Фармако-токсикологическая оценка комплексного препарата с гепатопротекторной активностью

Исследования проводились с 2017 года по 2020 год в Федеральном государственном бюджетном учреждении высшего образования «Санкт-Петербургский государственный университет ветеринарной медицины», кафедра токсикологии и фармакологии, а также в сельскохозяйственном производственном кооперативе Колхоза «Ленинский путь», Псковская обл., Пушкиногородский р-н.
Практическая основа данной научно-исследовательской работы состоит из детального описания механизма создания, а также выявления фармакологических и токсикологических функций гепатозащитного препарата «Гепатон-вет», лечебной результативности указанного лекарственного средства, касаемой предупреждения и терапии гепатозов животных (нетелей).
Центральным предметом изучения выступает «Гепатон-вет» (рабочее название – Гепатон) – многофункциональное ветеринарное лекарственное средство, которое имеет консистенцию эмульсии, светло-коричневый оттенок, а также особые вкусовые и обонятельные характеристики. Компонентами данного лекарственного средства выступают: метионин, урсодезоксихолиевая кислота (УДХК), Витамин Е (токоферола ацетат), экстракт расторопши пятнистой, сироп шиповника.
В экспериментальном подходе применялись клинические, токсико-фармакологические, количественные химические (гравиметрия), биохимические, морфологические, а также иные методологии анализа.
Для доклинических исследований использовались белые нелинейные крысы из питомника РАМН «Рапполово» Ленинградской области возрастом от 3 до 5 месяцев и массой тела 160– 220 г., нелинейные мыши возрастом от 3 до 5 месяцев и массой тела 17– 25 г., а также морские свинки и кролики.
Перед исследованием все животные были подвергнуты профилактическому карантинированию. Длительность карантина (акклиматизационного периода) для всех животных составляла 7 дней. В течение карантина проводили ежедневный осмотр каждого животного (поведение и общее состояние), дважды в день животных наблюдали в клетках (заболеваемость и смертность). Перед началом исследования животные, отвечающие критериям включения в эксперимент, были распределены в группы по принципу аналогов.
В комнате содержания животных поддерживались следующие условия окружающей среды: температура окружающего воздуха 18-24 градусов Цельсия; относительная влажность 50-60%; автоматическая смена 12-ти часового светового периода (06.00-18.00 – день, 18.00- 06.00 –ночь); 100% вентилирование без рециркуляции со сменой воздуха 7-12 объемов комнаты в час.
Животных содержали в поликарбонатных клетках на подстиле площадью 2150 см2. В качестве подстилки использовались опилки деревьев нехвойных пород, стерилизованные в сухожаровом шкафу. Для кормления животных использовался комбикорм полнорационный для лабораторных животных ЛБК-120 (Тосненский комбикормовый завод), соответствующий ГОСТ 34566-2019. Профильтрованная водопроводная вода давалась в стандартных автоклавированных питьевых бутылочках.
Доклинический анализ данного лекарственного средства осуществлялся в виварии Федерального государственного бюджетного учреждения высшего образования «Санкт- Петербургского государственного университет ветеринарной медицины» согласно «Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях», принятой в Страсбурге в 1987 году.
Непосредственно клинические исследования осуществлялись на крупном рогатом скоте на базе сельскохозяйственного производственного кооператива Колхоза «Ленинский путь», Псковская обл., Пушкиногородский р-н.
Анализ токсикологических свойств лекарственного средства «Гепатон-вет». Общие токсикологические параметры лекарственного средства были проанализированы согласно
«Методическим рекомендациям по токсико-экологической оценке лекарственных средств, применяемых в ветеринарии», установленным отделом ветеринарии Российской академии сельскохозяйственных наук в 1998 году, а также «Научно-методологическими аспектами исследования токсических свойств фармакологических лекарственных средств для животных», разработанными Дорожкиным В.И. и Смирновым А.М. в 2008 году.
