Фармакологические свойства новых производных 2-оксиндола

В первой главе показана проблематика вопроса фармакотерапии и развития
сахарного диабета 2 типа. Описаны основные характерные для 2-оксиндольного
скаффолда фармакологические свойства. Выявлено вероятное влияние изучаемых
производных на активность киназы гликогенсинтазы типа 3 бета и альфа-глюкозидазу.
Для данных ферментов систематизированы основные функции в организме человека и
эффекты, вызываемые их ингибиторами.
Во второй главе диссертации описаны материалы и методы работы. Изучено 27
новых производных под лабораторными шифрами «K» и «OIP», 20 из которых
относится к производным 3-арилиден-2-оксиндола, 7 соединений – к производным 3,3-
дизамещённых-2-оксиндолов*.
3-арилиден-2-оксиндолы3,3-дизамещённые-2-оксиндолы

Описан in vitro поиск ингибиторов киназы гликогенсинтазы типа 3 в методиках
изучения влияния на активность человеческого рекомбинантного фермента и синтез
оксида азота перитонеальными макрофагами мышей под влиянием липополисахарида, а
также поиск ингибиторов альфа-глюкозидазы в методике изучения влияния на
активность альфа-гюкозидазы S. cerevisiae. Определена зависимость активности
изучаемых соединений от химической структуры. Для выявленных соединений-лидеров
построены модели связывания с ферментами, определены активные центры и ключевые
аминокислоты, а также определена их цитотоксичность на первичных клеточных линиях
животных в МТТ- и ЛДГ-тестах, оценено лекарственное подобие, основные
фармакокинетические и токсикологические свойства in silico.
Для соединений, ингибирующих активность GSK3B, изучена их
антидиабетическая активность в методиках определения влияния на утилизацию
глюкозы фибробластами крыс, на уровень постпрандиальной гипергликемии в
пероральном тесте толерантности к глюкозе при однократном введении и на показатели
углеводного обмена, воспалительный статус и поведенческую активность животных с
моделированным сахарным диабетом 2 типа; противовоспалительная активность в
методиках изучения влияния на липополисахаридиндуцированный отек задней лапы
крыс,активацию,фагоцитарнуюактивностьизимозанопосредованную
хемилюминисценцию перитонеальных макрофагов; антиагрегантная активность in vitro
с использованием АДФ и коллагена в качестве индукторов агрегации тромбоцитов;
антитромботическая активность в методике изучения влияния соединений на время
окклюзии сонной артерии индуцированного аппликацией 50%-го раствора хлорида
железа (III) интактным крысам.

*
Выражаем глубокую признательность сотруднику кафедры медицинской химии
и тонкого органического синтеза Московского государственного университета имени М.
В. Ломоносова (МГУ) доценту, канд. хим. наук Н. А. Лозинской за синтез и
предоставление субстанций веществ для данной работы.
Соединение, ингибирующее альфа-глюкозидазу, изучено на наличиее
антигипергликемической активности в пероральном тесте толерантности к дисахаридам
(млаьтоза, сахароза) и моносахаридам (глюкоза) на интактных крысах.
В третьей главе приведены результаты in vitro исследования влияния 16 новых
производных 2-оксиндола на активность киназы гликогенсинтазы типа 3 бета человека.
Выявлено одно производное (К-167), оказывающее большее ингибирующее GSK3B
действие в конечной концентрации 10 мкМ, чем вещество сравнения SB-21673; 4
соединения проявили активность выше 50% (К-165, К-167, К-248, OIP-NO2-2). Вещество
К-167 (IC50 4,2 нМ) в два раза превосходит по активности вещество сравнения (IC50 8,4
нМ).
% ингибирования GSK3B

100SB-216763
IC508,4 нМ
80Соединение K-167
IC504,2 нМ
Соединение K-165
40IC50 155,4 нМ

20Соединение K-248
IC50 4343,0 нМ
-11-10-9-8-7-6-5-4-3 C, lg(M)

Рисунок 1. Влияние соединений K-167, K-165, K-248 и SB-216763 в зависимости от
концентрации на активность GSK3B

В предварительно проведенных исследованиях по изучению влияния на
липополисахаридиндуцированный синтез оксида азота перитонеальными макрофагами
мышей выявлено соединение К-248, оказывающее наибольший противовоспалительный
эффект в ряду исследованных производных 2-оксиндола (IC50 8,78 мкМ).
Липополисахарид является специфическим активатором Tlr4 рецепторов. GSK3B
задействована как в Myd88-зависимом (Tlr4/Myd88/IRAK/TRAF6/TAK1/…/GSK3B), так
и в Myd88-независимом (Tlr4/TRIF/TRAF3/…/GSK3B) сигнальном каскаде (Beurel, Jope,
2009), в связи с чем данная методика может быть использована для поиска ингибиторов
GSK3B, способных проникать внутрь клеток.
Проведен анализ зависимости ингибирующей активности от структуры новых
производных 2-оксиндола. Выявлено, что производные 3-арилиден-2-оксиндола
оказались более перспективными и активными в сравнении с 3,3-дизамещенными-2-
оксиндолами. Возможным объяснением служит наличие ароматического радикала в
положении С3 у производных 3-арилиден-2-оксиндола, в связи с чем образуется
расширенная система π-π сопряжения, электронные системы находятся в одной
плоскости, образуя плоский σ-скелет. При анализе заместителей в положении С3 (R1)
показано, что наличие шестичленного ароматического цикла с гетероатомом в орто-
положении или гидроксильной группой в пара-положении повышало ингибирующую
GSK3B активность.
Вещества К-167 и К-248 были выбраны для углубленного изучения
фармакологических свойств.
Соединение К-167. Проведено in silico исследование механизма действия
вещества, обнаружено, что взаимодействие происходит в АТФ-связывающем сайте
фермента. По данным (An и др., 2010) установлено, что такое же взаимодействие
характерно для вещества сравнения. Выявлены ключевые аминокислоты,
обуславливающие взаимодействие изучаемого соединения, и вещества сравнения с
активным центром фермента: VAL70, ALA83, CYS199 и LEU188.

