вихрей Тейлора создается неодина- ковая механическая нагрузка на рабочую поверхность с биоматериалом (см. рис. 3,а), следующей задачей было определение перспективных изменений конструкции для создания более однородной нагрузки на клеточный слой. До- полнительно описана модификация реактора, позволяющая создавать цикличе- скую механическую нагрузку на биологический материал. В разделе приведены сравнение и анализ результатов численного моделирования течения для трех перспективных моделей на основе ротационного биореактора.
Основная геометрия всех моделей совпадала с геометрией исходного рота- ционного реактора. В начале раздела представлены результаты тестового рас- чета течения, проведенного для исходной модели с увеличенным диаметром каркаса пленки. Расчет показал, что структура течения вблизи поверхности с биоматериалом изменилась: образовалось четыре вихря Тейлора, что ухудшило равномерность распределения касательного напряжения по поверхности. По- этому последующие расчеты течения проводились с первоначальным размером каркаса пленки, и основной целью данного раздела являлось определение ос- новных перспективных схем организации течения. Дальнейшую оптимизацию геометрии каркаса для наиболее эффективного использования поверхности культивирования следует проводить после выбора конкретной модели ротаци- онного биореактора.
Первая перспективная модель предполагает изменение рабочей поверхно- сти: расположение пленки с биоматериалом во внутренней полости каркаса пленки на поверхности Fi2 (см. рис. 1,г). В исходной модели биореактора при вращении каркаса в зазоре между ним и корпусом образовывались два вихря,
Рис. 4. Касательное напряжение на рабочей поверхности: распределение вдоль образующей поверхности (а), зависимость средней величины от частоты вращения
каркаса (б).
Сплошная линия – исходная модель ротационного биореактора, пунктирная линия – первая
перспективная модель.
в то время как во внутренней полости вихрей не было. По графику вдоль обра- зующей рабочей поверхности в первой перспективной модели видно (рис. 4,а), что касательное напряжение не имеет минимумов, в отличие от исходной моде- ли (см. рис. 3,а). Хорошую однородность распределения имеет 83–88 % по- верхности культивирования при частотах вращения 0,083–0,233 Гц. Среднее касательное напряжение ниже по величине в сравнении с исходной моделью (рис. 4,б), однако данную модификацию можно использовать при дальнейших медицинских экспериментах без значительных изменений в конструкции реак- тора. В данной модели клетки будут находиться в зоне повышенного давления, но оно не превышает значения для нормальной жизнедеятельности клеток.
Модификации во второй перспективной модели заключаются в замене вращающихся и стационарных элементов. При вращении внешней стенки (кор-
Рис. 5. Визуализация поля течения по проекции вектора скорости на плоскость сим- метрии при вращении внутреннего каркаса (исходная модель) и стенки корпуса
(вторая перспективная модель) при частоте вращения f = 0,167 Гц. 14

Рис. 6. Касательное напряжение на рабочей поверхности: распределение вдоль обра- зующей поверхности (а), зависимость средней величины от частоты вращения (б).
Сплошная линия – исходная модель ротационного биореактора, пунктирная линия – первая перспективная модель, точки – вторая перспективная модель.
пуса) и неподвижном каркасе пленки течение жидкости устойчиво, в результате в зазоре между корпусом и каркасом не образуется вихрей (рис. 5). Рабочая по- верхность в данной модификации соответствует поверхности Fi1, как и в исход- ной модели. Механическая нагрузка на рабочую поверхность становится более равномерной (рис. 6). Для расчета данного варианта использовалась та же гео- метрия и расчетная сетка, что и в Главе 2. Граничные условия были изменены на условие вращения поверхностей корпуса вместо вращения поверхностей каркаса. Частоты вращения корпуса для удобства сравнения были выбраны те- ми же, что и в случае вращения внутреннего каркаса в исходной модели. Остальные граничные условия и постановка задачи не изменялись.
Анализ распределения касательного напряжения по рабочей поверхности показал, что при вращении внешней стенки исчезает минимум в центральной области, но сохраняется повышенное значение механической нагрузки на краях пленки (рис. 6,а). Относительно давления рабочая поверхность находится в зоне разрежения, если вращается каркас, и в зоне повышенного давления, если вращается корпус. В последнем случае 96–100 % зоны культивирования клеток имеют хорошую однородность распределения касательного напряжения и ста- тического давления в исследуемом диапазоне частот вращения. Средние каса- тельные напряжения выше по величине, чем в исходной и первой перспектив- ной модели (рис. 6,б). Максимальное значение касательного напряжения огра- ничено 20 мПа при частоте вращения 0,233 Гц при данном типе течения. Сред- нее статическое давление выше, чем в других рассчитываемых моделях, однако оно не превышает величины, которые могут реализовываться в физиологиче- ских условиях.
