Характеристика кислород-зависимой и кислород-независимой бактерицидных систем нейтрофилов крови при лейкозе крупного рогатого скота

2.1 Материалы и методы исследования. Экспериментальная часть
диссертационной работы выполнена в период с 2018 по 2021 гг. в ФГБОУ ВО
Омский ГАУ на кафедре ветеринарной микробиологии, инфекционных и
инвазионных болезней и на базе ФГБНУ «Омский аграрный научный центр» в
отделе ветеринарии.
Для изучения эпизоотической ситуации и динамики эпизоотического
процесса инфекции ВЛКРС использованы данные годовой ветеринарной
отчетности областной и районных ветеринарных лабораторий о результатах
диагностических исследований на лейкоз крупного рогатого скота (количестве
инфицированных и больных) на территории Омской области в 2014-2018 году. На
основании собранного материала с использованием специальной компьютерной
программы «Эпизоотическое районирование» (Е.С. Борисов и др., 2020)
осуществляли составление картограмм инфицированности и заболеваемости за
отдельно взятый год и в динамике за ряд лет.
Объектом исследования являлся крупный рогатый скот симментальской и
черно-пестрой породы (молодняк разных периодов постнатального развития и
коровы от 3-х лет и старше, свыше 1500 голов), принадлежащие разным
сельскохозяйственнымпредприятиямОмской областисшироким
распространением вирусной инфекции. В опыте с экспериментальным
инфицированием лабораторных животных вирусом лейкоза использовано 10
беспородных кроликов в возрасте 3-4-х месяцев.
Предметом исследования являлась периферическая кровь и сыворотка крови
животных. Всего исследованию было подвергнуто 657 голов.
Для экспериментального инфицирования кроликов использовали кровь от
больной лейкозом коровы с лейкоцитозом 18 тыс/мкл и лимфоцитозом 92%,
которую вводили в краевую вену уха однократно в объеме 1 мл в соответствии с
методикой, описанной в работе М.И. Гулюкина с соавт. (2015).
ВирусоносительствоВЛКРСопределялиспомощьюреакции
иммунодиффузии (РИД) в геле агара с использованием коммерческого набора
(производство ФКП «Курская биофабрика – фирма «Биок», Россия), а также
реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) в нашей модификации с
использованием компонентов из набора для диагностики лейкоза в РИД и
люминесцирующей сыворотки против глобулинов быка. Учет реакции
осуществляли по 4-х крестной системе с оценкой не менее 3-х крестов на
микроскопе Axiostar plus (производство Carl Zeiss, Германия).
Гематологический метод исследования проводили в соответствии с
Методическими указаниями по диагностике лейкоза крупного рогатого скота
(2000).
Выделение провируса лейкоза из крови крупного рогатого скота, а также
постановку полимеразной цепной реакции (ПЦР) проводили в соответствии с
инструкцией производителя по применению коммерческих наборов. В работе
использовали комплект реагентов для выделения ДНК из клинического материала
«ДНК-сорб-В», а также тест-систему «ЛЕЙКОЗ» для выявления вируса крупного
рогатого скота методом ПЦР вариант FRT50 F (изготовитель ФБУН ЦНИИ
эпидемиологииРоспотребнадзора).Амплификациюосуществлялина
анализаторе-термоциклере для детекции нуклеиновых кислот методом ПЦР в
реальном времени ICycler iQ5 (BioRad, США).
Состояние ферментных и неферментных систем нейтрофильных
гранулоцитов оценивали посредством определения в цитоплазме содержания
лизосомально-катионных белков (ЛКБ) по методу М.Г. Шубича с бромфеноловым
синим и активности миелопероксидазы (МПО) по методу Грэхем-Кнолля с
использованием бензидина. В мазках с помощью иммерсионной микроскопии
учитывали процент положительно прореагировавших клеток по активности
гранул (неактивные, мало- (1-я степень), средне- (2-я) и высокоактивные (3-я
степень)) и в соответствии со стандартными методиками рассчитывали средний
цитохимический коэффициент (СЦК).
При разработке математических моделей основным статистическим
инструментарием исследования явились методы регрессионного анализа
(приближение функций по методу наименьших квадратов). Обработку цифрового
материала еще одним вариантом регрессионного метода – дискретно-
динамическим анализом, проводили с помощью специальной компьютерной
программы (Е.С. Борисов и др., 2021).
Цифровые данные обрабатывали с помощью стандартных методов
вариационной статистики. Статистическую значимость различий средних
оценивали по t-критерию Стьюдента.