Рисунок2. Межмолекулярные
взаимодействия соединения К-167
и АТФ-связывающего центра GSK3B

Исследована цитотоксичность, на перитонеальных макрофагах мышей
производное К-167 не вызывало гибель клеток вплоть до конечной концентрации 7
мкМ, при этом в концентрации 50 мкМ наблюдалась значительная токсичность; в
концентрации 20 мкМ у линии неонатальных фибробластов сердца крыс
цитотоксический эффект отсутствовал.
Вещество К-167 улучшает захват глюкозы из среды неонатальными
фибробластами сердца крыс на 237,80 ± 27,82%. Выявленное влияние на захват глюкозы
быстро пролиферирующими клетками подтверждает предположение о наличии
антидиабетического действия.
Активность в наномолярном диапазоне концентраций при цитотоксичности в
микромолярном диапазоне позволяет сделать вывод о широком терапевтическом
индексе вещества.
под кривой “Глюкоза-Время”
% Снижения площади

30Рисунок 3. Влияние соединения K-167
(10, 20 и 30 мг/кг) и вилдаглиптина (10
мг/кг) на площадь под кривой «Глюкоза
10– Время» при пероральной нагрузке
глюкозой (2 г/кг) у животных с
моделированным сахарным диабетом
г)

г)

г)
н
ти

/к

/к

/к

(M ± m)
мг

мг

мг
п
ли
аг

(1

(2

(3
лд
16
Ви

K-

K-

K-
ие

ие

ие
н

н

н
не

не

не
ди

ди

ди
ое

ое

ое
С

С

С
Изучено влияние вещества К-167 на уровень постпрандиальной гипергликемии в
пероральном тесте толерантности к глюкозе при однократном введении крысам с
моделированным СД2. Данное производное испытывалось в 3 дозах: 10, 20 и 30 мг/кг.
Показано, что доза 30 мг/кг по эффективности (ΔAUC 29,30 ± 3,88%, p<0,001) соответствует препарату сравнения вилдаглиптину в дозе 10 мг/кг (ΔAUC 26,60 ± 3,20%, p<0,001). Она была выбрана для проведения дальнейших исследований как наиболее эффективная. Изучено влияние соединения при курсовом пероральном введении в течение 90 дней мышам линии c57bl6j с развитым СД2. В качестве препарата сравнения использовался метформин (100 мг/кг). Выявлено, что соединение К-167 оказывает выраженную антидиабетическую активность, начиная с первого дня курсового введения. Данный эффект сохранялся в течение всех трех месяцев введения и был сопоставим с препаратом сравнения. Производное К-167 улучшает гликемический контроль у животных, что подтверждается снижением уровня глюкозы плазмы крови натощак во всех исследованных временных точках на 19,3%, 10,3% и 20,4% (p<0,001) относительно группы ВЖД. Вещество К-167 снижает уровень глюкозы (на 29,1%, p<0,05) и инсулина (на 78,3%, p<0,0001) плазмы крови относительно группы ВЖД, благодаря чему не было выявлено признаков инсулинорезистентности у опытной группы животных (снижение индекса инсулинорезистентности на 71,2%, p<0,001). АБВ 1050001.0 ### 84000 ### 0.8 Глюкоза, мМ HOMA-IR, у.е. Инсулин, пкг * 6* *30000.6 ** 20000.4 *** 2********* 1000****0.2 ен00.0 Д)67 тн ыЖми1 орK-еД)н е н Д) во(В67 ыми ми ы е Ж тн афЖ1 тн жиететниорK- K- ор (В (В во во единее ф М ие таф а и жи ныдиетни ет ет ая +ж н те Дне не оеди М е ди ак е вМ ы роВЖы ди ди нт + С тн + ая тн ая жи Д Дое ое + Иак ак ов в ВЖ Д коВЖ ро С нтС нт соВЖир и + И И+ ож ож Д ВыД ВЖ к к ВЖ со со Вы #1-way ANOVA к Интактным животным, посттест Данета Вы *1-way ANOVA к группе ВЖД, посттест Данета#1-way ANOVA к Интактным животным, посттест Данета #1-way ANOVA к Интактным животным, посттест Данета *1-way ANOVA к группе ВЖД, посттест Данета *1-way ANOVA к группе ВЖД, посттест Данета Рисунок 4. Влияние соединения K-167 (30 мг/кг) и метформина (100 мг/кг) на уровень глюкозы (А) и инсулина (Б) плазмы крови, а также рассчитанный показатель инсулинорезистентности HOMA-IR (В) животных с СД2 (M ± m) Соединение К-167 не влияет на вес животных, при этом в морфометрическом анализе жировой ткани показано снижение всех типов абдоминальных жировых отложений до уровня интактных животных (мезентериальных на 33,54%, эпидидимальных на 34,9% и ретроперитонеальных на 36,9% относительно группы ВЖД; p<0,01). Исследуемое вещество нормализовало уровень триглицеридов печени (снижение на 24,1% от группы ВЖД, p<0,05). Производное К-167 оказывало противовоспалительное действие, что выражалось в нормализации показателей лейкоцитарной формулы крови (снижение количества сегментоядерных нейтрофилов на 38% и повышение числа лимфоцитов на 21,5% от группы ВЖД, p<0,0001), а также уровней ранних медиаторов воспаления (ФНО-α на 39,4% и оксида азота на 59,3% относительно группы ВЖД, p<0,05); оказывало благоприятное влияние на антирадикальную систему организма: снижение уровня ТБК- активных продуктов печени (на 71% от группы ВЖД, p<0,05) и увеличение количества