Функционирование антиоксидантной системы растений в природных условиях и при зеленении проростков

Функционирование антиоксидантной системы в листьях светового и теневого фенотипов Plantago media
Растения P. mediа в открытых местообитаниях получали на порядок больше света, чем в травостое. В безоблачные дни интенсивность ФАР и УФ (А+В)- радиации на открытых участках достигала 1700 мкмоль/м2с и 16 Вт/м2 соответ- ственно, тогда как в сомкнутом травостое была в 5–7 раз меньше. Различия в температуре и относительной влажности воздуха были не столь существенны.
В результате длительной адаптации к условиям обитания сформировались фенотипы P. mediа (рис. 1), которые по своим морфофизиологическим харак- теристикам были отнесены к световым и теневым (Головко и др., 2011; Zakhozhiy et al., 2020). У световых растений листья толще, площадь меньше, содержание крахмала в них больше, растворимых углеводов меньше. Теневые растения отличались меньшей удельной поверхностной плотностью листьев, накапли- вали больше хлорофиллов, содержали меньше каротиноидов и фенольных со- единений. Адаптация к режиму высокой освещенности способствовала фор-
Рис. 1. Внешний вид рас- тений Plantago media на от- крытом участке (1) и в траво- стое (2) (Южный Тиман, 6–7 июля 2012 г.).
мированию устойчивого к фотоингибированию ФСА. В листьях светового фенотипа активирова- лись процессы нефотохимического тушения с уча- стием зеаксантин-зависимого механизма тепловой диссипации энергии (Головко и др., 2011; Golovko et al., 2012; Miszalski et al., 2016).
Результаты изучения про-/антиоксидантного
метаболизма P. media позволили оценить роль
АОС при адаптации растений к условиям произ-
растания. На Ю. Тимане листья светового фено-
типа накапливали больше продуктов ПОЛ (в сред-
и 1.4 раз соответственно), характеризовались бо- лее высокой активностью SOD (в 1.3 раза) и GPX, чем листья теневого фенотипа (табл. 1). В тече- ние суток максимум этих показателей отмечали в полуденные и послеполуденные часы. Активность GPX изменялась комплементарно содержанию
немв1.3раза),содержалибольшеО•–,НО (в1.2 222
Н2О2. Световые и теневые растения P. media мало отличались по активности САТ, другого важного фермента, утилизирующего Н2О2 (табл. 1).
Порядок величин и закономерности изменения основных показателей про- /антиоксидантного метаболизма растений P. media, произрастающих на пой- менном лугу в районе нижнего течения р. Вымь были сходны с таковыми на Ю. Тимане (табл. 2). На открытом участке листья растений имели повышен- ный окислительный статус, о чем свидетельствует более высокий уровень на- копления продуктов ПОЛ, содержания Н2О2 и активности антиоксидантных ферментов (SOD и пероксидаз). Различия между фенотипами были сильнее выражены в период массового цветения (начало августа), чем в фазу бутониза- ции (конец июня–начало июля). В фазу бутонизации у обоих фенотипов SOD была представлена двумя изоформами Сu/Zn–SOD и одной Mn–SOD. В период массового цветения Mn–SOD идентифицировано не было (рис. 2).
Аскорбат-глутатионовый цикл играет важную роль в детоксикации Н2О2. Аскорбат и глутатион – мощные низкомолекулярные антиоксиданты. Функци- онирование АГЦ в листьях P. media зависело от внутренних факторов (фаза развития) и условий произрастания. Активность ферментов и содержание ме- таболитов АГЦ (табл. 3, 4) в листьях P. media увеличивались в фазу цветения, причем у световых растений в большей степени, чем у теневых. Максимум активности ферментов АГЦ наблюдали в полуденные часы (рис. 3).
В природных условиях листья световых и теневых растений P. media нахо- дятся под воздействием УФ (А+В)-радиации разной интенсивности. Мы иссле- довали эффекты умеренных доз потенциально опасной для фототрофных кле-
Таблица 1
ТБК-РП, нМ/г сухой массы
О2•– 540/мин/г
су хой массы
Н2О2, мкМ /г су хой массы
SOD, Ед/мг белка
GPX, мкМ гваякола/мг белка мин
САТ, мкМ Н2О2/ мг белка мин
Вр емя су ток, ч
16
11
22
Характеристика про-/антиоксидантного метаболизма листьев растений Plantago media (Ю. Тиман, 6–7 июля 2012 г.)
Показатели
Световые растения
442.2±34.9a*
496.0±17.9a* 344.2±19.6b*
321.3±10.8a
387.2±17.6b
248.9±13.5c
3.4±0.2a*
4.1±0.2a* 3.6±0.1a*
2.9±0.1a
3.4±0.2a
3.0±0.1a
9.3±0.2a*
12.2±0.1b* 9.8±0.1a*
28.5±1.9a*
33.0±1.9b* 27.7±2.3a*
10.0±1.1a
12.2±0.8a 7.7±1.2a
8.7±1.0a
11.5±0.7a
6.9±1.0a
8.3±1.2a
4.8±0.4b 10.7±2.1a
11.4±0.8a
8.6±3.6a
6.9±1.9b
Теневые растения
7.0±0.1a
8.4±0.4b
6.5±0.5a
22.6±2.3ab
26.4±1.2b
18.2±2.1а
Примечание: здесь и далее разными латинскими буквами обозначены статистичес- ки значимые различия исследуемого показателя в течение суток, звездочкой – разли- чия между световыми и теневыми растениями (при Р £ 0.05).