2.2 Эпизоотологическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота в
Омской области. Анализ серологических и гематологических исследований,
проведенных за период с 2014 по 2018 год, свидетельствует о неблагоприятной
эпизоотической обстановке по лейкозу крупного рогатого скота сложившейся на
территории Омской области.В соответствии с данными годовой статистической
отчетности областной и районных ветеринарных лабораторий в общей сложности
за 5 лет было подвергнуто серологическому исследованию с помощью реакции
иммунной диффузии (РИД) более 1,9 млн. проб сывороток крови, из которых
около 304,5 тыс. (15,9%) оказались положительными.
С 2014 года, в котором было выявлено минимальное количество носителей
вируса лейкоза (10,7%), наблюдается увеличение уровня инфицированности,
достигающее максимума (17,3%) в 2017 году. Затем в 2018 году отмечено
снижение величины серопревалентности до 16,8%. Необходимо также отметить,
что минимум, зарегистрированный в 2014 году, совпал с наименьшим числом
проведенных серологических тестирований с помощью РИД. В частности, за
указанный период было подвергнуто обследованию около 302 тыс. проб. В
последующие годы охват поголовья диагностическими исследованиями был
выше, о чем свидетельствовал объем проведенных тестирований, который
составил от 388,2 тыс. проб и выше. Гематологическим методом с 2014 по 2018
год было суммарно исследовано около 705 тыс. проб крови, что позволило
выявить 2217 (0,3%) больных лейкозом голов крупного рогатого скота. Процент
гематологически больных животных был приблизительно одинаковым в течение
наблюдаемого нами периода – от 0,3 до 0,4%.
Затем нами было проведено ранжирование районов с помощью специальной
компьютерной программы по уровню (высокий, средний и низкий)
инфицированности ВЛКРС или заболеваемости лейкозом как за отдельно взятый
год, так и суммарно за ряд лет. По результатам серологических исследований за 5
лет (2014-2018 гг.) самое значительное распространение инфекции ВЛКРС
регистрируется в Черлакском районе (36,3%), Исилькульском (34,0%) и
Москаленском (30,1%) районах, в то же время самые минимальные значения
вирусоносительства наблюдали в Седельниковском (2,4%), Азовском (2,5%),
Одесском (3,3%), Крутинском (4,6%), Полтавском (7,2%), Омском (8,4%),
Марьяновском (9,9%) и Тевризском (9,9%) районах. Еще в 21 из 32 районов
Омской области уровень серопревалентности составил от 10 до 30 %.
По результатам гематологических исследований территорию Омской области
можно разделить на следующие группы: до 0,3; от 0,31 до 1,0 и свыше 1,0 %
больных коров, находящихся в гематологической стадии заболевания. Анализ
лабораторных исследований за период с 2014 по 2018 год показал, что ни одного
случая проявления лейкоза в гематологической стадии не было установлено в 5
районах области: Большеуковском, Знаменском, Муромцевском, Нижнеомском и
Одесском. Самый большой процент положительных проб (свыше 1 %) в сумме за
5 лет зарегистрирован в Марьяновском, Оконешниковском, Седельниковском и
Усть-Ишимском районах.
Таким образом, в результате анализа серологических и гематологических
исследований за 2014-2018 годы установлена тенденция к увеличению числа
инфицированных ВЛКРС при практически неизменном проценте больных
животных за этот же период.

2.3 Оценка кислород-зависимых и кислород-независимых механизмов
бактерицидной системы нейтрофильных гранулоцитов у кроликов,
инфицированных ВЛКРС. С целью изучения особенностей двух составных
частей антимикробной защиты, одна из которых реализует свою активность в
присутствии кислорода, а другая – в анаэробных условиях, было отобрано 10
беспородныхкроликов.Частьособей(n=5)былаподвергнута
экспериментальному инфицированию ВЛКРС. Остальные животные (n=5)
служили в качестве контроля.
Через 30 и 90 суток после экспериментального инфицирования от
лабораторных животных была отобрана кровь для серологических исследований с
помощью РИД и РНИФ в предложенной нами модификации, а также оценки
функционального состояния нейтрофилов цитохимическими методами
(активность миелопероксидазы, содержание лизосомальных катионных белков).
