Исследование роли представителей семейства универсальных стрессовых белков в регуляции роста и развития растения Arabidopsis thaliana

Объект исследования – растение Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. экотип Columbia дикого типа (Col-0) и созданные на его основе трансгенные линии с инсерциями Т-ДНК в различных участках гена At3g58450: GK_115C08 (grusp-115), GK_562A03 (grusp-562) и GK_756D02 (grusp-756) из коллекции GABI-Kat (Kleinboelting et al., 2012, Европейский исследовательский центр NASC (Великобритания)). Семена стерилизовали 10 минут в 50% растворе гипохлорита натрия (коммерческий раствор «Белизна») с добавлением 0,02% Tween-20 и проращивали в чашках Петри на половинной питательной среде Мурасиге-Скуга (MС; Duchefa, Нидерланды), содержащей 0,8% агар. После стратификации в течение 3 суток в темноте при 4°C чашки переносили в стандартные условия в климатическую камеру (21°C, 120 мкЕ·м−2·с−1, 16-часовой световой период (длинный день, ДД)). В возрасте 10 дней проростки переносили в почвенную культуру. Для анализа фенотипа в условиях короткого дня (КД) семена проращивали в стандартных условиях, а затем в возрасте 10 дней переносили в условия 8-часового светового периода.
Фенотипический анализ и обработка фитогормонами. Фенотипический анализ проводили, опираясь на шкалу стадий развития растений Arabidopsis, разработанную Boyes с соавторами (Boyes et al., 2001).
Для анализа прорастания в присутствии фитогормонов и регуляторов роста семена высаживали на среду MС, содержащую 1 или 5 мкМ АБК, 10 мкМ ГК4+7 (ГК) или 5 мкМ паклобутразола (П), ингибитора биосинтеза ГК. Использовали концентрации фитогормонов и ингибитора, исходя из ранее опубликованных исследований (Zhao et al., 2014; Liu et al., 2016). Влияние флуридона (Ф), ингибитора биосинтеза АБК, оценивали по методике Zhao с соавторами (Zhao et al., 2014). Семена выдерживали сутки при +4°С в темноте в среде MС, содержащей 100 мкМ флуридон, а затем промывали стерильной водой и пересаживали на агаризованную среду, содержащую 1 мкМ АБК. Прорастание подсчитывали с момента окончания стратификации и переноса семян в климатическую камеру в течение 7 дней.
Для анализа перехода к цветению в присутствии ГК растения в почвенной культуре, начиная с двухнедельного возраста, 2 раза в неделю опрыскивали 100 мкМ ГК (Osnato et al., 2012).
Для исследования профиля экспрессии генов USP при обработке фитогормонами проростки Col-0 в возрасте двух недель, выращенные в стандартных условиях, переносили на жидкую среду MС, содержащую фитогормоны в конечных концентрациях: 5 мкМ транс-зеатина (тЗ), 10 мкМ салициловой кислоты (СК), 5 мкМ ГК 4+7 (ГК), 50 мкМ АБК, 50 мкМ метилжасмоновой кислоты (МЖ), 1 мкМ индолилуксусной кислоты (ИУК), 10 мкМ предшественника биосинтеза этилена 1- аминоциклопропан-1-карбоксиловой кислоты (АЦК). Концентрации фитогормонов подбирали аналогично используемым концентрациям в базе данных eFP Browser (https://bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi). Проростки переносили в климатическую камеру в стандартные условия на 3 или 24 ч, а затем использовали для анализа генной экспрессии методом RT-qPCR.
Выделение РНК из растительных тканей и ПЦР в режиме реального времени (RT-qPCR). РНК из проростков, розеточных листьев и цветков выделяли с применением TRIzol-реагента по стандартному протоколу. РНК из стручков и семян выделяли методом, описанным в работе Meng и Feldman (Meng and Feldman, 2010). РНК очищали обработкой ДНКазой I, свободной от РНКаз (Thermo Scientific, США). Отсутствие примеси геномной ДНК в образцах РНК проверяли с помощью ПЦР. Обратную транскрипцию проводили с использованием олиго(dT)18-праймера и обратной транскриптазы RevertAid Reverse Transcriptase (Thermo Scientific). ПЦР в режиме реального времени (RT-qPCR) проводили с использованием реакционной смеси qPCRmix-HS SYBR (Евроген, Россия) и амплификаторов АНК-32 (Синтол, Россия) и Light Cycler 96 (Roche, Швейцария). В качестве референсных генов использовались гены регуляторной субъединицы А2 протеинфосфатазы PP2A (At3g25800) и убиквитин-конъюгирующего фермента UBC10 (At5g53300).
