Физиологические основы культивирования, повышения стрессоустойчивости и хранения волосовидных корней

ИССЛЕДОВАНИЙ
В качестве объектов исследования были выбраны модельная система
волосовидных корней табака N. tabacum, а также волосовидные корни витании W.
somnifera и подсолнечника H. annuus. При создании трансгенных растений был
применен метод агробактериальной трансформации с использованием бинарного
вектора pCambia 1301 («CAMBIA», Австралия). Культуры волосовидных корней
табака, подсолнечника и витании были созданы из листовых эксплантов
двухмесячных растений при помощи A. rhizogenes штаммов А4 и 15834. Измеряли
сырую и сухую массу и средний прирост культуры корней на 30-й день
культивации.
Для проведения биохимического анализа стресс опосредованных
изменений антиоксидантной системы культуры волосовидных корней
выращивали в течение 30 дней в условиях действия стресс-факторов. Для анализа
произошедших после хранения изменений, культуры выращивали в стандартной
среде в течение 30 дней. Все биохимические исследования по определению
активности антиоксидантной системы имели, по меньшей мере, 15 повторностей
(n≥15). Анализ водорастворимых сахаров проводили в смеси фенола и серной
кислоты (Dubois et al., 1956), флавоноидов – в смеси нитрита натрия и хлорида
алюминия (Marinova et al., 2005). Для определения активности
супероксиддисмутазы (СОД) применяли метод, основанный на способности СОД
конкурировать с нитросиним тетразолием за супероксид-анионы (Чевари и др.,
1985). Активность пероксидаз (ПО) определяли по способности полимеризации
гваякола до тетрагваякола (Ermakov et al., 1987; Panchuk et al., 2002). Активность
каталаз (КАТ) проверяли по скорости деградации молекул перекиси водорода
(Panchuk et al., 2002). Количество малонового диальдегида (МДА) в навеске
определяли с помощью тиобарбитуровой кислоты (Taylor et al., 2007). Метод
определения пролина был основан на работе Bates (1973) с модификациями от
Khedr et al. (2003). Скорость образования супероксид-аниона (СА) определяли
акцепторным методом, основанным на определении окрашенного продукта
окисления адреналина – аденохрома (Minibaev et al., 1998). Экстракцию перекиси
водорода проводили по Chaouch et al. (2010), измерение его содержания по
Bindschedler et al. (2001). Общая антиоксидантная способность (ОАС)
оценивалась на этанольных (80%) экстрактах по восстановлению Mo(VI) до
Mo(V) при кислом pH (Boestfleisch et al., 2014). Содержание общего растворимого
белка определяли по Бредфорду (Bradforf, 1978).
При хранении волосовидных корней использовали такие стресс-факторы
как дефицит сахарозы, гипоксия, хранение в присутствии маннитола и высоких
концентраций NaCl. Для усовершенствования условий выращивания изучали
возможности культивирования волосовидных корней в колбах различного
объема, а также в биореакторах душевого и дисперсионного типов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Сравнительный анализ содержания сахаров и флавоноидов в культурах
волосовидных корней подсолнечника Heliantus annuus L.
На семядольных эксплантах подсолнечника волосовидные корни начинали
появляться через 11 дней после инокуляции агробактериями. Эффективность
трансформации семядольных эксплантов H. annuus составила 93% при
использовании штамма А4 и 78% при использовании штамма 15834. В нашем
исследовании было определено общее содержание сахаров и флавоноидов в 10
изолированных культурах волосовидных и нативных корней подсолнечника.
Содержание водорастворимых сахаров в линиях штамма 15834 в среднем
составило 91,5±0,8 мг, А4 – 45,66±0,93 мг, в нативных – 24,86±3,9 мг на 1 г сухой
массы. Таким образом, содержание водорастворимых сахаров в волосовидных
корнях было выше, нежели в нативных. Стоит отметить, что повышенное
содержание сахаров в волосовидных корнях может быть как следствием
активного метаболизма и синтеза собственных сахаров, так и высокой
проницаемости мембраны, поскольку культуры корней выращивали в среде
богатой сахарозой.