Положительная реакция как с помощью РИД, так и РНИФ на 30-е сутки от
начала эксперимента была выявлена у 3-х из 5-и кроликов. Тем не менее, следует
отметить, что у 2-х непрореагировавших особей наблюдали люминесценцию
антител с оценкой на 2 креста. На 90-е сутки после экспериментального
инфицирования ВЛКРС у 4-х из 5-и животных была установлена положительная
РИД, в то же время по результатам исследований в РНИФ у всех кроликов
опытной группы была зафиксирована люминесценция антител с оценкой на 3-4
креста. Все особи контрольной группы как в первый, так и во второй срок
исследования были серонегативными при их тестировании как в РИД, так и
РНИФ.
Результаты исследования функционального состояния нейтрофильных
гранулоцитов у кроликов на 30-е сутки после экспериментального
инфицирования ВЛКРС показали, что на 30 сутки после инфицирования кроликов
по сравнению с контрольной группой происходит увеличение числа клеток с
нулевой активностью миелопероксидазы (МПО) в 2 раза (р<0,001), катионных белков лизосом (ЛКБ) – в 2,1 раза (р<0,05), а также одновременное снижение количества нейтрофилов с высокой активностью гранул (3 степень) соответственно в 3,15 и 3,8 раза (р<0,001). Такого рода изменения также способствовали существенному уменьшению СЦК МПО и ЛКБ в 2,1 раза (р<0,001). На следующий срок исследования нами отмечена аналогичная закономерность изменений, но характеризующихся большей интенсивностью по сравнению с результатами, полученными на 30-е сутки после инфицирования. В частности, по результатам изучения ферментной активности МПО у инфицированных кроликов относительно контрольной группы наблюдалось уменьшение числа нейтрофильных гранулоцитов с 3-й степенью в 5,3 раза (р<0,001), а неферментных катионных белков – в 4,1 раза (р<0,001). Снижению также было подвернуто количество клеток со 2-й степенью активности, однако статистически значимой разницы достигало только изменение МПО. На 90-е сутки после инфицирования ВЛКРС также наблюдался, выраженный в более значительной степени по сравнению с предыдущим исследованием, рост числа неактивных нейтрофилов. Так, количество нейтрофилов с нулевой активностью МПО и ЛКБ относительно контроля возрастало соответственно в 2,5 (р<0,001) и 2,8 (р<0,001) раза. Вследствие выявленных изменений, происходило дальнейшее падение СЦК МПО и ЛКБ. Так, если этот коэффициент при первоначальном исследовании на 30-е сутки после инфицирования был снижен в 2,1 раза, то при повторном на 90-е сутки – соответственно в 3,9 и 3,5 (р<0,001) раза. Таким образом, на основании полученных результатов можно прийти к заключению о том, что у кроликов, инфицированных ВЛКРС, происходит угнетение как кислород-зависимых (миелопероксидаза), так и кислород- независимых (катионные белки) систем бактерицидной защиты нейтрофильных гранулоцитов, нарастающее по мере увеличения срока после экспериментального заражения. 2.4 Оценка кислород-зависимых и кислород-независимых механизмов бактерицидной системы нейтрофильных гранулоцитов у инфицированного вирусом лейкоза молодняка крупного рогатого скота разного возраста. По результатам диагностических исследований было отобрано 80 особей разного возраста: 20 – в возрасте до 2-х месяцев (10 интактных (контроль) и 10 положительно реагирующих в ПЦР (инфицированные ВЛКРС));20 – в возрасте 4- 6 месяцев (15 интактных и 5 носителей ВЛКРС);20 – в возрасте 9-12 месяцев (15 интактных и 5 носителей ВЛКРС);20 – в возрасте 15-17 месяцев (10 интактных и 10 носителей ВЛКРС). У всех животных оценили функциональное состояние нейтрофильных гранулоцитов путем определения в крови активности миелопероксидазы и содержания катионных белков лизосом цитохимическим методом. Как показали полученные результаты, ПЦР-позитивный молодняк в возрасте до 2-х месяцев по сравнению с интактными животными этого же возраста имеет более высокое содержание клеток с высокой активностью гранул с МПО и ЛКБ и, напротив, низкое – с нулевой активностью гранул (табл. 1). В частности, у инфицированных телят количество МПО-, ЛКБ-позитивных клеток с 3-й степенью возрастало соответственно до 76,2±2,6% против 60,9±2,86% (р<0,01) и 66,2±2,23% против 56,0±3,13% (р<0,01) у ПЦР-отрицательных животных. В то же время число МПО-, ЛКБ-неактивных клеток уменьшалось соответственно до 14,7±1,58% против 