Исследование и разработка магнитоиммунолипосом и нейтрофильных внеклеточных ловушек в качестве средств адресной доставки лекарственных веществ

Объектами исследования служили нейтрофилы – полиморфно-ядерные лейкоциты, выделенные из периферической крови здоровых добровольцев, наночастицы липосом и парамагнитные наночастицы.
Изучение условий образования и структуры НВЛ. Выделение нейтрофилов из гепаринизированной донорской крови осуществляли методом
седиментации
(ρ1=1,119г/см3,
внеклеточных
инкубируя суспензию клеток с латексом (d=1,5 мкм) в течение 5-45 мин. при t=37ОС. Нами была использована концентрация активатора – 5 ∙ 106 частиц в мл, что соответствовало соотношению латекс : клетки – 20:1. Визуализацию НВЛ осуществляли методом флуоресцентной микроскопии с использованием красителя акридинового оранжевого. О фрагментации нуклеиновых кислот в структуре НВЛ судили с помощью метода электрофореза в агарозном геле. Наличие участков митохондриального генома в неклеточных сетях определяли методом RT-ПЦР, используя праймеры к гену цитохрома b. Методом иммуноферментного анализа было установлено наличие в структуре НВЛ гистона Н3.
Были проведены эксперименты по изучению влияния УФ-света на способность нейтрофилов образовывать внеклеточные ловушки. Облучение клеток проводили светом лампы ДРТ-400 в дозах 151, 453, 906 и 1359 Дж/м2 с использованием светофильтра УФС-1 с полосой пропускания 240-390 нм.
Синтез магнитных наночастиц. Для приготовления наночастиц магнетита в 50 мл дистиллированной воды растворяли хлорид железа (III) и сульфат железа (II) в соотношении 2/1 в концентрациях от 5 ммоль/л до 50 ммоль/л по железу. После растворения компонентов добавляли 1% раствора аммиака в соотношении объёмов 2/1, после чего реакционную смесь перемешивали в течение 1 минуты и
на двойном градиенте плотности фиколл-урографина ρ2=1,077г/см3). Инициацию образования нейтрофильных ловушек полиморфно-ядерными лейкоцитами запускали,
осаждали частицы в постоянном магнитном поле. Собранные таким образом наночастицы промывали трижды дистиллированной водой.
Подготовка образцов марганцевого феррита осуществлялась следующим образом: к 200 мкл раствора солей (FeCl3 и MnCl2) в их соотношении 2/1 добавляли 0.5 М раствор NaOH объёмом 50 мкл. Образцы инкубировали в» в течение 120 минут при 50oС. Полученные наночастицы осаждали методом центрифугирования при 10000 об/мин в течение 15 минут. Надосадочную жидкость удаляли, осадок наночастиц ресуспендировали в 1 мл 0.1 М натрий- фосфатного буфера.
Характеристику наночастиц осуществляли методами динамического и электрофоретического светорассеяния (Zetasizer Nano ZSP (Malvern, Великобритания)), рентгеновской дифракции (ARL X’TRA (Thermo Scientific)) и электронной микроскопии (Libra 120 (ZEISS)).
Получение иммуномагнитолипосом.
Липосомы синтезировали методом гидратации/регидратации. Раствор фосфатидилхолина (0,5%) (Sigma, США), холестерина (0,5%) (Sigma, США) и дистероилфосфоэтаноламин–полиэтиленгликоля (2000) (0,1%) (Avanti Polar lipids, США) в этиловом спирте испаряли в роторном испарителе RV10 control (IKA, Германия) при температуре водяной бани 60оС. К полученной липидной пленке добавляли 0,1 М натрий-фосфатный буфер с наночастицами магнетита, покрытого ЦТАБ (1 мг/мл), и перемешивали в течение одной минуты. Антитела к гистону H3 (Cloud-Clone corp., США) инкубировали с реагентом Траута (Sigma, США) 1ч. Тиолированное антитело добавляли к синтезированным липосомам и инкубировали в течение 12 ч при t = 4°С. [Theresa M.Allen, 2005]
Следующим этапом стала диспергенция получаемых липосом, для чего растворы были подвержены воздействию ультразвука. Облучение проводили на ультразвуком дезинтеграторе Qsonica Sonicators (США) в течение 15 мин (20 кГц, 10 секундный импульс с перерывом 3 с).
