Иммунодиагностика на основе магнитных наночастиц

В работе использовались наночастицы железа с углеродным покрытием (Fe@C), синтезированные в лаборатории прикладного магнетизма Института физики металлов имени М.Н. Михеева УрО РАН. Для данных магнитных наночастиц произведена оптимизация процедуры синтеза конъюгатов на их основе. В процессе синтеза использовали метод конъюгации на основе гомобифункционального сшивающего реагента – глутарового альдегида (рисунок 1) [1]. Поверхность аминированных магнитных наночастиц (Fe@C-NH2) покрывали молекулами инертного белка – бычьего сывороточного альбумина (БСА). Полученную суспензию инкубировали с раствором глутарового альдегида (ГА) в течение 30 минут. После отделения суспензии ГА-Fe@C-NH2/БСА от несвязавшихся молекул ГА и БСА с помощью метода гель-хроматографии проводили функционализацию активированных глутаровым альдегидом наночастиц распознающими молекулами. Несвязанные белки также удаляли при помощи гель-хроматографии.
I II III
БСА
Fe@C-NH2
Рисунок 1 – Схема получения конъюгатов на основе железоуглеродных наночастиц, функционализированных распознающими молекулами: I – покрытие наночастиц Fe@C-NH2 молекулами БСА; II – активация поверхности наночастиц c помощью глутарового альдегида; III – функционализация поверхности активированных наночастиц распознающими молекулами, в данном случае моноклональными антителами
Синтезированные таким образом наноконъюгаты использовались в качестве диагностических реагентов при разработке твердофазного ЯМР-иммуноанализа на нитроцеллюлозной мембране для определения ПСА и ЯМР-иммуноанализа в
иммунологических планшетах для определения антител против столбнячного анатоксина. Размеры наночастиц оценивали методом обратного динамического светорассеяния и просвечивающей электронной микроскопии.
Для экспериментов по созданию твердофазного ЯМР-иммуноанализа на нитроцеллюлозе были использованы сыворотки крови 11 доноров-женщин в возрасте от 23 до 43 лет. Концентрации ПСА в сыворотке определяли методом иммуноферментного анализа. ПСА- отрицательные образцы сывороток крови объединяли и хранили при +4 °C. Для экспериментов по созданию ЯМР-иммуноанализа с использованием иммунологических планшетов для определения антител против столбнячного анатоксина были использованы сыворотки крови 14 доноров, вакцинированных цельноклеточной вакциной АКДС и 1 невакцинированного донора. В работе также использовался пул сывороток крови, полученный от трех интактных кроликов. Концентрацию антител против столбнячного анатоксина в сыворотках крови определяли с помощью иммуноферментного анализа. Образцы аликвотировали и хранили при -20 °C. Все исследования проводились согласно Хельсинской Декларации ВМА 2000 г. и протоколу Конвенции Совета Европы о правах человека и биомедицине 1999 г.; получено разрешение этического комитета ИЭГМ УрО РАН (IRB00010009) от 09.06.2017. ЯМР-иммуноанализ проводили с использованием портативного ЯМР-релаксометра, созданного специалистами лаборатории прикладного магнетизма Института физики металлов имени М.Н. Михеева УрО РАН.
Полученные данные обрабатывали с помощью программ в MS Office Excel, Microsoft (США) и GraphPad Prism 6.01, GraphPad Inc (США). Графики были подготовлены в программе GraphPad Prism 6.01. Калибровочные кривые получали, используя программу Originlab 2020b (OriginLab Corporation, США).
Принцип получения аналитического сигнала при твердофазном ЯМР- иммуноанализе. Регистрация аналитического сигнала при ЯМР-релаксометрии основана на способности магнитных наночастиц влиять на время поперечной релаксации протонов T2. При помещении протонов в магнитное поле их векторы намагниченности будут вращаться в одной фазе. При воздействии на них радиочастотным импульсом происходит смещение фаз вращения векторов намагниченности протонов так, что в итоге векторы всех протонов будут двигаться в разных фазах. После прекращения действия импульса векторы протонов постепенно вновь выстроятся вдоль магнитного поля. Этот процесс и называется спин-спиновой релаксацией, а время необходимое для дефазировки 37% протонов – Т2 временем релаксации. Если внести в данную систему магнитные наночастицы, то время релаксации протонов изменится. В
представленном исследовании степень изменения времени релаксации зависит от количества магнитных наночастиц в анализируемой пробе. В данном случае показатель времени Т2 находился в обратной зависимости от концентрации Fe@C-NH2/БСА/распознающая молекула: чем больше магнитных наночастиц содержалось в анализируемой пробе после процедуры промывки, тем ниже было значение времени Т2. Следовательно, Т2 снижалось при повышении концентрации аналита в исследуемой пробе (рисунок 2).
