Иммуногенная и протективная активность конъюгированных олигосахаридов – синтетических аналогов фрагментов капсульного полисахарида Streptococcus pneumoniae серотипа 3

Препараты. Ди-, три- и тетрасахариды (Схема 1), соответствующие одному, полутора и двум повторяющимся звеньям КП S. pneumoniae серотипа 3, синтезированы в ФГБУН ИОХ им. Н.Д. Зелинского РАН (лаборатория гликоконъюгатов, заведующий лабораторией член-корреспондент РАН, д.х.н., профессор Н.Э. Нифантьев). Для иммунизации животных олигосахариды конъюгировали с БСА скваратным методом. Для идентификации индуцированных антител в ИФА использовали конъюгаты олигосахаридов с биотином, полученные методом ацилирования, которые иммобилизовали на пластике планшетов, покрытых стрептавидином [Цветков Ю.Е. и соавт., 2017]. Лиофилизированные конъюгаты хранили в стеклянных флаконах при температуре от 2о С до 8о С.
Схема 1. Структура олигосахаридов, соответствующих фрагментам капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 3, и их конъюгатов.
Примечание: а) дисахарид, б) трисахарид; в) тетрасахарид; 1 а-в) спейсер; 2 а-в) конъюгаты олигосахаридов с БСА; 3 а-в) конъюгаты олигосахаридов с биотином.
Методом MALDI-TOF анализа установлено, что конъюгаты ди-, три- и тетрасахарида с БСА содержали в среднем 19, 18 и 16 олигосахаридных лигандов на одну молекулу белка соответственно. Содержание углеводов в конъюгатах составило 9, 13 и 15% соответственно [Tsvetkov YE., et al. 2017].
Бактериальный капсульный полисахарид получен в лаборатории иммунохимической диагностики ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова (заведующий лабораторией д.м.н., профессор Н.Е. Ястребова) из штамма S. pneumoniae серотипа 3 No10196 [Ванеева Н.П., Ястребова Н.Е., 2015].
Конъюгированная 13-валентная пневмококковая вакцина Превенар 13 (фирма “Pfizer”, США), содержащая в своем составе конъюгат КП S. pneumoniae серотипа 3 с CRM197, использована в качестве референс-препарата в разовой иммунизирующей дозе 1,1 мкг/мышь по КП серотипа 3, что эквивалентно 1⁄2 дозы, рекомендуемой для человека.
Лабораторные животные. Мыши линии BALB/с (самцы) (n=250) массой 14-16 г получены из питомника НЦ биомедицинских технологий (филиал «Андреевка»). Протоколы экспериментов утверждены этическим комитетом ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова.
Иммунные сыворотки. Гипериммунные антибактериальные кроличьи сыворотки к различным серотипам пневмококка, а также к некоторым грамотрицательным и грамположительным бактериям получены в лаборатории иммунохимической диагностики ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова.
Иммунизация мышей, определение титра и изотипа антител в ИФА.
Мышей иммунизировали двукратно внутрибрюшинно конъюгатами ди-, три- и тетрасахарида c БСА (2,5; 5; 10 или 20 мкг в расчете на углевод), адсорбированными на геле алюминия гидроксида (Sigma–Aldrich Co., США) (250 мкг/доза), с интервалом 14 суток. Через 2 недели в сыворотке крови иммунизированных мышей определяли титр и изотип антител (АТ) углеводной специфичности методом ИФА. В качестве антигена в твердофазном ИФА использовали биотинилированные олигосахариды или КП S. pneumoniae серотипа 3. Оптическую плотность (OП) определяли с помощью микропланшетного ИФА-
ридера (iMark, Bio-Rad, Япония) при длине волны 450 нм. Титр АТ представляли в виде разведения сыворотки или трансформировали значения в log10.
Определение антител к двуспиральной ДНК проводили методом твердофазного ИФА при иммобилизации на дне лунок пластиковых планшетов препарата нативной ДНК, полученной из спермы лосося (Bochringer GmbH, Германия). Результаты учитывали на многоканальном автоматическом фотометре (Titertech Multiscan MC, Flow Laboratories, Англия) при длине волны 490 нм (работу выполняли на базе лаборатории иммунохимической диагностики).