Выделение белка и вестерн-блот анализ. Для получения экстракта тотального белка 100 мг растительного материала, предварительно замороженного в жидком азоте, гомогенизировали в 500 мкл экстракционного буфера (10 мM Трис-HCl, pH 8,0, 0,5% ЛДС, 4% глицерин, 0,1 мM ЭДТА и 1х смесь ингибиторов протеаз (Thermo Scientific)). Концентрацию белка определяли бицинхониновым методом с использованием набора для определения белка Pierce BCA assay kit (Thermo Scientific).
Разделение образцов белка (20 мкг), денатурированных при 70°С течение 5 минут, осуществляли в 12,5% Next Gel ДДС-ПААГ (Amresco, США) с использованием камеры Mini-PROTEAN Tetra (Bio-Rad, США). Иммобилизацию белков на PVDF-мембраны (GE Healthcare, США) проводили в условиях полусухого переноса на приборе Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell (Bio-Rad). Вестерн-блот анализ с антителами против белка GAI (AS11 1631, Agrisera, Швеция) проводили согласно рекомендациям фирмы-производителя антител. Взаимодействие антигена с антителом выявляли иммунохимическим методом при помощи набора Clarity Western ECL Substrate (Bio-Rad) и регистрировали на рентгеновской пленке Kodak (Kodak, США).
Программное обеспечение и электронные базы данных. Информацию о целевых генах получали на портале TAIR (arabidopsis.org).
Поиск последовательностей, содержащих USP-домен, производили в базе данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) при помощи инструмента DELTA- BLAST (Domain Enhanced Lookup Time Accelerated BLAST), который использует данные из базы консервативных доменов (Conserved Domain Database, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml). В качестве шаблонной последовательности USP-домена использовали последовательность белка MJ0577 из Methanocaldococcus jannaschii (Uniprot: Q57997, https://www.uniprot.org/uniprot/Q57997). Характеристику паттернов экспрессии генов USP проводили на основе данных из базы Transcriptome Variation Analysis (TraVA), интегрированных в графическую оболочку eFP Browser (https://bar.utoronto.ca/efp/cgi- bin/efpWeb.cgi). Поиск потенциальных партнеров GRUSP производили в базе данных IntAct (https://www.ebi.ac.uk/intact/).
Статистическая обработка данных. Статистическую обработку результатов проводили при помощи программного обеспечения GraphPad Prism 6. Достоверность различий оценивали при помощи двухвыборочного теста ANOVA. На графиках и диаграммах указаны стандартные ошибки.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Характеристика белков USP у Arabidopsis. Для получения наиболее полной информации о гомологах USP в базе данных NCBI был произведен поиск аминокислотных последовательностей Arabidopsis, гомологичных
последовательности белка MJ0577 из M. jannaschii при помощи инструмента DELTA- BLAST. В результате была обнаружена 91 аминокислотная последовательность, соответствующая 56 генам. Множественным выравниванием подтверждено, что обнаруженные последовательности содержат в своем составе структурные элементы, соответствующие USP-домену.
Согласно материалам базы данных eFP Browser, гены обнаруженных белков USP реагируют на обработку различными фитогормонами (Горшкова и др., 2021; табл. 1).
Таблица 1. Гены USP, реагирующие на наибольшее число фитогормонов согласно данным транскриптомного анализа из базы eFP Browser.