Рисунок 2 – Принцип получения аналитического сигнала в виде изменения Т2 в твердофазном ЯМР-иммуноанализе
Твердофазный ЯМР-иммуноанализ на нитроцеллюлозной мембране. Принцип и процедура анализа будут описаны на примере сэндвич-анализа для определения ПСА. Тест- полоски из нитроцеллюлозной мембраны погружали в 3,5 мл раствора ФСБ (фосфатно-солевой буфер) и выдерживали 5 минут. Далее тест-полоску обрабатывали раствором моноклональных антител против ПСА (клон 3А6). После этого полоски высушивали 15 минут при комнатной температуре и 30 минут при + 37 °C, промывали 1,5 мл ФСБТ (ФСБ+ твин-20) три раза по 5 минут, блокировали неспецифические сайты связывания 1,5 мл раствора ФСБТ + 2% казеин + 1% БСА в течение 60 минут и вновь осуществляли процедуру промывки. Затем тест-полоски инкубировали с анализируемыми образцами (400 мкл) в течение 60 минут, вновь промывали, вносили в лунки 400 мкл раствора детектирующего реагента Fe@C-NH2/БСА/1А6 в ФСБТ + 2% казеин и инкубировали в течение 60 минут. После этого тест-полоски промывали ФСБТ. Далее проводили измерение Т2 времени релаксации, помещая тест-полоску в катушку портативного

ЯМР-релаксометра (рисунок 3). Все этапы анализа за исключением процедур промывки и измерения проводились при + 37 °C.
Рисунок 3 – Процесс измерения Т2 образца в ходе твердофазного ЯМР- иммуноанализа
Непрямой ЯМР-иммуноанализ с использованием планшета для иммунологических реакций в определении антител против столбнячного анатоксина. Раствор столбнячного анатоксина, разведенного в карбонатном бикарбонатном буфере, pH 9,6 вносили в лунки планшета и инкубировали в течение 2 часов. После этого лунки 3-х кратно промывали ФСБТ, вносили блокирующий буфер (ФСБТ + 2% казеин + 1% БСА), инкубировали 1 час и вновь промывали. Далее в лунки вносили калибровочные растворы или образцы сывороток крови, содержащие антитела против столбнячного анатоксина, инкубировали 1 час и промывали. Затем лунку инкубировали в течение 1 часа с конъюгатом Fe@C-NH2/БСА/белок G, разведенным в ФСБТ + 2% казеина до конечной концентрации 0,05 мг/мл, и вновь промывали. После этого в лунки планшета вносили 100 мкл 0,1 M NaOH, проводили инкубацию в течение 1 часа и измеряли время релаксации протонов в каждой лунке (рисунок 4). Все этапы анализа за исключением процедур промывки и измерения проводились при +37 °C.

Рисунок 4 – Процесс измерения Т2 образца в ходе ЯМР-иммуноанализа с использованием иммунологических планшетов
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Оптимизация процедуры синтеза конъюгатов на основе магнитных
наночастиц
Известно, что покрытие поверхности магнитных наночастиц молекулами БСА может создавать как электростатические, так и стерические препятствия к их агрегации и, следовательно, обеспечивать сохранение стабильности в различных условиях (Schubert, J. Coating matters: Review on colloidal stability of nanoparticles with biocompatible coatings in biological media, living cells and organisms / J. Schubert, M. Chanana // Current Medicinal Chemistry. 2018. V.25, No35. P. 4553-4586). Более того, молекулы БСА содержат множество функциональных групп, что позволяет проводить ковалентное присоединение распознающих молекул. В данной работе представлены результаты исследований, посвященных покрытию поверхности аминированных железоуглеродных наночастиц (Fe@C-NH2) молекулами БСА. Аминогруппы придают поверхности наночастиц заряд, обеспечивающий электростатическое взаимодействие между молекулами БСА и поверхностью Fe@C. В результате происходит образование группы единичных наночастиц, заключенных в белковую оболочку (Fe@C- NH2/БСА) (рисунок 5).
