Иммунобиологические свойства комплекса рекомбинантных белков OprF и анатоксина Pseudomonas aeruginosa

Материалы и методы исследования
Комплекс рекомбинантных белков содержал 100 мкг анатоксина и 50
мкг OprF, адсорбированных на Al(OH)3, в объеме 1 мл раствора, получен в
лаборатории протективных антигенов НИИВС им. И.И. Мечникова по
технологии, описанной в работах [Калошин и соавт., 2011; 2012; 2016]. Для
иммунизации животным вводили 0,5 мл препарата.
Лабораторные животные (мыши, морские свинки и кролики),
соответствующие требованиям по породе, массе и состоянию здоровья, были
получены из питомников ФГБУН “НЦБМТ” ФМБА России.
Безопасность комплекса рекомбинантных белков исследовали в
соответствии с «Руководством по доклиническим исследованиям
иммунобиологических препаратов» (под ред. А.Н. Миронова, 2013 г.) и XIV
Государственной Фармакопеей РФ.
Острую токсичность трех опытных серий препарата оценивали по
параметрам клинического состояния и изменения массы тела подопытных
животных (белых беспородных мышей и морских свинок) в течение 14 дней
после однократной иммунизации препаратом. Формировали 2 опытные
группы животных на каждую серию препарата (животным первой группы
внутрибрюшинно вводили однократную (25 мкг OprF, 50 мкг анатоксина), а
второй – десятикратную (250 мкг OprF, 500 мкг анатоксина) дозу препарата,
в обоих случаях в объеме 0,5 мл) и одну контрольную группу (вводили 0,9 %
раствор NaCl в объеме 0,5 мл).
Пирогенность определяли двумя методами: 1) в опыте на кроликах,
которымвнутривенновводиликомплекснеадсорбированных
рекомбинантных белков в соответствии с XIV Фармакопеей РФ,
ОФС.1.2.4.0005.15 «Пирогенность» (25 мкг OprF, 50 мкг анатоксина в
объеме 0,5 мл); 2)по содержанию эндотоксина в препаратах с
использованиемЛАЛ-теста(ОФС.1.2.4.0006.15«Бактериальные
эндотоксины» (Метод Е). Для постановки ЛАЛ-теста применяли тест-набор
ENDOSAFE® ENDOCHROME™ в соответствии с инструкцией
производителя.
Иммунотоксические свойства препарата оценивали по способности
вызывать неспецифическую активацию иммунитета к неродственным
антигенам в соответствии с требованиями «Руководства по доклиническим
исследованиям иммунобиологических препаратов» (раздел 2.5). Влияние
препарата на гуморальное звено иммунитета мышей оценивали методом
локального гемолиза в геле по Ерне [Jerne, 1963] по способности вызывать
неспецифическую поликлональную активацию лимфоцитов селезенки
мышей, продуцирующих IgM-антитела к эритроцитам барана. Влияние на
клеточное звено иммунитета оценивали в реакции гиперчувствительности
замедленного типа (ГЗТ) при введении его мышам в комбинации с
эритроцитами барана, а морским свинкам – с полным адъювантом Фрейнда
(ПАФ).
Для определения аллергизирующих свойств использовали тесты
гиперчувствительности немедленного типа (тест общей анафилаксии на
морских свинках с вычислением индекса синдрома по Weigle) и
гиперчувствительности замедленного типа (тест отека лапы на мышах) в
соответствиистребованиями«Руководстваподоклиническим
исследованиям иммунобиологических препаратов» (раздел 2.6).
Фагоцитарную активность лейкоцитов мышей оценивали методом
проточной цитометрии (Cytomics FC-500 («Beckman Coulter», США) по
способности нейтрофилов и моноцитов поглощать убитые нагреванием
FITC-меченые микробные клетки Staphylococcus aureus.
Бактерицидную активность лейкоцитов измеряли методом
проточной цитометрии по способности лейкоцитов крови разрушать FITC-
меченые живые микробные клетки Staphylococcus aureus, что проявлялось в
восприимчивости разрушенных клеток к окраске иодидом пропидия.
Дендритные клетки (ДК) получали при культивировании клеток
костного мозга мышей линии BALB/c в обогащенной среде RPMI-1640 в
присутствии GM-CSF и IL-4. На 6-е сутки в культуру незрелых ДК вносили
комплекс рекомбинантных белков в адсорбированном и несорбированном
виде, на 9-ые сутки анализировали иммунофенотип клеток методом
проточной цитометрии.
Концентрацию цитокинов в образцах сыворотки крови мышей и
супернатантах культур спленоцитов определяли при помощи тест-системы
FlowCytomix Thl/Th2 Mouse 10 plex для проточной цитометрии
(«BenderMedSystems», Австрия). Цитокины в сыворотке крови оценивали
после однократной иммунизации через 4 ч, 8 ч, 24 ч и 14 сут.