29,3±2,23% (р<0,001) и 21,5±1,86% против 31,7±2,9% (р<0,01) в контрольной группе. Об активизации функционального состояния нейтрофильных гранулоцитов также свидетельствовало увеличение средних цитохимических коэффициентов СЦК МПО и ЛКБ соответственно до 2,44±0,06 против 1,99±0,07 (р<0,001) и 2,18±0,06 против 1,88±0,08 (р<0,01). Таблица 1 – Активность миелопероксидазы и содержание катионных белков лизосом у интактных и ПЦР-позитивных телят в возрасте до 2-х месяцев, M±m ЦитохимическиеМиелопероксидазаКатионные белки лизосом показателиПЦР-ПЦР+ПЦР-ПЦР+ 0 степень, %29,30±2,2314,70±1,58 ** 31,70±2,9021,50±1,86* 1 степень, %2,80±0,532,60±0,564,60±0,585,20±0,81 2 степень, %7,00±1,586,50±1,177,70±1,837,10±1,00 3 степень, %60,90±2,8676,2±2,60 * 56,00±3,1366,20±2,23* СЦК1,99±0,072,44±0,06**1,88±0,082,18±0,06* Примечание: *р<0,01; **р<0,001. У инфицированного вирусом лейкоза молодняка крупного рогатого скота в возрасте 4-6 месяцев по сравнению с телятами, имеющими отрицательный результат в ПЦР, наблюдалась идентичная траектория изменений. В этой возрастной группе также наблюдалось уменьшение количества МПО-неактивных клеток до 21,20±2,54% против 29,66±3,18% (р<0,05) и ЛКБ-неактивных клеток до 16,00±2,12% против 31,60±1,17% (р<0,001) у интактного молодняка крупного рогатого скота. Одновременно происходил рост числа нейтрофилов с 3-й степенью активности гранул с МПО и ЛКБ, а также их СЦК. У молодняка 9-12-месячного возраста прослеживалась такая же закономерность изменений цитохимических показателей, которая нами была выявлена у телят в возрасте до 6-и месяцев. У них было зарегистрировано снижение МПО-неактивных клеток до 23,0±2,48% против 41,86±3,71% (р<0,01) в группе ПЦР-отрицательных, а также ЛКБ-неактивных до 24,0±4,53% против 41,2±3,13% (р<0,01) в контроле. Одновременно наблюдали статистически значимое увеличение количества нейтрофильных гранулоцитов с высокой активностью гранул с МПО и ЛКБ относительно значений интактных животных. Наряду с этим по сравнению с ПЦР-отрицательными животными также происходило повышение СЦК МПО с 1,60±0,11% до 2,19±0,06% (р<0,001), а также СЦК ЛКБ с 1,58±0,09% до 2,12±0,12% (р<0,01). Однонаправленная трансформация цитохимических показателей, выявленная у молодняка до 9-12-месячного возраста, сменяется противоположной закономерностью изменений у молодняка в возрасте 15-17 месяцев, свидетельствующих о недостаточности ферментных и неферментных механизмов антимикробной защиты (табл. 2). Наблюдался рост числа фагоцитов с отсутствием в гранулах фермента миелопероксидазы и особенно катионных белков, содержание которых увеличивалось до 55,6±2,4% против 40,7±2,16 % (р<0,001) у интактных животных. Количество нейтрофилов со 2-й и 3-й степенью активности гранул с ЛКБ напротив, снижалось. Так, их содержание у ПЦР-позитивного молодняка крупного рогатого скота составило соответственно 12,80±1,09% против 19,60±1,56% (р<0,01) и 18,60±2,01% против 27,40±0,99% (р<0,01) у ПЦР- отрицательных животных. Идентичная закономерность изменений была характерна и для ферментной деятельности нейтрофилов, особенно это касалось нейтрофилов с высокой плотностью гранул с МПО. Кроме этого, был подвержен существенному снижению у ПЦР-положительных животных СЦК МПО до 1,04±0,04 против 1,27±0,07 (р<0,05) в контроле, а также СЦК ЛКБ до 0,94±0,06 против 1,34±0,03 (р<0,001) в интактной группе. Таблица 2 – Активность миелопероксидазы и содержание катионных белков лизосом у интактного и ПЦР-позитивного молодняка крупного рогатого скота в возрасте 15-17 месяцев, M±m ЦитохимическиеМиелопероксидазаКатионные белки лизосом показателиПЦР-ПЦР+ПЦР-ПЦР+ 0 степень, %41,60±3,0047,70±2,0240,70±2,16 55,60±2,40*** 1 степень, %13,80±1,1918,70±2,1612,30±2,9013,00±1,66 2 степень, %19,10±2,2015,20±1,1519,60±1,5612,80±1,09** 3 степень, %25,50±1,6618,40±1,71** 27,40±0,9918,60±2,01** СЦК1,27±0,071,04±0,04*1,34±0,030,94±0,06*** Примечание: *р<0,05; **р<0,01; ***р<0,001. Таким образом, во все наблюдаемые периоды постнатального развития молодняка крупного рогатого скота выявлены значительные изменения активности кислород-зависимой и кислород-независимой антимикробных систем нейтрофилов у ПЦР-позитивных особей по сравнению с интактными животными. Сравнительный анализ динамики изменений аэробной и анаэробной бактерицидных систем по разным цитохимическим показателям у молодняка всех изучаемых нами возрастных категорий показал, чтооникак у интактного, так и у скомпрометированного по лейкозу молодняка крупного рогатого скота имеют однонаправленную закономерность изменений цитохимических параметров, что свидетельствует о тесном их взаимодействии. 