Результатом проведенных исследований стала разработка подходов к синтезу железоуглеродных наночастиц, покрытых БСА, с регулируемыми размерами (от 100 до 200 нм). Тонкую настройку размеров наночастиц производили, варьируя условия синтеза: pH среды, ионную силу и массовое соотношение БСА:наночастицы [1,3].
А
Рисунок 5 – ПЭМ-изображение: А) Аминированных наночастиц (Fe@C-NH2); Б) Аминированных наночастиц, покрытых БСА (Fe@C-NH2/БСА)
Возможность конъюгирования наночастиц с распознающими молекулами (РМ) была продемонстрирована путем ковалентного присоединения стрептавидина (Fe@C-NH2/БСА/Str). В итоге были успешно синтезированы Fe@C-NH2/БСА/Str с размерами 100, 130 и 190 нм, при этом процесс функционализации никак не повлиял на диаметр наночастиц. Для оценки функциональной активности полученных диагностических реагентов были синтезированы конъюгаты магнитных наночастиц с моноклональными антителами против ПСА (клон 1А6), которые в дальнейшем обозначены как Fe@C-NH2/БСА/1А6. Исходное соотношение антител и наночастиц в ходе синтеза составляло от 10 до 160 мкг на 1 мг. Функциональную активность конъюгатов оценивали методом прямого твердофазного дот-иммуноанализа для определения белка G. Оценку результатов анализа планировали проводить с помощью ЯМР-релаксометра и визуально. Однако, провести визуальную оценку не удалось, так как цветовой сигнал не наблюдался, при этом изменения времени релаксации Т2 были зафиксированы (рисунок 6) [3]. Полученные данные подтверждают факт того, что регистрация сигнала при помощи ЯМР- релаксометра позволяет значительно повысить чувствительность прямого анализа по сравнению с колориметрической оценкой сигнала [1, 2, 3].
Сохранение размеров наночастиц при длительном хранении важно для практического применения диагностических реагентов на основе магнитных наночастиц с распознающими молекулами. Изменение размеров подобных конъюгатов при хранении ввиду агрегации наночастиц может привести к искажению результатов анализа, созданного на их основе (Laurentius, L.B. Advantages and limitations of nanoparticle labeling for early diagnosis of infection / L.B. Laurentius, N.A. Owens, J. Park et al. // Expert Review of Molecular Diagnostics. 2016. – Vol. 16, No9. P. 883-895).

Рисунок 6 – Оценка функциональной активности конъюгатов Fe@C-NH2/БСА/1А6 с различными массовыми соотношениями Fe@C-NH2/БСА:РМ с помощью ЯМР-релаксометрии, (n=3)
Рисунок 7 – Оценка коллоидной стабильности конъюгатов Fe@C-NH2/БСА/Str (слева) и Fe@C-NH2/БСА/1А6 (справа) при хранении при +4° C, (n=3)
Поэтому было необходимо провести изучение стабильности разрабатываемых конъюгатов. Конъюгаты Fe@C-NH2/БСА/Str и Fe@C-NH2/БСА/1А6 хранили в виде суспензий в стабилизирующей смеси, состоящей из ФСБ, 20% глицерина, 1% БСА и 0,1% азида натрия (Raev, M.B. Investigation into size distribution of carbon nanoparticles covalently functionalized with proteins / M.B. Raev, P.V. Khramtsov, M.S. Bochkova // Nanotechnologies in Russia Edition. 2015. Vol. 10, No1-2. P. 140-148). Размеры и полидисперсность наночастиц в составе конъюгатов не изменялись при хранении (рисунок 7) в течение месяца при +4° C по данным динамического светорассеяния [3].