Иммунофенотип лимфоцитов селезенки (по маркерам CD3, CD4,
CD5, CD8, CD16/32, CD19, CD25, MHC II) и дендритных клеток (CD11c,
CD14, CD34, CD38, CD80, CD83, CD86, CD123, MHC I, MHC II, TLR2, TLR4)
оценивали методом проточной цитометрии на приборе Cytomics FC-500
(Beckman Coulter, США).
Содержание антител к антигенам-компонентам препарата в
сыворотке крови иммунизированных и неиммунизированных мышей
определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа. На
планшеты для ИФА раздельно сорбировали растворенные в 50 мМ
карбонатно-бикарбонатном буфере (pH 9,4) рекомбинантные белки OprF и
анатоксин в концентрации 10 мкг/мл, использовали конъюгированные с
пероксидазой хрена вторичные антитела к иммуноглобулинам мыши (Имтек,
Россия), антитела к IgM, IgG и подклассам IgG мыши (Thermo Fisher
Scientific, США). Титром антител считали предельное разведение сыворотки,
при котором ее оптическая плотность (ОП) не менее чем в 2 раза превышала
оптическую плотность для отрицательного контроля (сыворотка крови
неиммунизированных животных).
Протективную активность трех экспериментальных серий
комплекса оценивали при внутрибрюшинном заражении мышей живой
вирулентной культурой P. aeruginosa (штамм PA103) через две недели после
курса иммунизации. Значения 50%-й летальной дозы возбудителя,
выраженные в количестве бактериальных клеток, для иммунизированных и
неиммунизированных животных вычисляли по формуле Кербера в
модификации Ашмарина-Воробьева. Индекс эффективности определяли как
отношение LD50, рассчитанное для иммунизированных животных, к LD50
для контрольных животных.
Статистическую обработку данных проводили с помощью
программ Excel и «Statistiсa 10». Достоверность различий между
сравниваемыми величинами определяли в рамках параметрической (по
Фишеру-Стьюденту) и непараметрической базовой статистики с
использованием методов Манна-Уитни и Краскела-Уоллиса. Различия
рассматривались как значимые при p≤0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Безопасность и переносимость
Острая токсичность. Клинические признаки интоксикации после
введения препарата не выявлены ни в одной из групп животных, получавших
комплекс рекомбинантных белков; гибель животных не зафиксирована,
поэтому расчет LD50 не проводили. Не выявлено статистически значимых
различий массы тела и изменений в потреблении корма в группах животных,
получавших препарат в разных дозах, и животных, которым вводили 0,9%
раствор NaCl. Препарат хорошо переносился подопытными животными, не
вызывал изменений поведения и внешнего вида. Таким образом, комплекс
рекомбинантных белков синегнойной палочки является нетоксичным.
Пирогенность. Исследование пирогенных свойств препарата на
кроликах показало, что у отдельных особей температура повышалась не
более чем на 0,5 °С, а в целом по группе – не более чем на 1,2 °С, что
свидетельствовало об отсутствии пирогенных свойств.
По результатам ЛАЛ-теста содержание бактериальных эндотоксинов в
трех сериях препаратов составляло 35 ЕЭ/мл, 11,3 ЕЭ/мл и 21,1 ЕЭ/мл,
соотвественно. Пороговая пирогенная доза, согласно требованиям
Фармакопеи, не должна превышать 5 ЕЭ/мл/кг. Учитывая эти рекомендации,
доза препарата, равная 0,5 мл, позволит применять его у пациентов с массой
тела от 3,5 кг.
Таким образом, апирогенность комплекса рекомбинантных белков
была доказана двумя методами: по концентрации эндотоксина с помощью
ЛАЛ-теста и in vivo.
Иммунотоксичность. Исследование возможной патологической
активации гуморального ответа оценивали по способности препарата
индуцировать поликлональную активацию лимфоцитов. Число В-
лимфоцитов селезенки иммунизированных мышей, продуцирующих
антитела класса IgM к эритроцитам барана, увеличивалось в 1,3-1,65 раза
(p>0,05) по сравнению с контролем.
Исследование влияния препарата на клеточный иммунный ответ
проводили в реакции гиперчувствительности замедленного типа на мышах
при введении его совместно с эритроцитами барана и на морских свинках –
вместе с полным адъювантом Фрейнда. Индекс реакции ГЗТ к ЭБ при
введении десятикратной (250 мкг OprF, 500 мкг анатоксина) дозы комплекса
рекомбинантных белков не превышал 2,23, по сравнению с 1,95 в контроле.
Интенсивность кожной реакции ГЗТ к ПАФ на морских свинках при
внутрикожном введении в среднем по группе не превышала 1,2 баллов.
Таким образом, полученные данные указывают на отсутствие
иммунотоксического действия препарата.
Аллергизирующие свойства. Аллергизирующие свойства исследовали
в реакциях гиперчувствительности немедленного (реакция общей
анафилаксии) и замедленного (тест отека лапки) типов.