Острая токсичность. Анализ токсикометрии указанного лекарственного средства был произведен экспериментально (интрагастральное введение подопытным грызунам). Критерии способности препарата вызывать гибель при однократном интрагастральном введении были оценены с помощью методики Кербера, разработанной в 1931 году. Лекарственное средство единожды вводилось внутрижелудочно лабораторным мышам и крысам посредством зонда с атравматичным концом в максимально возможных физиологических дохах.
Подострая и хроническая токсичность. Данный критерий выявляли в соответствии с рекомендациями по токсико-фармакологическому анализу новейших лекарственных средств для предупреждения и терапии неинфекционных заболеваний (Воронежский филиал Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института патологии, фармакологии и терапии, 1998 год). Параметрами анализа указанного критерия на грызунах выступали: общие (клинические) показатели здоровья, количество погибших животных, масса грызунов на протяжении эксперимента, биохимические и морфологические исследования крови/., Кроме того, произведен анализ температуры тела (ректальные пробы), анализ состояния зрения, анализ физиологических показателей (методологии внезапной активизации двигательного аппарата, «открытого поля», анализ комплексного функционала центральной нервной системы, скачки АД, ЭКГ), несколько нагрузочных проб (например, с применением фенолсульфофталеина секреции почек, а также гексобарбитала для проверки детоксицирующей функции печени).
Активность работы почек наблюдалась на подопытных крысах по объему мочи, выделяемой за сутки, по биохимическому составу мочи, а также по ее физико-химическим параметрам, которые состояли из анализа прозрачности, оттенка, запаха, степени густоты, а также объема по отношению к выявленным параметрам животных контрольной группы. Количество белковых элементов выявляли посредством процесса закипания с 20% 2-гидрокси- 5-сульфобензойной кислоты, пробами Фуше и Адлера выявляли количество пигментов крови и желчи, а пробой Гайнса – количество углеводных соединений.
Нарушения эмбрионального развития под воздействием тератогенных факторов выявлялись в соответствии с «Методическими указаниями по изучению репродуктивной токсичности фармакологических веществ».
У морских свинок проведением эпикутанной сенсибилизации выявлялось аллергизирующее воздействие (гиперчувствительность к компонентам).
Гепатопротекторные свойства лекарственного средства «Гепатон-вет» выявлялся на различных типах прогрессирования заболеваний у животных, занятых в лабораторных экспериментах (n=50). Для экспериментальных проявления нарушений работы печени применялся дихлорэтан (крысам внутрижелудочно вводили один миллилитр раствора данного вещества (на голову) ежедневно в течение недели).
Анализ фармакологических и терапевтических свойств лекарственного «Гепатон-вет» осуществлялся посредством наблюдения за его воздействием на биохимические показатели крови и клинический статус животных, у которых были выявлены патологии системы метаболизма и заболевания печени (оценку проводили на нетелях).
Эксперименты в животноводческих хозяйствах осуществлялись согласно условиям, обязательным к исполнению при опытах с подборкой животных-аналогов, организации контрольных мер, наблюдению за идентичными условиями кормления и ухода за особями во время осуществления экспериментальной деятельности и сбора итоговых показателей.
Результативность лечения выявлялась по итогам наблюдений за клиническим состоянием нетелей, по биохимическим показателям крови, а также по ультразвуковому исследованию органа контрольных и экспериментальных особей.
Биохимические исследования в лабораторных условиях осуществлялась посредством применения автоматизированного аппарата «Vitalab Flexor Junior».
Если затрагивать вопросы прибыльности (экономической выгоды), то показатели вычислялись согласно «Методическим рекомендациям по определению общего экономического эффекта от использования результатов научно-исследовательских и опытно- конструкторских работ в Агропромышленном комплексе» от 2007 года.
Выявленные в процессе экспериментов количественные показатели проходили обработку с применением комплекса ПО «Statistica 6.0». Данные обозначаются как средний показатель «X», стандартная погрешность среднего показателя – «m». Достоверность различий между сериями выявляли посредством t- критерия Стьюдента.