2.5 Оценка кислород-зависимых и кислород-независимых механизмов бактерицидной системы нейтрофильных гранулоцитов у коров с разной степенью компрометации к лейкозу. Опыт №1. С целью изучения активности различных бактерицидных систем нейтрофильных гранулоцитов у коров с разной степенью компрометации к лейкозу было отобрано 25 голов крупного рогатого скота, которых по результатам диагностических исследований распределили на 3 группы: 1-я группа – контрольная (10 интактных клинически здоровых животных, имеющих отрицательную реакцию иммунодиффузии (РИД) с гликопротеидным антигеном ВЛКРС); 2-я группа – носители ВЛКРС (10 коров, положительно реагирующих в РИД); 3-я группа – больные лейкозом и подозрительные по заболеванию (5 коров, положительно реагирующих в РИД, с гематологическим проявлением болезни в соответствии с «лейкозным ключом»). У всех животных была отобрана кровь для цитохимических исследований. Анализ изменений содержания катионных белков в фагоцитах показал, что относительно показателей РИД-негативных животных в крови как инфицированных ВЛКРС, так и больных лейкозом коров наблюдаются существенные изменения, которые у последних носят более выраженный характер. Так, происходит достоверное (р<0,01) снижение числа клеток со 2-й и 3- й степенью плотности гранул с антимикробным пептидом до 11,50±2,22% и 18,30±1,49% соответственно у РИД-позитивных и до 8,00±1,14% и 15,20±1,83% соответственно у больных животных против 21,70±3,32% и 30,0±2,71% в контрольной группе. На этом фоне значительно увеличивается количество ЛКБ- неактивных клеток с 36,80±5,46% у интактных коров до 63,70±3,50% (р<0,01) у носителей ВЛКРС и до 69,20±2,22% (р<0,001) у больных лейкозом животных. Наблюдаемая нами трансформация также способствовала падению уровня общей величины катионных белков (СЦК) до 0,84±0,08 (р<0,01) у РИД-позитивных особей, а также до0,70±0,05(р<0,001) у больных лейкозом коров против 1,45±0,13 в группе РИД-отрицательного крупного рогатого скота. Для показателя ферментной активности МПО была характерна идентичная траектория изменений, наблюдаемых нами при анализе катионных белков, хотя они не во всех случаях достигали значимой разницы. Наблюдался выраженный рост числа МПО-неактивных фагоцитов с 30,80±4,63% у РИД-отрицательных животных до 53,80±3,37% (р<0,01) у инфицированных ВЛКРС и до 61,80±5,49% (р<0,01) у больных и подозрительных по заболеванию лейкозом. Помимо этого, отмечалось достоверное снижение СЦК, усиливающееся при переходе в гематологическую стадию заболевания. Его значения в контрольной группе составляли 1,29±0,08, когда как у инфицированных ВЛКРС и больных лейкозом были существенно меньше – 0,90±0,08 и 0,72±0,09. Как показали результаты статистической обработки между показателями СЦК ЛКБ и МПО с помощью коэффициента корреляции выявлено их тесное взаимодействие как у РИД-отрицательных, так и у РИД-положительных коров. Так, в этих группах между деятельностью кислород-зависимых и кислород- независимых механизмов бактерицидности обнаружена прямая сильная корреляционная связь (соответственно: r = 0,75, r = 0,77). Эта корреляционная зависимость в значительной степени изменялась у больных лейкозом и подозрительных по заболеванию и характеризовалась как обратная слабая (r = - 0,06). Таким образом, у крупного рогатого скота, инфицированного ВЛКРС, имеет место недостаточность анаэробных и аэробных механизмов, характеризующаяся снижением реализации бактерицидного потенциала нейтрофильных гранулоцитов и усиливающаяся при переходе в гематологическую стадию заболевания. Опыт №2. По результатам диагностических исследований было сформировано 3 группы из 28 голов крупного рогатого скота: 1-я группа – РИД и ПЦР-негативные (n=10), служили в качестве контроля; 2-я группа – РИД- негативные, ПЦР-позитивные (n=8); 3-я группа – РИД и ПЦР-позитивные (n=10). У животных всех групп была отобрана кровь для цитохимических исследований с целью изучения особенностей