2. Разработка твердофазного ЯМР-иммуноанализа
Данный блок экспериментов был посвящен разработке гетерогенного иммуноанализа. В качестве твердой фазы была использована нитроцеллюлозная мембрана, следовательно, при проведении анализа протоны воды находились в ее порах (Mujawar, L.H. Influence of Pluronic F127 on the distribution and functionality of inkjet-printed biomolecules in porous nitrocellulose substrates / L.H. Mujawar, A. Van Amerongen, W. Norde // Talanta. 2015. Vol. 131 P. 541-547). В отличие от гомогенных анализов, выполняемых в объеме жидкости, в данном случае для

эффективного влияния магнитных наночастиц на время релаксации максимального количества протонов необходимым является нахождение МНЧ в порах мембраны.
Таким образом, образование иммунных комплексов, в состав которых входили магнитные наночастицы, на поверхности твердой фазы было неприемлемым. Требовалось подобрать способ и условия для нанесения первых моноклональных антител против ПСА (клон 3А6) на нитроцеллюлозную мембрану, обеспечивающие эффективное проникновение молекул данного белка внутрь пор твердой фазы. Протестированы различные способы нанесения моноклональных антител против ПСА на нитроцеллюлозную мембрану. Было показано, что способ нанесения, включающий полное погружение тест-полоски в раствор первых моноклональных антител, является оптимальным. При использовании данного подхода проникновение иммуноглобулинов G внутрь пор нитроцеллюлозной мембраны наиболее эффективно, что позволяет достигать предела детекции со значением менее 1 нг/ мл [4, 5].
Помимо этого, были подобраны оптимальные условия процедуры анализа: состав блокирующего буфера, концентрация первых моноклональных антител против ПСА и концентрация диагностического реагента Fe@C-NH2/БСА/1А6. Известно, что клинически значимый уровень ПСА в крови составляет 4 нг/мл (Arneth, B. M. Clinical Significance of Measuring Prostate-Specific Antigen / B. M. Arneth // Laboratory Medicine. 2009. V.40, No8, P. 30). Кроме того, следует учитывать, что исследуемые образцы сыворотки крови необходимо разводить в несколько раз блокирующим буфером. Таким образом, подобранные условия анализа должны приводить к ситуации, при которой минимальная определяемая концентрация будет ниже 1 нг/мл. Это позволит с большей точностью разграничить образцы сывороток крови пациентов, содержащие ПСА в концентрации выше и ниже клинически значимого уровня. Определено, что наилучший блокирующий эффект достигается при использовании 1% или 2% раствора казеина [5, 6]. Оптимальная рабочая концентрация для первых МКА против ПСА (клон 3А6), была определена как 0,1 мг/ мл [5, 6, 7]. Следующим этапом исследования стало проведение твердофазного ЯМР-иммуноанализа для детекции ПСА в образцах сывороток крови в подобранных условиях. По результатам осуществленного анализа была построена калибровочная кривая в соответствии с четырeхпараметрической логистической моделью. Аналитическую чувствительность (минимально определяемая концентрация, нижний предел детекции) определяли следующим образом. Три стандартных отклонения вычитали из среднего арифметического для показателя времени T2 отрицательного образца (отрицательный образец − 3×стандартных отклонения). По калибровочной кривой (рисунок 8) оценивали, какой концентрации аналита соответствует полученная величина. Именно этот показатель концентрации аналита и соответствовал минимальной достоверно отличимой от фона
концентрации, которую выявлял данный анализ. Минимальная определяемая концентрация ПСА для разработанного метода составила 0,35 нг/мл.
Специфичность (селективность) анализа была определена с использованием трех онкомаркеров: хорионический гонадотропин человека (ХГЧ), альфа-фетопротеин (АФП) и калликреин 2, который вместе с ПСА (также известным как калликреин 3) относится к семейству калликреинов. Калликреин 2 имеет приблизительно 80% структурную гомологию с ПСА и также используется в качестве маркера для диагностики рака простаты (Stephan, G. Clinical utility of human glandular kallikrein 2 within a neural network for prostate cancer detection / G. Stephan, K. Jung, A. Soosaipillai et al. // BJU International. 2005. Vol. 96, No4. P. 521-527). Сигнала не было отмечено в образцах, содержащих 1, 10 и 100 нг/мл АФП, ХГЧ или калликреина 2 (рисунок 9), соответственно. Полученные данные свидетельствуют о том, что разработанный метод анализа обладает высокой степенью селективности по отношению к ПСА. Таким образом, разработанный анализ позволит разграничивать образцы сывороток крови, содержащие ПСА в концентрации выше и ниже клинически значимого уровня. Полученные данные говорят о том, что описанные подходы к созданию твердофазных ЯМР-иммуноанализов с использованием нитроцеллюлозной мембраны могут успешно применяться при конструировании диагностических тест-систем.
