СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ………………………………………………………………………. 4
ВВЕДЕНИЕ ……………………………………………………………………………………………. 5
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ………………………………………………………………………. 11
1.1. Общая характеристика растительных вакуолей ……………………………….. 11
1.2. Особенности строения вакуолярных мембран …………………………………. 13
1.2.1. Современные представления о структуре мембран…………………….. 13
1.2.1. Вакуолярная мембрана …………………………………………………………….. 15
1.3. Липидный состав вакуолярной мембраны ……………………………………….. 16
1.3.1. Жирные кислоты липидов ………………………………………………………… 18
1.3.2. Нейтральные липиды ………………………………………………………………. 22
1.3.3. Полярные липиды ……………………………………………………………………. 26
1.4. Влияние абиотических стрессовых воздействия на растения ……………. 30
1.4.1. Окислительное стрессовое воздействие и изменение
мембранных липидов ……………………………………………………………………….. 33
1.4.2. Гиперосмотическое стрессовое воздействие и изменение
мембранных липидов ……………………………………………………………………….. 36
1.4.3. Гипоосмотическое стрессовое воздействие и изменение
мембранных липидов ……………………………………………………………………….. 40
1.5. Роль липидов в защите от абиотических стрессовых воздействий …….. 42
1.6. Выводы из обзора литературы ………………………………………………………… 51
2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ …………………………………………… 52
2.1. Объект исследования …………………………………………………………………….. 52
2.2. Условия создания стрессового воздействия …………………………………….. 52
2.3. Методы для характеристики стрессовых воздействий ………………………. 53
2.3.1. Кондуктометрический метод ……………………………………………………. 53
2.3.2. Метод компьютерной цейтраферной видеосъемки микроскопических
образцов ………………………………………………………………………………………….. 53
2.3.3. Определение содержания диеновых конъюгатов ……………………….. 54
2.4. Макрообъемный метод выделения вакуолей ……………………………………. 55
2.5. Метод выделения тонопласта …………………………………………………………. 55
2.6. Экстракция липидов ………………………………………………………………………. 56
2.7. Анализ жирнокислотного состава липидов ……………………………………… 56
2.8. Качественный и количественный анализ фосфолипидов ………………….. 57
2.9. Качественный и количественный анализ гликоглицеролипидов ……….. 59
2.10. Количественный анализ стеринов …………………………………………………. 60
2.11. Использованные реактивы ……………………………………………………………. 60
2.12. Статистическая обработка данных ………………………………………………… 61
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ …………………………. 62
3.1. Оценка влияния стрессовых воздействий ………………………………………… 62
3.2. Влияние окислительного стрессового воздействия на липидный профиль
тонопласта ………………………………………………………………………………………….. 65
3.3. Влияние гиперосмотического стрессового воздействия на липидный
профиль тонопласта …………………………………………………………………………….. 75
3.4. Влияние гипоосмотического стрессового воздействия на липидный
профиль тонопласта …………………………………………………………………………….. 85
ЗАКЛЮЧЕНИЕ …………………………………………………………………………………….. 93
ВЫВОДЫ……………………………………………………………………………………………… 97
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ………………………………………………………………………. 98
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АФК – активные формы кислорода
ГЛ – гликоглицеролипиды
ГФИ – гликозилфосфатидилинозиты
ДГДГ – дигалактозилдиацилглицерины
ДК – диеновые конъюгаты
ЖК – жирные кислоты
ИДС – индекс двойных связей
ЛФХ – лизофосфатидилхолины
МГДГ – моногалактозилдиацилглицерины
МЭЖК – метиловые эфиры жирных кислот
НЖК – насыщенные жирные кислоты
НЛ – нейтральные липиды
ННЖК – ненасыщенные жирные кислоты
ПННЖК – полиненасыщенные жирные кислоты
ПЛ – полярные липиды
ПОЛ – перекисное окисление липидов
ПФИ – полифосфатидилинозиты
СТ – стерины
СХДГ – сульфохиновазилдиацилглицерины
ФГ – фосфатидилглицерины
ФИ – фосфатидилинозиты
ФК – фосфатидная кислота
ФЛ – фосфолипиды
ФС – фосфатидилсерины
ФХ – фосфатидилхолины
ФЭ – фосфатидилэтаноламины
ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭПР – эндоплазматический ретикулум

В качестве объекта исследования использовали корнеплоды столовой свеклы (Beta vulgaris L.) сорт Модана. В данной работе мы исследовали окислительный стресс и два вида осмотического стресса: гиперосмотический и гипоосмотический. Гипоосмотический стресс создавали путем помещения очищенных корнеплодов в дистиллированную воду на 24 ч. Гиперосмотический стресс создавали следующим образом: неочищенные корнеплоды Beta vulgaris в течение трех суток увядали при комнатной температуре. Окислительный стресс – кусочки ткани корнеплода размером 1 см3 инкубировали в растворе 100 мМ Н2О2 в течение 16 ч.