Была определена сумма флавоноидов в культуре волосовидных корней
подсолнечника. Культуры волосовидных корней подсолнечника однолетнего,
полученные с помощью штамма А4, характеризовались наибольшим
содержанием флавоноидов. Приведенные данные свидетельствуют о том, что
волосовидные корни, полученные с помощью A. rhizogenes, являются
устойчивыми системами, способными не только сохранять биосинтез вторичных
метаболитов, но и поддерживать его на более высоком уровне, чем нативные
корни (Yang et al., 2006).
2. Рост и стрессоустойчивость волосовидных корней табака,
экспрессирующих ген AtGSTF11 под контролем 35S CaMV промотора
Глутатион-S-трансферазы(GSTs)осуществляютмножество
восстанавливающих реакций, используя трипептид глутатион (GSH) в качестве
косубстрата или кофермента (Dixon et al., 2002). После агробактериальной
трансформации с использованием A. rhizogenes отобрали 4 устойчивые линии
волосовидных корней (ВК). В ходе предварительных испытаний, определили
интенсивность стресс-факторов.

Рис. 1. Изменение сырой (А) и
сухой (Б) массы волосовидных
корней табака в стандартных (1) и
стрессовых условиях: засоления (2
– 150 мМ NaCl; 3 – 200 мМ NaCl),
теплового стресса (4 – +32°С; 5 –
+35°С), и действия тяжелых
металлов (6 – 100 мкM CuSO4 и 7 –
100 мкМ Cd(CH3COO)2 (СdAc)).
Звездочки (*) указывают на
достоверные различия между
диким типом (ДТ) и трансгенными
линиями, по тесту Дункана (P
<0,05). Трансгенные волосовидные корни табака 35S::AtGSTF11 при стандартных условиях в среднем росли лучше дикого типа (ДТ) в 2,1 раза (рис. 1). В стандартных условиях сырая масса трансгенных волосовидных корней линий L1, L2 и L3 была в среднем на 28% выше ДТ. При помещении волосовидных корней в условия высокотемпературного стресса сырая масса корней ДТ снизилась в 5, а трансгенных от 2,1 до 3,2 раза. В более жестких условиях гипертермии (35°С) сырая масса корней ДТ уменьшилась в 45,5 раз, трансгенных в 5,8-12,5 раза. Сухая масса трансгенных корней была выше ДТ в 2 раза при 32°С, при 35°С – в 3,2 раза. Сырая масса трансгенных линий была больше чем у ДТ в среднем в 1,6 раза при загрязнении кадмием, а сухая масса в 2 раза. Так как трансгенные волосовидные корни обладали повышенной устойчивостью к действию стрессовых факторов, что может быть связано с повышенной устойчивостью к АФК, было решено измерить ряд параметров антиоксидантной системы при влиянии стрессовых факторов. После предварительных исследований, в которых были использованы волосовидные культуры корней разного возраста (20-50 дней), мы выявили, что активность ферментов и содержание малонового диальдегида (МДА) сильно отличались в зависимости от продолжительности культивирования на одной среде. Рис. 2. Активность ферментов антиоксидантной системы (А – пероксидаза, Г – супероксиддисмутаза), содержание малонового диальдегида (Б) и пролина (В) в культурах волосовидных корней табака разного возраста. Звездочки (*) указывают на достоверные различия между ДТ и трансгенными линиями, по тесту Дункана (P<0.05). Во время длительного культивирования в чашках Петри твёрдая среда истощается, насыщается продуктами жизнедеятельности культуры, что в свою очередь создаёт неблагоприятные условия для дальнейшего роста волосовидных корней. Активность ферментов (рис 2А, Г) в трансгенных линиях повышалась с течением времени. В волосовидных корнях ДТ активность каталаз не изменялась, активность пероксидаз (ПО) (рис 2А) повышалась и превышала значение трансгенных на 24,8%, а активность супероксиддисмутазы (СОД) (рис 2Г) повышалась и была ниже значения трансгенных на 12%. Содержание пролина у ДТ по мере старения культуры волосовидных корней увеличивалось (рис 2В), однако, как в свежей, так и в старой культуре у трансгенных линий пролина было меньше, чем у ДТ. Содержание МДА (рис 2Б) в трансгенных