Реакцию ГНТ у морских свинок на введение разрешающей дозы
несорбированных белков-компонентов (75 мкг OprF, 150 мкг анатоксина)
определяли через 21 сутки после первой иммунизации. У большинства
морских свинок не наблюдали никаких реакций. Выраженные частые
почесывания, единичные чихания, понижение температуры тела
происходили у половины животных, которым вводили десятикратную
прививочную дозу (250 мкг OprF, 500 мкг анатоксина). Все эти симптомы
исчезали в течение часа после инъекции разрешающей дозы. Индекс
синдрома по Weigle по группе не превышал 1,2, что соответствовало слабой
выраженности анафилактоидной реакции.
Исследование реакции замедленного типа показало увеличение массы
лапки (по отношению к контрольной лапке) на 18,9% при введении первой
серии препарата, на 21,4% – второй и 19,3% – третьей. Эти результаты
свидетельствовало об отсутствии у препарата аллергенных свойств. Таким
образом, в опытах на лабораторных животных (мышах, морских свинках и
кроликах) не выявлено неблагоприятных эффектов, что свидетельствует о
безопасности комплекса рекомбинантных белков P. aeruginos для животных.
Влияние комплекса рекомбинатных белков OprF и анатоксина P.
aeruginosa на активацию врожденного иммунитета
Фагоцитарная активность. Мышей иммунизировали дважды с
интервалом в 14 дней и исследовали фагоцитарную активность моноцитов и
гранулоцитов крови в отношении убитых клеток Staphylococcus aureus на 7 и
14 сутки после каждой иммунизации (табл.1).

Таблица 1. Фагоцитарная активность лейкоцитов периферической крови
иммунизированных и неиммунизированных мышей по поглощению убитого
нагреванием S. aureus( % и индекс активации)
ГруппаМоноцитыГранулоциты
№Срок послеКлетки,,ДостоверностьКлетки,Достоверность
иммунизациипоглотившиеразличия междупоглотившихразличия
стафилококк,группамистафилококк,между
% и ИА% и ИАгруппами
1Контроль (без42,76±1,33P1и2=0,012153,22±11,1P1и2=0,0081
иммунизации)P1и3=0,012P1и3=0,0122
P1и4=0,0119P1и4=0,0367
P1и5=0,0119P1и5=0,0122

27 сут после I77,82±5,29P2и1=0,012177,68±4,32P2и1=0,0081
иммунизации1,82P2и3=0,6761,46P2и3=0,0122
P2и4=0,021P2и4=0,53
P2и5=0,012P2и5=0,21

314 сут после I76,64±2,83P3и1=0,01290,64±4,14P3и1=0,0122
иммунизации1,79P3и2=0,6761,7P3и2=0,008
P3и4=0,0121P3и4=0,037
P3и5=0,0121P3и5=0,0122

47 сут после IΙ67,38±4,32P4и1=0,011975,02±13,47P4и1=0,0367
иммунизации1,57P4и2=0,02151,4P4и2=0,411
P4и3=0,1218P4и3=0,0367
P4и5= 0,144P4и5=0,403

514 сут после63,08±2,38P5и1=0,011973,58±3,65P5и1=0,0122
IΙ1,47P5и2=0,01221,38P5и2=0,121
иммунизацииP5и3=0,0121P5и3=0,012
P5и4=0,143P5и4=0,403

Примечание: в первой строке 2 и 4 столбцов – M±σ %, во второй строке –индекс
активации. Статистически достоверные значения отмечены жирным шрифтом (p<0,05, критерий Манна-Уитни). Представленные данные свидетельствовали об усилении фагоцитарной активности лейкоцитов после первой иммунизации, достигающей максимума на 14 сутки. Вторая иммунизация не увеличивала активность фагоцитов, уровень которой был значимо ниже по сравнению с первой вакцинацией, но выше, чем у неиммунизированных животных. Следовательно, иммунизация комплексом рекомбинантных белков активирует клеточное звено иммунной системы, стимулируя гранулоциты и макрофаги, являющиеся антиген- представляющими клетками. Бактерицидную активность лейкоцитов периферической крови мышей оценивали через 4 и 24 часа после однократной иммунизации мышей комплексомрекомбинантныхбелков, белками-компонентами,не адсорбированными на гидроксиде алюминия или гидроксидом алюминия per se, в сравнении с группой контроля (неиммунизированные мыши). Отмечено значимое усиление неспецифической бактерицидной активности лейкоцитов мышей через 4 ч с последующим нарастанием данного показателя к 24 ч после введения комплекса рекомбинантных белков (табл.2). Белки- компоненты лишь незначительно усиливали бактерицидную активность лейкоцитов, а адъювант гидроксид алюминия в