2.2.Результаты исследования
2.2.1.Фармацевтическая разработка нового лекарственного средства
Исходя из агрегатного состояния подобранных компонентов, их физико-химических свойств и приоритетной формой дачи целесообразнее всего изготовить данную композицию в виде гетерогенной дисперсной системы (эмульсии) типа масло/вода, где масло расторопши выступает в роли эмульгатора, сироп шиповника и токоферола ацетат- липофильные основы эмульсии, метионин- растворимый компонент, урсодезоксихолиевая кислота- нерастворимое вещество, добавленное в препарат путём диспергирования.
Учитывая вышеизложенные факты, разную степень растворимости компонентов препарата и многокомпонентность задуманного средства были создана экспериментальная композиция гепатопротектора со следующим соотношением компонентов: урсодезоксихолиевая кислота- 1,5 г, масло расторопши пятнистой-51 г, метионин-2,25 г, токоферола ацетат-3000 МЕ, сироп шиповника- до 100 мл.
Получившаяся лекарственная форма соответствует ОФС.1.4.1.0017.15 Эмульсии [58]. Препарат представляет собой эмульсию темного цвета со светло-коричневым оттенком, со специфическим травяным запахом.
Согласно ОФС.1.4.1.0017.15 Эмульсии единственным обязательным нормативным показателем для пероральных эмульсий является pH препарата.
Измерение водородного показателя экспериментальных композиций проводили портативным высокоточным pH – метром ИВА-ТЕСТ с автоматической калибровкой. Значение pH испытуемого образца- 5,32 (слабокислая среда).
2.2.2. Токсикологическая оценка препарата «Гепатон-вет»
2.2.2.1. Изучение острой токсичности препарата
Под острой токсичностью понимаются возможные негативные эффекты от приёма фармакологической субстанции, которые отмечаются после единичного или повторного (в течение суток) применения.
Максимальная (исходя из физиологической потребности животных в жидкости) доза гепатопротектора не вызвала гибели животных. В ходе эксперимента установлено, что достоверные различия в динамике массы тела между группами опытных и контрольных животных отсутствуют.
В результате исследований LD50 и LD100 для препарата «Гепатон-вет» установлены не было, препарат классифицируется как малотоксичный, относится к четвёртому классу опасности по ГОСТ 12.1.007- 76 «Вредные вещества».
2.2.2.2. Изучение подострой и хронической токсичности препарата
Исследования на субхроническую и хроническую токсичность проводились с целью установления возможных негативных эффектов, которые возникают вследствие длительного использования лекарственного препарата.
Препарат «Гепатон-вет» при введении внутрь в течение 180 дней не вызывает у крыс летального исхода. Кроме того, принятие животными препарата не оказывает влияния на динамику роста массы и интенсивность приёма корма.
Функцию по обезвреживанию чужеродных веществ печени оценивали по продолжительности гексеналового сна. Данные представлены в таблице 1.
Таблица 1. Влияние препарата «Гепатон-вет» на продолжительность гексеналового сна у белых крыс (n=30)
* достоверное отличие от контроля (р< 0.05). Из данных представленной таблицы следует, что исследуемое гепатопротекторное средство уменьшает продолжительность гексеналового сна через 90 и 180 дней после его применения в опытной группе по сравнению с группой контрольных крыс, что косвенно указывает на активацию детоксицирующей функции печени под действием лекарственной формы препарата «Гепатон-вет». В ходе исследования оценивалось влияние препарата на параметры функционального состояния почек. Существенных изменений со стороны выделительной функции почек при введении препарата «Гепатон-вет» белым крысам не наблюдалось. Достоверных изменений в структуре поведения животных в процессе исследования субхронической и хронической токсичности из всех экспериментальных групп не наблюдалось. Введение препарата «Гепатон-вет» в течение 180 суток ни в одной из исследованных доз не влияло на порог возбудимости крыс. Исследуемый нами препарат «Гепатон-вет» не оказывает существенного влияние на ряд функций нервной системы (в частности на подпороговую суммацию) и ряд показателей функционирования сердечно-сосудистой системы (ЧСС, АД и ряд показателей ЭКГ). Гематологические исследования крови подопытных животных проводились до начала введения препарата и через 90 и 180 дней введения. Результаты исследования свидетельствуют о том, что в костном мозге крыс, получавших препарата «Гепатон-вет», происходило умеренное, но статистически достоверное увеличение общего количества клеток, а также клеток эритроцитарного ростка, лимфоцитов и мегакариоцитов по сравнению с таковыми показателями животных интактных контрольных групп. Патологических сдвигов костномозгового кроветворения не отмечалось. Проведенными экспериментальными данными не установлено токсическое влияние препарата «Гепатон-вет» на течение беременности и роды у лабораторных крыс (таблица 2). Сроки Продолжительность гексеналового сна (мин, М ±m) исследования Интактные Контроль Препарат «Гепатон- вет» в дозе 0.5 мл/кг Препарат «Гепатон- вет» в дозе 10мл/кг ♂ ♀ ♂ ♀ ♂ ♀ ♂ ♀ До начала эксперимента 28,1 ±1,6 27,2±2,3 26,2±2,4 25,6±1,8 32,2±2,5* 28,6±1,7* 31,3±3,2* 29,2±2,7* Через 90 дней 30,1±1,7 29,4±2,3 25,2±2,0 27,1±2,3 21,2±1,3* 21,5±1,9* 20,9±1,5* 22,1±1,7* Через 180 дней 26,1±2,4 31,3±3,2 28,8±2,5 29,0±2,1 20,4±1,8* 19,0±1,1* 19,6±1,3* 20,8±1,4* Таблица 2. Параметры оценки эмбриотоксического и тератогенного действия препарата «Гепатон-вет» (М±m; n=10) Параметры Контроль Опыт Эмбриотоксическое действие Среднее количество жёлтых тел на одну самку 10,3±0,8 10,4±0,4 Среднее количество мест имплантации на одну самку 10,1±0,5 10,2±0,3 Среднее количество живых эмбрионов на одну самку 9,6±0,3 9,5±0,5 Среднее количество нежизнеспособных эмбрионов на одну самку 0,4±0,2 0,4±0,3 Смертность эмбрионов, % 7,1±0,3 6,8±0,5 Гибель эмбрионов после имплантации, % 59,7±0,6 60,2±0,3 Гибель эмбрионов до имплантации, % 34,6±0,2 32,3±0,3 Выживаемость, % 91,1±0,2 92,3±0,4 Средняя масса одного эмбриона, мг 882,6±14,4 879,8±18,4 Средний размер тела эмбриона, мм 24,9±0,1 24,7±0,3 Тератогенное действие Число новорожденных на самку 9,3±0,8 9,4±0,7 Средний вес, мг 6014,5±112,3 6018,2±116,3 Средняя длина туловища, мм 44,3±0,4 43,3±0,9 Различные аномалии и врожденные уродства Не выявлены Не выявлены Значимых различий в плодовитости крыс опытной и контрольной групп установлено не было. Естественные роды у самок наступали на 22-24 дни периода плодоношения. Крысята рождались живыми, отклонения в развитии, а также внешние аномалии в ходе осмотра не обнаружены. Существенных различий в размерах и реакции на внешние раздражители между крысятами опытной и контрольной групп установлено не было. Следовательно, препарат «Гепатон-вет» не оказывает эмбриотоксическое и тератогенное действие на организм опытных животных. 2.2.3. Изучение аллергизирующих свойств исследуемого препарата Оценку аллергизирующего действия препарата «Гепатон-вет» проводили путем провокационных кожных проб на морских свинках методом накожных аппликаций. В течение всего периода опыта за животными велись наблюдения, проводилось измерение толщины кожной складки на месте нанесения препарата, а также определялась местная температура кожи. Результатами исследования сенсибилизирующего действия препарата «Гепатон-вет» как в период изучения препарата, так и после его прекращения, каких-либо изменений в клиническом статусе животных и на месте кожных аппликаций выявлено не было, упругость, эластичность и подвижность кожи животных не изменялась. При пальпации мест нанесения препарата болевая реакция не была выявлена, патологические изменения кожи отсутствовали. Исходя из результатов клинических испытаний, ответная реакция была оценена как «отрицательная». Следовательно, препарат «Гепатон-вет» не обладает потенциальной аллергенной активностью. 