Таблица 2
Характеристика про-/антиоксидантного метаболизма
листьев растений Plantago media (пойменный луг р. Вымь, 1–2 августа 2018 г.)
Вр емя суток, ч
ТБК–РП, нМ/г сухой массы
Н2О2, мкМ/г сухой массы
SOD, Ед/мг белка
АРХ, мкМ Asc/ мг белка мин
GPX,мкМ гваякола/мг белка мин
11
22
11
22
20.5±0.7a
23.1±0.2b*
1.2±0.1a
1.7±0.1b*
не опр. 1.5±0.1ab*
1.1±0.1a
1.3±0.1b
не опр.
1.1±0.1a
11.6±0.4a
16.6±0.4b*
не опр. 13.2±1.1c
10.1 ± 0.6a
14.0± 0.8b
не опр.
8.9 ± 0.1a
Световые растения
307.9±11.4a*
327.2±12.2a*
350.1±12.4b* 331.1±22.2a
250.8±13.2a
260.7±12.1a
297.1±14.1b
280.4±11.9ab
17.2±1.1a*
20.0±1.1b*
17.9±1.0a*
15.1±0.4c 22.2±0.5b
Теневые растения
28.3±0.2c*
15.1±1.0a
15.7±1.1a
15.8±1.1a
13.5±0.8b
18.0±0.7a
21.9±0.5a
24.5±0.6b
19.1±1.3a
Рис. 2. Изоформы супероксиддисмутазы в листьях растений Plantago media, про- израстающих на пойменном лугу в фазу бутонизации (а) и массового цветения (б).
Таблица 3
Содержание восстановленной (Asc) и окисленной (DHA) форм аскорбата в листьях растений Plantago media, мкМ/г сухой массы
Вр емя суток, ч
6 29.1±0.6a*
13 34.3±1.5b*
22 30.8±0.6a*
6 54.9±0.6a*
13 56.1±1.1b*
22 54.0±0.5a*
DHA Су ммар ное содер жание
Су ммар ное содер жание
16.0±0.5a
17.7±0.2a
19.3±1.0b
26.1±1.8a
28.9±1.5a
18.4±1.9b
Asc
Asc
DHA
4.0±0.6a
4.8±0.4a
5.4±0.7a
4.6±0.5a
4.8±0.4a
5.1±0.4a
Световые растения
Теневые растения
Фаза бутонизации (2–3 июля)
5.5±0.6a 34.0±0.6a*
8.4±0.8b* 41.4±2.0b*
8.3±1.2b* 39.9±1.3b*
12.0±0.3a
12.4±0.2a
13.9±0.6b
Фаза массового цветения (1–2 августа)
3.5±0.6a 58.4±2.3a*
10.1±1.7b* 66.6±2.3a*
9.7±0.7b* 62.6±1.7a*
22.9±0.3a
23.5±0.8a
24.3±2.4b
8

Таблица 4
Содержание восстановленной (GSH) и окисленной (GSSG) форм глутатиона в листьях растений Plantago media, мкМ GSH/г сухой массы
Вр емя суток, ч
13
6
22
Световые растения
GSSG Су ммар ное содер жание
Теневые растения
GSH
5.6±0.9ab*
9.3±1.5a*
2.6±0.1b
46.8±1.6a*
50.8±2.2a*
49.4±1.4a*
GSH GSSG
Су ммар ное содер жание
2.3±0.3a
3.3±0.1b
2.4±0.1a
24.3±1.4a
21.7±1.1a
23.5±1.1a
Фаза бутонизации (2–3 июля)
0.05±0.01a
0.09±0.01a*
0.45±0.01b*
5.7±0.5a*
9.4±0.4b*
2.9±0.5c
2.2±0.5a
3.2±1.3b
1.9±0.2ab
0.08±0.01a
0.13±0.01a
0.51±0.01b
Фаза массового цветения (1–2 августа)
1.13±0.08a*
1.43±0.24b*
1.82±0.05b*
47.9±1.6a*
52.6±1.5a*
51.6±2.0b*
22.2±1.8a
19.2±1.0a
20.9±1.6a
2.15±0.24a
2.50±0.19b
2.62±0.31b
Рис. 3. Активность дегидроаскорбатредуктазы (А) и глутатионредуктазы (Б) в лис- тьях растений Plantago media, произрастающих на пойменном лугу: а, в – фаза бутони- зации (2–3 июля 2018 г.), б, г – фаза массового цветения (1–2 августа 2018 г.). Столбцы с темной заливкой – световые растения, со светлой – теневые растения.
ток УФ-В радиации (280–315 нм) на про-/антиоксидантный метаболизм листь- ев. Обработка теневых листьев УФ-В в дозе 6 кДж приводила к повышению содержания продуктов ПОЛ и активности SOD в 1.5–2 раза (рис. 4). Дальней- шее повышение дозы не оказывало существенного эффекта. У листьев светово- го фенотипа изменений величины исследованных показателей не выявили.
Листья P. media эллиптические, с 7–9 жилками, составляющими существен- ную часть биомассы листовой пластинки. Известно, что жилки осуществляют
Рис. 4. Влияние УФ–В радиации на накопление продуктов липопероксидации (а) и активность супероксиддисмутазы (б) в листьях светового и теневого фенотипов расте- ний Plantago media. Столбцы с темной заливкой – световые растения, со светлой – теневые растения.
Примечание: разными латинскими буквами обозначали статистически значимые различия по исследуемым показателям между контрольным и опытным вариантом световых и теневых растений (при Р £ 0.05).