В ходе работы использовались различные контроли для установления влияния осмотического и окислительного стрессов, потому как осмотическому стрессовому воздействию подвергались целые корнеплоды, а окислительному – кусочки ткани корнеплодов. Для осмотических стрессов контролем служили целые корнеплоды без осмотических воздействий, для окислительного стресса – кусочки ткани корнеплодов размером 1 см3 инкубировали в дистиллированной воде. Оценку осмотических воздействий путем определения осмотической концентрации клеточного сока на осмометре ОМКА 1Ц-01 (Россия) и массы корнеплодов до и после осмотического стресса.
Выход электролитов из тканей корнеплода измеряли кондуктометрическим методом (Грищенкова, Лукаткин, 2005) с использованием кондуктометра ОК-104 (Radelkis, Венгрия) с платиновым электродом. Степень выхода электролитов рассчитывали в процентах от полного выхода.
Оценка барьерных свойств мембран осуществлялась с помощью оригинальной экспериментальной установки цейтраферной компьютерной видеосъемки (ЦКВ), позволяющей получать серии компьютерных изображений микроскопических объектов (Нурминский и др., 2004). Результаты видеосъемки использовались для изучения динамики разрушения мембран вакуолей. Компьютерная обработка данных ЦКВ осуществлялась с помощью программы CellsPro, функционирующей в среде Matlab.
Содержание первичных продуктов перекисного окисления липидов – диеновых конъюгатов (ДК), проводили на спектрофотометре Specord – S-100 (Analytik Jena AG, Германия) при 203 нм. по методике (Владимиров, Арчаков, 1972).
Изолирование вакуолей и вакуолярных мембран из ткани корнеплодов проводили модифицированным макрообъемный методом, разработанным в лаборатории физиологии растительной клетки СИФИБР СО РАН (Саляев и др., 1981).
Общие липиды из тонопласта экстрагировали модифицированным методом Фолча (Folch et al., 1957).
Метиловые эфиры жирных кислот (ЖК) получали по методу (Christie, 1993). Анализ метиловых эфиров ЖК тонопласта проводили с использованием хромато-масс- спектрометрa Agilent technology 5973N/6890N MSD/DS (США). Для идентификации пиков метиловых эфиров жирных кислот использовали стандарты метиловых эфиров (Sigma, США) и данные библиотеки масс-спектров NIST 05 (Dobson, 1993; Wolff and Christie, 2002). Для оценки степени ненасыщенности жирных кислот рассчитывали индекс двойной связи (ИДС) (Lyons et al., 1964). Рассчитывали сумму ненасыщенных жирных кислот (∑ННЖК), сумму насыщенных жирных кислот (∑НЖК) и отношение суммы ненасыщенных жирных кислот к сумме насыщенных жирных кислот (ΣННЖК/ΣНЖК).