Название гена At1g11360 At1g77280 At2g21620 At2g24370 At2g47710 At3g01520 At3g11930 At3g13690 At3g17020 At3g25930 At3g53990 At3g58450 At3g62550 At5g14680 At5g47740 At5g63940
Номенклатура согласно TAIR
RD2
AtUSP GRUSP
Фитогормоны
ГК, АБК, МЖ, тЗ, АЦК ГК, АБК, тЗ, ИУК ГК, АБК, АЦК, МЖ, тЗ тЗ
ГК, АБК, тЗ
ГК, АБК, МЖ, тЗ, АЦК ГК, АБК, МЖ, тЗ, АЦК АБК, ИУК
ГК, АБК, тЗ
ГК, МЖ, тЗ, АЦК ГК, АБК, МЖ, тЗ ГК, АБК
ГК, МЖ, тЗ, АЦК ГК, АБК, тЗ
ГК, АБК, тЗ АБК, ИУК
Среди рассмотренных генов были выбраны 16 генов USP, транскрипция которых регулировалась максимальным числом фитогормонов (табл. 1). Экспрессия этих генов была проанализирована методом RT-qPCR в двухнедельных проростках Col-0, обработанных растворами фитогормонов в течение 3 и 24 ч. Наиболее выраженную реакцию в ответ на обработку фитогормонами проявил ген At3g58450 (рис. 1). Его экспрессия возрастала на 2-3 порядка в ответ на обработку АБК, а присутствие в среде ГК его экспрессию подавляло (Горшкова и др., 2021). Кроме этого, экспрессия At3g58450 возрастала через 24 ч воздействия АЦК и ИУК и подавлялась трехчасовой обработкой транс-зеатином.
Для гена At3g58450 характерен специфический профиль экспрессии в зависимости от стадии развития (Gorshkova et al., 2018). Согласно рис. 2, максимум накопления мРНК At3g58450 наблюдается в сухих семенах с последующим снижением при формировании проростка. В вегетативных розетках транскрипты
данного гена не детектируются в наших экспериментальных условиях, но в цветках его экспрессия вновь активируется и возрастает в стручках при созревании семян.
Рисунок 1. Экспрессия гена At3g58450 в двухнедельных проростках в ответ на обработку фитогормонами в течение 3 и 24 ч. А, уровень экспрессии гена At3g58450 в ответ на обработку 50 мкМ АБК, 10 мкМ СК, 5 мкМ тЗ, 50 мкМ МЖ, 10 мкМ АЦК, 1 мкМ ИУК. Б, уровень экспрессии гена At3g58450 в ответ на обработку 5 мкМ ГК. Нормализация относительно уровня экспрессии гена UBC10 и относительно уровня экспрессии соответствующих генов в необработанном контроле. Данные представлены в логарифмической форме за исключением экспрессии гена At3g58450 в присутствии ГК по причине полного подавления его экспрессии. Тонкая пунктирная линия отмечает изменение уровня экспрессии в 2 раза по сравнению с необработанным контролем. Звездочками отмечена достоверность различий на уровне значимости: * – p < 0,05; ** - p < 0,01. Рисунок 2. Профиль экспрессии гена At3g58450 (GRUSP). экспрессии зависимости от стадии А, уровень GRUSP в развития. относительно экспрессии гена Phos2A. Б, снижение количества транскриптов GRUSP при набухании семян. Нормализация относительно уровня экспрессии гена UBC10. Нормализация уровня Таким образом, профиль экспрессии At3g58450 связан с семенем и прорастанием, при этом демонстрируя разнонаправленную зависимость от фитогормонов АБК и ГК, регулирующих, в том числе, эти стадии развития. В связи с 10 этим мы дали этому гену и соответствующему белку название Germination-Related USP (GRUSP), т.е. универсальный стрессовый белок, связанный с прорастанием. Характеристика инсерционных мутантов Arabidopsis со вставкой Т-ДНК в гене At3g58450. Для дальнейшего исследования функции белка GRUSP нами были использованы трансгенные инсерционные линии grusp-562, grusp-756 и grusp-115 (рис. 3), несущие вставку Т-ДНК в промоторной области, 1-ом интроне и 3’-UTR гена, соответственно. Линии grusp-115 и grusp-562 являются гомозиготными трансгенными линиями (рис. 3 В) по Т-ДНК, но для grusp-756 не удалось отобрать чистую линию даже спустя 5-7 поколений отбора. Несмотря на это, экспрессия GRUSP в зеленых стручках значительно снижена у grusp-756 по сравнению с Col-0. Рисунок 3. Структура гена GRUSP и характеристика трансгенных инсерционных линий grusp-115 (115), grusp-562 (562) и grusp-756 (756). А, структура гена GRUSP и положение инсерций Т-ДНК в трансгенных