важные функции (транспортную, участвуют в передаче сигналов и др.). Срав- нительный анализ показал, что у обоих фенотипов жилки не отличались суще- ственно от заключенной между ними паренхимной ткани по содержанию ТБК– РП и Н2О2 (табл. 5). Однако активность SOD и GPX в паренхиме листьев свето- вых растений была достоверно выше, чем в жилках. При этом активность дан- ных ферментов и содержание Н2О2 в паренхиме и жилках световых растений было в 1.5–3 раза больше, чем у теневых. Эти различия отражают повышен- ный окислительный статус клеток паренхимы листьев в условиях высокой ос- вещенности.
Световые р астения
Теневые р астения
Жилки
Паренхима
Жилки
Паренхима
14.2±2.0 а
15.4±0.7 а
10.0±1.1а
9.7±0.5а
137.3±7.9 а
119.0±15.9 a
131.7±6.2 а
129.6±4.3а
7.5±0.4 а
10.9±0.7 b
3.2±0.7 а
2.5±0.5 а
Характеристика про-/антиоксидантного метаболизма в паренхиме и жилках листьев растений Plantago media
Таблица 5
38.8±1.1 а
49.3±1.7 b
25.5±0.7 а
27.7±0.8 b
Вар иант
Части листа
Н2О2, мкМ/г сухой массы
ТБК–РП, нМ/г сухой массы
GPX, мкМ гваякола/мг белка мин
SOD, Ед/мг белка
Примечание: разными латинскими буквами обозначены статистически значимые различия величин исследуемых показателей между жилками и паренхимой световых и теневых растений (при Р £ 0.05).
Итак, нами получены данные о состоянии про-/антиоксидантного метабо- лизма растений P. mediа, адаптированных в природных условиях к различному уровню освещенности. Листья светового фенотипа отличались от теневых по- вышенным окислительным статусом, накапливали больше продуктов ПОЛ и АФК, характеризовались более высокой активностью антиоксидантных фер- ментов и содержанием низкомолекулярных антиоксидантов, проявляли высо-
кую устойчивость к действию УФ-радиации. В течение суток максимум этих показателей отмечали в полуденные и послеполуденные часы. Выявлена гете- рогенность тканей световых листьев P. media по активности антиоксидантных ферментов.
3.2. Функционирование про-/антиоксидантной системы листьев факультативного САМ-растения Hylotelephium triphyllum в природных условиях
Переход с С3 на САМ-фотосинтез у факультативных видов происходит под влиянием неблагоприятных факторов среды, чаще всего недостатка влаги (Luttge 2000; Broetto et al., 2002; Grams, Thiel, 2002). Немаловажное значение при этом имеет онтогенетическое состояние растений (Cushman, Bohnert, 1999). Работами нашей лаборатории установлено, что наиболее отчетливо признаки перехода на САМ у H. triphyllum проявляются в период генеративного разви- тия растений (Головко и др., 2021).
Мы исследовали функционирование АОС в листьях растений H. triphyllum, произрастающих в прирусловой части пойменного луга поблизости от расте- ний P. media на участке с песчано-супесчаной почвой, покрытой тонким слоем аллювия. Растительность в этой части поймы разреженная. В фазу массового цветения и начала плодоношения растений (июль-август) листья H. triphyllum характеризовались сравнительно интенсивным про-/антиоксидантным метабо- лизмом (табл. 6). Содержание ТБК–РП и активность SOD днем заметно выше, чем рано утром и поздно вечером, тогда как содержание Н2О2 увеличивалось к ночи. На гелях была обнаружена лишь одна изоформа Cu/Zn–SOD (рис. 5).
Таблица 6
Характеристика про-/антиоксидантного метаболизма
листьев растений Hylotelephium triphyllum
в период массового цветения–начало плодоношения (30 июля–1 августа 2018 г.)
Вр емя суток, ч
12
22
ТБК–РП, нМ/г сухой массы
310.1±7.4a
348.2±12.5b
349.5±6.0b
285.3 ±8.5a
Показатель
Н2О2,
мкМ/г сухой массы
92.4±0.7a
89.6±0.3b
86.9±0.7b
92.6±0.1a
SOD, Ед/мг белка
75.1± 6.1a
80.9±5.0a
81.3±4.7a
57.9±2.8b
Обработка листьев индуктором ОС – метилвиологеном не оказала влияния на содержание Н2О2 (табл. 7). Содержание продуктов ПОЛ снижалось почти на 20%. Уровень активности SOD повы- сился в 1.6 раза.
Таким образом, нами установлено, что листья растений H. triphyllum в пе-
Рис. 5. Активность Cu/Zn–SOD в ли- стьях Hylotelephium triphyllum в период массового цветения–начало плодоноше- ния (30 июля–1 августа 2018 г.).
11

Влияние метилвиолагена (10 мкМ)
на показатели про–/антиоксидантного метаболизма листьев растений Hylotelephium triphyllum
Таблица 7
Опыт
130±0.1 a 277±13.9b
102.2±8.4 b
Показатель
Н2О2, мкМ / су хой массы ТБК–РП, нМ/г сухой массы SOD, Ед/мг белка
Вариант
Контроль
134±0.2a 336±7.9a
61.8±12.9 a
Примечание: разными латинскими буквами обозначали статистически значимые различия по исследуемым показателям между контрольным и опытным вариантом (при Р £ 0.05).