Антигенсвязывающую способность антител исследовали в реакции ингибирования ИФА при прибавлении к иммунным сывороткам лигандов олигосахаридов или КП серотипа 3. Определяли IC50 – концентрацию антигена, уменьшающую ОП450 в 2 раза.
Антитело-зависимый фагоцитоз (опсонофагоцитоз). Количество нейтрофилов и моноцитов периферической крови интактных мышей (n=10), захвативших инактивированные ацетоном FITC-меченные бактерии S.pneumoniae серотипа 3, обработанные иммунной и нативной сыворотками, определяли с помощью проточного цитофлуориметра (Cytomix FC-500, Beckman Coulter, США, с программным обеспечением CXP). Результат представляли процентах.
Протективная активность. Мышей, иммунизировали внутрибрюшинно гликоконъюгатами (2,5; 5; 10 или 20 мкг по углеводу на мышь) 2-кратно с интервалом 14 суток. Через 2 недели животных заражали S. pneumoniae серотипа 3 No3 (ЦКП НИИВС им. И.И. Мечникова) путем внутрибрюшинного введения 104 колониеобразующих единиц на мышь (5,6 LD50). Количество выживших животных учитывали на 16 сутки после заражения.
Содержание бактериальных эндотоксинов в гликоконъюгатах
определяли хромогенным ЛАЛ-тестом по конечной точке в соответствии с ОФС «Бактериальные эндотоксины» 42-0062-07. Результат оценивали в единицах эндотоксина (ЕЭ). Содержание эндотоксинов в конъюгатах ди-, три- и тетрасахаридов с БСА составляло 0,08-0,11 ЕЭ/мл. Исследование проведено в испытательной лаборатории ООО «НПО «ЛАЛ-Центр», г. Москва, Россия.
Продукция цитокинов. Спленоциты неиммунизированных мышей (2,5×105 клеток/лунка) вносили в лунки стрептавидиновых планшетов (Pierce, США) с иммобилизованными на их поверхности биотинилированными олигосахаридами, и инкубировали 24 ч при 37° С [Komarova B.S. et al., 2018]. Содержание цитокинов в супернатанте клеток определяли с помощью набора реагентов FlowCytomix Mouse Thl/Th2 10-plex Kit (eBioscience, США), содержащего бусы, покрытые моноклональными антителами к цитокинам (IL-1α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-17A, GM-CSF, IFNγ и TNFα).
Концентрацию цитокинов в сыворотке крови мышей определяли с помощью набора реагентов FlowCytomix Mouse Thl/Th2 Kit 14-plex (eBioscience, США), с бусами, покрытыми моноклональными антителами к цитокинам (IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-21, IL-22, IFNγ и TNFα). Детекцию результатов проводили методом проточной цитофлуориметрии (FC-500, Beckman Coulter, США).
Экспрессия поверхностных молекул на мононуклеарных клетках селезенки мышей. Спленоциты мышей обрабатывали анти-мышиными антителами, конъюгированными с фикоэритрином (PE) или флуоресцеин- изотиоцианатом (FITC): CD3, CD4, CD8, CD19, CD5.2, NK1.1, CD25, CD4/CD25 (Treg), TCR (гамма-дельта T) и I-EK (MHC класса II) (eBioscience, США) при 4° C в течение 30 мин. Результаты оценивали с помощью проточной цитофлуориметрии, представляя их как количество иммунокомпетентных клеток (в %), экспрессирующих на поверхностной мембране соответствующие маркеры.
Статистический анализ. Результаты представляли средним значением ± стандартное отклонение (M±SD). Для оценки различий между сравниваемыми группами использовали критерий Манна-Уитни для независимых выборок. Выживаемость мышей после заражения оценивали с помощью точного критерия Фишера. Значения P ≤ 0,05 считали статистически значимыми. Программное обеспечение Statistica 10 (StatSoft Inc., Tulsa, OK, США).
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Антигенная активность ди-, три- и тетрасахаридов
Наличие общих антигенных детерминант у олигосахаридов и КП S. pneumoniae серотипа 3 определяли по способности АТ, индуцированных к КП, взаимодействовать с биотинилированными ди-, три- и тетрасахаридами методом ИФА, а также по способности лигандов олигосахаридов блокировать связывание АТ, специфичных к КП или олигосахаридам, с биотинилированными олигосахаридами или КП, иммобилизованными на твердой фазе, методом ингибирования ИФА.