Рисунок 8 – Калибровочная кривая для определения ПСА методом твердофазного ЯМР-иммуноанализа, (n=3)
Рисунок 9 – Оценка специфичности (селективности) разработанного метода, (n=3)
3. Разработка твердофазного ЯМР-иммуноанализа с использованием иммунологических планшетов
Данный блок исследований был направлен на разработку более удобного формата ЯМР- анализа и на повышение его чувствительности. Анализ проводили в стандартном 96-луночном иммунологическом планшете из полистирола. При постановке анализа в такой аранжировке иммунные комплексы, содержащие магнитные наночастицы, образуются на поверхности лунок планшета. В этом случае в генерации аналитического сигнала будут задействованы только те протоны, которые находятся в непосредственной близости к стенкам лунок планшета. Одним из способов увеличения количества доступных протонов, является перевод в раствор иммунных комплексов, содержащих магнитные наночастицы, при помощи различных элюирующих растворов (рисунок 10). При таком подходе магнитные наночастицы в составе иммунных комплексов со стенок лунок планшета переходят в свободное состояние и распределяются по всему объему раствора. Это приводит к значительному увеличению количества доступных протонов и, как следствие, к увеличению сигнала в виде снижения времени релаксации Т2. Данный метод позволяет объединить преимущества традиционных твердофазных анализов с преимуществами ЯМР-анализа в объеме жидкости. При выборе элюирующего реагента в данном исследовании важным аспектом являлась способность реагента быстро разрушать иммунные комплексы и обеспечивать коллоидную стабильность наночастиц. Сохранение коллоидной стабильности было необходимым условием, поскольку агрегация магнитных наночастиц под действием элюирующих растворов могла повлиять на эффективность разрабатываемого анализа. Была исследована стабильность конъюгатов магнитных наночастиц в следующих растворах: 0,1 M HCl, 0,1 M NaOH, 8 M мочевина, 3 M KSCN (тиоцианат калия) и ФСБ. Фосфатно-солевой буфер использовали в качестве отрицательного контроля. Определено, что МНЧ в составе конъюгата Fe@C-NH2/БСА/белок G стабильны во всех исследованных растворах в течение 2 часов при комнатной температуре [8, 9].
Рисунок 10 – Схема твердофазного ЯМР-анализа в лунках планшета: 1. Покрытие лунок планшета антилигандом; 2. Добавление образца; 3. Добавление диагностического реагента; 4. Добавление элюирующего раствора

Для оценки способности указанных элюирующих растворов быстро разрушать иммунные комплексы были выполнены прямой анализ для детекции Bi-БСА (рисунок 11), непрямой анализ для определения IgG против столбнячного анатоксина (СА) (рисунок 11) и сэндвич-анализ для детекции ПСА (рисунок 11). После инкубации с диагностическими реагентами в лунки были внесены элюирующие растворы, инкубация продолжалась в течение 60 мин. Результаты измерений выражались как отношение времени релаксации T2 тестируемого образца (T2T) и T2 (T2E) элюирующего раствора (T2T/T2E). В лунках, в которые был добавлен фосфатно-солевой буфер, наблюдалось незначительное изменение T2, что подтверждает влияние магнитных наночастиц, сорбированных на поверхности лунок, на время релаксации лишь небольшого количества протонов. При прямом определении Bi-БСА приемлемой чувствительности удалость добиться только при использовании 0,1 М раствора NaOH [8, 9]. Таким образом, в дальнейших исследованиях в качестве элюирующего раствора использовали 0,1М NaOH. В случае анализов для определения человеческого IgG и ПСА аналитическая чувствительность была практически одинаковой для всех тестируемых растворов (рисунок 11) [4, 10]. Далее была проведена оптимизация ЯМР-анализа в определении IgG против СА. Показано, что с учетом временной задержки при регистрации сигнала для каждого образца, оптимальным временем инкубации планшета с элюирующим раствором является 60 минут [4]. Продемонстрировано, что снижение влияния матричного эффекта достигается при разведениях образцов сыворотки крови 1/64 и более [9].