риод функционирования САМ-фотосинтеза характеризовались интенсивным про-/антиоксидантным метаболизмом и накапливали значительное количество Н2О2. Содержание Н2О2 не изменялось при воздействии на листья метилвиоло- гена.
3.3. Антиоксидантная защита клеток в процессе деэтиоляции (на примере первого листа проростков Triticum aestivum)
Нами исследованы закономерности изменения про–/антиоксидантного ме-
таболизма первого листа при деэтиоляции пятисуточных проростков пшеницы
на непрерывном свету. Содержание О •– и H O , высокое в этиолированных про- 222
ростках, при переносе на свет сначала снижалось, а спустя несколько часов
вновь повышалось, демонстрируя тем самым сложный характер функциональ-
ных изменений в фототрофных клетках (табл. 8). В последующий период (12–
48 ч) содержание О •– практически не изменялось, а H O уменьшалось, дости- 222
гая минимальных значений к концу эксперимента. Содержание продуктов ПОЛ было наибольшим в период 6–12 ч зеленения (табл. 8).
Общая активность SOD была ниже в этиолированных листьях и в первый час освещения, затем она увеличилась в среднем на 27% (рис. 6а). Максималь- ные значения отмечены в период 6–12 ч зеленения, после чего активность фер- мента вновь снизилась, и в последующие сутки оставалась практически на том же уровне. В экстрактах листьев выявлены три изоформы SOD. Одна иденти- фицирована как Mn–SOD, остальные две как Cu/Zn–SOD (рис. 6б). Судя по интенсивности окраски полос, активность Mn–SOD увеличивалась между 2 и 12 ч деэтиоляции, Cu/Zn–SOD–1 практически исчезала после 12 ч освещения, а активность Cu/Zn–SOD–2 была высокой в течение всего эксперимента.
Этиолированные проростки отличались низким содержанием восстанов- ленного Asc и достаточно высоким содержанием его окисленной формы (DHA) (табл. 9). В процессе зеленения общий пул аскорбата возрастал, в основном за счет восстановленного Asc. Содержание DHA было максимальным в этиолиро- ванных проростках. Содержание общего GSH возрастало в 1.4 раза в первые 4 ч деэтиоляции, и было представлено преимущественно восстановленной фор-
Изменения содержания активных форм кислорода и продуктов перекисного окисления липидов
в процессе деэтиоляции проростков Triticum aestivum
Таблица 8
Деэтиоляция, ч
1
4
12
48
Показатель
О2•–,
540/мин/г сухой массы
19.1±0.7a
14.2±0.5b
16.0±0.6c
15.8±0.8bc 19.2±0.3a
17.3±1.3ac
16.5±0.7c
19.1±1.5a
H2O2, мкМ/г сухой ТБК–РП, нМ/г сухой массы массы
19.0±0.4a 158.5±7.3a
15.2±0.9b 127.5±8.5b
14.5±0.7b 181.8±8.1c
17.1±0.7c 181.35±9.3c
16.4±1.0bc
14.5±0.7b
14.2±0.2b
14.0±0.9d
260.1±19.8d
255.9±9.1d
191.1±7.5c
179.4±12.5c
Примечание: здесь и далее разными латинскими буквами обозначены статистичес- ки значимые изменения величин исследуемых показателей в процессе деэтиоляции (при Р £ 0.05).
мой (90%). После 6 ч экспозиции к свету пул GSH снизился в 2.3 раза. При этом отмечали накопление окисленного глутатиона (GSSG), в среднем на 40%.
Характер изменения активности ферментов АГЦ был практически одина- ковым (рис. 7). Активность АРХ, DHAR и GRувеличивалась при переносе эти- олированных проростков на свет на 10–25%. Затем отмечали некоторое сни- жение уровня их активности. Начиная с 6 ч освещения активность АРХ и DHAR повышалась до уровня, наблюдаемого в этиолированных проростках, актив- ность GR увеличивалась 1.2 раза. Минимальную активность ферментов АГЦ отмечали после 24 ч зеленения.
Таким образом, этиолированные проростки характеризовались относительно высоким уровнем накопления АФК. В процессе деэтиоляции наблюдали моду- ляцию активности антиоксидантных ферментов и содержания низкомолекуляр- ных метаболитов.
Рис. 6. Общая активность (а) и изоформы (б) супероксиддисмутазы в процессе де- этиоляции проростков Triticum aestivum.
Таблица 9
Содержание восстановленной и окисленной форм аскорбата и глутатиона в процессе деэтиоляции проростков Triticum aestivum, мкМ/г сухой массы
Деэтиоляция, ч
0 1.5±0.2a
1 2.2±0.1b
2 1.8±0.1a
4 2.7±0.1b 6 4.2±0.3c
12 не опр.
24 5.4±0.4d
48 6.4±0.5e
Показатель
Asc
DHA
4.2±0.1a
2.5±0.2b
2.3±0.1b
3.7±0.5a 3.8±0.4a
неопр.
2.7±0.1b
2.5±0.2b
Су ммар ное содер жание
5.7±0.2a
4.8±0.1a
4.1±0.2b
6.4±0.4a 8.0±0.4c
неопр.