отсутствие белков P. aeruginosa не оказывал влияния на нее. Таблица 2. Бактерицидная активность лейкоцитов периферической крови мышей в отношении Staphylococcus aureus (% и индекс активации, ИА) Погибшие клетки S. aureus (%) 4 часа после иммунизации24 часа после иммунизации Исследуемый препарат Время инкубации 1ч3ч1ч3ч Комплекс белков без 39,26±1,5943,26±1,241,0±2,1750,86±3,2* Al(OH)3ИА 1,12ИА 1,11ИА 1,13ИА 1,34 Комплексбелков, 57,9±1,82*65,36±2,4*)** 68,3±2,2*)**79,54±6,1*)** адсорбированных на ИА 1,64ИА 1,67ИА1,89ИА 2,09 Al(OH)3 31,9±1,9640,14±1,631,46±3,4540,24±2,28 Гидроксид алюминия ИА 0,91ИА 1,02ИА 0,89ИА 1,06 Контроль 35,2±1,739,12±2,136,22±1,4438,04±1,12 (неиммунизированные) Примечание: в первой строке – M±σ,%; во второй строке – индекс активации. * – достоверность различий между опытом и контролем; ** – между препаратом- комплексом (с адъювантом) и несорбированными белками, p<0,05 по критерию Манна- Уитни для независимых выборок. Созревание дендритных клеток. Влияние комплекса рекомбинантных антигенов на созревание дендритных клеток, полученных из костного мозга мышей, исследовали по изменению их иммунофенотипа и содержанию цитокинов в культуральной среде. Эти показатели сравнивали у дендритных клеток, созревавших в культуре под действием: 1) адсорбированных рекомбинантных белков OprF и анатоксина; 2) комплекса не адсорбированных белков; 3) TNF-α – классического индуктора созревания дендритных клеток; 4) без стимуляции (незрелые клетки). Внесение вариантов комплексов рекомбинантных белков в культуру незрелых дендритных клеток индуцировало их созревание, что выражалось в снижении количества незрелых CD34+ клеток, увеличении числа клеток с экспрессией маркеров терминальной дифференцировки CD83, клеточной адгезии CD38, костимуляторных молекул CD80 и CD86, молекул главного комплекса гистосовместимости MHCII. Отмечено снижение численности клеток, экспрессирующих CD14, TLR2 и TLR4. Влияние обоих препаратов было сопоставимо с действием классического индуктора созревания клеток – TNF-α, при этом адсорбированный комплекс рекомбинантных белков оказывал более выраженный эффект. Введение исследуемых препаратов в культуру незрелых дендритных клеток приводило к увеличению в популяции доли миелоидных дендритных клеток, экспрессирующих маркер CD11c (интегрин α-Χ) в 2,3 раза, и плазмацитоидных дендритных клеток с фенотипом СD11с−/CD123+, экспрессирующих α-цепь рецептора IL-3 – в 2,6 раза. Нарастание доли обоих типов клеток в культуре при воздействии комплекса было значительным и соответствовало воздействию TNF-α (2,38 и 2,95 раз соответственно), белки без адъюванта оказывали более слабый эффект (увеличение в 1,5 раза) (табл.3). В результате проведенных исследований установлено, что исследуемые белки синегнойной палочки индуцируют созревание дендритных клеток из клеток-предшественников, увеличивая экспрессию большинства молекул, характерных для зрелых дендритных клеток, участвующих в процессах презентации антигенов Т-лимфоцитам. Однако при этом численность клеток с экспрессией паттерн-распознающих рецепторов снижалась, что может свидетельствовать об изменении функции клеток от рецепции антигенов к их презентации лимфоцитам. Действие этих белков сопоставимо с действием TNF-α и в присутствии адъюванта – гидроксида алюминия – дополнительно усиливается. Таблица 3. Влияние комплекса рекомбинантных антигенов на созревание мышиных дендритных клеток ИсследуемыеКлетки, позитивные по исследуемым маркерам (%), при стимуляции маркерыиндуктором созревания дендритныхНесорбированные КомплексTNF-αБез клетокбелкибелков,стимуляции адсорбированных(негативный на гидроксидеконтроль) алюминия 18,53±1,3*15,46±2,4*17,36±1,35*42,9±1,9** CD34 0,430,360,4 44,27±3,72*)**42,1±2,87*)**37,6±3,19*58,2±3,32** CD14 0,760,720,66 30,4±3,05*)**)*** 51,2±2,78*45,03±3*18,6±2,26** CD38 1,632,752,4 70,16±3,1*73,43±3,4*69,8±2,42*45,2±2,82** MHC