Биотинилированный тетрасахарид выявлял IgG-АТ к КП S. pneumoniae серотипа 3 в исследуемой сыворотке в более высоком титре по сравнению с ди- и трисахаридом (log10 3,2; 2,0; 2,4 соответственно) и не взаимодействовал с АТ к S. pneumoniae серотипов 1, 2, 4, 5, 6А, 6B, 14, 19F, 23F, Haemophilus influenzae типа b, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Staphylococcus aureus (Рис.1).
Рис.1. Специфичность взаимодействия АТ, индуцированных к КП S. pneumoniae серотипа 3, с биотинилированными олигосахаридами в ИФА.
Примечание. К – контроль (нативная сыворотка). Каждый образец пуловой иммунной сыворотки кроликов (n=2) исследовали в 4-х повторах. M±SD. Тест Манна-Уитни, * P < 0,05 по сравнению с контролем и гетерологичными сыворотками. Способность IgG-АТ, специфичных к КП S. pneumoniae серотипа 3, связывать свободные олигосахариды (лиганды) показана в реакции ингибирования ИФА при использовании иммобилизованных на твердой фазе конъюгатов ди-, три- и тетрасахарида c биотином (Рис.2). Рис.2. Блокирование лигандами взаимодействия IgG-АТ, индуцированных к КП S. pneumoniae серотипа 3, с иммобилизованными на твердой фазе биотинилированными олигосахаридами, в реакции ингибирования ИФА. Примечание. Каждый образец пуловой иммунной сыворотки кроликов (n=2) исследовали в 4-х повторах. M±SD. Лиганды ди- и трисахарида характеризовались слабой способностью блокировать связывание IgG-АТ, индуцированных к КП S. pneumoniae серотипа 3, независимо от использованного биотинилированного олигосахарида, иммобилизованного на планшетах, покрытых стрептавидином. В системе сыворотка к КП S. pneumoniae серотипа 3 / биотинилированный тетрасахарид лиганд тетрасахарида связывал IgG-АТ к КП в той же концентрации, что и очищенный бактериальный КП S. pneumoniae серотипа 3 (IC50 = 0,1 мкг/лунка). В системе сыворотка к КП S. pneumoniae серотипа 3 / бактериальный КП только лиганд тетрасахарида обладал ингибирующей активностью, сопоставимой с активностью КП S. pneumoniae серотипа 3 в максимальной из испытанных концентраций (10 мкг/лунка) (Рис.3 А). Рис.3. Блокирование лигандами взаимодействия IgG-АТ, индуцированных к КП S. pneumoniae серотипа 3, с иммобилизованным на твердой фазе КП, в реакции ингибирования ИФА. Примечание. А) Антибактериальная сыворотка кроликов (n=2) к S. pneumoniae серотипа 3. Б) Сыворотка мышей (n=6), иммунизированных вакциной Превенар 13, содержащая CRM197-КП S. pneumoniae серотипа 3. Каждый образец пуловой иммунной сыворотки исследовали в 4-х повторах. M±SD. Ингибирующая активность всех исследованных лигандов в сыворотке крови животных, иммунизированных вакциной Превенар 13, не достигала IC50 (Рис. 3 Б). Различия между связыванием АТ с лигандами в антибактериальной сыворотке и в сыворотке к КП, входящему в состав пневмококковой вакцины, могут быть обусловлены строением активных центров антител, определяемых структурой КП, использованного для иммунизации животных: в одном случае - нативного бактериального, в другом – подвергнутого химической модификации в процессе получения вакцины. Показано, что лиганд тетрасахарида, по сравнению с ди- и трисахаридом, активно блокировал связывание IgG1-АТ, специфичных к олигосахаридной части конъюгатов, с КП, иммобилизованным на твердой фазе (Рис. 4А). Рис 4. Блокирование лигандами и КП взаимодействия олигосахаридспецифических IgG1-АТ с КП (А) или биотинилированными олигосахаридами (Б), иммобилизованными на твердой фазе, в реакции ингибирования ИФА. Примечание. AL – алюминия гидроксид. Каждый образец пуловой иммунной сыворотки мышей (n=6 для каждого конъюгата) исследовали в 4-х повторах. M±SD. При использовании в качестве антигенов в твердофазном ИФА биотинилированных олигосахаридов, только лиганд тетрасахарида и КП S. 14 pneumoniae серотипа 3 блокировали связывание АТ, специфичных к тетрасахариду, при условии иммобилизации на твердой фазе конъюгата тетрасахарид-биотин (Рис. 4Б). 