8.1±0.3d
8.9±0.5d
GSH
8.4±0.7a
8.8±0.5a
9.5±0.6a
12.0±0.8b 10.3±0.3ab
GSSG
0.6±0.1a
0.9±0.1a
0.7±0.1a
0.7±0.1a 0.7±0.1a
Су ммар ное содер жание
9.0±0.5a
9.7±0.4a
10.2±0.8a
12.7±0.7b 11.0±0.5b
4.0±0.3c 0.2±0.01a 4.2±0.1c
3.7±0.4c 2.2±0.3b 5.9±0.3c
4.3±0.5c 1.50±0.3b 5.8±0.2c
Рис. 7. Динамика изменения активности аскорбатпероксидазы (а), дегидроаскор- батредуктазы (б) и глутатионредуктазы (в) в процессе деэтиоляции проростков Triticum aestivum.
Глава 4. ПРО-/АНТИОКСИДАНТНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ
И ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ ПРИ АДАПТАЦИИ РАСТЕНИЙ К УСЛОВИЯМ ОБИТАНИЯ И ЗЕЛЕНЕНИИ (ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ)
4.1. Особенности функционирования про-/антиоксидантной системы дикорастущих растений в природных условиях
Изучение генерации АФК и функционирования АОС растений природной флоры расширяет представления об их жизнедеятельности и реакциях на воз- действие факторов среды, способных нарушить баланс между поглощением и использованием световой энергии. Нами исследованы закономерности функ- ционирования про-/антиоксидантного метаболизма и компонентов АОС в лис- тьях P. media (С3-вид) и H. triphyllum (факультативный САМ-вид) в природных местообитаниях в подзоне средней тайги Республики Коми (европейский се- веро-восток России).
Ранее в нашей лаборатории были получены данные об адаптивных моди- фикациях и защитных реакциях растений P. media в местообитаниях с разным режимом освещенности (Головко и др., 2011; Golovko et al., 2012; Zakhozhiy et
al., 2020). Нашими исследованиями установлено, что листья световых расте-
ний отличались от затененных повышенным окислительным статусом. Содер-
больше в среднем на 20–30%, чем в листьях теневых растений (табл. 1 и 2). Увеличение пула АФК и ТБК–РП в дневные часы больше зависело от освещен- ности, чем от изменения других факторов среды, о чем свидетельствуют ре- зультаты дисперсионного анализа (ANOVA). Накопление продуктов липопе- роксидации в листьях световых растений наблюдалось на фоне полуденной депрессии фотосинтеза (Головко и др., 2011). Полученные результаты согласу- ются с представлениями о том, что в условиях высокой освещенности дисба- ланс между поглощением лучистой энергии и возможностью ее реализации в процессе фотосинтеза приводит к увеличению генерации АФК (Li et al., 2009; Pospisil, 2016; Foyer, 2018).
Метаболический дисбаланс и накопление АФК, вызванные высокой интен- сивностью света и/или другими неблагоприятными факторами, производят сиг- налы, которые интегрируются и передаются в другие части клетки, в результа- те клеточная физиология и биохимия корректируются, чтобы растение могло адаптироваться (Foyer, 2018). Считается, что H2O2 может действовать как пре- образователь, а также как инициатор ретроградной передачи сигналов (Vanderauwera et al., 2005; Galvez-Valdivieso et al., 2009; Borisova-Mubarakshina et al., 2015; Exposito-Rodriguez et al., 2017). Вполне вероятно, что повышение Н2О2 в листьях световых растений P. media способствует активации АОС и механизмов фотозащиты, включая процессы, связанные с нефотохимическим тушением. Показано, что механизм тепловой диссипации энергии активиро- вался существенно в листьях светового фенотипа P. media (Головко и др., 2011; Golovko et al., 2012).
SOD является «первой линией защиты» от ОС, поскольку регулирует уро-
более высоким, чем листья теневого фенотипа, уровнем активности SOD (табл. 1 и 2). Эта закономерность проявлялась во все годы исследований, независимо от погодных условий и фазы развития растений. Листья исследуемых феноти- пов не отличались по изоферментному составу SOD, причем более активной в течение всего фотопериода была Cu/Zn–SOD (рис. 2). Известно, что Cu/Zn– SOD может компенсировать низкую активность и/или отсутствие активности Fe–SOD в пластидах (Pilon et al., 2011; Ravet, Pilon, 2013).
В хлоропластах АРХ находится в тесном функциональном и структурном взаимодействии с SOD, что способствует быстрой нейтрализации молекул О •– и утилизации Н2О2 (Иванов и др., 2013). Нами обнаружены сходные тренды2в изменении активности APX и SOD. Активность АРХ была более высокой в листьях световых растений P. media, чем теневых, в течение всего фотоперио- да (табл. 2).
Гваяколпероксидазы относятся к III классу пероксидаз, однако многие ис- следователи принимают активность GPX за общую активность всех клеточ- ных пероксидаз. Согласно нашим данным, листья светового и теневого фено- типов либо достоверно не отличались по активности GPX, либо уровень ак-
жание АФК (О •– и Н О ) и продуктов ПОЛ в листьях световых растений было 222
вень накопления О •–. Листья световых растений P. media характеризовались 2
тивности фермента был выше в листьях световых растений P. media, что ука- зывает на динамичность данного показателя (табл. 1 и 2). Световые и теневые растения P. media мало отличались по активности САТ, другого утилизирую- щего Н2О2 фермента (табл. 1). Вероятно, это связано с разным сродством пе- роксидазы и САТ к Н2О2. Как известно, САТ включаются в работу при чрезмер- ном накоплении Н2О2 (Anjum et al., 2016).