ВК на 30 день культивации было достоверно выше, чем у ДТ в среднем на 17%, однако на 60 день значение ДТ превышало трансгенные в среднем в 1,7 раза. Общая антиоксидантная способность (ОАС) ВК табака, содержащая целевую конструкцию, на 30 день была выше таковой ДТ на 49% (L1) и 38% (L3). С течением времени значение ОАС снижалось во всех исследованных культурах в среднем на 16%, но у трансгенных волосовидных корней оставалось выше, чем у ДТ. Рис. 3. Содержание малонового диальдегида(А),общая антиоксидантная способность (Б) и содержание пролина (В) в культурах волосовидных корней табака при стандартных условиях (К) и при действии различных стрессовых факторов: засолении (150 мМ NaCl), гипертермии (32°С) и действии тяжелого металла – ацетата кадмия (CdAc) (100 мкМ СdAc). Звездочки (*) указываютнадостоверные различиямеждуДТи трансгенными линиями, по тесту Дункана (P<0,05). В качестве стрессоров выступали засоление (150 мМ NaCl), высокая температура окружающей среды (32°С), и загрязнение среды тяжелыми металлами (100 мкМ CdAc). Активность СОД при действии выбранных стрессовых факторов не подвергалась значительному изменению, однако активность двух других ферментов – пероксидаз и каталаз – повышалась во всех линиях. Стоит заметить, что активность пероксидаз резко возрастала при гипертермии, в трансгенных ВК она была выше ДТ примерно в 2 раза. Интенсивность перекисного окисления липидов (рис 3А) в культурах также увеличивалась при действии стрессоров. Причем, при стандартных условиях содержание МДА у трансгенных линий было выше в среднем на 30%, чем у ДТ. Содержание МДА в корнях ДТ было максимально при гипертермии, превышая значения трансгенных культур примерно в 3 раза. ОАС (рис 3Б) культур ВК возрастала в средах с повышенным содержанием соли и в среде загрязнённом ацетатом кадмия. В условиях высоких температур мы наблюдали за снижением ОАС. Как при стандартных, так и при стрессовых условиях ОАС была достоверно выше в трансгенных ВК. Содержание пролина (рис 3В) при стандартных условиях сильно не различалось между ДТ и трансгенными линиями. Однако при действии стрессоров накопление пролина в корнях ДТ было выше. Так, при засолении в трансгенных волосовидных корнях содержание пролина было ниже на 32-67%, чем в ДТ (рис 3В). Таким образом, по морфологическим параметрам, трансгенные волосовидные корни табака обладали большей стрессоустойчивостью и продуктивностью. Выраженный эффект трансгена был обнаружен при засолении, гипертермии и загрязнении среды тяжелыми металлами. Наши данные согласуются с ранее полученными результатами других авторов относительно влияния трансгенов GST. К примеру, при сверхэкспрессии гена ThGSTZ1 растения Tamarix hispida приобрели высокую устойчивость к засухе и засолению (Yang et al., 2014). А внедрение гена VvGSTF13 в Arabidopsis thaliana придало им повышенную устойчивость к воздействию соли, засухи и метилвиологена (Xu et al., 2018). Поэтому, трансгенез с использованием генов GSTs может стать перспективнымрешениемприповышениистрессоустойчивостии продуктивности культур волосовидных корней. 3. Стрессоустойчивость волосовидных корней табака, экспрессирующих ген NtEXPA5 под контролем 35S CaMV промотора Активность экспансинов наиболее важна в регуляции и обеспечении роста клеток растяжением (Cosgrove, 2015). Так же есть сведения о том, что экспансины способствуют повышению стрессоустойчивости растений (Zhao et al., 2011, Xu et al., 2014, Kuluev et al., 2016). После проведенной нами агробактериальной трансформации было получено 127 линий волосовидных корней табака. Отобранные линии ВК (E1-E6) имели генетическую конструкцию, содержащую 35S::NtEXPA5, а также включали гены rolA и rolB. Было показано, что в нормальных условиях анализируемые линии трансгенных ВК росли быстрее, чем ДТ до 52% (рис. 