2. Иммуногенность конъюгатов олигосахаридов с БСА Конъюгат тетрасахарида с БСА (20 мкг по углеводу на мышь), адсорбированный на геле алюминия гидроксида, приводил к образованию у мышей, на 14 сутки после 2-кратной иммунизации, самого высокого уровня IgG1- АТ, специфичных к КП, иммобилизованному на твердой фазе (Рис.5). Рис.5. Титр IgG1-АТ, специфичных к КП, иммобилизованному на твердой фазе, в сыворотках крови мышей, иммунизированных конъюгатами олигосахаридов с БСА. Примечание. 6 мышей на иммунизирующую дозу. Тест Манна-Уитни, * P < 0,05 по сравнению с конъюгатами ди- и трисахарида с БСА в дозе 20 мкг на мышь. С помощью биотинилированных ди-, три- и тетрасахаридов, иммобилизованных на твердой фазе, в сыворотках крови мышей, полученных 15 через 14 суток после 2-ой иммунизации гликоконъюгатами, выявлены IgM- и IgG-АТ (Рис.6). Наибольшее разнообразие изотипов IgG-АТ: IgG1, IgG2a и IgG2b (log10 3,9; 2,4; 2,9 соответственно), выявлено в сыворотке к конъюгату тетрасахарид-БСА в гомологичной системе. IgG1- и IgG2a-АТ к CRM197-КП S. pneumoniae серотипа 3 (Превенар 13), выявляли только с помощью биотинилированного тетрасахарида. IgG3-АТ не обнаружены. Рис.6. Изотипы олигосахаридспецифических АТ у иммунизированных мышей. Примечание. AL – алюминия гидроксид. Горизонтальная линия отсекает отрицательные результаты. Каждый образец пуловой иммунной сыворотки мышей (n=6 для каждого конъюгата) исследовали в 4-х повторах. M±SD. Тест Манна-Уитни,* P < 0,05 по сравнению с нативной сывороткой. При оценке опсонизирующей активности олигосахарид-индуцированных АТ установлено, что нейтрофилы (Pис 7А) и моноциты (Рис.7Б) интактных мышей захватывали больше инактивированных бактерий S. pneumoniae серотипа 3 (%) в присутствии сывороток к ди-, три- и тетрасахариду по сравнению с использованием нативной сыворотки (Р < 0,05). Только в присутствии сыворотки к конъюгату тетрасахарид-БСА фагоцитарная активность нейтрофилов и моноцитов крови мышей была выше по сравнению с использованием сыворотки к CRM197-КП S. pneumoniae серотипа 3 (Превенар 13) (Р < 0,05). Рис.7. Антитело-зависимый фагоцитоз инактивированных клеток S.pneumoniae серотипа 3 нейтрофилами (А) и моноцитами (Б) периферической крови мышей. Примечание. Проточная цитофлуориметрия. Каждый образец исследовали в 4-х гейтах. К(-) – без обработки сывороткой. Me(Q1-Q3). Me – медиана. Q – квартиль. Тест Манна-Уитни, * P < 0,05 по сравнению c нативной сывороткой. Протективную активность гликоконъюгатов (табл.1) оценивали при Таблица 1. Протективная активность гликоконъюгатов при заражении мышей S. pneumoniae серотипа 3 Иммуноген Ди-БСА+AL Три-БСА+AL Тетра-БСА+AL CRM197-КП S. pneumoniae серотипа 3 Контроль Разовая доза по углеводу, мкг Титр IgG1-АТ, log10 2,5±0,5 2,8±0,5 2,7±0,3 2,7±0,3 3,1±0,2 3,0±0,3 3,2±0,4 3,2±0,3 3,3±0,3 3,2±0,2 3,2±0,4 3,5±0,1* 2,9±0,3 2,9±0,2 0±0 Выжило мышей день 0 день 16 8 7* 8 7* 8 8** 8 7* 8 8** 8 8** 8 8** 8 8** 8 8** 8 8** 8 8** 8 8** 6 6** Н.о. Н.о. 8 1 2,5 5,0 10 20 2,5 5,0 10 20 2,5 5,0 10 20 1,1 2,2 09 % NaCl Примечание. AL – алюминия гидроксид. Н.о. – не определяли. Заражающая доза 5,6 LD50. M±SD. Точный критерий Фишера, *P < 0,05; **P < 0,01 по сравнению с контролем. внутрибрюшинном заражении мышей S. pneumoniae серотипа 3 через 2 недели после 2-ой иммунизации. Самой высокой протективной активностью обладали конъюгаты три- и тетрасахарида с БСА, а также конъюгат CRM197-КП S. pneumoniae серотипа 3 (Превенар 13). Единичная гибель мышей отмечена в группе животных, иммунизированных конъюгатом дисахарид-БСА. Конъюгаты без адъюванта не стимулировали формирование антител и не обладали протективной активностью (данные не преставлены). 