Фосфолипиды тонопласта корнеплодов Beta vulgaris количественно определяли аналитической тонкослойной хроматографией по неорганическому фосфору методом Васьковского (Vaskovsky and Latyshev, 1975). Гликоглицеролипиды тонопласта корнеплодов Beta vulgaris количественно определяли аналитической тонкослойной хроматографией по галактозе методом (Dubois et al., 1956) в модификации (Roughan and Batt, 1968).
Суммарные стерины тонопласта корнеплодов Beta vulgaris силилировали (Дударева, 2020). Образовавшиеся триметилсилильные производные стеринов были проанализированы с помощью хромато-масс-спектрометра GC–MS 7000/7890A TripleQuad, Agilent Technologies (США). Идентификацию стеринов проводили путем сравнения их времен удержания со стандартами, а также использовали библиотеки масс- спектров NIST08 и WILEY7. Количественный анализ был проведен с использованием калибровочной кривой по холестерину, кампестерину, стигмастерину и β-ситостерину с учетом отклика внутреннего стандарта.
Эксперименты проводили не менее чем в пяти независимых повторностях. Полученные данные представляли в виде средней арифметической (M) или медианы (Me), а разброс значений – в виде стандартного отклонения (±S.D.) или интерквартильной широты [25%; 75% процентиль]. С помощью критерия Шапиро-Уилка (Shapiro-Wilk) проверяли нормальность распределения (ГОСТ Р ИСО 5479-2002). Различия между экспериментальными данными считали статистически значимыми при P≤0,05 (Гланц, 1999).
При нормальном распределении для доказательства наличия значимых различий между средними применяли однофакторный дисперсионный анализ и последующее множественное сравнение средних проводили по методу Тьюки для осмотических стрессовых воздействий, так как сравнение было против одного контроля. Для доказательства наличия значимых различий между средними при окислительном стрессовом воздействия использовали парный двухвыборочный t-тест.
Если распределение отличалось от нормального, для доказательства наличия значимых различий между медианами использовали H-критерий Краскела-Уоллиса и последующее множественное сравнение медиан проводили по методу Стьюдента- Ньюмена-Кеулса или Данна для осмотических стрессовых воздействий. Для доказательства наличия значимых различий между медианами при окислительном стрессовом воздействия использовали тест Манна-Уитни.
Статистические расчеты осуществляли с помощью программного пакета SigmaPlot 12.5.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Оценка влияния стрессовых воздействий
При осмотических стрессах происходили существенные изменения массы корнеплода Beta vulgaris и осмотической концентрации клеточного сока. При гиперосмотическом стрессе масса корнеплода снижалась на 20%, осмотическая концентрация клеточного сока увеличивалась на 13%, а при гипоосмотическом стрессе, наоборот, масса увеличивалась на 20%, а осмотическая концентрация снижалась на 12% (Ozolina et al., 2016).
О процессах перекисного окисления липидов можно судить по увеличению содержания диеновых конъюгатов в тканях корнеплодов (рис. 1). При окислительном стрессе выход диеновых конъюгатов увеличивался на 47%. В условиях осмотических стрессов количество диеновых конъюгатов было почти в два раза больше, чем в контроле.
Рис. 1. Содержание диеновых конъюгатов при окислительном и осмотических стрессах в тканях корнеплодов Beta vulgaris
Примечание: M±S.D. * – наличие значимых различий в сравнении с контролем 1, значимость различий рассчитана с помощью t-теста, ** – наличие значимых различий в сравнении с контролем 2, значимость различий рассчитана с
Состояние проницаемости мембран оценивали по выходу электролитов из тканей корнеплода в условиях стрессового воздействия (рис. 2).
помощью
дисперсионного
Последующее
сравнение средних проводили по методу Тьюки.
однофакторного анализа. множественное
Рис. 2. Характеристика окислительного и осмотических стрессов кондуктометрическим методом по выходу электролитов из тканей корнеплодов Beta vulgaris
Примечание: M±S.D. * – наличие значимых различий в сравнении с контролем 1, значимость различий рассчитана с помощью t-теста, ** – наличие значимых различий в сравнении с контролем 2, значимость различий рассчитана с помощью однофакторного дисперсионного анализа. Последующее множественное сравнение средних проводили по методу Тьюки.