восстановленного глутатиона в 3,4 раза от группы ВЖД (p<0,01) и на 97% от группы интактных животных (p<0,05). от общего времени изучения объектов Уровень интереса к новому объекту, % вермени изучения нового объекта *** * # 40Рисунок 5. Влияние соединения K-167 (30 мг/кг) и метформина (100 мг/кг) на 20уровень интереса к новому объекту в тесте «Распознавание нового объекта» у 0животныхсСД2(M ± m) еД)н67 тн ыЖми1 во(ВорK- жи а ет фие етен едиМ ин тныаяД +д аковое нтирВЖ+ С ИжД ко соВЖ Вы #1-way ANOVA к Интактным животным, посттест Дана *1-way ANOVA группе ВЖД, посттест Дана Соединение К-167 препятствовало развитию поведенческих изменений под воздействием ВЖД, что показано по нормализации результатов тестов «Открытое поле» и «Распознавание нового объекта». Совокупность выявленных эффектов при курсовом введении соединения К-167 позволяет сделать вывод о наличии у него большого спектра плейотропных эффектов (антидиабетический, противовоспалительный, антиоксидантный, антирадикальный), позволяющих достоверно корректировать проявления моделированной патологии. Эффективность исследуемого производного сопоставима с препаратом сравнения метформином. На клеточной модели in vitro в биохимических исследованиях выявлено, что производное К-167 в наномолярных концентрациях предотвращает индуцированную липополисахаридом и неопсонизированным зимозаном (специфический лиганд Tlr3 рецепторов) активацию макрофагов. В морфологическом исследовании подтверждено наличие данной активности (коэффициент распластанности макрофагов: 0,310 ± 0,059, в концентрации 3 нМ, p<0,0001; группа контроля 2,290 ± 0,126). Обнаружено отсутствие влияния вещества на фагоцитарный ответ перитонеальных макрофагов в конечной концентрации 7 мкМ и перитонеальных нейтрофилов в концентрации 20 мкМ. Выявлено, что вещество К-167 препятствует выработке ИЛ-6 под воздействием липополисахарида (IC50 18,51 ± 14,80 мкМ). Отсутствие чрезмерной поляризации макрофагов и влияния на врожденный бактериальный ответ говорит о благоприятном иммунотропномдействиисоединения.Наживотныхвмодели липополисахаридиндуцированного отека задней лапы крыс (100 мкг/лапа) производное К-167 в дозе 30 мг/кг при пероральном введении оказало выраженную противовоспалительную активность. Выявлено достоверное снижение веществом К-167 объема отека задней лапы животных в течение 24 часов (ΔAUC 63,2% от группы ЛПС, p<0,05), достоверное снижение выработки ФНО-α (на 90,9% от группы ЛПС, p<0,05) и оксида азота (на 57,1% от группы ЛПС, p<0,01) в плазме крови. По результатам исследований подтверждено влияние соединения на сигнальный путь Toll-рецепторов, что может быть использовано для предотвращения прогрессирования подострого воспаления и инсулинорезистентности при СД2. 40**** сонной артерии, мин Время окклюзии Рисунок 6. Влияние соединения К-167 20и ацетилсалициловой кислоты на время окклюзиисоннойартерии, индуцированной аппликацией 50%-м 0растворомхлоридажелеза(III) ль/к г /к г /к гинтактнымживотным(M ± m) ромгмгмг о нт005030 К117 КК АСАС16 К- е ни не ди ое С 1-way ANOVA к группе Контроль, посттест Данета Для изучения антиагрегантной активности использовались две методики, различающиеся индукторами агрегации. В методике с использованием АДФ (5 мкМ) соединение проявило высокий уровень активности (IC50 21 мкМ соответственно) относительно препарата сравнения кислоты ацетилсалициловой (IC50 104 мкМ). При использовании в качестве индуктора агрегации коллагена (15 мкг/мл) вещество К-167 в 16 раз активнее препятствовало агрегации тромбоцитов (IC50 3,02 мкМ), чем ацетилсалициловая кислота (IC50 49,3 мкМ). Наличие антитромботической активности у производного К-167 определялось по влиянию на время окклюзии сонной артерии крыс, индуцированной аппликацией 50%-ы раствором хлорида железа (III). Исследуемое вещество вводилось перорально в дозе 30 мг/кг. В качестве препарата сравнения использовалась кислота ацетилсалициловая в различных дозировках. Вещество К-167 пролонгировало время окклюзии сонной артерии на 78,5% (p<0,0001) от группы контроля. Соответствующий уровень активности для препарата сравнения (68,4%, p<0,0001) показан в дозе 150 мг/кг. Полученные результаты позволяют сделать вывод о возможности коррекции поздних осложнений СД2 исследуемым веществом, что окажет дополнительноепротекторноедействиенаорганизм. Проведенаоценкалекарственногоподобия,расчетосновных фармакокинетических и токсикологических свойств производного К-167. Выявлено, что исследуемое производное имеет благоприятный фармакокинетический профиль, относится к соединениям 4-го