I 1,551,621,54 50,7±3,4*)***73,1±3,3*)**52,3±3,1*22,36±2,35** MHC II 2,263,272,34 51,56±2,2*)**)*** 63,3±3,3*66,43±2,4*29,5±2,1** CD80 1,742,142,25 61,2±3,96*67,2±4*63,86±3,85*13,7±2,1** CD86 4,474,94,66 50,2±2,7*)***60,2±1,97*50,43±2,46*21,33±2,08** CD80/MHC II 2,352,822,36 48,2±2,2*64,5±4,1*)**53,4±3,5*8,1±1,95** CD83 5,957,966,59 СD11с -/19,07±1,9*)**)*** 32,8±2,6*36,9±1,6*12,5±2,13** CD123+1,52,62,95 CD11c+/25,3±2,2*)**)*** 38,37±2,96*39,93±2,33*16,76±1,66** CD123-1,52,32,38 31,2±2,56*36,1±2,85*35,7±4,9*54,86±3,8** TLR2 0,570,660,64 22,57±2,3*20,9±2,8*24,7±3,0328,9±1,71 TLR4 0,780,720,85 Примечание: в первой строке – M±σ (%); во второй строке: кратность изменения показателя по сравнению с негативным контролем. Статистически достоверные значения отмечены: знаком * – p<0,05 по сравнению с группой контроля; ** – p<0,05 по сравнению с TNF-α; *** – p<0,05 по сравнению с сорбированными белками (критерий Манна-Уитни). Секреция цитокинов дендритными клетками. Созревающие дендритные клетки секретировали широкий спектр цитокинов (табл. 4). Под воздействиемисследуемыхпрепаратовзначительноповышались концентрации следующих цитокинов: IL-1α, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12 (p40), IL-12 (p70), IL-13, IL-17A, IFN-γ, KC (CXCL1, MCP-1 (CCL2), MIP-1α (CCL3), MIP-1β (CCL4), RANTES (CCL5), TNF-α) . При этом ряд цитокинов (IL-2, IL-3, IL-5, IL-9, CCL11, G-CSF, GM- CSF) в культуральной жидкости не выявлены. Комплекс рекомбинантных белков в адсорбированном и свободном виде увеличивал выработку цитокинов дендритными клетками сильнее, чем TNFα. Среди них следует выделить цитокины острой фазы воспаления, такие как IL-1, IL-6 и TNFα, Th1-цитокины (IFN-γ, IL-12), Th2-цитокины (IL- 4, IL-6, IL-10, IL-13), а так же цитокины и хемокины, отвечающие за привлечение фагоцитов в очаг воспаления (IL-17, CXCL1, CCL3, CCL4, CCL5). Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что комплекс исследуемых рекомбинантных белков P. aeruginosa, индуцируя созревание дендритных клеток, вызывал секрецию ими ряда цитокинов, влияющих на дальнейшие этапы развития иммунного ответа, в том числе на поляризацию Т-хелперов, а сорбция на гидроксиде алюминия усиливала действие рекомбинантных белков P. aeruginosa в отношении секреции ряда исследованных цитокинов. Таблица 4. Влияние комплекса рекомбинантных антигенов на созревание мышиных дендритных клеток Концентрация цитокинов в супернатантах культур дендритных клеток, пг/мл, Исследусозревавших при стимуляции: емыйКомплексКомплексTNF-αБез цитокиннесорбированныхадсорбированныхстимуляции белковбелков(негативный контроль) 3362,25±220,25*)**9888±1019*#266,75±1,25*92±4** IL-1β1213,5±85,5*)**4630,75±120,75*#42±5*22±1** IL-66809,5±1098,5*)**10929±968,75*#598,5±5,5*57,75±57,75** TNF-α1600±66,22*)**5701±153,68*#183,13±4,1*85,7±0,2** IL-442,22±0,69*)**147,55±19,6*#19,26±1,09*13,09±0,1** IL-10716,9±77,95*)**1293,255±25,47*#395,97±4,09*235,87±11,72# IL-13906±11,87*)**1438,8±50,8*#557,23±0,2*490,89±7,57** IL- 12(p40)10628±1561*)**15320±2635*#3181±102,5*933,5±14,5** IL- 12(p70)1936±124,7*)**8435±819*#265,5±30,6*183±0,2** IFN-γ7946,7±1202,7*)**8392,5±176,5*#458,7±17,25*86±6** IL-17A456,5±35,5*)**785,5±210*#117,1±32,3*82,7±4,1** CXCL17046,7±1202*)**8392,5±176,5*#458,75±17,25*86±6** 552,75±66,25* CCL34738±137,75*)**1204,5±176*#2777,25±18,75* * 3911,25±377,75 745,75±16,75* CCL45613,75±378,75*)** 8629,25±627,75*#** CCL514121±1543*)**19672±1332*#796±89*164±10** Примечание: данные представлены как M±σ (%). Достоверность различий отмечена знаками: * - по сравнению с контролем (незрелые дендритные клетки, без стимуляции), **- по сравнению с TNFα (классический индуктор созревания), p<0,01 (по критерию Манна-Уитни). Продукцию цитокинов in vivo оценивали через 4, 8, 24 ч и 14 суток в образцах сыворотки крови мышей, иммунизированных однократно (табл.5). Отмечено повышение концентрации (до десятков раз) цитокинов острой фазы, Th1- и Th2-цитокинов, что свидетельствовало об активации различных механизмов иммунного ответа. Наиболее выраженным (в сотни раз) было повышение уровня IL-17, отвечающего за привлечение фагоцитов в очаг воспаления и активацию иммунной системы в борьбе с P. aeruginosa, за счет активации фагоцитов. Уровень обладающих схожим действием цитокинов IL-21 и IL-22 повышался через 8 ч после иммунизации менее выраженно до 15-17 пг/мл Таблица 5. Изменения концентрации цитокинов (пг/мл) в сыворотке крови иммунизированных мышей на разных сроках наблюдения ЦитокинСрок наблюдения 0ч4ч8ч24 ч14 cуток IL-1α8,4±2,143,2±5,27*21,37±3,2*6,7±0,957,87±0,47 IL-1β2,43±0,5618,47±1,96* 32,47±2,5*1 10,4±1,21*4,82±0,45 IL-22,8±0,455,5±0,81*7,53±1,09*5,4±0,85*3,3±0,33 TNF-α4,53±0,9511,67±2*22,46±2,5*38,5±3,95*7,5±0,67* IFN-γ1,4±0,11,56±0,21,46±0,315,23±2,05*5,9±0,32 IL-12p706,41±0,817,7±0,4523,13±3*34,23±3,1*9,8±1,1 IL-44,99±0,164,23±0,517,06±0,4*3,6±0,45,2±0,28 IL-54,26±1,212,27±2,35* 4,06±0,565,93±0,83,1±0,27 IL-63,42±0,65,53±0,817,46±1,75*18,43±2,04*3,89±0,38 IL-105,7±0,916,96±0,87,63±1,121,13±2,6*6,34±0,56 IL-133,66±0,665,35±0,694,39±0,735,52±0,763,78±0,55 IL-17A19,33±3,042489±78,5*4801±72,27* 146,3±12,58*24,5±2,65 IL-2103,66±0,96*17,13±1,59* 11,77±2,33*2,5±0,24 IL-224,63±1,46,46±0,9615,03±2,43* 4,4±1,034,5±0,35 Примечание: данные представлены как M±σ. * – достоверность различий по сравнению с контролем, р<0,05 (по критерию Манна-Уитни). Спонтанная и индуцированная продукция цитокинов in vitro. Представляло интерес оценить изменения функции лимфоцитов селезенки мышей при иммунизации. Для этого провели сравнительное исследование продукции цитокинов в культуре клеток иммунизированных и неиммунизированных мышей при стимуляции фитогемагглютинином. У иммунизированных мышей клетки селезенки активнее синтезировали IFN-γ и IL-12p70, определяющие поляризацию Т-хелперов по Th1 пути (табл.6). При этом у иммунизированных мышей секреция провоспалительных цитокинов IL-1α и IL-1β снижалась. Изменения секреции цитокинов, определяющие Th2-поляризацию, были разнонаправленными: уровни IL-5 и IL-10 у иммунизированных мышей оказались выше, а IL-13 – ниже, чем у неиммунизированных. Кроме того, у иммунизированных животных отмечено увеличение секреции IL-22, являющегося одним из важных факторов, обеспечивающих иммунитет к P. aeruginosa. Таблица 6. Секреция цитокинов спленоцитами мышей in vitro при стимуляции фитогемагглютинином (пг/мл) Цитокин КонтрольКонтроль/ФГА Иммунизированные Иммунизированные/ФГА IL-1α5,3±0,7558,65±1,944,23±0,5110,6±2,19* IL-1β5,7±0,3639,37±2,965,1±0,9121,2±2,1* IL-29,3±1,4117,33±2,055,6±0,9121,37±2,87 TNF-α3,3±0,6511,8±7,433,23±0,816,2±2,1 IFN-γ31,97±3,32 107,9±13,4748,57±6,23164,7±7,37* IL-6,76±0,45 18,2±218,27±2,145,17±5* 12p70 IL-46,43±0,22 24,07±2,94,26±1,0525,3±2,74 IL-53,36±0,812,87±2,274,4±0,0143,43±58,78* IL-64,66±0,85 21,37±2,753,76±0,3515,4±2,95 IL-1012,43±2,27 45,77±3,6528,33±2,9667,73±5,98* IL-138,51±1514,9±53,039,2±1,01112,41±14,01* IL-17A154±7,932444±82,9838,19±3,932450±71,51 IL-21034,6±4,3817,67±17,339,07±3,1 IL-2211,63±1,59 27,87±2,825,9±2,5545,83±3,75* Примечание: данные представлены как M±σ. * – достоверность различий по сравнению со стимулированными спленоцитами неиммунизированных мышей, р<0,05 (по критерию Манна-Уитни). Влияние комплекса рекомбинантных антигенов P. aeruginosa на адаптивный иммунитет Исследование субпопуляционной структуры лимфоцитов селезенок мышей, проведенное через две недели после двукратной иммунизации комплексом рекомбинантных антигенов, показало, что в опытной группе (иммунизированные мыши) увеличилась доля NK-клеток, несущих маркеры CD16+/CD32+ (рецепторы к Fc-фрагменту IgG, FcγRII и FcγRIIΙ) – в 1,64 раз (с 8,06 до 13,28%); CD3+/СD4+T-хелперов в 1,25 раза (с 36,04 до 45,17%) и CD19+ B-лимфоцитов в 2,3 раз (с 12,17 до 28,17%); доля