Оценка взаимодействия иммуномагнитолипосом со структурами НВЛ. Для оценивания взаимодействия липосом со структурами НВЛ использовали метод флуоресцентной микроскопии. Нейтрофилы стимулировали частицами латекса в течение 30 мин. при t=37ОС. При синтезе липосом к липидам добавляли амфотерицин В (0,005%). Далее добавляли суспензию липосом к нейтрофилам в соотношении клетка/липосома=1 / 10. Затем инкубировали нейтрофилы с липосомами 1 ч при температуре 37oС и готовили препараты для флуоресцентной микроскопии (Сайфитдинова А.Ф., 2008) с окраской красителем Sybr Green (0,1%). Просмотр препаратов осуществляли на микроскопе Nikon Eclipse Ni-E/Ni- U. Изображение поля зрения просматривали в 2х каналах (Eх=340-380 нм и Eх= 465-495 нм) и накладывали изображения в программе Adobe Photoshop.
Дизайн токсикологических экспериментов с клетками крови человека.
Определение токсических свойств наночастиц на эритроцитах крови человека.
В качестве объекта исследования использовали суспензии эритроцитов, полученные из крови доноров в день взятия пробы. Операцию отмывки эритроцитов физиологическим раствором проводили трижды методом центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 минут. Полученную суспензию эритроцитарных клеток доводили до величины оптической плотности (D412) равной 0,8, а затем использовали в экспериментах. Суспензии эритроцитарных клеток предварительно инкубировали в течение 1 ч с «пустыми» липосомами и липосомами, содержащими 0,03% азид натрия, в соотношениях эритроциты / липосомы: 1/1, 1/10, 1/100, 1/1000. Затем эритроциты осаждали центрифугированием при 3 000 об/мин на центрифуге MPV-340. О разрушении эритроцитов судили по выходу лактакдегидрогеназы (ЛДГ), определяя её активность в надосадочной жидкости. [Биологические мембраны, Артюхов В.Г., Наквасина М.А.,2000].
В кварцевую кювету для спектрофотометра помещали 2,8 мл надосадочной жидкости и 0,1 мл NADH до конечной концентрации 5,4*10-5 моль/л. На спектрофотометре ShimadzuUV-2401 при длине волны 340 нм измеряли оптическую плотность D1. Затем в кювету приливали 0,1 мл пирувата натрия до конечной его концентрации в смеси 1,5*10-3 моль/л и через 30 секунд регистрировали оптическую плотность D2. Каталитическую активность ЛДГ оценивали по формуле:
А = (D1- D2)* V пр / (ε *l*t),
где ε – молярный коэффициент поглощающего соединения (NADH), равный 6,22 *103 моль-1 см-1, l-длина оптического пути, t – время инкубации (30 с), V пр –
конечный объём реакционной смеси (3 мл).
Определение токсических свойств наночастиц на лимфоцитах крови человека.
Лимфоциты крови человека выделяли центрифугированием на градиенте плотности фиколл-урографина (ρ = 1.077 г/см3). К лимфоцитам добавляли наночастицы в тех же соотношениях, что и в экспериментах с эритроцитами.
Определение жизнеспособности полученной клеточной фракции осуществляли на проточном цитофлуориметре Guava easyCyte 8 HT (MerkMillipore Group, USA) согласно протоколу коммерческого набора GUAVA VIA COUNT. В работе использовали образцы клеток с жизнеспособностью не менее 98%.
Дизайн токсикологических экспериментов с микроводорослями.