класса токсичности (малотоксичные). На основании прогнозирования возможно наличие гепато- и иммунотоксичности, а также мутагенности в тесте Эймса, что дает основания при планировании доклинического изучения вещества особое внимание уделить функциональной активности печени и мутагенным свойствам, а также определению порога доз, при которых проявляются данные эффекты. Изучаемое вещество К-167 при пероральном введении мышам не проявило признаков острой токсичности в дозе 2 г/кг, выживаемость животных через 2 недели после введения составила 100%, значимых изменений в весе животных не обнаружено. Полученные данные позволяют сделать вывод о его принадлежности к соединениям 5- го класса токсичности (нетоксичные). Соединение К-248. На первом этапе проведено in silico изучение механизма связывания производного с GSK3B. Сайт-связывания соответствует активному центру связывания препарата сравнения, описанного по данным (An и др., 2010). Выявлены ключевые аминокислоты, обуславливающие взаимодействие изучаемого соединения и вещества сравнения с активным центром фермента: VAL70, ALA83, CYS199 и LEU188. РисунокМежмолекулярные 7. взаимодействиясоединения К-248 и АТФ-связывающего центра GSK3B Соединения К-248 в конечной концентрации 7 мкМ не влияет, а в концентрации 50 мкМ оказывает цитотоксическое действие на линию перитонеальных макрофагов мышей. В концентрации 20 мкМ на линии неонатальных фибробластов сердца крыс гибель клеток отсутствовала. Производное К-248 в конечной концентрации 20 мкМ улучшает захват глюкозы неонатальными фибробластами сердца крыс на 272,8 ± 48,76%. Выявленное влияние на захват глюкозы быстро пролиферирующими клетками и наличие высокой противовоспалительной активности предполагают наличие антидиабетического действия у вещества. Изучаемое соединение ингибирует GSK3B, способно проникать внутрь клеток, а также не вызывает цитотоксичности вплоть до высоких микромолярных концентраций, в связи с чем взято для проведения углубленного изучения фармакологических свойств. АБВ 1050001.0 ### 84000 ### 0.8 Глюкоза, мМ HOMA-IR, у.е. Инсулин, пкг * 6** *30000.6 ** 20000.4 *** 2****** 1000***0.2 00.0 е ин Д) ы Ж м тн е ин Д) K- ор е ин Д) (В ы во ы Ж м ф тн Ж ие м тн а K- жи ор K- (В ет ор ет (В во н во не ф ие М ди е ф а ие жи а ы жи ет ет ди ет + ет н тн н ая не М ди Д е не ое М ди е ак в ы ВЖ ы ди + ро ди С тн + нт ая тн ая Д ое и + Д ак И ое в ВЖ ак ож в ВЖ Д ро С нт ро С ВЖ нт к и + со И и + И ож Д ож Вы Д ВЖ к ВЖ к со со #1-way ANOVA к Интактным животным, посттест Данета Вы Вы *1-way ANOVA к группе ВЖД, посттест Данета#1-way ANOVA к Интактным животным, посттест Данета #1-way ANOVA к Интактным животным, посттест Данета *1-way ANOVA к группе ВЖД, посттест Данета *1-way ANOVA к группе ВЖД, посттест Данета Рисунок 8. Влияние соединения K-248 (30 мг/кг) и метформина (100 мг/кг) на уровень глюкозы (А) и инсулина (Б) плазмы крови, а также рассчитанный показатель инсулинорезистентности HOMA-IR (В) животных с СД2 (M ± m) Изучено влияние соединения К-248 при курсовом пероральном введении в течение 90 дней в дозе 30 мг/кг мышам линии c57bl6j с развитым СД2. В качестве препарата сравнения использовался метформин (100 мг/кг). В отличие от производного 2-оксиндола К-167, вещество К-248 не оказало влияния на уровень постпрандиальной гипергликемии при первичном однократном введении вещества (ΔAUC 5,6%), однако значимо снижало его в тестах на 45-й и 90-й дни курсового введения (ΔAUC 21,6 и 14% соответственно, p<0,0001). Выявлено, что соединение К-248 значимо снижает уровень глюкозы плазмы крови натощак во всех исследованных временных точках на 24%, 7,8% и 12,5% (p<0,0001; 0,05; 0,001). Изучаемое производное снижает уровень глюкозы плазмы крови на -44,4% (p<0,05) и инсулина на 73,5% (p<0,001) от группы ВЖД, что позволило предотвратить развитие инсулинорезистентности (снижение индекса инсулинорезистентности на 51,6%, p<0,05). Вещество не влияет на массу животных, однако показано значимое снижение массывсехисследованныхтиповабдоминальныхжировыхотложений: мезентериальных на 34,3%, ретроперитониальных на 39,1% и эпидедимальных на 44,6% (p<0,001). Снижение массы ретроперитонеальных и эпидидимальных жировых отложений недостоверно превышало таковое при введении вещества К-167. Вещество К-248 снижает уровень триглицеридов печени на 15,1% (p<0,05). Соединение К-248 оказывало более выраженное противовоспалительное действие, чем производное К-167, что выражалось во влиянии на выработку ранних медиаторов воспаления (снижение уровня ФНО-α на 46,6% и оксида азота на 