2.2.4. Гепатозащитная активность исследуемого препарата Моделирования токсического гепатита проводилось согласно методики по Хабриеву Р.У. с использованием дихлорэтана, препараты сравнения- «Эссенциале» и «Легалон». Количество животных в каждой группе (интактные, подвергшиеся отравлению дихлорэтаном, дихлорэтан + «Гепатон-вет», дихлорэтан + «Эссенциале», дихлорэтан + «Легалон») составляло 10 голов. Клиническая картина в группе без лечения характеризовалась гиподинамией, снижением аппетита (уменьшение потребления корма и воды), заторможенностью, взъерошенностью шерсти, неопрятностью. Наблюдалась некоторая желтушность слизистых оболочек и склер, пальпаторно можно было определить увеличение размеров печени. При оценке лечения препаратом «Гепатон-вет» и препаратами сравнения показано, что все препараты уменьшают признаки поражения печени, однако при применении «Гепатон-вет» большинство исследованных биохимических показателей возвращаются к физиологической норме. На 21-е сутки после введения токсикантов производилось биохимическоое исследование крови, при котором учитывались показатели антиоксидантной системы (диеновых коньюгатов (ДК), кетодиенов (КД) и малонового диальдегида (МДА), а также уровня эндогенной интоксикации (по содержанию МСМ). Результаты указаны в таблице 3. Таблица 3. Влияние препарата «Гепатон» на степень липопероксидации при интоксикации дихлорэтаном (М±m; n=10) Показатели Группы животных Интактная Опытная (дихлорэтан + «Гепатон») Негативный контроль (Дихлорэтан) ДК(232) ,опт.ед Начало опыта 0,16±0,02 0,56±0,03 0,73 ± 0,02 Конец опыта 0,22±0,03* 0,23±0,02* 0,47±0,02 КД(273) ,опт.ед Начало опыта 0,14±0,02 0,28±0,04 0,33±0,02 Конец опыта 0,18±0,03* 0,16±0,02 0,27±0,03 МДА(537), мкМ/л Начало опыта 1,57±0,09 2,01±0,02 2,44±0,03 Конец опыта 1,55±0,08 1,71±0,11* 2,27±0,11 * достоверное отличие от контроля (р< 0.05). Исходя из полученных результатов, можно сделать вывод, что использование препарата «Гепатон-вет» при моделировании острого токсического гепатита позволило восстановить нарушенный гомеостаз организма лабораторных животных, структуру и целостность мембран гепатоцитов, ингибировать процессы перекисного окисления липидов как одного из звеньев патогенеза гепатитов, стимулировать антиоксидантную защиту и мощность эндогенной антиокислительной системы организма, желчеобразование и желчевыделение, а также активизировать репаративные процессы печеночной ткани на клеточном и внутриклеточном уровнях. 2.2.5. Фармакологические свойства препарата «Гепатон-вет» Цель настоящих исследований - установление специфической активности, и лечебного эффекта препарата «Гепатон-вет». Изучение фармакологической активности и лечебных свойств препарата «Гепатон-вет» проведено в СПК «Колхоз Ленинский путь» Пушкиногорского района Псковской области на нетелях 3-4 летнего возраста. Предварительно было проведено предварительное обследование животных для оценки их физиологического статуса и возможных нарушений функционального состояния работы печени. В ходе проведения скрининговых исследований были выявлены животные (n=20) c морфо-функциональными нарушениями печени по типу жировой дистрофии. Диагноз был поставлен на основании клинико-биохимических симптомов Применение препарата «Гепатон-вет» в течение 21 дня способствовало нормализации показателей белкового, жирового и пигментного обмена, являющихся индикатором морфо- функционального состояния печени, что свидетельствует о наличии у исследуемого препарата гепатопротективных свойств. Расчет экономической эффективности был проведен по результатам использования препарата «Гепатон-вет» для лечения дистрофий печени по жировому типу у нетелей на базе СПК «Колхоз Ленинский путь» Пушкиногорского района Псковской области. Для экономических расчетов была выбрана оптимальная схема терапии препаратом: «Гепатон-вет» – внутрь в дозе 100 мл 1 раз в день в течение 21 дня. При расчетах использовали курс лекций «Экономическая эффективность применения современных средств в животноводстве, птицеводстве и звероводстве» (И.