В ответ на гиперосмотический стресс выход электролитов возрастал на 59%, а при окислительном стрессе на 106%.
При оценке стабильности изолированных вакуолей методом цейтраферной видеосъемки было установлено, что стабильность мембран изменялась при всех изучаемых стрессах (рис. 3). Самые интенсивные разрушения вакуолей было отмечены в условиях гипоосмотического стресса (разрушение в 4,5 раза больше, чем в контроле). При гиперосмотическом стрессе период полураспада уменьшался на 28%, при окислительном практически в два раза, на 54%.
Рис. 3. Влияние окислительного и осмотических стрессов на период полураспада изолированных вакуолей корнеплодов Beta vulgaris
Примечание: M±S.D. * – значимость различий в сравнении с контролем 1, рассчитана с помощью t-теста, ** – значимость различий в сравнении с контролем 2,
Таким образом, данные оценки стрессового воздействия на ткани корнеплода показывают, что стрессовая нагрузка в условиях окислительного и осмотических воздействий на клетки Beta vulgaris была достаточно интенсивной.
Влияние окислительного стрессового воздействия на липидный профиль тонопласта
Суммарное содержание липидов тонопласта уменьшалось почти в два раза после окислительного стрессового воздействия (рис. 4).
Рис. 4. Содержание суммарных липидов в тонопласте корнеплодов Beta vulgaris в условиях окислительного стресса
Примечание: Me, планками погрешностей представлены 25% и 75% процентили. * – наличие значимых различий, значимость различий рассчитана с помощью U-критерия Манна–Уитни.
Изменения, которые произошли в жирнокислотном составе липидов вакуолярной мембраны при окислительном воздействии, представлены в таблице 1. Среди НЖК тонопласта в контрольном варианте и после окислительного воздействия преобладали пальмитиновая (С16:0) и стеариновая (С18:0) кислоты, а среди ННЖК – олеиновая (C18:1(n-9)) и линолевая (C18:2(n-6)).
При рассмотрении изменений минорных ЖК, можно отметить, что содержание лауриновой ЖК (С12:0) после стрессового воздействия увеличилось почти в два раза. После окислительного стресса возрастало также количество пентадекановой кислоты
рассчитаны
однофакторного
анализа.
множественное сравнение средних проводили по методу Тьюки.
с
помощью дисперсионного Последующее
(C15:0) (на 31%). Содержание пальмитиновой ЖК (C16:0) увеличилось на 12% от контроля после окислительного воздействия. Пальмитиновая ЖК в основном преобладает в составе высокополярных липидов, которые могут быть приравнены к аннулярным липидам (они более упорядочены, менее подвижны, имеют в составе более насыщенные жирные кислоты и выделяются из мембраны вместе с белком). Без них невозможно функционирование многих ферментных систем (Жуков, 2015).
При окислительном стрессовом воздействии содержание стеариновой кислоты (C18:0) снизилось. Среди ННЖК количественные изменения происходили в основном с пальмитолеиновой ЖК (С16:1) – содержание увеличивалось на 30% и линолевой ЖК (C18:2(n-6)) – содержание снижалось на 7,4%. Липидный анализ показал, что избыточное продуцирование пальмитолеиновой ЖК включается в большинство основных классов полярных липидов, включая цитоплазматическую «эукариотическую» фракцию хлоропластных гликоглицеролипидов. В наших экспериментах, при стрессовом воздействии на вакуолярную мембрану, суммарные количества НЖК и ННЖК статистически значимо не изменялись. Увеличение НЖК мембранных липидов влияет на такой показатель, как микровязкость, и делает мембрану менее эластичной. Известно, что НЖК менее чувствительны к окислительному повреждению, и защита от этого повреждения животных тканей связана с повышением насыщенности ЖК липидов (Portero-Otin et al., 2001).