4). Рис. 4. Удельный прирост (А) и средняя сухая масса волосовидныхкорней табака в стандартных (1) и стрессовых условиях (2 – 150 мМ NaCl, 3 – 100 мкM CuSO4, 4 – 100 мкМ CdAc, и 5 – 75мМ маннитол). Звездочки (*) указывают на достоверные различия междуДТи трансгенными линиями, по тесту Дункана (P <0,05). Конститутивная экспрессия гена NtEXPA5 придала волосовидным корням повышенную стрессоустойчивость. При нормальных условиях волосовидные корни росли быстрее корней дикого типа, обладали большей сухой массой (рис 4). При действии стрессовых факторов, трансгенные корни так же, в большинстве случаев росли лучше ДТ. Трансгенные корни 35S::NtEXPA5 характеризовались большей активностью супероксиддисмутазы (рис. 5В), а также повышенной антиоксидантной способностью (рис. 5А). При действии стрессовых факторов трансгенные ВК накапливали меньше перекиси водорода (рис. 5Б). Это говорит о том, что культуры трансгенных корней испытывали меньший стресс как при росте в нормальных условиях, так и при росте под действием различных стрессоров. Видимо, такие результаты связаны с продуктом целевого гена. Устойчивость к засухе может быть достигнута за счет увеличения поглощения воды и снижения потерь воды, в то же время устойчивость к засухе включает в себя регулировку осмотических свойств, антиоксидантной способности и устойчивости к высыханию (Yue et al., 1998). Рис. 5. Общая антиоксидантная способность(А)культур волосовидныхкорней, содержание в них перекиси водорода (Б) и активность супероксиддисмутаз (В) при стандартных условиях (К) и при действии стрессоров: NaCl - засоления (150 мМ NaCl) и Ман - осмотического стресса (75 мМ маннитол).Звездочки(*) указывают на достоверные различиямеждуДТи трансгенными линиями, по тесту Дункана (P<0,05). Экспансины способствуют увеличению оводненности клеток, а значит интенсивность осмотического стресса при их действии может снижаться (Han et al., 2015). К тому же имеются сведения, согласно которым экспансины помогают снижать избыточную концентрацию Na+ в клетках, что так же может объяснить снижение стрессовой нагрузки на клетки (Jadamba et al., 2020). 4. Разработка методов хранения культур волосовидных корней Актуальной проблемой в биотехнологии волосовидных корней является сохранение полученных культур. Из-за того, что ВК являются гетеротрофной системой, их необходимо постоянно подпитывать органическими и минеральными веществами, поэтому их быстрый рост вызывает необходимость частых пересадок. Нам удалось сохранить волосовидные корни витании в течении 90 дней в условиях высокосолевого стресса и дефицита сахарозы. При этом перенесшие хранение культуры корней никак не отличались от контрольных линий и культивировались простым пересаживанием на свежую среду МС. Так же нам удалось сохранить жизнеспособными волосовидные корни табака, включающие трансген AtGSTF11 в условиях низких положительных температур в течение 240 дней. Стоит так же отметить то, что при хранении выживаемость трансгенных волосовидных корней увеличилась, по сравнению с ДТ. Таким образом, гены глутатион-S-трансфераз могут быть предложены не только для повышения продуктивности и стрессоустойчивости культур волосовидных корней, но и для увеличения сроков их долговременного сохранения в стрессовых и дефицитных условиях без пересадок. 