линиях. Стрелками указаны позиции праймеров, используемых при анализе генотипа мутантной линии; над стрелками указаны их номера или названия: 1 – 8474td, 2 – 562_LP, 3 – 562_RP, 4 – 756_LP, 5 – 756_RP, 6 – 115_LP, 7 – 115_RP. Б, результат ПЦР-анализа, подтверждающий гомозиготность трансгенных линий на уровне геномной ДНК. Для анализа использовали следующие пары праймеров: LP+RP – 2+3 для grusp-562, 4+5 для grusp- 756, 6+7 для grusp-115; RP+8474td – 3+1 для grusp-562, 5+1 для grusp-756, 7+1 для grusp-115. В, результаты анализа ОТ-ПЦР трансгенных линий на уровне мРНК, выделенной из зеленых стручков растений. Для анализа использовали пары праймеров USP и 115Ex, в качестве контроля - праймеры к гену Phos2a. Линия grusp-562 характеризуется измененным уровнем экспрессии данного гена на разных стадиях развития (рис. 4), поскольку наличие Т-ДНК в области промотора привело к нарушению регуляции транскрипции At3g58450. В отличие от Col-0, у данной линии не наблюдается полной репрессии транскрипции гена At3g58450 в ходе развития трансгенных растений. GRUSP участвует в регуляции прорастания. На рис. 5 представлена диаграмма развития всех трансгенных линий по сравнению с Col-0 в течение 10 дней после переноса на свет. Согласно рис. 5, grusp-115 и grusp-756 завершают прорастание и переходят к формированию семядолей лишь на пятый день развития в присутствии 1 мкМ АБК, в отличие от Col-0. В то же время grusp-562 практически не отличается от Col-0 как в нормальных условиях, так и в присутствии АБК. Торможение в развитии линий grusp-115 и grusp-756 значительно усиливается при увеличении концентрации АБК в среде. При концентрации АБК 5 мкМ развитие grusp-115 и grusp-756 останавливается на стадии зародышевого корешка, в то время как у Col-0 и grusp-562 семядоли успевают появиться. Рисунок 4. Профиль экспрессии гена GRUSP на разных стадиях развития grusp-562 по сравнению с Col-0. А, экспрессия GRUSP при набухании семян grusp- 562. Б, экспрессия GRUSP в зависимости от стадии развития grusp- 562. Нормализация относительно уровня экспрессии гена UBC10. Рисунок 5. Диаграмма развития при прорастании grusp-115, grusp- 562 и grusp-756 в нормальных условиях и в присутствии АБК по сравнению с Col-0. Семена высаживали на среду, содержащую 1 (АБК 1) или 5 (АБК 5) мкМ АБК. Указанные стадии соответствуют стандартной классификации стадий развития Arabidopsis, описанной в работе Boyes et al., 2001. Cверхчувствительность к АБК при прорастании может быть вызвана либо повышенным содержанием АБК в тканях, либо увеличенной активностью компонентов ее сигнального пути. Эксперимент с обработкой семян ингибитором биосинтеза АБК флуридоном показывает, что на седьмой день прорастания среди растений линий grusp-115 и grusp-756 в присутствии АБК семядоли сформированы лишь у 30-40% проростков; предобработка флуридоном увеличила это количество лишь до 60% (рис. 6). При этом без гормонального присутствия проростки из предобработанных флуридоном семян сформировались полностью у всех четырех линий. Таким образом, предобработка ингибитором биосинтеза АБК не снимает отставания при прорастании, что указывает на возможные нарушения чувствительности к АБК у трансгенных линий. Рисунок 6. Количество раскрытых семядолей у grusp- 115, grusp-562 и grusp-756 по сравнению с Col-0 на седьмой день прорастания в нормальных условиях и в присутствии 1 мкМ АБК с предобработкой флуридоном (+ Ф) или без нее. О возможном нарушении сигнальных путей АБК свидетельствуют и результаты анализа экспрессии генов. Согласно рис. 7, в сухих семенах нет разницы между Col-0 и grusp-115 в уровне транскриптов ключевых регуляторов ответа на АБК – ABI4 и ABI5. Однако спустя 24 часа набухания семени уровень транскриптов ABI4 и ABI5 гораздо выше у grusp-115, чем у Col-0. Поскольку при прорастании необходимо быстро подавить процессы, связанные с