кислород-независимого и кислород-зависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов. Анализ полученных данных показал, что при обнаружении провируса у серонегативных животных не происходит выраженных изменений основных цитохимических параметров, характеризующих активность антимикробных пептидов, относительно показателей контрольной группы. На фоне некоторой тенденции к увеличению числа клеток с 0-й, 1-й и 3-й степенью плотности гранул с ЛКБ отмечалось снижение количества фагоцитов со 2-й степенью до 12,57±2,85% против 26,80±3,61% (р<0,05) у РИД и ПЦР-отрицательных животных. В группе животных, имеющих положительные результаты вРИД и ПЦР по сравнению с контролем, напротив, были выявлены существенные сдвиги. В частности, можно выделить многократное увеличение числа ЛКБ-неактивных клеток (соответственно: 62,10±4,09%; 13,20±4,19%, р<0,001) за счет снижения количества фагоцитов со средней плотностью гранул с ЛКБ (соответственно: 8,50±2,38%; 26,80±3,61%, р<0,01) и высокой плотностью гранул с ЛКБ (17,90±1,92%; 50,20±6,43%, р<0,001). Вследствие этих изменений также происходило достоверное уменьшение СЦК до 0,81±0,09 против 2,14±0,15 в группе интактных коров. В группе серонегативных коров, у которых был выявлен провирус лейкоза крупного рогатого скота, по сравнению с интактными животными также не было зарегистрировано существенных изменений цитохимических параметров. При одновременном обнаружении у животных провируса и вируса лейкоза (ПЦР+, РИД+) наблюдались изменения, свидетельствующие о дефекте кислород- зависимой бактерицидной системы. Так, относительно цитохимических параметров особей контрольной группы происходило увеличение количества МПО-неактивных клеток (соответственно: 49,40±3,55%; 21,00±2,88%, р<0,001) при одновременном снижении числа фагоцитов с 3-й степенью плотности гранул с МПО (соответственно: 29,10±3,27%; 46,80±6,97%, р<0,05), а также среднего цитохимического коэффициента (соответственно: 1,20±0,09; 1,90±0,11, р<0,01). Таким образом, провирусная форма лейкоза у коров до обнаружения специфических антител характеризуется отсутствием дефектов со стороны кислород-зависимых и кислород-независимых механизмов бактерицидной системы нейтрофильных гранулоцитов. 2.6. Разработка способов выявления животных с риском инфицирования вирусом лейкоза крупного рогатого скота 2.6.1. Оценка предрасположенности молодняка крупного рогатого скота к инфицированию вирусом лейкоза. Установленная закономерность функционирования бактерицидных систем лейкоцитов у молодняка крупного рогатого скота разных периодов постнатального развития побудила нас к использованию цитохимических показателей нейтрофилов (ЛКБ и МПО) для выявления животных с повышенной чувствительностью к лейкозной инфекции в условиях неблагополучной фермы. С этой целью нами была разработана программа для ПК на Delphi 2010, позволяющая автоматизировать анализ риска по состоянию параметров неспецифической резистентности. Для этого в базу данных заносятся средние цитохимические коэффициенты содержания лизосомально-катионных белков (ЛКБ) и миелопероксидазы (МПО) в нейтрофилах крови. Изучение динамики цитохимических показателей условно здоровых относительно идентичных параметров, характерных для молодняка крупного рогатого скота, инфицированного ВЛКРС, позволило формализовать тренды следующими математическими моделями. Три из четырех моделей имеют следующий вид: y = а+bx+cx2, другая – y=a+bx+c/x. Модели были подобраны по наилучшему приближению к исходным данным с оценкой по критерию Фишера. Оценка степени риска инфицирования лейкозом происходит при сравнении индивидуальных показателей с расчетными, полученными при исследовании контрольных групп разных возрастов и верифицированных полимеразной цепной реакцией. Результат оценивается по шкале от –4 до +4. Животные, предрасположенные к лейкозу, имеют значения от +1 до +4-х (рис. 1). Рисунок 1 – Оценка предрасположенности молодняка крупного рогатого скота к инфицированию ВЛКРС Как показано на рисунке1, у 11 из 20 голов молодняка крупного рогатого скота 9-12-месячного возраста отмечена предрасположенность к инфицированию ВЛКРС. Следует отметить, что все ПЦР-позитивные (True) животные также попали в группу риска. Аналогичная тенденция за редким исключением отмечалась и в остальных возрастных категориях. Таким образом, с помощью программы для ПК можно проводить донозологическую оценку риска инфицирования молодняка вирусом лейкоза, что будетспособствоватьсвоевременномупринятиюорганизационно- профилактических мероприятий. 