5. Оптимизация условий культивирования волосовидных корней табака и витании в колбах разного объема и прототипах биореактора Генетически трансформированные корни табака начали появляться на 7-й день после инокуляции агробактериями. Эффективность трансформации листовых эксплантов табака бактерией A. rhizogenes штамма А4 составила 77%. ПЦР-анализ показал, что все отобранные для работы линии волосовидных корней табака содержат ген rolB A. rhizogenes. Волосовидные корни витании были получены не в рамках выполнения данной диссертации и были подробно описаны ранее (Михайлова и др., 2017). Наибольший прирост массы у волосовидных корней табака (рис 6) наблюдался в колбе с объемом в 2000 мл, а наименьший в колбе в 100 мл (минимальный объем). При постоянном перемешивании возникает разность в скорости потока жидкости в колбах, которая максимальна возле стенок и практически равна нулю в центре. Из-за этой разности потока, волосовидные корни постоянно подвергаются механическому взаимодействию. Дальнейшие работы были связаны с тестированием двух способов подачи питательной среды в прототипах биореакторов. Сконструированные нами прототипы биореактора относятся к газофазному типу (Patra, Srivastava, 2017). В первом прототипе (душевой) среда подавалась из резервуара для среды в камеру роста сверху в виде крупных капелек воды, омывала корни и возвращалась в резервуар. Для нормального роста корней в биореакторе необходимо, чтобы жидкостная и газовая фаза оптимально чередовались (Mishra et al., 2007). Потому мы подобрали несколько схем, при которых общее время подачи среды в течение суток составило: схема 1 – 690 мин, схема 2 – 540 мин, схема 3 – 405 мин, схема 4 – 285 мин, схема 5 – 210 мин. В условиях прототипа душевого типа к концу второй недели волосовидные корни табака всех линий прекращали рост и темнели. Питательный раствор при этом не менял цвет, прозрачность или запах. Можно предположить, что потемнение происходило из-за относительно свободного доступа кислорода в камеру, в отличие от закрытой стеклянной колбы. В то же время есть сведения, согласно которым, потемнение происходит из-за чрезмерного накопления фенольных соединений в ответ на стрессовые факторы (Loaiza-Velarde, 2003). В данном случае стрессовым фактором мог быть механический стресс, создаваемый потоками воды. Рис. 6. Сравнительный анализприроста биомассы волосовидных корней табака и витании при культивировании в колбах разного объема в течении 6 недель Второй прототип (дисперсионный) биореактора отличался от первого тем, что мы добились полной герметичности конструкции, а значит вероятность контаминации резко снижалась; среда подавалась в виде густого тумана, через специальные распылители, при этом снижался механический стресс; в камеру нагнетался стерильный воздух – доступ к кислороду повышался. Схема работы насоса повторяла таковые предыдущего прототипа. Наиболее комфортной для роста волосовидных корней табака оказалась схема 2, при котором средняя масса образцов увеличилась в 2,3 раза. Далее с увеличением времени застоя биореактора уменьшался и прирост корней. Подводя итоги работы было доказано, что дисперсионный тип биореактора при выращивании волосовидных корней имеет определенные преимущества над душевым. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Внедрение трансгена AtGSTF11 в волосовидные корни табака привело к повышению устойчивости к засолению, высоким температурам и загрязнению тяжелыми металлами. Сырая масса трансгенных волосовидных корней линий L1, L2, L3 была в среднем на 28% выше, чем у ДТ в стандартных условиях, а в условиях гипертермии (+35°С) на 557%. Удалось выявить, что в трансгенных корнях при засолении повышается содержание общего растворимого белка, при высоких температурах повышается активность пероксидаз. Так же при действии стрессовых факторов в трансгенных корнях обнаружили пониженное содержание перекиси водорода и продуктов перекисного окисления липидов. Предположительно, такой результат был достигнут из-за способности продукта гена AtGSTF11 повышать общую антиоксидантную способность ткани. Было получено и проанализировано 6 линий волосовидных корней табака с конститутивной экспрессией гена экспансина табака NtEXPA5, которые характеризовались более высокими темпами роста и повышенной продуктивностью при