передачей сигнала АБК (Finch-Savage et al., 2006), эти результаты могут косвенно подтверждать, что у grusp-115 это подавление происходит медленней, чем у дикого типа. Рисунок 7. Экспрессия генов регуляторов ответа на АБК в сухих и набухающих семенах grusp-115 по сравнению с Col-0. Семена набухали 24 часа в жидкой среде МС. Нормализация относительно уровня экспрессии гена UBC10. Звездочками отмечена статистическая достоверность различий между Col-0 и трансгенными линиями в рамках одного эксперимента: * - p < 0,05; ** - p < 0,01. Такое поведение линии grusp-115 с полной инактивацией гена GRUSP позволяет предположить, что GRUSP является негативным регулятором сигнала АБК, действующим через ABI4/ABI5: сигнал АБК вызывает индукцию экспрессии GRUSP, который пока еще не известным способом подавляет ABI4 и ABI5, что вызывает снижение интенсивности сигнала АБК. Антагонизм ГК и АБК играет ключевую роль в физиологии покоя и прорастания семени. Согласно рис. 8 А, гиббереллины ускоряют прорастание семян Col-0, однако не оказывают значительного воздействия на прорастание grusp-115: в присутствии 10 мкМ ГК4+7 в первый день прорастания зародышевый корешок виден лишь у 15% семян в сравнении с 10% проросших семян в отсутствие ГК. Ингибитор биосинтеза гиббереллинов паклобутразол, напротив, обладает выраженным эффектом: спустя 7 дней прорастания в присутствии 5 мкМ П прорастает не более 15% семян grusp-115 по сравнению с 65-70% семян дикого типа (Gorshkova et al., 2021a). Рисунок 8. Прорастание семян трансгенной линии grusp-115 по сравнению с Col-0 в нормальных условиях и в присутствии 10 мкМ ГК (А) или 5 мкМ паклобутразола (П) (Б). Каждое измерение производилось в двух биологических повторностях по 100-200 семян на чашку. Этот фенотип имеет сниженный уровень экспрессии генов GA20ox1 и GA3ox1, контролирующих заключительные этапы биосинтеза ГК, у grusp-115 (рис. 9). Результатом этого является потенциальный дефицит гиббереллинов в семенах и проростках grusp-115, на что косвенно указывает сверхчувствительность этой линии к паклобутразолу при прорастании (Gorshkova et al., 2021a). Рисунок 9. Экспрессия генов, ассоциированных с метаболизмом ГК, в 10- дневных проростках grusp-115 по сравнению с Col-0. Нормализация относительно уровня экспрессии гена UBC10. Звездочками отмечена статистическая достоверность различий между Col-0 и трансгенными линиями: * - p < 0,05; ** - p < 0,01. С другой стороны, линия grusp-115 характеризуется низкой чувствительностью к ГК (Gorshkova et al., 2021a). Ключевыми регуляторами чувствительности тканей к ГК являются белки из группы DELLA – репрессоры гиббереллинового ответа; сигнал ГК реализуется преимущественно через их деградацию (Dill et al., 2004). Мы проанализировали количество DELLA-белка GAI в проростках grusp-115 в присутствии ГК или П по сравнению с Col-0, используя метод вестерн-блот гибридизации тотальных экстрактов белка из 10-дневных проростков со специфическими антителами к GAI. Согласно рис. 10, в проростках grusp-115 уровень GAI выше, чем у Col-0, как в нормальных условиях, так и в присутствии ГК или П. Тем не менее, в присутствии ГК количество GAI в проростках grusp-115 снижается, что соответствует нормальному ответу на обработку ГК. Таким образом, чувствительность к ГК у grusp-115 не нарушена, а лишь снижена по интенсивности (Gorshkova et al., 2021a). Причиной этому может быть то, что GRUSP воздействует на метаболизм ГК не напрямую, а опосредованно через АБК- зависимые пути, поскольку семя при прорастании не способно воспринимать сигнал ГК, пока не будет до необходимого уровня подавлен сигнал АБК (Finch-Savage et al., Рисунок 10. Содержание белка GAI в проростках Сol-0 и grusp-115 в ответ на присутствие ГК или П. Тотальные экстракты белка были получены из 10- дневных проростков, росших в присутствии 10 мкМ ГК 4+7 или 5 мкМ П. 20 мкг белка наносили на гель и анализировали методом вестерн-блот гибридизации со специфическими антителами против GAI. Интенсивность сигнала была измерена при помощи программного обеспечения ImageJ. 