Методика основана на регистрации различий в оптической плотности тест- культуры водоросли хлорелла, выращенной в водной среде, не содержащей искусственных наночастиц (контроль) и в водных дисперсных системах,
содержащих тестируемые наночастицы (опыт). Критерием токсичности наночастиц является снижение на 20 % и более величины оптической плотности культуры водоросли, выращиваемой в течение 22 часов в дисперсной системе наночастиц (ДС НЧ), по сравнению с ее ростом на контрольной среде, приготовленной на дистиллированной воде. Количественная характеристика токсичности при этом определяется общепринятым показателем: индексом токсичности (I) – относительной (в %) величиной прироста оптической плотности для ДС по сравнению с контролем:
I = (ΔDк – ΔDдс) / ΔDк × 100 %,
где ΔDк и ΔDдс – средние значения прироста оптической плотности в
контроле и в дисперсной системе соответственно.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Выявление условий образования и структуры нейтрофильных внеклеточных ловушек
На первом этапе исследований были визуализированы структуры нейтрофильных внеклеточных ловушек и подобраны временные условия их образования. Нами было установлено, что для активации процесса нетоза необходимо инкубировать суспензию нейтрофилов с частицами латекса не менее 30 мин. По истечении этого времени внеклеточные сети образуют 80 ± 2% клеток. Нами была исследована структура внеклеточных сетей методом электрофореза в агарозном геле. При стимулировании частицами латекса клеток к выделению внеклеточных ловушек в инкубационную среду происходило выделение нуклеиновых кислот, которые двигались в геле одним фронтом, смещаясь от точки нанесения на 2 мм, что соответствует высокомолекулярной ДНК (рис.1). При этом не наблюдалось ни характерной для апоптоза «апоптотической лестницы», ни наблюдаемой при некрозе «размытой дорожки». Следовательно, мы показали, что при стимуляции нейтрофилов частицами латекса происходит образование нейтрофильных внеклеточных ловушек без фрагментации ДНК.
Рис.1. Визуализация и структура НВЛ
Для выявления роли митохондрий в процессах образования НВЛ нами была проведена оценка внедрения фрагментов мтДНК в образующиеся внеклеточные структуры методом RT-PCR. Для образцов, содержащих нуклеиновые кислоты митохондрий (в качестве положительного контроля) и внеклеточных сетей, значение Cр (номер цикла, при котором флуоресценция превышает пороговое значение) по каналу Fam составило 27,7 и 31,7 соответственно. Таким образом, было показано, что при стимуляции нейтрофилов крови человека латексом происходит образование НВЛ с участием не только ядерного генома, но и митохондриального. В совокупности с данными о времени образования НВЛ при стимуляции нейтрофилов латексом (в течение 30 минут), можно констатировать, что латекс-стимулированный нетоз протекает по пути, предложенному Yousefi S. и соавторами (2009 г.). Выделенные НВЛ анализировали методом ИФА. Было установлено, что в образцах НВЛ присутствует гистон Н3 (Рис.2).
Рис.2. Выявление содержания гистона Н3 в структуре НВЛ методом иммуноферментного анализа
Его концентрация статистически значимо возрастает по сравнению с контролем, в качестве которого служили нейтрофилы крови человека, не стимулированные к образованию НВЛ.
В связи с наличием данных литературы о разностороннем действии УФ- света на биологические системы, и в частности на компоненты иммунной защиты организма человека, особый интерес представляет изучение влияния УФ-света на процессы образования и функционирования нейтрофильных внеклеточных ловушек.
Рис.3. Динамика изменения числа клеток, образующих НВЛ в интактном состоянии и при облучении УФ-светом в дозах 151 – 1359 Дж/м2
Анализ микроскопических препаратов показал, что УФ-излучение в дозах 151, 453 и 906 Дж/м2 оказывает иммунодепрессивное действие на способность нейтрофилов образовывать НВЛ. При подсчёте 100 клеток не было обнаружено образования внеклеточных сетей. (Рис.3). При увеличении дозы облучения до 1359 Дж/м2 мы наблюдали образование групп клеток, которые формировали единую ловушку, существенно превосходящую по размерам ловушки, образованные одной клеткой, причём данный эффект сохранялся на всех проанализированных нами образцах.
Синтез наночастиц магнетита и марганцевого феррита
Первым типом синтезируемых магнитных наночастиц (МНЧ) явился магнетит (Fe3O4). На начальном этапе был осуществлён подбор концентрации ионов железа, при которой образующиеся частицы обладали бы большей агрегационной устойчивостью. Для этого измеряли кинетику осаждения полученных частиц. Нами были выбраны промежутки времени – 1 минута и 10 минут. О степени осаждения частиц судили по отношению светопропускания через эти промежутки времени к значению светопропускания в начальный момент времени. Анализ полученных данных показал, что при концентрации ионов железа 30 мМ это отношение минимально, что говорит о минимальном осаждении частиц. В дальнейшей работе при приготовлении магнетита использовали концентрацию солей железа 30 мМ. Концентрация осадителя
(водного раствора аммиака) оказывает также большое влияние на процесс образования наночастиц магнетита и их характеристики. Была исследована способность к осаждению частиц при добавлении 1%-го раствора аммиака объёмом 0,1 -1 мл к 1 мл раствора солей железа. В ходе экспериментов было установлено, что при добавлении 0,1 и 0,2 мл водного раствора аммиака к раствору солей железа образующиеся наночастицы обладали слабовыраженными магнитными свойствами. При увеличении концентрации аммиака у наночастиц появлялись парамагнитные свойства. При добавлении 0,5 мл аммиака значение Δτ минимально, что говорит о наименьшей степени оседания частиц.