25,8% от группы ВЖД, p<0,05) и показатели лейкоцитарной формулы крови животных (снижение количества сегментоядерных нейтрофилов на 46,6% и повышение числа лимфоцитов на 25,8% от группы ВЖД, p<0,0001), что позволяет сделать вывод о предотвращении развития хронического подострого воспаления, характерного для патогенеза СД2. Также обнаружено снижение уровня ТБК-активных продуктов печени на 70,7% (p<0,05) от группы ВЖД, при отсутствии достоверного влияния на количество восстановленного глутатиона печени в отличие от соединения К-167. Производное К-248 на клеточной модели in vitro в конечной концентрации 3 нМ предотвращает индуцированную липополисахаридом и неопсонизированным зимозаном активацию макрофагов. В морфологическом исследовании подтверждено наличие данной активности (коэффициент распластанности макрофагов: 0,570 ± 0,086, p<0,0001). Выявлено отсутствие влияния производного К-248 на фагоцитарный ответ перитонеальных макрофагов в конечной концентрации 7 мкМ и перитонеальных нейтрофилов в концентрации 20 мкМ. Производное К-248 препятствует выработке ИЛ-6 под воздействием липополисахарида (IC50 17,60 ± 18,63 мкМ).Препятствование чрезмерной поляризации макрофагов, отсутствие влияния на врожденный бактериальный ответ подтверждают наличие благоприятного иммунотропного действия соединения. На животной модели липополисахаридиндуцированного отека задней лапы крыс (100 мкг/лапа) вещество К-248 в дозе 30 мг/кг при пероральном введении оказывало выраженную противовоспалительную активность. Изучаемое соединение предотвращало увеличение объема отека задней лапы животных в течение 24 часов (ΔAUC 77,4% от группы ЛПС, p<0,001) и достоверно снижало выработку ФНО-α (на 79,5% от группы ЛПС, p<0,05) и оксида азота (на 49,6% от группы ЛПС, p<0,01) в плазме крови. 0.25ЛПС 0.20IC50 8,78 мкМ OD550 0.15 ДМСО 0.10 0.010.11101001000 С, мкМ Рисунок 9. Влияние соединения К-248 на выработку оксида азота и ИЛ-6 40ЛПСперитонеальными макрофагами под воздействиемлипополисахарида. ИЛ-6, пкг/мл IC50 17.6018,63 мкМ ДМСО 0.010.11101001000 С, мкМ Изучено влияние соединения К-248 на процесс агрегации тромбоцитов с использованием индукторов агрегации раствора АДФ (5 мкМ) и раствора коллагена (15 мкг/мл). Вещество К-248 оказывает высокую антиагрегантную активность в обеих методиках (IC50 10 и 0,79 мкМ соответственно), превосходя препарат сравнения «Кислота ацетилсалициловая» по активности (IC50 104 и 49,3 мкМ) и производное К-167 в 2 раза. Оценено лекарственное подобие, расчет основных фармакокинетических и токсикологических свойств соединения. По результатам прогноза, производное К-248 имеет благоприятный фармакокинетический профиль, доступно перорально и проникает внутрь клеток. Рассчитано, что изучаемое вещество относится к 4-му классу токсичности (малотоксичные). На основании прогнозирования возможно наличие гепатотоксичности и мутагенности, что дает основания при планировании доклинического изучения соединения особое внимание уделить функциональной активности печени и мутагенным свойствам, а также определению порога доз, при которых проявляются данные эффекты. В результате проведенного исследования выявлены производные 3-арилиден-2- оксиндола К-167 и К-248, перорально доступные ингибиторы GSK3B. Соединение К- 167 оказывает выраженный антидиабетический эффект при однократном введении, влияет на многие звенья патогенеза СД2, в том числе корректирует хроническое подострое воспаление и может быть использовано для корректировки его осложнений (антиагрегантная и антитромботическая активности). Вещество К-248 имеет более выраженную противовоспалительную активность, за счет которой реализуется его антидиабетическая активность, при этом он в 2 раза активнее производного К-167 на in vitro моделях агрегации тромбоцитов. В четвертой главе приведены результаты In vitro изучения влияние 24 новых производных 2-оксиндола на активность альфа-глюкозидазы S.cerevisiae. Выявлено 6 производных (К-127, К-165, К-170(1), К-237, К-246, К-248), оказывающих большее ингибирующее влияние на альфа-глюкозидазу в конечной концентрации 100 мкМ, чем препарат сравнения «Акарбоза». Соединение К-170(1) (IC50 6,78 мкМ) превосходит препарат сравнения по активности (IC50 436,7 мкМ). % ингибирования -глюкозидазы Соединение K-170(1) 80IC50 6,78 мкМ Акарбоза IC50 436,70 мкМ -8-7-6-5-4-3-2 C, lg(M) Рисунок 10. Влияние соединения K-170(1) и акарбозы в зависимости от концентрации на активность α-глюкозидазы Анализ зависимости ингибирующей активности от структуры новых производных 2-оксиндола показал, что производные 