Водорастворимые антиоксиданты являются необходимым компонентом АОС. Аскорбат выполняет ряд важных функций в регуляции фотосинтеза, осо- бенно при акклимации растений к высокой интенсивности света (Plumb et al., 2018). Он участвует в регуляции накопления АФК, выступает в качестве аль- тернативного донора электронов для ФСII, необходим для регенерации жиро- растворимых антиоксидантов (токоферолов и токотриенолов), участвует в био- синтезе антоцианов и требуется для превращения виолаксантина в зеаксантин в светозависимом виолаксантиновом цикле. Согласно нашим данным, листья световых растений P. media отличались вдвое большим размером пула общего аскорбата, чем листья теневых растений, причем у обоих фенотипов доля вос- становленной формы составляла 70–80% (табл. 3). Высокий уровень Asc в зре- лой фотосинтезирующей ткани согласуется с представлениями о роли этого метаболита в защите ФСА от фотодеструкции. Тот факт, что в листьях обоих фенотипов основная доля общего Asc приходилась на восстановленную форму указывает на эффективную работу систем регенерации данного метаболита. Помимо синтеза de novo, окисленная форма Asc регенерируется до восстанов- ленной в глутатионзависимой реакции с участием DHAR. Согласно нашим данным, активность DHAR была выше в листьях световых растений P. media (рис. 3А), что свидетельствует о важности поддержания высокого уровня вос- становленной формы Asc в зрелой фотосинтезирующей клетке.
Глутатион является донором электронов для функционирования DHAR. Он способен восстанавливать сульфгидрильные группы белков после их окисле- ния в реакциях с Н2О2, служит субстратом для GR, является важным участни- ком редокс-сигнализации (Foyer, Noctor, 2011). Листья световых растений P. media содержали значительно больше восстановленного GSH по сравнению с теневыми растениями (табл. 4). Полученные результаты могут свидетельство- вать о важности данного метаболита для поддержания редокс-гомеостаза клетки и как регулятора сигнальных путей. Общий пул глутатиона в листьях P. media был представлен преимущественно его восстановленной формой (80–90%). При этом листья теневых растений отличались повышенным содержанием GSSG, что вероятно обусловлено пониженной активностью фермента GR (рис. 3Б).
В совокупности полученные результаты позволяют полагать, что эффек- тивное функционирование АГЦ является характерной особенностью метабо- лизма листьев растений светового типа и важным компонентом адаптивной реакции фотосинтезирующих тканей при избыточной радиации.
Значительную часть массы (объема) листа P. media занимают жилки. Ранее сообщалось, что проводящие ткани являются важным источником молекул H2O2 в растениях особенно во время воздействия неблагоприятных факторов среды (Slesak et al., 2007). Наши данные указывают на присутствие Н2О2 в проводя-
щей системе листьев P. media (табл. 5). Однако антиоксидантный статус парен- химы листьев P. media, заключенный между жилками, был выше, чем у самих жилок, что свидетельствует о более высоком окислительном статусе клеток паренхимы в условиях высокой освещенности.
Низкие дозы УФ вызывают эустресс и стимулируют повышение толерант- ности растений к воздействию более высоких доз. Мы не выявили эффекта экологически значимых доз УФ-В радиации на про-/антиоксидантный метабо- лизм листьев световых растений P. media. В то же время у листьев теневых растений эти дозы вызывали развитие ОС, о чем свидетельствует увеличение содержания продуктов ПОЛ и активности SOD (рис. 4).
Таким образом, нами установлено, что листья растений светового феноти- па P. media характеризовались более высоким накоплением АФК и продуктов ПОЛ по сравнению с листьями теневых растений. Этому соответствовала бо- лее высокая активность антиоксидантных ферментов и АГЦ. Следовательно, смещение про-/антиоксидантного статуса в условиях высокой инсоляции явля- ется стабильной характеристикой метаболизма световых растений, связанной с развитием толерантности к световому фактору. Однофакторный дисперсион- ный анализ (ANOVA) показал, что все микроклиматические факторы среды на уровне растений (ФАР, УФ-радиация и температура воздуха), в большинстве случаев оказывали статистически значимое влияние (Р £ 0.05) на компоненты про-/антиоксидантного метаболизма листьев P. media. Однако наибольшие зна- чения критерия Фишера были получены для светового фактора. Это означает, что интенсивность света сильнее влияет на АОС, чем все другие факторы.
Большой теоретический и практический интерес представляет сравнитель- ное изучение про-/антиоксидантного метаболизма растений с разным типом фотосинтеза (С3 и САМ) и особенно видов, способных осуществлять С3-САМ переход при неблагоприятном действии среды (Winter, Holtum, 2014). Счита- ется, что САМ-растения устойчивы к высокому содержанию АФК (Surоwka et al., 2007; Niewiadomska, Borland, 2008). H. triphyllum – один из немногочислен- ных представителей сем. Crassulaceae на территории Республики Коми (Голов- ко и др., 2007). Об индукции САМ у H. triphyllum свидетельствуют закономер- ные суточные изменения кислотности клеточного сока, содержания малата и активности ФЕП-карбоксилазы, наиболее выраженные в период генеративно- го развития растений (Головко и др., 2021). Нами установлено, что в фазу мас- сового цветения листья H. triphyllum содержали в среднем в 1.2 раза больше ТБК–РП, чем в листьях P. media (табл. 6). Содержание Н2О2 в них достигало 80–90 мкМ/г сухой массы, тогда как у P. media не превышало 22 мкМ/г сухой массы. Активность SOD в листьях H. triphyllum была в три раза выше, чем в листьях P. media. Это согласуется с имеющимися в литературе сведениями об интенсивном про-/антиоксидантном метаболизме листьев САМ-растений (Li et al., 2001). Высокое содержание Н2О2 в листьях H. triphyllum, по крайней мере частично, обусловлено повышенной активностью SOD. Опыты с метилвиоло- геном показали, что в обработанных индуктором ОС листьях активность SOD возрастала в 1.6 раза, что ограничивало накопление ТБК–РП (табл. 7). Причем содержание Н2О2 оставалось стабильно высоким. Наши данные о содержании
Н2О2 в листьях H. triphyllum и имеющиеся в литературе сведения (Pei et al., 2000; Murata et al., 2014; Slesak et al., 2003, 2008; Surowka et al., 2016) позволя- ют полагать, что Н2О2 может участвовать в регуляции САМ.