2.7. Оценка повышенной чувствительности коров к лейкозной инфекции. По результатам диагностических исследований с помощью РИД была отобрана периферическая кровь у 20-и голов крупного рогатого скота, из которых 10 имели положительную реакцию с гликопротеидным антигеном ВЛКРС, остальные 10 – отрицательную. В крови определили содержание катионных белков лизосом и активность миелопероксидазы, дифференцируя нейтрофильные гранулоциты по степени активности гранул, а также производя расчет СЦК. Помимо этого, провели дополнительные диагностические исследования с помощью ПЦР. Затем полученные цитохимические показатели были подвергнуты исследованию с помощью дискретно-динамического анализа, которые по условию этого метода разделили на 3 группы: с минимальными, средними и максимальными значениями базисного параметра. Для дальнейшей работы использовали только группы с минимальными и максимальными величинами, в которых произвели расчет средних значений вариабельных параметров и изучили достоверность их различий. Взаимосвязь между средними вариабельного параметра в этих двух группах, распределенных по базису, считали установленной при их достоверном (р<0,05) различии. Например, при распределении цитохимических параметров по базису ЛКБ с высокой степенью активности гранул, выявлены взаимосвязи (р<0,05) с 4-мя вариабельными: ЛКБ с низкой активностью; МПО с высокой активностью; СЦК ЛКБ и СЦК МПО. Взяв каждый из изучаемых параметров в качестве базисного и произведя аналогичный анализ, мы установили в общей сложности 24 статистически значимых взаимосвязи из 56 возможных и на их основе составили таблицу, позволяющую по интервалам сочетаний параметров дифференцировать индивидуумов с нарушениями иммунной функции нейтрофильных гранулоцитов. Следует отметить, что 13 из этих сочетаний, характеризовали взаимосвязь между цитохимическими параметрами кислород-зависимого и кислород-независимого метаболизма, что свидетельствовало о тесном взаимодействии этих бактерицидных систем. Наибольшей долей участия обладали ЛКБ-, МПО- высокоактивные клетки, а также СЦК ЛКБ и МПО. Рассмотрев каждое значимое сочетание дифференциальной таблицы и сопоставив с индивидуальными значениями цитохимических параметров животных, мы определили коров с признаками нарушения иммунной функции нейтрофильных гранулоцитов. У всех без исключения РИД-позитивных животных с помощью дискретно-динамического анализа установлено нарушение иммунной функции фагоцитов. Недостаточность бактерицидных систем также выявлена у 66,66% интактных и 57,14% носителей провируса лейкоза коров (табл. 3). Таблица 3 – Распределение коров с функциональным нарушением нейтрофилов в зависимости от результатов диагностических исследований Выявлено с Статус животных по результатамКоличествофункциональным диагностических исследованийживотныхнарушением количество% РИД (+), ПЦР (+)99100,0 РИД (+), ПЦР (–)11100,0 РИД (–), ПЦР (+)7457,14 РИД (–), ПЦР (–)3266,66 Следует отметить, что у 3-х из 7-и носителей провируса ЛКРС, определены более высокие значения цитохимических показателей, в первую очередь, ЛКБ-, МПО-высокоактивных клеток, что, по-видимому, можно связать с начальным этапом развития вирусной инфекции у этих животных и готовностью фагоцитов ответить на раздражение. Таким образом, обработка цитохимических показателей с помощью дискретно-динамическогоанализапозволяетопределятьзначения, характеризующие нарушение иммунной функции нейтрофилов, тем самым дифференцировать животных с явным наличием ВЛКРС, а также с повышенной чувствительностью к лейкозной инфекции с достаточно высокой точностью. 3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ На основании результатов проведенных исследований нами сделаны следующие выводы: 1. По результатам серологических исследований (РИД) на лейкоз крупного рогатого скота на территории Омской области с 2014 по 2018 гг. уровень инфицированности вырос в 1,57 раза (с 10,7 до 16,8%) и в среднем составил 15,9% при практически неизменной ежегодной величине выявления коров в гематологической стадии заболевания лейкозом (от 0,3 до 0,4%). На значительной территории области уровень серопревалентности варьировал от 10 до 30%. 