3-арилиден-2-оксиндола оказались более перспективными и активными в сравнении с 3,3-дизамещенными-2-оксиндолами. При анализе заместителей в положении С3 (R1) выявлено, что гетероциклические радикалы снижали, а карбоциклические радикалы с заместителем в пара-положении увеличивали ингибирующую альфа-глюкозидазу активность. Наличие амидной группировки в положении С5 (R2 для 3-арил-2-оксиндолов и в положении R3 для 3,3-дизамещенных-2- оксиндолов) увеличивало активность соединений. Соединение К-170(1) взаимодействует с альфа-глюкозидазой в отличном от акарбозы центре связывания, что выявлено методом молекулярного докинга in silico. Для соединения К-170(1) выявлены ключевые аминокислоты, описывающие его связывание с аллостерическим центром фермента: ASP649, ARG653, GLU767, ARG643, PRO676, LYS765, GLU767. Рисунок 11. Расположение сайтов связывания акарбозы и соединения К-170(1) с α- глюкозидазой. Производное К-170(1) в конечной концентрации 20 мкМ не вызывает гибель перитонеальных макрофагов мышей и неонатальных фибробластов крыс. Рисунок 9. Влияние соединения K-170(1) и акарбозы на уровень глюкозы плазмы крови при пероральной нагрузке мальтозой (А) и на площадь под кривой «Глюкоза – Время» (Б) (M ± m) В методике перорального теста толерантности к дисахаридам (мальтоза и сахароза) производное 2-оксиндола К-170(1) вводилось перорально в дозе 5 мг/кг, в качестве препарата сравнения использовалась акарбоза (5 мг/кг, перорально). Соединение оказывает значимый антигипергликемический эффект (ΔAUC: мальтоза 42,1%; сахароза 28,8%; p<0,001), сопоставимый с препаратом сравнения (ΔAUC: мальтоза 37,2%; сахароза 17,9%; p<0,001). При использовании мальтозной углеводной нагрузки отмечается более выраженный эффект вещества, чем при использовании сахарозы, что может быть связано с большим влиянием исследуемого соединения на мальтазу, чем на сахаразу. Вещество К-170(1) не вызывало гипогликемического эффекта в обоих тестах. Производное К-170(1) не оказало достоверного влияния на уровень постпрандиальной гипергликемии (ΔAUC 12,3%) в пероральном тесте толерантности к глюкозе. Согласно полученным результатам, можно сделать вывод, что вещество К- 170(1) оказывает выраженную антигипергликемическую активность в тестах с дисахаридами, что объясняется его механизмом действия. Оценено лекарственное подобие и рассчитаны основные фармакокинетических и токсикологических свойства исследуемого соединения в сравнении с применяемым в клинической практике препаратом «Акарбозой» – ингибитором альфа-глюкозидазы. По результатам прогноза можно сделать вывод, что вещество К-170(1) имеет схожий показатель лекарственного подобия с препаратом сравнения, но в отличие от акарбозы способно хорошо абсорбироваться в ЖКТ, что относит вещество К-170(1) к классу всасываемых ингибиторов α-глюкозидазы. Для данного класса отмечается меньшая частота возникновения характерных для ингибиторов альфа-глюкозидазы побочных эффектов со стороны желудочно-кишечного тракта (Kawamori и др., 2009). На основании прогнозирования возможно наличие гепатотоксичности и мутагенности в тесте Эймса, что дает основания при планировании доклинического изучения соединения особое внимание уделить функциональной активности печени и мутагенным свойствам, а также определению порога доз, при которых проявляются данные эффекты. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Согласно результатам исследования, производные 3-арил-2-оксиндола обладают рядом фармакологически изученных эффектов: ингибирование киназы гликогенсинтазы типа 3 бета или альфа-глюкозидазы, влияние на выделение провоспалительных цитокиновприактивациимакрофаговлипополисахаридом,атакже противовоспалительной активностью. Выявлены новые ингибиторы киназы гликогенсинтазы типа 3 бета (GSK3B) и альфа-глюкозидазы в ряду производных 2-оксиндола. При поиске производных, влияющих на активность GSK3B, из изученных 16 новых производных 2-оксиндола показано 4 соединения с активностью более 50% и одно превосходящее вещество сравнения. Установлено, что уровень ингибирующей GSK3B активности увеличивался при наличии 3-арилиден-2-оксиндольного скаффолда и шестичленного ароматического цикла с гетероатомом в орто-положении или гидроксильной группой в пара-положении у С3 (R1). По результатам проведенного изучения цитотоксичности, влияния на захват глюкозы быстропролиферирующими клетками, механизма взаимодействия соединений с ферментом и исследованных ранее противовоспалительных свойств, выявлены вещества К-167 и К-248 для проведения углубленного фармакологического