Вторым типом МНЧ явился марганцевый феррит (MgO*MnO x 2Fe2O3). В ходе проведенных опытов нами было установлено, что при термостатировании реакционной смеси при 30оС возможно получение наночастиц размером от 7,1 до 12,4 нм. Увеличение температуры до 50оС приводило к увеличению размеров получаемых наночастиц: минимальный размер – 12,3 ± 1,7 нм – был зарегистрирован при использовании осаждающего реагента в концентрации 45 ммоль/л, а максимальный – 21,5 ± 3,6 нм – при концентрации 5 ммоль/л. Дальнейшее увеличение температуры от 70оС до 90оС способствовало увеличению регистрируемого показателя от 58,7±8,6 до 218,1±32,7 нм.
В ходе проведённых исследований было установлено, что размер МНЧ магнетита составил 4,23 ± 1,19 нм, марганцевого феррита – 4,00 ± 0,73 нм. (Рис. 4).
Рис. 4. Изображения наночастиц магнетита (слева) и марганцевого феррита (справа), полученные методом просвечивающей электронной микроскопии
В ходе исследований было определено влияние окружения ионов в растворе на агрегационную устойчивость магнитных наночастиц.
В процессе получения наночастиц марганцевого феррита наименьшие значения ζ-потенциала выявлялись нами при использовании натрий-ацетатного буфера в диапазоне рН 4,0-5,5. При использовании натрий-фосфатного буфера со значением рН 5,5 наблюдалось большее значение величины ζ-потенциала наночастиц марганцевого феррита, чем при использовании натрий-ацетатного
13

буфера с тем же значением рН (- 14,00 мВ и – 9,76 мВ соответственно). При увеличении величины рН натрий-фосфатного буфера до 6 происходит возрастание значения ζ-потенциала, в диапазоне рН 6,0-8,0 статистически значимых отличий не наблюдалось. В точке рН 8,0 при использовании трис- глицинового буфера значение ζ-потенциала наночастиц выше, чем в случае натрий-фосфатного буфера. При использовании трис-глицинового буфера с рН 9,0 значение ζ-потенциала статистически достоверно снижается относительно вышеописанных условий эксперимента (рис. 5,а).
Наночастицы магнетита обладают более низкой стабильностью, чем наночастицы марганцевого феррита. При низких значениях рН в случае использования натрий-ацетатного буфера величина ζ-потенциала не превышает – 15 мВ. (рис.5,б). При применении натрий-фосфатного буфера значение ζ- потенциала значительно возрастает. В буферах со значением рН 5,5 он возрастает с – 5,5 мВ до – 14,6 мВ. При увеличении значения рН до 6,5 происходит увеличение ζ-потенциала до – 19,5 мВ. Дальнейшее увеличение величины рН не приводило к статистически значимым изменениям ζ-потенциала.
аб
Рис. 5. Величины ζ-потенциала наночастиц оксидов металлов в различных буферных системах (а – марганцевого феррита, б – магнетита)
Из полученных данных следует, что наночастицы на основе оксидов металлов при значениях рН 4,0-5,5 обладают низкой стабильностью в силу процессов их окисления. Оптимальным условием для марганцевого феррита является трис-глициновый буфер со значениями рН 8,0-8,5. Для магнетита оптимальным является более широкий диапазон значений рН: 6,5-8,0 для натрий фосфатного и 8,0-8,5 для трис-глицинового буферов.