клеток, позитивных по маркеру CD5, имеющему регуляторные функции, служащему костимуляторной молекулой для Т-лимфоцитов и увеличивающему выживаемость лимфоцитов [Soldevila et al., 2011], выросла в 1,14 раза (с 45,3 до 51,5%). Количество CD3+/CD8+ цитотоксических лимфоцитов снизилось в 1,47 раз (с 21,63 до 14,7%) по сравнению с контролем (неиммунизированные мыши) (табл. 7). В общей популяции клеток повышалось содержание типов, экспрессирующих маркеры ранней (СD25+, с 5,33 до 29,4%) и поздней (MHC II+, с 14,3 до 25,43%) активации клеток. Таблица 7. Иммунофенотип лимфоцитов селезенокмышей, иммунизированных комплексом рекомбинантных антигенов МаркерыПозитивные по исследуемому маркеру клетки (%) ОпытКонтрольКратность увеличения CD3+58,57±0,761,37±1,090,95 CD16+/CD32+13,28±1,81*8,06±0,681,65 CD3+/ CD16/CD325,46±0,403,06±0,251,78 СD3/CD4+45,17±1,05*36,04±0,881,27 CD4/CD25+29,4±1,93*5,33±0,855,52 CD5+51,5±0,8*45,3±0,961,14 CD19+28,17±1,33*12,17±12,31 CD3+/CD8a+14,7±1,03*21,63±1,660,68 MHCII+25,43±1,06*14,3±0,911,78 Примечание: данные представлены как M±σ. * – достоверность различий по сравнению с контролем, p<0,05 (по критерию Манна-Уитни). Изотипы секретируемых антител.Через 3 недели после курса иммунизации в сыворотке крови мышей иммуноферментным анализом определены специфические антитела к OprF классов IgM (в титрах от 1:200 до 1:3200, в среднем 1:1420) и IgG (от 1:3200 до 1:102400, в среднем 1:33600) и к анатоксину классов IgM (от 1:400 до 1:3200, в среднем 1:1480) и IgG (от 1:6400 до 1:102400, в среднем 1:58240) (на рис.1 и рис.2). IgG-антитела к обоим белкам были представлены всеми субизотипами с преобладанием IgG1 (от 1:800 до 1:51200 к OprF, в среднем 1:12240, и от 1:800 до 1: 102400 к анатоксину, в среднем 1:33360) и IgG2b (от 1:1600 до 1:25600 к OprF, в среднем 1: 11360, и от 1:1600 до 1: 102400 к анатоксину, в среднем 1:19680). Антитела у неиммунизированных животных не определялись в разведениях выше 1:100. Таким образом при иммунизации мышей омплексом рекомбинантных белков происходило образование специфических антител, служащих маркерами обоих путей дифференцировки Т-хелперов [Delves et al., 2017], особенно синтез IgG1-иммуноглобулинов. Рис. 1. Спектр антител к белку OprF у иммунизированных мышей, Рис. 2. Спектр антител к рекомбинантному анатоксину у иммунизированных мышей. Продолжительностьантительногоиммунногоответа. Специфические антитела, реагирующие с белками-компонентами препарата, OprF и рекомбинантным анатоксином, выявляли в сыворотке крови иммунизированных мышей через 2 недели после двукратной внутрибрюшинной иммунизации в титрах от 1:2000 до 1:32000. В сыворотках неиммунизированных мышей в разведении 1:1000 антитела не были найдены. В течение 12 недель срока наблюдения их уровень постепенно снижался (от 1:4000 до 1:1000 к OprF и от 1:8000 до 1:1000 к анатоксину). На всех сроках наблюдения титр антител иммунизированных животных был значимо выше, чем у неиммунизированных животных (p<0,01, критерий Манна-Уитни) (см. рис. 3). 35000 30000 25000 Антитела к Титр антител 20000OprF 15000Антитела к анатоксину 10000 5000 2 недели4 недели8 недель 12 недель Срок наблюдения после курса иммунизации Рис. 3. Динамика уровней антител к белкам OprF и анатоксину у иммунизированных мышей в течение срока наблюдения. Значения по шкале ординат – средний титр антител по группе и стандартное отклонение. В результате исследований установлено, что иммунизация комплексом рекомбинантных антигенов P. aeruginosa изменяет иммунофенотип лимфоцитов селезенки в сторону преобладания гуморального иммунитета, эффективно стимулирует образование антител к входящим в его состав рекомбинантным белкам P. aeruginosa. Напряженный иммунитет сохраняется до 12 недель после иммунизации (срок наблюдения). Протективнаяактивность.