изучения. Соединение К-167 – наномолярный ингибитор GSK3B, по активности превосходящий вещество сравнения в 2 раза. На животных с моделированным СД2 вещество при однократном пероральном введении в дозе 30 мг/кг оказывает выраженный антидиабетический эффект. Данная дозировка выбрана для проведения углубленного изучения активности при курсовом введении. Соединение проявляет выраженный антидиабетический эффект с первого дня курсового введения; корректирует уровни глюкозы, инсулина, массу жировых отложений, триглицеридов, ранних медиаторов воспаления, показатели лейкоцитарной формулы крови и поведенческую активность животных. В концентрации 3 нМ исследуемое вещество предотвращает индуцированную липополисахаридом активацию макрофагов, при отсутствии влияния на фагоцитарную активность в концентрации 20 мкМ. В дозе 30 мг/кг соединение К-167 снижет объем индуцированного липополисахаридом отека задней лапы крыс, выработку ФНО-α и оксида азота. Производное 2-оксиндола К-167 подавляет индуцированную АДФ и коллагеном агрегацию тромбоцитов in vitro, при этом in vivo в дозе 30 мг/кг пролонгирует время окклюзии сонной артерии, индуцированной аппликацией 50%-го раствора хлорида железа (III), что может быть использовано для предотвращения осложнений СД2. На основании теста острой токсичности относится к нетоксичным. Соединение К-248 ингибирует GSK3B в микромолярных концентрациях, оказывает выраженную противовоспалительную активность, улучшает захват глюкозы неонатальными фибробластами сердца. При курсовом пероральном введении (30 мг/кг) вешество проявляет увеличивающийся со временем антидиабетический эффект, что может быть связано с высоким уровнем противовоспалительной активности; недостоверно превосходит соединение К-167 по влиянию на показатели, характеризующие развивающееся хроническое подострое воспаление (уровень ФНО-α и лейкоцитарную формулу крови); снижает уровень глюкозы, инсулина, триглицеридов, массу висцеральных жировых отложений и нормализует поведенческую активность животных на уровне вещества К-167. В конечной концентрации 3 нМ вещество К-248 препятствует индуцированной липополисахаридом активации макрофагов, при отсутствии влияния на фагоцитарную активность в концентрации 20 мкМ. При однократном пероральном введении (30 мг/кг) производное 2-оксиндола К-248 предотвращает увеличение объема, индуцированного липополисахаридом отека задней лапы крыс (ΔAUC 77,4%), снижает выработку ФНО-α и оксида азота. Производное К- 248 в 2 раза превосходит соединение К-167 по уровню антиагрегантной активности на изученных моделях агрегации тромбоцитов. При поиске соединений, влияющих на активность альфа-глюкозидазы, из изученных 24 новых производных 2-оксиндола выявлено 6 производных, превосходящих препарат сравнения по активности. Установлено, что уровень, ингибирующий альфа-глюкозидазу, повышается при наличии 3-арилиден-2- оксиндольного скаффолда, карбоциклических радикалов с заместителем в пара- положении и амидной группировкой в положении С5 (R2 для 3-арил-2-оксиндолов и в положении R3 для 3,3-дизамещенных-2-оксиндолов), а гетероциклические радикалы в положении С3 (R1) снижают активность. По результатам проведенного изучения цитотоксичности и механизма взаимодействия соединений с ферментом, выявлено соединение-лидер К-170(1) для проведения углубленного фармакологического изучения. Соединение К-170(1) – микромолярный ингибитор альфа-глюкозидазы (IC50 6,78 мкМ). При однократном пероральном введении (5 мг/кг) вещество оказывает выраженную антигипергликемическую активность в тесте толерантности к дисахаридам, сопоставимую с препаратом сравнения. Производное К-170(1) не активно в тесте с глюкозой, что подтверждает выявленный механизм действия. При оценке основных токсикологических, фармакокинетических и фармакодинамических показателей in silico показан хороший фармакокинетический профиль применения пероральных форм введения соединения, что относит его к классу всасываемых ингибиторов альфа-глюкозидазы, обладающих меньшей частотой возникновения побочных эффектов. ВЫВОДЫ 1.Новые производные 3-арилиден-2-оксиндола ингибируют киназу гликогенсинтазы типа 3 бета (GSK3B) и альфа-глюкозидазу. Из изученных 16 новых производных 2-оксиндола в концентрации 10 мкМ выявлено 4 производных с ингибирующей GSK3B активностью более 50% и одно соединение, превосходящее вещество сравнения SB-21673. На наличие ингибирующей альфа-глюкозидазу активности изучено 24 производных 2-оксиндола в концентрации 100 мкМ, выявлено 6 веществ, превосходящих препарат сравнения акарбозу. 2.