Получение магнитоуправляемых липосом
На первом этапе синтеза липосом методом гидратации / регидратации были получены липосомы различных составов липидов и изучены их размерные
14

характеристики. Размер полученных липосом определяли с помощью метода динамического светорассеяния. Облучение синтезированных нами липосом проводили на ультразвуком дезинтеграторе Qsonica Sonicators в течение 15 минут (20кГц, 10 секундный импульс с перерывом 3 сек). Суспензию липосом подвергали продавливанию через мембранные фильтры с определённым размером пор. В работе использовали липосомальный экструдер LP-50, LipoFast, размер пор мембранного фильтра составлял 100 нм. Размер полученных липосом измеряли с помощью спектрометра динамического светорассеяния Photocor-FC. Данные, полученные с использованием этого метода, показывают, что образована монодисперсная система. В случае использования только ультразвукового дезинтегратора гидродинамический радиус частиц составляет 106,2 ± 4,8 нм; в случае использования дезинтегратора и экструдера – 59, 95 ± 2,5 нм. Таким образом, при применении вышеуказанного режима ультразвуковой обработки мы получили суспензию липосом с узким распределением по размеру. В дальнейшей работе использовали данный режим ультразвуковой обработки без применения экструзии.
При создании липосом важным моментом является контроль уровня окисления входящих в их состав липидов. Уровень ПОЛ в липидном бислое липосом определяли по содержанию диеновых и триеновых конъюгатов. Липосомы подвергали облучению ультразвуком. Облучение проводили на ультразвуком дезинтеграторе Qsonica Sonicators в течение 15 минут (20кГц, 10 секундный импульс с перерывом 3 сек). Рассчитывали содержание диеновых и триеновых конъюгатов по отношению к уровню ненасыщенных липидов (D232/D220 и D276/D220). Было установлено, что в течение первых 5 часов не происходит статистически значимого изменения в уровне содержания диеновых и триеновых конъюгатов. Через 24 часа после облучения липосом наблюдается статистически значимое увеличение уровня ПОЛ. Показатель D232/D220 увеличился на 0,91, показатель D276/D220 – на 0,67. Из этих данных следует, что в процессе облучения липосом идёт более ускоренное образование диеновых конъюгатов.
В качестве агентов, включаемых в липосомы, нами были выбраны инсулин и гемоглобин. Концентрацию белка определяли методом Лоури. Включаемость инсулина составила 57,5 ± 2,2 %, включаемость гемоглобина составила 33, 2 ± 2, 8 %. Следующим этапом работы стало определение роли гидрофобных связей в процессе включения инсулина. В качестве агента, разрушающего гидрофобные связи, нами была выбрана мочевина. К раствору инсулина в натрий-фосфатном буфере добавляли мочевину в концентрации 8М и измеряли степень включения инсулина по вышеописанной схеме. Включаемость белка резко снизилась и составила 13,1 ± 0,5 %. Снижение степени включения инсулина после воздействия мочевиной, по-видимому, связано с разрушением гидрофобных
связей между молекулами белка и липидов, что свидетельствует о значительной роли гидрофобных взаимодействий в процессах включения данного белка в липоосомы.
Для оценки качественного состава синтезируемого магнетита были зарегистрированы рентгенограммы наночастиц. Обнаруженные на рентгенограммах пики 2θ = 18; 30,20; 35,53; 43,1; 57,1 соответствуют показателям стандартного образца магнетита (Fe3O4) (PDF-2 карта No01-088-0315) (Рис.6).
Рис.6. Рентгенограмма наночастиц магнетита 1 – Fe3O4
2 – Fe3O4 -ЦТАБ
На рис. 7 представлены характерные электронномикроскопические изображения липосом с адсорбированными наночастицами магнетита. На микрофотографиях липосом с наночастицами Fe3O4-ЦТАБ [Рис.7, в] заметно увеличение числа наночастиц магнетита, встроенных в липидный бислой, по сравнению с частицами,
немодифицированными ЦТАБ [Рис. 7, б].