Мышейиммунизировали внутрибрюшинно двукратно тремя сериями препарата в объеме 0,5 мл., Через две недели после последней иммунизации животных заражали живой вирулентной культурой P. aeruginosa (штамм PA103). Наблюдение за выживаемостью проводили в течение недели и вычисляли LD50 возбудителя. Двукратная иммунизация комплексом рекомбинантных антигенов повышала выживаемость животных при заражении. Индекс эффективности, определяемый как отношение LD50 возбудителя для иммунизированных мышей к LD50 в контрольной группе, составил 2,8 для первой опытной серии комплекса, 3,3 – для второй и 3,4 – для третьей (табл. 8). Таблица 8. Протективные свойства препарата на модели внутрибрюшинного заражения мышей живой культурой P. aeruginosa Группа животных,ДозаКоличество павшихLD50, млнИЭ получивших двукратнозаражения,животных/количествоклеток млн клетокживотных в группеP. aeruginosa P. aeruginosa Физиологический10050/5034,86- раствор5032/50 2515/50 12,53/50 6,251/50 Серию препарата №120037/5097,262,79 10023/50 5011/50 255/50 12,51/50 Серию препарата №220033/50116,473,34 10020/50 509/50 252/50 12,50/50 Срию препарата №320034/50118,13,39 10016/50 5011/50 252/50 12,50/50 Таким образом, выявлена протективная активность комплекса рекомбинантныхбелковPseudomonasaeruginosa на модели внутрибрюшинного заражения иммунизированных животных. Выводы 1. Доказано отсутствие у комплекса рекомбинантных белков OprF и анатоксина Pseudomonas aeruginosa токсических, пирогенных, иммунотоксических и аллергизирующих свойств, что подтверждает его соответствие требованиям безопасности для иммунобиологических препаратов. 2. Установлено активирующее действие комплекса рекомбинантных белков OprF и анатоксина P. aeruginosa на эффекторы врожденного иммунитета, что проявлялось в усилении неспецифической фагоцитарной (до 1,82 раз) и бактерицидной (до 2,09 раз) активности лейкоцитов по отношению к гетерологичной бактерии Staphylococcus aureus. 3.Показана способность комплекса рекомбинантных белков OprF и анатоксина P. aeruginosa эффективно индуцировать созревание дендритных клеток in vitro с усилением экспрессии молекул презентации антигенов, снижением экспрессии TLR2/4 и липополисахаридных рецепторов CD14, а также секрецию ими цитокинов различных функциональных классов, в том числе острой фазы воспаления (IL-1, IL-6, TNFα), Th1- (IFN-γ, IL-12) и Th2- цитокинов (IL-4, IL-6, IL-10, IL-13), IL-17 и хемокинов (CXCL1, CCL3, CCL4, CCL5). 4.Показана стимуляция продукции in vivo цитокинов острой фазы, Th1-, Th2- и Th17 (IL-17, IL-21, IL-22) цитокинов, в особенности IL-17 (до 248 раз), при введении комплекса рекомбинантных белков OprF и анатоксина P. aeruginosa. 5.Выявлено действие комплекса рекомбинантных белков OprF и анатоксина P. aeruginosa на стимулированную фитогемагглютинином продукцию цитокинов спленоцитами мышей in vitro, при этом увеличивалась продукция цитокинов, индуцирующих дифференцировку Т-лимфоцитов (IL-12, IFN-γ), и уменьшалась продукция воспалительных и проаллергенных цитокинов (IL-1, IL-6, IL-13). 6.Показано, что иммунизация лабораторных животных комплексом рекомбинантных белков OprF и анатоксина P. aeruginosa индуцировала изменения иммунофенотипа лимфоцитов селезенки за счет нарастания в 1,25 раза доли Т-хелперов, в 2,3 раза доли В-лимфоцитов и клеток с маркерами ранней и поздней активации, а также уменьшения в 1,47 раз доли цитотоксических лимфоцитов. 7.Установлено индуцирующее действие иммунизации животных комплексом рекомбинантных белков OprF и анатоксина P.aeruginosa на синтез специфических антител к белкам OprF и анатоксину классов IgM и IgG (всех подклассов с преобладанием IgG1), сохранявшихся в крови до 12 недель после иммунизации (срок наблюдения). 8.Выявлены протективные свойства комплекса рекомбинантных белков OprF и анатоксина P. aeruginosa, увеличивавшего выживаемость иммунизированных мышей при внутрибрюшинном заражении живой вирулентной культурой возбудителя с индексом эффективности, равным 2,8 – 3,4.