В подобранных условиях была проведена оценка основных аналитических характеристик разработанного анализа. Калибровочные кривые были построены с использованием логистической функции (рисунок 12). Аналитическая чувствительность иммуноанализа составила 0,08-0,12 мМЕ/мл [9, 10]. Предел детекции анализа ЯМР на основе элюирования магнитных наночастиц в 4-7 раз ниже, чем у ранее разработанного ЯМР-анализа на нитроцеллюлозной мембране для определения IgG против СА (0,52 мМЕ/мл) (Khramtsov, P. Magnetic nanoclusters coated with albumin, casein, and gelatin: Size tuning, relaxivity, stability, protein corona, and application in nuclear magnetic resonance immunoassay / Khramtsov P, Barkina I, Kropaneva M et al. // Nanomaterials. 2019. Vol. 9, No9. P. 1345). При оценке внутрисерийной воспроизводимости анализа коэффициент вариации не превышал 7,5% [9, 10].
Рисунок 12 – Калибровочная кривая для определения антител против столбнячного анатоксина методом твердофазного ЯМР- иммуноанализа с использованием иммунологических планшетов
Рисунок 11 – Оценка эффективности использования элюирующих растворов для определения Bi-БСА, IgG, ПСА
Концентрация антител против СА в сыворотке крови отражает степень иммунной защиты от столбняка. Согласно рекомендациям ВОЗ, концентрация антител против СА – 0,1 МЕ/мл по данным, полученным с использованием ИФА, является общепринятым защитным порогом (Yen, L. M. Tetanus / L. M. Yen, C.L. Thwaites // Lancet. 2019. Vol. 393, No101818. P. 1657-1668). Была проведена оценка концентрации IgG против СА в 14 образцах сывороток крови добровольцев, иммунизированных вакциной АКДС, с помощью коммерческого ИФА и представляемого анализа. Результаты эксперимента представлены в таблице 1. Была показана высокая степень корреляции между двумя методами иммуноанализа (коэффициент корреляции Пирсона = 0,9983; p<0,0001). Полученные данные говорят о том, что метод ЯМР- иммуноанализа с использованием иммунологических планшетов позволяет проводить оценку напряженности иммунитета после вакцинации противостолбнячной сывороткой. 1 0,058 2 0,098 3 0,147 4 0,351 5 0,291 0,082 6 0,139 7 0,212 8 0,218 9 0,25 10 0,356 0,378 0,447 0,448 0,883 0,573 0,617 0,694 0,574 0,595 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 11 2,052 2,422 12 2,156 2,437 13 5,472 4,901 14 23,835 18,9 Таблица 1 – Концентрация IgG против СА в образцах сывороток крови доноров, определенная с помощью ЯМР-анализа с использованием иммунологических планшетов и ИФА, МЕ/мл No образца сыворотки ЯМР- анализ в лунках планшета ИФА No образца сыворотки ЯМР- анализ в лунках планшета ИФА No образца сыворотки ЯМР- анализ в лунках планшета ИФА Ключевым результатом проведенного исследования является разработка универсальных подходов к конструированию тест-систем на основе ЯМР-релаксометрии в различных форматах. Предложенные методики позволят создавать иммуноанализы для клинической лабораторной диагностики, контроля эффективности иммунизации, а также для оценки продукции различных биологических молекул иммунокомпетеными клетками. В ходе работы определено, что большую роль при получении конъюгатов на основе магнитных наночастиц играет изучение параметров синтеза, в конечном итоге влияющих на их размер. Разработка методов синтеза стабильных конъюгатов на основе железоуглеродных наночастиц с регулируемыми размерами, функционализированных распознающими молекулам, позволили сконструировать твердофазный ЯМР-иммуноанализ для определения ПСА и ЯМР- иммуноанализ с использованием иммунологических планшетов для детекции антител против столбнячного анатоксина. Полученные в ходе исследования результаты позволяют сделать вывод о том, что при разработке иммуносорбентов для твердофазного ЯМР-анализа необходимо использовать подходы отличные от тех, что применяются при конструировании традиционных дот-иммуноаналитических тестов, основанных на получении результата окрашенных зон, оцениваемых визуально. Оптимальным способом подготовки иммуносорбента в данном случае является полное погружение тест-полосок в раствор антител. Сконструированная твердофазная тест-система на основе ЯМР-иммуноанализа на нитроцеллюлозной мембране позволила определять ПСА в сыворотке крови с достаточной