Рис.7. Изображения липосом, полученные с помощью метода просвечивающей электронной микроскопии
А) липосомы без добавления магнетита
Б) липосомы с включёнными наночастицами магнетита
В) липосомы с включёнными наночастицами магнетита, покрытыми ЦТАБ Количественную оценку встраивания магнетита в липосомы проводили с
помощью спектрального метода по формуле: Нв=(1-D4121/D412исх -D4122/D412исх)x100 %, где Нв-количество включённого в мембрану липосом магнетита, в процентах; D4121 – оптическая плотность раствора после центрифугирования липосом, D4122- оптическая плотность раствора после разрушения и центрифугирования липосом D412исх- оптическая плотность исходного раствора магнетита в буфере. 16

Разрушение целостности липосом осуществляли с помощью детергента Triton X- 100. Рассчёт показал, что в случае Fe3O4 в липидный бислой встраивается 49,2 ± 0,5 % магнетита, в случае Fe3O4-ЦТАБ – 80,8 ± 0,5. Увеличение доли встроенных в липидную мембрану наночастиц Fe3O4 обусловлено взаимодействием гидрофобной углеводородной цепи молекулы ЦТАБ (С16Н33N(CH3)3Br) и гидрофобных остатков жирных кислот молекул фосфатидилхолина.
Для осуществления возможности точечного взаимодействия получаемых магнитолипосом со структурами НВЛ необходимо включать в их состав специальные векторные молекулы, взаимодействующие специфическим образом с «мишенями» в структуре НВЛ. В качестве такой «мишени» была выбрана молекула гистона Н3. Схематическое изображение синтезированных нами магнитолипосом приведено на рис.8.
Рис.8. Схематичное изображение строения мембраны синтезированных магнитоиммунолипосом
При получении данных наночастиц контролировали их размер на разных этапах синтеза.
В ходе проведения исследования мы показали, что размер полученных иммуномагнитолипосом составил 176,4 ± 12,95 нм. (Табл.1.) В связи с тем, что для обеспечения прохождения липосом через ряд физиологических барьеров в организме они должны иметь размер менее 200 нм, полученные нами иммунолипосомы могут быть использованы для проведения терапии различных патологических процессов.
Табл.1. Значения гидродинамического диаметра липосомальных наночастиц
Фосфатидилхолин (1%) + ультразвук 15 минут (20кГц, 10 секундный импульс 173,8 ± 12,5 с перерывом 3сек)
Фосфатидилхолин (0,5%)+холестерин (0,5%) + ультразвук 15 минут (20кГц, 10 171,8 ± 28,4 секундный импульс с перерывом 3сек)
Условия эксперимента
Среднее значение диаметра частиц (нм)
Фосфатидилхолин (0,5%) + холестерин (0,5%) + дистероилфосфоэтаноламин- полиэтиленгликоль (0,1%) + антитела к гистону Н3 + Fe3O4-ЦТАБ) + УЗ 15 минут (20кГц, 10 секундный импульс с перерывом 3сек)
176,4 ± 12,9
Для того чтобы убедиться в эффективности взаимодействия липосом и НВЛ, мы анализировали изображения, полученные методом флуоресцентной микроскопии. Для визуализации липосом использовали препарат «Амфотерицин В» ( . Данный препарат представляет собой
Амфотерицин В избирательно взаимодействует со стеролами. Связываясь с холестерином, имеет максимум возбуждения 328 нм, максимум флуоресценции – 465 нм. На первом этапе работы были подготовлены и проанализированы препараты для флуоресцентной микроскопии, состоящие из липосом с добавлением амфотерицина В. Было показано, что липосомы с добавлением амфотерицина B флуоресцируют. Таким образом, было показано, что амфотерицин В возможно использовать для визуализации липосом, содержащих холестерин.
АБ
Рис. 8. А)Изображение липосом, связанных с амфотерицином В, полученное методом флуоресцентной микроскопии
Б)Изображение липосом и НВЛ, полученное методом флуоресцентной микроскопии
На следующем этапе были проанализированы препараты липосом с амфотерицином В, добавленных к НВЛ и окрашенных красителем Sybr green (Рис. 8).
Для красителя Sybr green, который селективно связывается с нуклеиновыми кислотами, характерен максимум возбуждения 497 нм, максимум эмиссии – 521 нм.
Были проанализированы полученные изображения и производён подсчёт липосом, находящихся в структурах НВЛ и вне их. Установлено, что 83,4 ± 9,4 % липосом расположены в структуре НВЛ.
ОАО Синтез, Россия)
полиеновый макроциклический антибиотик с противогрибковой активностью.
18

Таким образом, нами было установлено, что 83,4 ± 9,4 % липосом (ФХ / ХЛ / ДСФЭ-ПЭГ / АТ-гистон Н3 / Fe3O4-ЦТАБ) взаимодействуют с молекулами гистона Н3 в структуре НВЛ.