3. Молекулярно-клеточные исследования Продукцию цитокинов, индуцированную биотинилированными ди-, три- и тетрасахаридами, исследовали in vitro в монокультуре лейкоцитов селезенки интактных мышей. Все биотинилированные олигосахариды, иммобилизованные на твердой фазе, стимулировали продукцию IL-1α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-17A, IFNγ, TNFα, кроме IL-6 и GM-CSF (Рис.8). Рис.8. Продукция цитокинов in vitro. Примечание. Проточная цитофлуориметрия. Исследовали пуловую монокультуру спленоцитов мышей (n=6) в 4 гейтах. M±SD. *P < 0,05 по сравнению с контролем (без биотинилированного олигосахарида). Биотинилированный тетрасахарид стимулировал более высокую продукцию IL-4, IL-10, IFNγ в среду культивирования по сравнению с конъюгатами биотина с ди- и трисахаридом; различий в продукции IL-1α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-17A, IFNγ и TNFα между конъюгатами не выявлено. Олигосахариды не являются лигандами Толл-подобных рецепторов и в составе иммобилизованных конъюгатов с биотином не могут быть захвачены антигенпрезентирующими клетками. Вероятно, активация иммунного ответа происходила через углеводсвязывающий домен лектина C-типа SIGN-R1, экспрессируемый на макрофагах [Paterson GK. et al., 2006]. На примере конъюгата дисахарида, соответствующего минимальному структурному фрагменту КП S. pneumoniae серотипа 3, и обладающего в присутствии адъюванта иммуногенной активностью, исследовали концентрацию цитокинов в сыворотке крови иммунизированных мышей (Рис.9). Рис.9. Концентрация цитокинов в сыворотке крови мышей, иммунизированных конъюгатом дисахарид-БСА с адъювантом и без адъюванта. Примечание. Проточная цитофлуориметрия. На каждый срок исследовали пуловую сыворотку мышей (n=3) в 4-х гейтах. Контроль - до иммунизации. M±SD. Тест Манна-Уитни, * P < 0,05 по сравнению с контролем. Продукцию цитокинов определяли до иммунизации (контроль) и на 1 и 7 сутки после 1-ой и 2-ой иммунизации (15 и 21 сутки от начала иммунизации) мышей разовой дозой 20 мкг по углеводу. Конъюгат дисахарид-БСА без адъюванта индуцировал продукцию IL-1α, IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL- 17A, IL-21, IL-22, IFNγ и TNFα. Адсорбция конъюгата на геле алюминия гидроксида приводила к более высокой и стойкой продукции ряда цитокинов: IL- 1α, IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21, IFNγ и TNFα во все сроки наблюдения. В самой высокой концентрации выявляли IL-17A (1767, 1356, 1336, 1347 пг/мл, соответственно срокам, при 19,3 пг/мл в контроле), тогда как без адъюванта - его концентрация снижалась (308, 257, 222, 28 пг/мл, соответственно срокам). Уровень IL-2 и IL-12p70 не изменялся. Экспрессию поверхностных молекул в культуре спленоцитов мышей определяли в те же сроки у тех же мышей (Рис.10). Рис.10. Экспрессия поверхностных маркеров на мембране спленоцитов мышей, иммунизированных конъюгатом дисахарид-БСА с адъювантом и без адъюванта. Примечание. Проточная цитофлуориметрия. На каждый срок исследовали пуловую монокультуру спленоцитов мышей (n=3) в 4 гейтах. M±SD. Тест Манна-Уитни, * P < 0,05 по сравнению с контролем. Конъюгат дисахарид-БСА, адсорбированный на геле алюминия гидроксида, вызывал более выраженные изменения уровня исследованных поверхностных молекул по сравнению с конъюгатом без адъюванта. Установлено, что на 1 и 7 сутки после 2-ой иммунизации мышей конъюгатом дисахарида, адсорбированным на геле алюминия гидроксида, повышалось содержание спленоцитов, экспрессирующих