2. Инокуляция ВЛКРС кроликам сопровождается достоверным снижением средних цитохимических коэффициентов активности ЛКБ и МПО нейтрофильных гранулоцитов в 2,1 раза на 30-е сутки после экспериментального инфицирования, значительно прогрессирующее к 90-м суткам, соответственно в 3,5 и в 3,95 раза (р<0,001). 3. Динамика цитохимических исследований ферментных и неферментных систем нейтрофильных гранулоцитов отражает существенные различия в изменении их параметров у носителей провирусной ДНК ВЛКРС относительно интактныхживотныхвовсе наблюдаемыевозрастныепериоды, характеризующиеся достоверным увеличением числа клеток с высокой активностью ЛКБ и МПОи средних цитохимических коэффициентов в 1,15-1,4 раза у молодняка крупного рогатого скота до 9-12-месячного возраста и последующим снижением этих показателей у телок в возрасте 15-17-и месяцев в 1,22-1,47 раза (р<0,05). 4. У коров, инфицированных ВЛКРС, имеют место дефекты кислород- независимых и кислород-зависимых механизмов, характеризующиеся снижением цитохимических коэффициентов активности ЛКБ и МПО соответственно в 1,7 и 1,4 раза и их дальнейшим падением при прогрессировании болезни (гематологическая стадия) – в 2,1 и 1,8 раза (р<0,05). У животных, являющихся носителями провируса ВЛКРС (РИД–, ПЦР+), подобного рода изменения реализации бактерицидного потенциала отсутствовали и, напротив, отмечалась некоторая тенденция к усилению активности антимикробных пептидов. 5. Отмечено тесное взаимодействие кислород-независимых и кислород- зависимых бактерицидных у ПЦР-позитивного молодняка крупного рогатого скота, а также у коров, инфицированных ВЛКРС (r≥0,70). У больных и подозрительных по заболеванию лейкозом коровкорреляционная зависимость исчезает, что указывает на возникновение нарушений в последовательности воздействия бактерицидных систем на вирусную инфекцию. 6. Разработана программа для ЭВМ, которая автоматизировала анализ риска к заболеванию лейкозом молодняка крупного рогатого скота по состоянию параметров неспецифической резистентности. Продемонстрирована возможность выявления коров с повышенной чувствительностью к лейкозной инфекции с помощью дискретно-динамического анализа по результатам цитохимических исследований активности ЛКБ и МПО. На основании полученных результатов рекомендовать следующие практические предложения: 1. Разработанную программу для ЭВМ «Оценка предрасположенности молодняка крупного рогатого скота к инфицированию вирусом лейкоза» целесообразно использовать при мониторинговых исследованиях хозяйств неблагополучных по лейкозу крупного рогатого скота для оценки риска к инфицированию ВЛКРС. 2. Методические рекомендации «Методы диагностики и оценки предрасположенности молодняка крупного рогатого скота к инфицированию вирусом лейкоза», рассмотрены и утверждены ученым советом ФГБНУ «Омского аграрного научного центра» (протокол №3 от 25 июня 2021 года). Предназначены для специалистов ветеринарных научно-исследовательских институтов, ВУЗов и лабораторий, проводящих исследования в области разработки новых методов и средств иммунодиагностики животных. 3. Теоретические и экспериментальные материалы исследований по изучению особенностей функционирования ферментных и неферментных бактерицидных систем нейтрофильных гранулоцитов при лейкозной инфекции целесообразно использовать при выполнении научно-исследовательских работ аналогичной направленности, при написании справочных пособий и монографий, а также в учебном процессе ВУЗов ветеринарного профиля. Перспективы дальнейшей разработки темы. Полученные результаты открывают перспективу дальнейших исследований, направленных на разработку новых подходов профилактики лейкозной инфекции у молодняка крупного рогатого скота, связанных с поиском и оптимальным применением препаратов (доза, схема), оказывающих позитивное влияние на показатели неспецифической резистентности, в частности на иммунную функцию нейтрофильных гранулоцитов. Использование полученных значений цитохимических параметров крупного рогатого скота, инфицированного ВЛКРС, возможно с целью выявления животных с риском к заболеванию животных, а также при прогнозировании течения инфекции.