Оценка токсических эффектов иммуномагнитолипосом в отношении животных и растительных клеток
Нами были проведены исследования по изучению выхода ЛДГ из эритроцитов крови человека под влиянием полученных наночастиц. Наночастицы добавляли к эритроцитам крови человека в соотношениях: липосомы / эритроциты = 1/1, 1/10, 1/100, 1/1000.
Рис.9. Выход ЛДГ из эритроцитов крови человека при их инкубации с липосомами
В ходе исследований было установлено, что при инкубации клеток с «пустыми» липосомами в соотношениях клетка/липосома = 1/1-1/1000 не наблюдается повышения содержания ЛДГ в надосадочной жидкости по сравнению с контролем. (рис.9)
При инкубации эритроцитов с липосомами, содержащими азид натрия, повышение выхода ЛДГ наблюдалось в соотношении клетка/липосома = 1/100- 1/1000.
Исследования на лимфоцитах крови человека проводились в тех же соотношениях клетки/липосомы, что и в экспериментах с эритроцитами. Жизнеспособность лимфоцитов определяли методом проточной цитофлуориметрии. Было показано, что липосомы не оказывают токсического влияния на лимфоциты крови человека. (Рис.10)
Рис.10. Определение жизнеспособности лимфоцитов крови человека при добавлении наночастиц
Было установлено, что количество жизнеспособных клеток во всех образцах составляет 100%.
Исследования индекса токсичности полученных липосом по отношению к водорослям показало, что при соотношении клетка/липосома = 1/ 100 не наблюдается изменений в индексе токсичности. При соотношении клетка/липосома = 1/ 1000 наблюдается увеличение содержания хлорофилла на суспензии клеток роста численности клеток изучаемой водоросли (Рис.11).
Рис. 11. Определение индекса токсичности синтезированных иммуномагнитолипосом по отношению к микроводорослям Chlorella vulgaris.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В настоящее время в мире активно развиваются исследования, направленные на совершенствование уже существующих и разработку новых средств для таргетной (адресной) доставки лекарственных препаратов.
В ходе проведённых в диссертационной работе исследований нами были изучены и оптимизированы условия синтеза липосом, содержащих в своём составе магнитные наночастицы.
Нами было выдвинуто предположение о возможности использования в качестве мишени для доставки лекарственных препаратов нейтрофильных внеклеточных ловушек, которые являются важным звеном в реализации
10 5 0 -5 -10 -15 -20 -25 -30 -35
клетка Chlorella v./липосом
1/1 1/10 1/100
1/1000
“пустые” липосомы
липосомы с азидом натрия
20
Индекс токсичности,%

иммунного ответа и в развитии онкопроцессов в организме. На первом этапе были изучены условия образования НВЛ и их структура. Показано, что при стимуляции нейтрофилов крови человека частицами латекса (1,5 мкм) образование внеклеточных сетей происходит при 370С в течение 30 минут. Данный процесс реализуется с выделением не только ядерной, но и митохондриальной ДНК. Имеющиеся в структуре НВЛ молекулы гистона Н3 были рассмотрены как потенциальные мишени для доставки липосомальных наночастиц.
Липосомы с включёнными в их состав магнитными наночастицами представляют особый интерес, так как перемещением таких систем и высвобождением включённого лекарственного препарата можно управлять с помощью действия внешнего магнитного поля. Поэтому на следующем этапе работы нами были разработаны условия синтеза и изучены характеристики магнитных наночастиц на основе оксидов металлов переменной валентности с целью их дальнейшего включения в состав липосом. При создании наносистемы для доставки лекарственных препаратов были подобраны условия синтеза, позволяющие получать частицы с необходимыми размерами. Выявлено, что при синтезе магнетита оптимальными являются исходные концентрации солей (FeCl3, FeSO4) – 30мМ и диапазон значений рН: 6.5-8.0 для натрий фосфатного и 8.0-8.5 для трис-глицинового буферов; для марганцевого феррита (FeCl3, FeMnO4) – 45мМ и трис-глициновый буфер со значениями рН 8.0-8.5. Синтезированные частицы магнетита были включены в состав липосом. Установлено, что при покрытии синтезированных наночастиц магнетита цетилтриметиламмония бромидом в липидный бислой липосом встраивалось на 31% больше магнитных наночастиц по сравнению с нестабилизированными ЦТАБ наночастицами. Это является важным моментом для освобождения пространства во внутренней полости липосом для лекарственных препаратов.