Н. Никитин, 2010). экономический эффект от применения препарата при лечении гепатоза у коров составил 10,2 руб. на один рубль затрат. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Данная работа посвящена разработке и исследованию фармакотоксикологических и терапевтических свойств нового комплексного гепатопротекторного препарата «Гепатон-вет», разработанного на базе кафедры фармакологии и токсикологии ФГБОУ ВО «СПбГУВМ, в состав, которого входят масло расторопши, урсодезоксихолиевая кислота, метионин, токоферола ацетат, сироп шиповника. В результате нами были сделаны следующие выводы: 1) «Гепатон-вет» – лекарственный препарат с уникальным интегральным фармакологическим ответом, включающим в себя антитоксическое, антиоксидантное и регенерирующее действие, представленный в форме грубодисперсной системы (эмульсии) светло-коричневого цвета со специфическим травяным запахом. 2) Токсикометрическими показателями «Гепатон-вета», проведенными на различных видах лабораторных животных, установлено, что препарат относится к 4 классу опасности – вещества малоопасные (ГОСТ 12.1.007-76 «Вредные вещества»). Длительное введение лабораторным животным исследуемого препарата не выявило патологических изменений основных системах органов. Применение препарата «Гепатон-вет» не оказывает негативного влияния на функцию почек и мочевыводящих путей у лабораторных животных. Препарат не обладает раздражающими, аллергизирующими и кожно-резорбтивными свойствами, не проявляет эмбриотоксического и тератогенного действия, не влияет на течение беременности и роды лабораторных животных. 3) Гепатозащитная активность препарата, изученная на моделях острого токсического экспериментального гепатита, выявила выраженное гепатопротективное и антиоксидантное действие препарата организм животных, что подтверждалось результатами гистологическими исследованиями печени крыс, у которых отмечались регенерационные процессы паренхимы печени. 4) Фармакологическая и лечебная активность «Гепатон-вета», изученная на нетелях, показала что «Гепатон-вет» терапевтической дозе способен купировать развитие дистрофии печени по жировому типу, а так же нормализует белковый, жировой и пигментный обмен. Экономическая эффективность от применения препарата при терапии жирового гепатоза у коров составила 10,2 рубля на один рубль затрат. Исходя из этого, можно сделать вывод, что использование нового гепатопротекторного препарата не только обоснованно с точки зрения эффективности ветеринарных мероприятий, но и экономически выгодно. ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ Ветеринарной практике и животноводству рекомендуется разработанный и апробированный препарат с гепатопротекторной активность «Гепатон-вет» (Патент No 2742414 C1 Российская Федерация, МПК A61K 31/198, A61K 31/355, A61K 31/575. Препарат комплексный с гепатопротекторной активностью для крупного рогатого скота : No 2020120624 : заявл. 16.06.2020 : опубл. 05.02.2021 / В. С. Понамарев, Н. Л. Андреева, О. С. Попова, В. А. Барышев) для лечения жирового гепатоза. Препарат применяется для крупного рогатого скота в дозе 100 мл/голову в течение 21 дня. ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Полученные данные позволяют в дальнейшем проводить широкие производственные испытания исследуемого препарата других видах продуктивных и непродуктивных животных, а также исследовать лечебный эффект в отношении различных патологий гепатобилиарного тракта. Перспективным является также дальнейшее совершенствование методов прижизненной диагностики гепатопатий различного генеза с дальнейшей высокоэффективной фармакокоррекцией обсуждаемых патологий. Дальнейшее изучение механизмов действия гепатопротекторных средств позволит не только моделировать новые соединения с уникальным интегральным фармакологическим ответом, но и потенцировать уже известные лекарственные препараты