аналитической чувствительностью 0,35 нг/мл. Однако достижение данного показателя возможно только при осуществлении большого количества циклов промывки на последней стадии анализа, что увеличивает время и трудоемкость его процедуры. Описанные технологические сложности возможно преодолеть с помощью автоматизации некоторых этапов разработанного анализа, в том числе и этапа промывки. При разработке модели для твердофазного ЯМР-анализа с использованием иммунологических планшетов показана возможность увеличения аналитической чувствительности в 4-7 раз по сравнению с анализом, осуществленным на пористой мембране. Однако процедура разработанного анализа все еще остается трудоемкой, в связи с необходимостью помещения каждой лунки планшета в отсек для измерения. Данную проблему можно решить путем модификации портативного ЯМР-релаксометра таким образом, чтобы появилась возможность одновременного считывания сигнала в нескольких лунках (Huber, S. Multichannel digital heteronuclear magnetic resonance biosensor / S. Huber, C. Min, C. Staat [et al.] // Biosensors and Bioelectronics. 2019. Vol. 126. P. 240-248). ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ 1) Атоматизация процедуры разработанных моделей анализа с целью ее упрощения; 2) Оценка возможности модификации составляющих частей ЯМР-релаксометра для одновременной регистрации аналитического сигнала от нескольких образцов; 3) Проведение исследований, связанных с созданием готового диагностического набора на основе иммуноанализа, предусматривающего использование явления ядерного магнитного резонанса. ВЫВОДЫ 1. Разработано технологическое решение получения стабильных диагностических реагентов на основе магнитных наночастиц и система детекции, использующая феномен ядерного магнитного резонанса в режиме измерения времени релаксации протонов, обеспечивающие возможность конструирования иммуноаналитических тест-систем с широким спектром специфичностей. Описанные диагностические реагенты имеют потенциал для применения в методах анализа на основе феномена ядерного магнитного резонанса. 2. Сконструирован твердофазный дот-иммуноанализ на основе ядерного магнитного резонанса с использованием полученных диагностических реагентов для определения простатспецифического антигена. Аналитическая чувствительность представленного метода составила 0,35 нг/мл. Разработанный метод позволяет разграничивать образцы сывороток крови пациентов, содержащие простатспецифический антиген в концентрации выше и ниже клинически значимого уровня. 3. Разработан твердофазный иммуноанализ на основе ядерного магнитного резонанса с использованием планшетов для иммунологических реакций, позволяющий определять уровень антител против столбняка. Аналитическая чувствительность сконструированной тест-системы составила 0,08-0,12 мМЕ/мл. Метод позволяет оценивать напряженность иммунитета после иммунизации противо столбнячной вакциной. Универсальность диагностического реагента, обусловленная применением G белка в качестве распознающей молекулы, дает возможность осуществлять количественную оценку концентрации иммуноглобулинов в ходе тестирования вакцин, иммунизации лабораторных животных, а также в биотехнологических процессах на этапах производства и очистки моноклональных антител. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. При синтезе диагностических реагентов на основе магнитных наночастиц с распознающими молекулами следует учитывать влияние массового соотношения белок:наночастицы, pH реакционной смеси и ионной силы на структурные характеристики получаемых суспензий; 2. Для получения надежных результатов твердофазного иммуноанализа на основе ядерного магнитного резонанса подготовку иммуносорбента из нитроцеллюлозной мембраны следует осуществлять методом полного погружения тест-полоски в раствор антианалита, а также использовать нитроцеллюлозную мембрану с диаметром пор более 5 мкм; 3. Для получения надежных результатов твердофазного иммуноанализа на основе ядерного магнитного резонанса с использованием иммунологических планшетов элюцию иммунных комплексов со стенок лунок следует производить в течение 60 минут, а также использовать при анализе разведение образцов сыворотки крови не менее 1/100.