Таким образом, вариант организации течения во второй перспективной модели является лучшей альтернативой существующей исходной схеме, опи- санной в Главе 2. Данный способ позволяет наиболее равномерно распределять
механическую нагрузку по поверхности культивируемого клеточного материа- ла за счет отсутствия вихрей Тейлора.
Третья рассматриваемая перспективная модель представляет собой асим- метричную модель на основе ротационного реактора. Наряду с постоянными потоками, активно исследуется влияние циклической нагрузки на дифференци- ровку стволовых клеток по типу костной ткани. Такой тип нагрузки можно ор- ганизовать в ротационном реакторе путем смещения осей вращения.
В разделе подробно описаны особенности геометрии асимметричного ро- тационного реактора (рис. 7). При расчете данного варианта все основные раз- меры корпуса и геометрия каркаса пленки совпадали с описанной ранее гео- метрией в Главе 2. Скругленные торцевые поверхности каркаса на рис. 7 не обозначены. В данной модели оси вращения корпуса и каркаса пленки па- раллельны и смещены относительно друг друга на расстояние s = 5 мм. Рабочей поверхностью для размещения биологического материала, как и в исходной модели, была выбрана внешняя поверхность каркаса. Таким образом, главным объектом математического моделирования являлась щель между корпусом и каркасом.
Рис. 7. Геометрия третьей перспективной модели – асимметричного ротационного биологического реактора.
а  вид спереди, б  вид сверху.
Далее постановка задачи (параметры рабочей среды, решаемые уравнения, начальные данные и т. д.) совпадала с постановкой в Главе 2 за исключением граничных условий. Исследовалось два способа генерации циклического пото- ка в асимметричном реакторе: вращением каркаса пленки и внешней стенки во- круг оси каркаса. Частоты вращения выбраны в диапазоне 0,05 < f < 0,233 Гц, поверхности вращались вокруг оси каркаса пленки. Далее в разделе описаны особенности дискретизации расчетной области. Дополнительно для сравнения были проведены расчеты течения на тех же частотах вращения для симметрич- ной модели (использовалась геометрия и расчетная сетка, описанная в Главе 2). В главе представлено подробное сравнение структуры течения в симмет- ричном и асимметричном биореакторах при вращении как каркаса пленки, так и корпуса (рис. 5 и 8), приведен анализ распределения механической нагрузки Рис. 8. Визуализация поля течения по проекции вектора скорости на плоскость сим- метрии в асимметричном реакторе при вращении внутреннего каркаса и стенки корпуса при частоте вращения f = 0,167 Гц. на рабочую поверхность. В асимметричном биореакторе касательное напряже- ние в окружном направлении меняется циклически, однако средние значения совпадают с симметричным случаем в пределах 5,5 % на всех исследуемых ча- стотах. Для асимметричной модели вычислялся размах колебаний, являющийся разностью между максимальным и минимальным значениями функции, отне- сенной к среднему значению функции, выраженный в процентах. Наибольший размах наблюдается в асимметричном реакторе при вращении корпуса, следо- вательно, данный вариант наиболее перспективен для циклического воздей- ствия потоком жидкости на клетки. Для касательного напряжения он составля- ет от 127 до 147 % при частоте вращения 0,05 < f < 0,233 Гц. Четвертая глава посвящена разработке метода оптической диагностики выращиваемой в ротационном биореакторе костной ткани. Дальнейшая опти- мизация биотехнологического процесса может быть связана с модернизацией реактора для постоянного, неинвазивного контроля состояния биоматериала в процессе культивирования. Подход выращивания костной ткани на тонких пленках делает возможным оптический контроль всех этапов биотехнологии методом ЛИФ-спектроскопии. Данный метод не требует сложной подготовки проб и его можно применять неинвазивно, в отличие от стандартных гистоло- гических методов. В главе описана экспериментальная установка, применяемая для регистра- ции спектров ЛИФ биологических образцов. Для возбуждения флуоресценции использовалась перестраиваемая лазерная система Vibrant (HE) 355 II + UV (Opotek Inc, США). Для регистрации спектров флуоресценции использовался монохроматор Acton SpectraPro SP2300 с матрицей Pixis 256 CCD (Princeton In- struments, США). Матрицы возбуждения–эмиссии регистрировались в диапа- зоне длин волн лазера 210–290 нм с шагом 10 нм. При изменении длины волны лазерного излучения регистрируемые спектры флуоресценции многокомпо- нентных образцов меняются, поскольку чистые флуорофоры обладают разными спектрами возбуждения. В отличие от отдельных спектров, матрицы – это дву- мерные наборы спектральных данных, которые