2006). А поскольку у grusp-115 при прорастании АБК-зависимые ответы подавляются медленней, этим можно объяснить наблюдаемую нечувствительность к ГК на ранних этапах прорастания. GRUSP участвует в регуляции перехода к цветению. Помимо прорастания, GRUSP также является потенциальным участником регуляции перехода к цветению (Gorshkova et al., 2021b). Оба этих процесса регулируются с участием ГК-зависимой индукции и АБК-зависимого подавления (Shu et al., 2018b). Роль ГК при переходе к цветению зависит от фотопериода: в условиях длинного дня (ДД) фотопериодический путь индукции играет основную роль, а гиббереллины – вспомогательную, ускоряя переход к цветению (Galvao et al., 2012, Porri et al., 2012); в условиях короткого дня (КД) ГК критически необходимы для флоральной индукции (Wilson et al., 1992). Рисунок 11. Фенотип линий grusp-115, grusp-562 и grusp-756 по сравнению с Col-0 в различных фотопериодических условиях. А, диаграмма стадий развития для линий grusp-115, grusp-562 и grusp-756 в условиях ДД. Б, внешний вид растений линий grusp-115, grusp-562 и grusp-756 в условиях ДД в возрасте 50 дней. В, диаграмма стадий развития для линий grusp-115, grusp-562 и grusp-756 в условиях КД. Г, внешний вид растений линий grusp-115, grusp-562 и grusp-756 в условиях КД в возрасте 120 дней. Согласно рис. 11 А, растения grusp-115 и grusp-756 в условиях ДД находятся в вегетативном состоянии около 35 дней, что на 7-10 дней дольше дикого типа (Gorshkova et al., 2021b), в то время как grusp-562 практически не отличается от Col-0. В условиях КД отставание grusp-115 и grusp-756 при переходе к цветению увеличивается вплоть до месяца. Обработка ГК ускоряет цветение, но не устраняет этого промежутка полностью (рис. 12): разница в 7-10 дней сохраняется при обработке grusp-115 ГК как в условиях ДД, так и КД. Это значит, что в отсутствие GRUSP в регуляторной цепи перехода к цветению изменен некий фактор, который не дает растению развиваться и расти быстрее. Этим предполагаемым фактором может быть флоральный репрессор FLC (Yan et al., 2010). Согласно рис. 13, grusp-115 демонстрирует более высокий уровень транскриптов FLC при переходе к цветению, что согласуется с ее фенотипом удлиненной вегетативной стадии. Рисунок 12. Время перехода к цветению grusp-115 в ответ на обработку 100 мкМ ГК и на фотопериодические условия. Звездочками отмечена статистическая достоверность различий между Col-0 и grusp-115 в рамках одного эксперимента: * - p < 0,05; ** - p < 0,01. Рисунок 13. Уровень экспрессии генов FT и FLC, вовлеченных в регуляцию цветения, у линий grusp-115, grusp-562 и grusp-756 на различных стадиях развития при росте в условиях КД. «Вегетативная стадия» - возраст растений 60 дней, все растения находятся в состоянии вегетативных розеток; «переход» - возраст растений 90 дней, Col-0 и grusp-562 имеют хорошо сформированные соцветия, grusp-115 и grusp-756 в вегетативном состоянии; «цветение» - возраст растений 140 дней, все растения имеют хорошо сформированные соцветия. Звездочками отмечена статистическая достоверность различий между трансгенными линиями и Col-0 в рамках одного эксперимента: * - p < 0,05; ** - p < 0,01. Поскольку FLC подавляет экспрессию генов гиббереллиновых оксидаз (Andres et al., 2012), возрастание транскриптов FLC у grusp-115 приводит не только к торможению развития, но и к формированию возможного дефицита по ГК, о чем свидетельствует реакция grusp-115 на обработку ГК. Таким образом, GRUSP так или иначе задействован во флоральной индукции, вызывая подавление экспрессии FLC. Возможно, этот механизм также реализуется через подавление АБК-зависимого ответа на уровне ABI4/ABI5, как и в