4.2. Динамика изменения активности ключевых компонентов антиоксидантной системы в процессе деэтиоляции проростков Triticum aestivum на непрерывном свету
Ключевым событием процесса деэтиоляции является трансформация эти- опластов в хлоропласты и формирование функционально компетентных фото- синтетических комплексов, что, в конечном итоге, позволяет растению пере- ключиться с гетеротрофного на автотрофный тип питания (Solymosi, Schoefs, 2010; Garmash et al., 2013; Кузнецов и др., 2020). В гетеротрофных тканях и органах растений основным источником АФК являются митохондрии (Muller, 2001), а также апопластная система генерации свободных радикалов (Mhamdi, van Breusegem, 2018). На начальных этапах зеленения образование АФК на свету может быть связано с формирующимся в этиохлоропластах ФСА (Asada, 2006; Leonowicz et al., 2018).
Нами выявлено, что этиолированные проростки пшеницы характеризова-
лись сравнительно высоким содержанием О •–, Н О и ТБК–РП (табл. 8). Отме- 222
чали также превалирующее содержание DHA и относительно низкую актив-
ность антиоксидантных ферментов. Это согласуется с имеющимися в литера-
туре сведениями о развитии ОС у проростков в темноте (Aleksandrushkina et
al., 2004; Корсункова и др., 2013). В первые часы после переноса 5–суточных
этиолированных проростков пшеницы на свет наблюдали некоторое снижение
содержания АФК и ТБК–РП. Далее в процессе деэтиоляции содержание О •– и 2
Н2О2 менялось незначительно. Активацию процессов ПОЛ отмечали в период
развития тилакоидной системы, что вероятно связано с повышенным образо-
ванием1О впроцессесинтезахлорофилла(Tripathy,Oelmuller,2012).Относи- 2
тельно стабильному уровню О •– и Н О способствовала активация АОС. Об- 222
щая активность SOD повышалась в период с 2 до 12 ч зеленения, когда проис- ходит активное формирование ФСА (Garmash et al., 2013). Анализ белковых профилей выявил наличие одной изоформы Мn–SOD и двух Cu/Zn–SOD в эти- олированных и зеленеющих проростках пшеницы (рис. 6). Это означает, что переход к зеленению не вызывает появления дополнительных форм SOD. Наи- более активной в течение всего эксперимента была Cu/Zn–SOD. Изоформы Fe– SOD не были идентифицированы. Это согласуется с данными других авторов (Leonowicz et al., 2018). Увеличение активности митохондриальной Мn–SOD наблюдали в период с 4 до 12 ч освещения, когда дыхание проростков было максимальным. Полученные нами данные согласуются с динамикой экспрес- сии генов разных изоформ SOD в процессе деэтиоляции проростков пшеницы, описанной в работе Garmash с соавт. (2017).
В ходе зеленения пул общего и восстановленного Asc возрастал и увеличи- вался почти вдвое спустя сутки экспозиции на свету. Известно, что синтез Asc индуцируется светом, что связано со светозависимой индукцией экспрессии генов ферментов, участвующих в его синтезе (Foyer, Noctor, 2011). Очевидно,
что изменения пула и соотношения разных форм Asc зависели от активности ферментов АГЦ. Нами установлено, что активность АPX, DHAR и GR была существенно выше в первые 24 ч зеленения, чем в последующее время (рис. 7). Это свидетельствует об участии АГЦ в поддержании про-/антиоксидантного баланса клетки в процессе развития тилакоидной системы и в целом ФСА. Об- щий пул GSH в течение первых 6 ч деэтиоляции возрастал и был представлен преимущественно его восстановленной формой (табл. 9). Это согласуется с представлениями о том, что растения в условиях нарушения клеточного гоме- остаза характеризуются высоким относительным содержанием восстановлен- ного GSH, необходимого для защиты от ОС (Foyer, Noctor, 2011). После 24- часового периода на свету, когда ФСА и собственные защитные системы хло- ропластов были уже практически сформированы, общий пул и относительное содержание восстановленного GSH существенно снизилось на фоне уменьше- ния активности GR. Возможно, что снижение общего пула GSH и соотноше- ния GSH/GSSG в этот период является сигналом для снижения активности АОС, что наблюдали в эксперименте.
Таким образом, нами выявлены закономерности изменения про-/антиокси- дантного метаболизма в процессе деэтиоляции проростков пшеницы, свидетель- ствующие в пользу представлений об участии АОС в поддержании гомеостаза фотосинтезирующей клетки в период становления фотосинтетической функции.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Наша работа была посвящена изучению про-/антиоксидантного статуса и выявлению закономерностей функционирования АОС дикорастущих растений в нестабильной среде природных местообитаний, а также этиолированных проростков при переносе на свет.