Следующим этапом работы стала разработка условий синтеза липосомальных наночастиц. Нами были подобраны условия ультразвуковой обработки, позволяющие стандартизировать размер липосом. Показано, что при обработке липосом ультразвуком частотой 20 кГц в течение 15 минут (10 секундный импульс с перерывом 3 сек) размер липосом из фосфатидилхолина составляет 106,2 ± 4,8 нм. По результатам данных исследований в 2017 году получен патент РФ «Способ получения липосом».
На заключительном этапе были получены липосомы состава фосфатидилхолин (0,5%) + холестерин (0,5%) + дистероилфосфоэтаноламин- полиэтиленгликоль (0,1%) + антитела к гистону Н3. Синтезированные липосомы были функционализированы антителами к гистону Н3, что позволяет данным наночастицам специфически взаимодействовать с НВЛ. Установлено, что с внеклеточными сетями взаимодействует 83,4 ± 9,4 % липосом.
Обязательным этапом при синтезе наночастиц является изучение их токсических свойств. Исследования цитотоксичности показали, что синтезированные иммуномагнитолипосомы в концентрациях 1-1000 липосом на клетку не оказывают токсического воздействия на клетки крови человека (эритроциты и лимфоциты), а также на клетки микроводоросли Chlorella vulgaris При включении в липосомы азида натрия (0,03%) происходит нарушение структурной целостности эритроцитов при концентрации 100-1000 липосом на 1 клетку. При увеличении концентрации до 1000 наночастиц на клетку выявляется активация роста количества клеток хлореллы.
Таким образом, проведённая работа позволила получить новые сведения о зависимости условий синтеза магнитных наночастиц и липосом на их характеристики. Получены новые данные о токсических эффектах синтезированных наночастиц в отношении различных биологических объектов (клетки крови человека, растительные клетки). Показана возможность использования липосом для адресной доставки лекарственных препаратов к структурам нейтрофильных внеклеточных ловушек.
Полученные данные имеют и практическое значение при получении иммуномагнитолипосом с требуемыми характеристиками.
ВЫВОДЫ
1. При инкубации нейтрофилов крови человека с частицами латекса для фагоцитоза (d=1,5 мкм) в течение 30 минут при температуре 37oС происходит образование внеклеточных ловушек, содержащих в своей структуре мтДНК и гистон Н3.
2. Ультрафиолетовый свет в диапазоне длин волн 240-390 нм в дозах 151-906 Дж/м2 блокирует образование нейтрофильных внеклеточных ловушек.
3. Обработка липосом ультразвуком в течение 15 минут (20 кГц, 10 секундный импульс с перерывом 3 сек) позволила нам синтезировать наночастицы стандартизированного размера (в диапазоне 130-180 нм в зависимости от их липидного состава).
4. Установлено, что при синтезе магнетита оптимальными являются исходные концентрации солей (FeCl3, FeSO4) – 30мМ и диапазон значений рН: 6.5-8.0 для натрий фосфатного и 8.0-8.5 для трис-глицинового буферов; для марганцевого феррита (FeCl3, MnCl2) – 45мМ и трис-глициновый буфер со значениями рН 8.0- 8.5.
5. Обнаружено, что покрытие наночастиц магнетита молекулами цетилтриметиламмония бромидом способствует увеличению степени включения магнетита в липидный бислой липосом на 31,6 %.
6. Получены липосомы (ФХ / ХЛ / ДСФЭ-ПЭГ / АТ-гистон Н3 / Fe3O4-ЦТАБ), способные к адсорбции на нейтрофильных внеклеточных ловушках
7. Показано, что липосомы (ФХ / ХЛ / ДСФЭ-ПЭГ / АТ-гистон Н3 / Fe3O4- ЦТАБ) не оказывают токсического воздействия на клетки крови человека (лимфоциты и эритроциты) и микроводоросли Chlorella vulgaris (при концентрациях 1-1000 липосом на 1 клетку).
8. Оценены разработанные нами магнитолипосомы и нейтрофильные внеклеточные ловушки как эффективные средства доставки лекарственных препаратов в различные мишени организма человека.