случае прорастания, поскольку ABI4 и ABI5 тормозят цветение, стимулируя экспрессию гена FLC (Wang et al., 2013, Shu et al., 2016). Однако для доказательства этого утверждения требуются более детальные исследования. Потенциальные партнеры GRUSP. В соответствии со свойствами USP-домена одним из механизмов функционирования GRUSP может быть взаимодействие с белковыми партнерами. Согласно материалам базы данных IntAct, у GRUSP имеется один предполагаемый партнер, кодируемый геном At2g47710 и также относящийся к семейству белков USP. В свою очередь, белок AT2G47710 обладает большим набором других потенциальных партнеров, помимо GRUSP (табл. 2). Таблица 2. Потенциальные партнеры белка AT2G47710 согласно материалам базы данных IntAct. Название гена At3g58450 At3g11930 At5g03240 At3g49160 At2g44970 At2g01760 At2g32840 At4g38060 At2g41760 Номенклатура согласно TAIR GRUSP UBQ3 ARR14 CCI2 NTAQ1 Аннотация согласно TAIR Adenine nucleotide alpha hydrolases-like superfamily protein Adenine nucleotide alpha hydrolases-like superfamily protein polyubiquitin 3 pyruvate kinase family protein alpha/beta-Hydrolases superfamily protein response regulator 14 proline-rich family protein hypothetical protein amino-terminal glutamine amidohydrolase Присутствие убиквитина среди возможных партнеров AT2G47710 может указывать на важную роль AT2G47710 в контроле процесса убиквитинирования белков, являющегося одним из основных регуляторных механизмов растительной клетки, в том числе и при передаче сигнала АБК и ГК (деградация белков DELLA (Dill et al., 2004) или ABI5 (Scubacz et al., 2016)). Другим потенциальным партнером AT2G47710 является N-концевая амидогидролаза глутамина NTAQ1, которая модифицирует глутамин на N-конце белков, обеспечивая их узнаваемость для специфических убиквитин-лигаз (Graciet et al., 2010). Этот механизм играет важную роль в жизни растений, в том числе и в регуляции чувствительности к АБК при прорастании семян (Holman et al., 2009). Кроме того, возможным партнером AT2G47710 является цитокинин-зависимый регулятор ответа ARR14. Гены At2g47710 и GRUSP демонстрировали небольшое подавление экспрессии цитокининами в первые 3 часа обработки, что, возможно, указывает на неисследованную еще взаимосвязь их с передачей сигнала цитокининов. В то же время среди возможных партнеров AT2G47710 есть USP-белок AT3G11930, который демонстрирует значительное сходство с GRUSP. Однако инактивация гена At3g11930 не отразилась на фенотипе соответствующей мутантной линии по сравнению с Col-0. Возможно, GRUSP и AT3G11930 участвуют в различных процессах, либо же функция GRUSP частично дублирует функцию AT3G11930. Этот вопрос также остается предметом для будущих исследований. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Семейство белков USP является обширной, но малоизученной группой растительных белков. В данном исследовании у Arabidopsis обнаружено как минимум 56 генов, кодирующих 91 последовательность белков семейства USP. Роль белков USP растений рассматривают преимущественно в контексте устойчивости к стрессовым факторам. В данной работе было впервые показано, что функции белков этого семейства не ограничены формированием устойчивости к стрессу, а могут затрагивать такие процессы, как регуляция прорастания семени и перехода растений к цветению. Примером такого белка является описанный в данной работе GRUSP – белок из семейства USP, кодируемый геном At3g58450 Arabidopsis. Данное исследование показало, что GRUSP является негативным регулятором сигнала АБК при прорастании. Этот вывод был сделан на основе следующих фактов: во-первых, профиля экспрессии гена GRUSP с максимумом в сухих семенах и с индукцией в ответ на обработку АБК; и, во-вторых, на основе фенотипа трансгенной линии grusp-115, проявляющей сверхчувствительность к присутствию АБК при прорастании. Учитывая, что линия grusp-115 