На примере сравнительного изучения двух фенотипов P. media в разных местообитаниях показано, что повышение антиоксидантного статуса является стабильной характеристикой метаболизма листьев растений, связанной с раз- витием толерантности к световому фактору. Листья растений светового фено- типа отличались повышенным, по сравнению с листьями теневых растений, накоплением АФК и уровнем ПОЛ. Этому соответствовала более высокая ак- тивность SOD, пероксидаз и АГЦ. Выявлено, что основной вклад в повыше- ние про-/антиоксидантного статуса листьев светового фенотипа вносят клетки паренхимы листа, тогда как в проводящих тканях (жилки) уровень активности антиоксидантных ферментов (SOD и GPX) в 1.3–1.4 раза ниже. Полученные результаты свидетельствуют в пользу представлений о том, что скоординиро- ванные изменения компонентов АОС играют важную роль при освоении рас- тениями местообитаний с разным уровнем освещенности.
САМ-фотосинтез присущ сравнительно небольшому числу видов растений, освоивших территории с теплым и сухим климатом. Нами установлено, что листья H. triphyllum, способного осуществлять переход с С3 на САМ-тип фото- синтеза, характеризовались более интенсивным про-/антиоксидантным мета- болизмом, чем обитающие в тех же условиях С3-растения P. media. Листья
H. triphyllum содержали в пять раз больше Н2О2 и отличались высокой активностью SOD, особенно в пери- од функционирования САМ. Ста- бильно высокое содержание Н2О2 может свидетельствовать об его уча- стии в регуляции САМ.
Нами установлены закономерно-
сти изменения про-/антиоксидантно-
го метаболизма этиолированных
проростков T. aestivum при экспози-
ции к свету. Выявлен вклад АОС и
ее отдельных компонентов в поддер-
жание окислительно-восстанови-
тельного баланса клеток зеленеюще-
го листа, в котором происходят кар-
динальные структурно-функцио-
нальные изменения, приводящие к переходу на автотрофный тип питания. Вы- явлено накопление низкомолекулярных антиоксидантов, повышение активнос- ти антиоксидантных ферментов и АГЦ в период 6–12 ч деэтиоляции – время формирования тилакоидной системы и становления фотосинтетической функ- ции. Полученные данные свидетельствуют о ключевой роли АОС на ранних этапах фотоморфогенеза растений.
В целом, полученная нами информация о генерации АФК и влиянии вне- шних условий на функционирование АОС позволяет расширить представле- ния о жизнедеятельности дикорастущих видов растений, активности и взаимо- действии компонентов АОС с другими, ограничивающими образование АФК процессами у растений природной флоры, обитающих в постоянно изменяю- щихся естественных условиях среды. Наши данные свидетельствуют о роли АОС растений при формировании устойчивости к высокой инсоляции (рис. 8).
ВЫВОДЫ
1. Установлено, что листья светового фенотипа дикорастущих растений
Н2О2), продуктов перекисного окисления липидов и более высоким уровнем активности супероксиддисмутазы, пероксидазы и аскорбат-глутатионового цикла, что связано с развитием толерантности к избыточной освещенности в открытых местообитаниях. Суточные изменения про-/антиоксидантного мета- болизма обусловлены сопряженным действием комплекса внешних факторов, среди которых интенсивность света является ведущим.
2. Выявлена гетерогенность тканей листьев светового фенотипа Plantago media по уровню активности ферментов антиоксидантной защиты. Активность супероксиддисмутазы и гваяколпероксидазы в 1.3–1.4 раза выше в паренхим- ной ткани между крупными жилками, чем в самих жилках, что указывает на
Рис. 8. Графическое представление о вов- лечении антиоксидантной системы в разви- тие устойчивости растений при измении ус- ловий среды обитания.
Plantago media отличались от теневых повышенным накоплением АФК (О •–, 2
роль ферментов в регуляции окислительно-восстановительного баланса кле- ток мезофилла в условиях высокой инсоляции. У листьев теневого фенотипа, получающих на порядок меньше света, такие различия не наблюдались.
3. Установлено, что активность про-/антиоксидантного метаболизма листь- ев световых растений Plantago media не изменялась после экспозиции к УФ-В радиации в дозе сопоставимой с получаемой в течение суток в природных ус- ловиях, тогда как листья теневых растений содержали на 30% больше продук- тов липопероксидации, а активность супероксиддисмутазы в них повышалась на 50% по сравнению с контролем.
4. Листья Hylotelephium triphyllum содержали в 4–5 раз больше пероксида водорода и характеризовались более высокой активностью супероксиддисму- тазы, чем листья Plantago media, что свидетельствует в пользу представлений о повышенном уровне про-/антиоксидантного метаболизма САМ-растений. Обработка листьев Hylotelephium triphyllum индуктором окислительного стрес- са – метилвиологеном существенно увеличивала активность супероксиддис- мутазы, но содержание пероксида водорода оставалось стабильным.
5. Выявлены закономерности изменения про-/антиоксидантного метаболиз- ма после переноса этиолированных проростков Triticum aestivum в условия не- прерывного освещения. Содержание продуктов липопероксидации и АФК (О •–
, Н2О2) в листьях пятисуточных этиолированных проростков пшеницы снижа-
лось в самом начале деэтиоляции в среднем на 25%. Наибольшую активность антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутазы и пероксидаз) и аскорбат- глутатионового цикла отмечали в период 6–12 ч зеленения – время формиро- вания тилакоидной системы хлоропластов и становления фотосинтетической функции листа.