содержат в себе дополнитель- ную информацию, что перспективно для статистического анализа. Ультрафио- летовый диапазон длин волн позволяет одновременно возбуждать флуоресцен- цию нескольких тканевых флуорофоров, включая белок коллаген, который вы- рабатывается в костной ткани. Таким образом, по изменению в концентрации коллагена можно судить о нарастании костной ткани. Однако регистрируемые спектры костной ткани многокомпонентны, и определить вклад коллагена в них – не простая задача. Для определения спектров чистых флуорофоров в матрицах оптически тонких образцов костных тканей был предложен новый алгоритм последова- тельных приближений на основе метода главных компонент (МГК). Для вы- числения векторов главных компонент был взят алгоритм NIPALS (non-linear iterative partial least squares) в тензорном виде. Для того чтобы вычислить спек- тры основных флуорофоров, стандартный алгоритм МГК был модифицирован. В разделе приведено подробное описание этапов вычисления нового алгоритма, отличия от стандартного алгоритма и особенности его работы. В новом алго- ритме число главных компонент фиксировалось и задавалось изначально, исхо- дя из предположения о составе образца. Затем спектры главных компонент ите- ративно уточнялись методом последовательных приближений. Такой подход использует неучтенные ранее данные в остатке и позволяет постепенно перей- ти от знакопеременных главных компонент к положительно определённым. В результате алгоритм рассчитывает спектры возбуждения и флуоресценции чистых флуорофоров и их весовые коэффициенты, пропорциональные кон- центрации. В главе приведены примеры работы алгоритма на тестовых наборах спек- тральных данных, показан процесс уточнения спектров главных компонент и приведено сравнение вычисленных главных компонент с чистыми спектрами. Приведено сравнение результатов работы нового алгоритма с другими извест- ными методами восстановления чистых спектров: алгоритмом MCR-ALS (mul- tivariate curve resolution-alternating least squares) и подходом составления линей- ных комбинаций из главных компонент. Сравнение алгоритмов проводилось на модельных наборах трехкомпонентных матриц, сгенерированных случайно с различными условиями пересечения чистых спектров флуоресценции. Сравне- ние показало, что для пересечения спектров, не удовлетворяющего условиям теорем о разрешимости спектров (когда один спектр полностью накладывается на другой), только новый модифицированный МГК восстанавливает спектры с высокой точностью, благодаря наличию коррелирующих данных в матрицах. Далее в главе приведены результаты тестирования нового алгоритма на реаль- ных спектральных данных оптически прозрачных двух- и трехкомпонентных смесей водных растворов флуоресцентных красителей. Для этих данных алго- ритм также показал хорошую точность восстановления чистых спектров. Было проведено исследование фотообесцвечивания биологических образ- цов под воздействием ультрафиолетового излучения для оценки его влияния на анализ спектральных данных. Результаты показали, что быстрее всего выцвета- ние происходит в коротковолновом диапазоне на длинах волн 210–240 нм. Од- нако, поскольку во время измерения спектров для матриц возбуждения – эмис- сии на длинах волн 210–230 нм интенсивность флуоресценции может упасть на 3 %, можно заключить, что фотообесцвечивание незначительно влияет на фор- му матриц возбуждения – эмиссии и последующий анализ данных. Далее в главе описано применение нового алгоритма для анализа костной ткани, выращенной в биореакторе на тонкой полимерной пленке. Представлено описание типов исследуемых образцов костных тканей и полимерных пленок, а также особенностей их спектральных данных. Образцы пленок, заселенные стволовыми клетками, культивировали в динамических условиях ротационного биореактора исходной конструкции и в статических условиях культурального планшета в качестве контроля. Для всех групп в процессе культивирования в питательную среду вводили индукторы, стимулирующие превращение стволо- вых клеток в клетки кости. В биореакторе биоматериал культивировался при частоте вращения 0,133 Гц, что соответствовало среднему касательному напря- жению на рабочей поверхности 8 мПа. На второй, третьей и пятой неделе куль- тивирования из реактора и планшета вынимались образцы для исследования методом ЛИФ и гистологического анализа. Анализ спектральных данных показал, что все зарегистрированные спек- тры состоят из четырех главных компонент (рис. 9). По максимумам флуорес- ценции и характеру спектров возбуждения главные компоненты соответствуют флуоресцирующим аминокислотам тирозину (1), триптофану (2), белку колла- гену (3) и флуоресцирующим структурам полимера поликапролактона (4), из которого состоят пленки. Было показано, что вклад компоненты, связанной с коллагеном, увеличивается в спектрах образцов, культивируемых в исходном Рис. 9. Спектры флуоресценции (а) и возбуждения (б) главных компонент в образцах костных тканей, выращенных на пленках. 