нормальных условиях культивирования, по сравнению с контролем. Волосовидные корни табака сверхэкспрессирующие ген NtEXPA5 отличались повышенной устойчивостью к действию NaCl, маннитола, ацетата кадмия и CuSO4. В стандартных условиях и при засолении трансгенные корни 35S::NtEXPA5 характеризовались большей активностью антиоксидантных ферментов, а именно каталаз и супероксиддисмутазы. Такой позитивный эффект может быть связан со способностью экспансинов увеличивать оводненность клеток и снижать избыточную концентрацию Na+ в клетках. Полученные нами культуры волосовидных корней подсолнечника однолетнего характеризовались более высоким содержанием флавоноидов, чем нативные корни подсолнечника. Предполагается, что подобный эффект усиления биосинтеза веществ вторичного метаболизма в трансформированных волосовидных корнях обусловлен экспрессией rol-генов A. rhizogenes. Продукты генов rolB и rolC способны оказывать значительное влияние на биосинтез вторичных метаболитов, что позволяет получать культуры волосовидных корней с высоким уровнем синтеза того или иного соединения. Результаты нашей работы свидетельствуют о том, что волосовидные корни, полученные с помощью A. rhizogenes, являются устойчивыми системами, способными не только сохранять биосинтез вторичных метаболитов, но и поддерживать его на более высоком уровне, чем нативные корни. Нам удалось сохранить волосовидные корни витании в течение 90 дней в условиях высокосолевого стресса, дефицита сахарозы и при низких положительных температурах, что в свою очередь облегчит создание банка волосовидных корней с ценными качествами. Культуры волосовидных корней обладают многими преимуществами, среди которых можно выделить высокий и непрерывный выход широкого спектра метаболитов и высокий потенциал роста на безгормональных, относительно дешевых питательных средах. Несмотря на весьма неплохие результаты сконструированного нами прототипа биореактора дисперсионного типа, они уступают данным, полученным при выращивании волосовидных корней в колбах. Следовательно, нам пока не удалось подобрать оптимальную конструкцию биореактора и условия для культивирования в нем волосовидных корней. ВЫВОДЫ 1. Показано, что волосовидные корни подсолнечника накапливают больше флавоноидов, чем нативные корни, и, что линии корней, полученные с помощью штамма 15834 Agrobacterium rhizogenes более продуктивны, чем полученные с помощью штамма А4. 2. Выявлено, что волосовидные корни с конститутивной экспрессией гена AtGSTF11 обладают более быстрым ростом и повышенной устойчивостью к засолению, гипертермии и загрязнению тяжелыми металлами. Главным механизмом защиты от активных форм кислорода у трансгенных волосовидных корней является быстрое восстановление окисленных антиоксидантов, что способствует более эффективному сохранению окислительного баланса в клетке и увеличению активности каталаз, пероксидаз и супероксиддисмутаз. 3. Обнаружено, что волосовидные корни с конститутивной экспрессией гена NtEXPA5 крупнее, чем нетрансгенные формы и обладают более быстрым ростом. Конститутивная экспрессия гена NtEXPA5 повышает активность супероксиддисмутаз и каталаз как при нормальных условиях, так и при действии засоления и маннитола, что является причиной более низкого содержания АФК в клетках и увеличения стрессоустойчивости культур волосовидных корней. 4. Выявлено, что наиболее эффективными условиями хранения волосовидных корней табака и витании являются низкие положительные температуры, дефицит сахарозы и питательные среды с высоким содержанием NaCl. 5. Трансгенные по гену AtGSTF11 волосовидные корни обладают более длительной выживаемостью при хранении по сравнению с диким типом. 6. При культивировании волосовидных корней вариант подачи мелкодисперсной питательной среды более эффективен, чем капельный.