Соединения, содержащие 3-арилиден-2-оксиндольный скаффолд, были более активными в сравнении с 3,3-дизамещенным-2-оксиндольным скаффолдом при поиске ингибиторов GSK3B. Шестичленный ароматический цикл с гетероатомом в орто-положении или гидроксильной группой в пара-положении у С3 (R1) увеличивал активность веществ. 3.Производные 3-арилиден-2-оксиндола – более активные ингибиторы альфа-глюкозидазывсравнениис3,3-дизамещенным-2-оксиндолами. Гетероциклические радикалы в положении С3 (R1) снижали, а карбоциклические радикалы с заместителем в пара-положении увеличивали ингибирующую альфа- глюкозидазу активность. Амидная группировка в положении С5 (R2 для 3-арил-2- оксиндолов и в положении R3 для 3,3-дизамещенных-2-оксиндолов) увеличивала активность соединений. 4.Соединение К-167 является ингибитором GSK3B (IC50 4,2 ± 0,7 нМ), по уровню активности превосходит вещество сравнения SB-216763 в 2 раза (IC50 8,4 ± 2,0 нМ). Вещество улучшает захват глюкозы неонатальными фибробластами сердца крыс в конечной концентрации 20 мкМ; при однократном пероральном введении (30 мг/кг) эквивалентно по эффективности препарату сравнения вилдаглиптину (10 мг/кг); при курсовом пероральном введении (30 мг/кг) оказывает выраженное антидиабетическое действие, начиная с первого дня введения; снижает уровни глюкозы, инсулина, триглицеридов, ранних медиаторов воспаления (ФНО-α и оксида азота), а также массу висцеральных жировых отложений; нормализует показатели лейкоцитарной формулы крови, а также поведенческую активность животных. 5.Вещество К-167 предотвращает индуцированную липополисахоридом активацию макрофагов в концентрации 3 нМ; не влияет на фагоцитарную активность до конечной концентрации 20 мкМ. При однократном пероральном введении (30 мг/кг) снижает объем индуцированного липополисахоридом отека задней лапы в течение 24 ч, выработку ФНО-α и оксида азота в плазме крови. 6.Производное 2-оксиндола К-167 подавляет индуцированную АДФ (5 мкМ) и коллагеном (15 мкг/мл) агрегацию тромбоцитов (IC50 21 и 3,02 мкМ); при пероральном введении (30 мг/кг) пролонгирует время окклюзии сонной артерии (78,51 ± 19,48%), индуцированной аппликацией 50%-го раствора хлорида железа (III). 7.Соединение К-248 ингибирует GSK3B (4,34 ± 0,21 мкМ) и оказывает выраженнуюпротивовоспалительнуюактивностьнамодели липополисахаридиндуцированной активации перитонеальных макрофагов; улучшает захват глюкозы из среды неонатальными фибробластами сердца в конечной концентрации 20 мкМ. Изучаемое производное при курсовом пероральном введении (30 мг/кг) оказывает увеличивающийся со временем антидиабетический эффект, что может быть связано с высоким уровнем противовоспалительной активности. Соединение К-248 недостоверно превосходит производное К-167 по влиянию на показатели, характеризующие развивающееся хроническое подострое воспаление (уровень ФНО-α и лейкоцитарную формулы крови); при этом снижая уровень глюкозы, инсулина, триглицеридов, массу висцеральных жировых отложений и нормализуя поведенческую активность животных на уровне соединения К-167. 8.Производное 2-оксиндола К-248 в концентрации 3 нМ препятствует индуцированной липополисахаридом активации макрофагов, не влияет на фагоцитарную активность до конечной концентрации 20 мкМ; при однократном пероральном введении (30 мг/кг) препятствует увеличению объема, индуцированного липополисахаридом отека задней лапы в течение 24 ч, снижает выработку ФНО-α и оксида азота. 9.Вещество К-248 в 2 раза превосходит соединение К-167 по уровню антиагрегантной активности на моделях агрегации тромбоцитов, индуцируемых АДФ (5 мкМ) и коллагеном (15 мкг/мл) (IC50 10 и 0,79 мкМ). 10.Производное К-170(1) ингибирует альфа-глюкозидазу (IC50 6,78 мкМ). Установлена антигипергликемическая активность (5 мг/кг), сопоставимая с препаратом сравнения «Акарбозой» (5 мг/кг). 11.Изученные соединения К-167, К-170(1) и К-248 не вызывали гибели неонатальных фибробластов сердца крыс в конечной концентрации 20 мкМ и первичных перитонеальных макрофагов мышей в конечной концентрации 7 мкМ. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1.3-арилиден-2-оксиндол является перспективным скаффолдом для поиска соединений, влияющих на активность киназы гликогенсинтазы типа 3 бета, альфа- глюкозидазы. 2.Новые производные 2-оксиндола, вещества К-167 и К-248, подавляют индуцированный липополисахаридом синтез оксида азота и интерлейкина-6. 3.Необходимо проведение расширенных доклинических исследований ингибиторов GSK3B производных К-167 и К-248, а также ингибитора альфа- глюкозидазы соединения К-170(1).