19 Рис. 10. Отношение весовых коэффициентов третьей и четвертой главных компонент для исследуемых типов образцов пленок. СК3, СК5 – статическое культивирование после трех и пяти недель, ДК3, ДК5 – динамиче- ское культивирование после трех и пяти недель. ротационном биореакторе, по сравнению с образцами, выращенными статиче- ски в культуральном планшете (рис. 10). При увеличении времени культивиро- вания до пяти недель данное отношение продолжает возрастать, что говорит о росте биологического материала на пленке. Поскольку гистологическое иссле- дование также показало рост уровня коллагена на 53 % при трехнедельном ди- намическом культивировании по сравнению с образцами контроля и увеличе- ние плотности клеток на 36 %, можно констатировать, что к третьей неделе культура стволовых клеток в динамических условиях трансформируется в костный материал. Таким образом, метод ЛИФ можно применять для диагно- стики роста костной ткани в процессе культивирования в ротационном биоре- акторе. В заключении сформулированы основные выводы диссертации. Моделирование течения жидкости в полости ротационного биореактора исходно предложенной конструкции позволило визуализировать структуру те- чения и показать наличие вихрей Тейлора, которые вызывают неравномерность распределения механической нагрузки на биоматериал. Моделирование показа- ло, что в новом биореакторе на рабочей поверхности при частотах вращения от 0,083 до 0,233 Гц создается среднее касательное напряжение потока жидкости в диапазоне от 4 до 17 мПа, которое подходит для стимуляции преобразования мезенхимальных стволовых клеток в клетки кости. Медицинские эксперименты позволили найти оптимальную частоту вращения каркаса пленки, равную 0,133 Гц, что соответствовало среднему касательному напряжению 8 мПа. При данных условиях в новом биореакторе были успешно выращены образцы кост- ной ткани. Были определены перспективные изменения, которые можно внести в ис- ходную конструкцию биореактора ротационного типа для дальнейшей оптими- зации технологии. Вторая представленная перспективная модель с вращаю- щимся корпусом позволяет воздействовать на выращиваемые клетки равномер- ным потоком без вихрей. Средние касательные напряжения на рабочей поверх- ности составляют от 5 до 20 мПа при частотах вращения от 0,083 до 0,233 Гц. На основе конструкции ротационного биореактора можно реализовывать цик- лическую нагрузку на биоматериал через смещение оси вращения (третья пер- спективная модель). При смещении каркаса на 5 мм и вращении корпуса в диа- пазоне частот вращения 0,05–0,233 Гц размах колебаний касательного напря- жения составляет от 127 до 147 %. Метод ЛИФ можно применять для диагностики нарастания костной ткани на тонкой пленке в новом биореакторе. Для анализа спектральных данных был разработан новый алгоритм на основе МГК. Алгоритм позволяет оценивать число флуоресцирующих компонент, а также с высокой точностью рассчиты- вать чистые спектры возбуждения, флуоресценции и их весовые коэффициен- ты. Алгоритм не использует априорную информацию о спектрах и может быть применен при исследовании образцов с неизвестным составом. В отличие от алгоритма MCR-ALS и подхода составления узких комбинаций из главных компонент, новый алгоритм с высокой точностью восстанавливает чистые спектры в случае, не удовлетворяющем условиям теорем о разрешимости спектров. Новый алгоритм позволил оценить количество основных флуоресцирую- щих компонент в образцах костного материала, выращенных в ротационном биореакторе исходной конструкции, и рассчитать их спектры возбуждения и флуоресценции. Было установлено, что в спектры флуоресценции костной тка- ни на пленках вносят вклад аминокислоты тирозин и триптофан, коллаген и флуоресцирующие структуры поликапролактона. Показано, что вклад компо- ненты, связанной с коллагеном, увеличивается для образцов, культивируемых в ротационном биореакторе, по сравнению со статическими условиями культу- рального планшета. Гистологическое исследование образцов подтвердило фор- мирование костной ткани. Данные результаты демонстрируют эффективность механической стиму- ляции стволовых клеток потоком жидкости для образования костной ткани, перспективность применения биологических реакторов ротационного типа для тканевой инженерии и лазерной флуоресцентной спектроскопии для диагно- стики растущей ткани.