молекулы (TCR+) γδ T-клеток (с 5,8 %до19% при0,6%вконтроле);CD5+В1-клеток(с4,5%до13%при2,6%в контроле), а также продуктов генов главного комплекса гистосовместимости класса II на антигенпрезентирующих клетках (с 30,2 % до 57,2 % при 17,4 % в контроле). Вакцина Превенар 13 индуцировала экспрессию всех исследованных молекул, кроме CD16+/CD32+ NK и CD3+/CD16+/CD32+ NKT через 14 дней после 2-ого введения (28 суток от начала иммунизации). IL-17, γδ T-клетки и CD5+ В1-клетки имеют значение не только в защите от инфекции, но могут участвовать в развитии аутоиммунных реакций [Su D. et al., 2013; Popi A.F. et al., 2016]. В связи с этим, проведено определение уровня антител к двуспиральной ДНК в сыворотке крови иммунизированных мышей (Рис.11). Рис. 11. Уровень IgG-АТ к двуспиральной ДНК у иммунизированных мышей в ИФА. Примечание. Каждый образец пуловой иммунной сыворотки мышей (n=6) исследовали в 4-х повторах. M±SD. В сыворотках мышей, иммунизированных конъюгатами олигосахаридов с БСА или конъюгатом CRM197 с КП S. pneumoniae серотипа 3 (Превенар 13), не выявлено повышения уровня антител в разведении > 1:160 (точка отсечения отрицательных результатов ОП490 < 0,2) к двуспиральной ДНК, действие которых направлено на разрушение ядер клеток иммунизированных мышей. ВЫВОДЫ 1. Показано, что антитела к капсульному полисахариду S. pneumoniae серотипа 3 распознавали тетрасахарид, а антитела к тетрасахариду характеризовались специфичностью к капсульному полисахариду, что свидетельствует о наличии общих антигенных структур у тетрасахарида и капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 3. 2. Установлено, что конъюгаты ди-, три- и тетрасахарида с БСА, адсорбированные на геле алюминия гидроксида, при двукратной иммунизации мышей, вызывали образование олигосахаридспецифических IgM- и IgG- антител при наибольшем разнообразии изотипов антител (IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b), индуцированных к конъюгату тетрасахарид-БСА, и не стимулировали повышение уровня IgG-антител к двуспиральной ДНК. 3. Отмечено, что антитела к тетрасахариду стимулировали фагоцитоз инактивированных бактерий S. pneumoniae серотипа 3 нейтрофилами и моноцитами периферической крови интактных мышей в большей степени, чем антитела к капсульному полисахариду серотипа 3, индуцированные введением конъюгированной 13-валентной пневмококковой вакцины. 4. Выявлено, что протективная активность конъюгатов три- и тетрасахарида, адсорбированных на геле алюминия гидроксида, при заражении иммунизированных мышей S. pneumoniae серотипа 3, была выше, чем адсорбированного конъюгата дисахарида (100, 100 и 87,5 % выживших мышей соответственно). 5. Показано, что in vitro биотинилированный тетрасахарид, иммобилизованный на твердой фазе, индуцировал более высокую продукцию IL-4, IL-10, IFNγ спленоцитами интактных мышей по сравнению с конъюгатами биотина с ди- и трисахаридом; различий в стимуляции продукции IL-1α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-17A, IFNγ, TNFα между конъюгатами не выявлено. 6. На примере конъюгата дисахарид-БСА, адсорбированного на геле алюминия гидроксида, показана стимуляция у мышей продукции цитокинов: IL-1α, IL- 1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-17A, IL-21, IL-22, IFNγ и TNFα; IL- 17A в сыворотке крови выявляли в стабильно высокой концентрации, тогда как при введении конъюгата без адъюванта его уровень снижался. 7. Установлено, что после второй иммунизации мышей конъюгатом дисахарид- БСА, адсорбированным на геле алюминия гидроксида, повышалось содержание спленоцитов, экспрессирующих молекулы (TCR+) γδ T-клеток, CD5+ В1-клеток, а также активированных клеток MHC II+.