накапливает увеличенное количество транскриптов регуляторов ответа на АБК ABI4 и ABI5 при прорастании, а также учитывая данные транскриптомики, где в семенах мутантов abi5 и abi4/abi5 накопление транскриптов GRUSP значительно снижено (Nakabayashi et al., 2005, Reeves et al., 2011), можно предположить, что GRUSP и ABI4/ABI5 формируют регуляторную петлю с отрицательной обратной связью: интенсивный сигнал АБК вызывает индукцию экспрессии GRUSP через ABI4/ABI5; в свою очередь, GRUSP пока еще не известным способом подавляет активность ABI4 и ABI5, и, как следствие, интенсивность сигнала АБК снижается (рис. 14 А). Поскольку антагонистами АБК при прорастании являются гиббереллины, то действие GRUSP косвенно затрагивает метаболизм ГК и чувствительность к гиббереллиновому сигналу (рис. 14 А). Исследования, выполненные в данной работе, показали, что GRUSP также вовлечен в регуляцию перехода к цветению через негативную регуляцию экспрессии гена флорального репрессора FLC (рис. 14 Б). Об этом свидетельствует отставание линии grusp-115 при переходе к цветению, сопряженное с повышенным накоплением транскриптов FLC. Возможно, этот процесс также протекает с участием ABI4 и ABI5, поскольку взаимодействие этих факторов с FLC при регуляции цветения показано ранее экспериментально (Wang et al., 2013, Shu et al., 2016). Однако в данном исследовании экспериментальных подтверждений этому получить не удалось; эта тема остается предметом будущих исследований. Рисунок 14. Предполагаемый механизм GRUSP в прорастания перехода к цветению (Б). участия регуляции (А) и Анализ свойств USP-домена позволяет предположить, что основной механизм реализации функции GRUSP на молекулярном уровне – взаимодействие с белковыми партнерами. Для GRUSP на основе анализа баз данных обнаружен партнер из семейства USP, кодируемый геном At2g47710. В свою очередь, для этого белка обнаружен ряд потенциальных партнеров, среди которых – убиквитин, NTAQ1, ARR14, а также еще один USP-белок, кодируемый геном At3g11930. Набор этих партнеров позволяет предположить широкие регуляторные возможности для белка GRUSP. ВЫВОДЫ 1. Установлено, что семейство универсальных стрессовых белков (USP) у Arabidopsis thaliana представлено 91 белковой последовательностью, кодируемой 56 генами. 2. Обнаружена фитогормон-зависимая экспрессия у 16 генов USP, при этом максимальный эффект наблюдался при действии абсцизовой кислоты, этилена и метилжасмоната. 3. Среди изученных генов USP наиболее выраженную чувствительность к фитогормонам обнаружили у гена At3g58450, экспрессия которого значительно возрастала в ответ на обработку абсцизовой кислотой, этиленом и ауксином, но полностью подавлялась при обработке гиббереллинами. Показано, что ген At3g58450 обладает органоспецифичной экспрессией с максимальным накоплением транскриптов в цветках, зелёных стручках и сухих семенах, и их отсутствием в розеточных листьях. 5. Исследование показало, что ген At3g58450 кодирует белок GRUSP (Germination-Related USP), чья функциональная активность связана с прорастанием. Установлено, что GRUSP является негативным регулятором передачи сигнала АБК при прорастании, действуя предположительно через регуляторные белки ABI4 и ABI5. 6. Выявлена прямая зависимость между инактивацией гена At3g58450 и замедленным подавлением АБК-зависимых ответов, сниженной экспрессией генов биосинтеза ГК и увеличенным накоплением DELLA-белка GAI при прорастании семян и развитии проростков. 7. Одновременно с нарушениями в прорастании семян трансгенные линии grusp демонстрировали отставание в цветении. Установлено, что GRUSP вовлечен во флоральную индукцию за счет подавления экспрессии репрессора цветения FLC. 8. Для GRUSP определён потенциальный партнер из семейства USP, кодируемый геном At2g47710, который, в свою очередь, взаимодействует с белком USP, кодируемый геном At3g11930.