Таблица 1
Влияние окислительного стресса на жирнокислотный состав липидов вакуолярных мембран корнеплодов Beta vulgaris, (% от суммы ЖК)
Жирные кислоты C12:0, лауриновая
C14:0, миристиновая C15:0, пентадекановая C16:0, пальмитиновая C16:1, пальмитолеиновая C18:0, стеариновая C18:1(n-9), олеиновая C18:1(n-7), цис-вакценовая C18:2(n-6), линолевая C18:3(n-3), линоленовая C20:0, арахиновая
C22:0, бегеновая ИДС
ΣНЖК ΣННЖК ΣННЖК/ΣНЖК
Контроль
0,25 [0,24; 0,26] 0,92 [0,83; 0,98] 1,00 [0,96; 1,05] 31,04 [30,53; 31,69] 0,74 [0,74; 0,76] 5,45 [4,95; 5,71] 23,93 [23,25; 24,61] 1 [0,96; 1,03]
33,04 [32,72; 33,26] 1,88 [1,68; 2,12] 0,41 [0,32; 0,51] 0,5 [0,48; 0,54] 0,97 [0,96; 0,98] 39,78 [38,81; 40,45] 60,22 [59,55; 61,19] 1,51 [1,47; 1,58]
Окислит. стресс
0,52 [0,45; 0,59] * 0,97 [0,92; 1,02]
1,31 [1,3; 1,36] * 34,89 [34,36; 35,61] * 1,25 [1,22; 1,35] * 3,9 [3,67; 4,1] * 22,18 [21,96; 22,64] 1,05 [1,02; 1,07]
30,6 [29,88; 31,51] * 2,2 [1,98; 2,44]
– 0,43 [0,39; 0,47] 0,93 [0,92; 0,94]
42,03 [41,77; 42,48] 57,97 [57,52; 58,23] 1,38 [1,35; 1,39] *
Примечание: Me [25%; 75%]. * – наличие значимых различий, значимость различий рассчитана с помощью U-критерия Манна–Уитни.
При изучении фосфолипидов, основного класса мембранных липидов, было установлено, что преобладающими липидами в тонопласте корнеплодов Beta vulgaris были фосфатидилхолины и фосфатидилэтаноламины (рис. 5).
Рис. 5. Содержание фосфолипидов в тонопласте корнеплодов Beta vulgaris в условиях окислительного стресса
Примечание: Me, планками погрешностей представлены 25% и 75% процентили. * – значимость различий рассчитана с помощью U- критерия Манна–Уитни.
После окислительного воздействия количество ФЭ и ФК снижалось. Вероятно, снижение содержания этих липидов связано со стабилизацией мембранного бислоя, так как они имеют малую головную группу и по строению похожи на усеченный конус, вызывая деформацию отрицательной кривизны. Согласно имеющимся данным, этот переход влияет на такие характеристики мембраны, как проницаемость и микровязкость. Количественные изменения ФК при стрессах чаще всего связаны с увеличением ее содержания в связи с участием в клеточном сигналинге. Так, например, после низкотемпературной обработки содержание ФК в листьях Arabidopsis thaliana увеличилось в десять раз, но в этих экспериментах содержание ФК в контрольных растениях было всего 0,7% от суммы всех ФЛ в отличие от наших результатов (17,8%) (Welti et al., 2002).
Согласно литературным данным, отношение ФХ к ФЭ оценивает текучесть, целостность мембраны и может изменяться при стрессах (de Vries et al., 2004; Wu et al., 2020). Соотношение ФХ/ФЭ в тонопласте после окислительного стресса уменьшалось на 6,8% (табл. 2). Стоит также отметить отсутствие ФС после окислительного стресса.
Таблица 2
Отношение ФХ/ФЭ среди ФЛ, отношение ДГДГ/МГДГ среди ГЛ и отношение стигмастерин/β-ситостерин в стеринах вакуолярной мембраны Beta vulgaris при окислительном, гипер- и гипоосмотическом стрессах
Отношение
ФХ/ФЭ ДГДГ/МГДГ
Стигмастерин/ β-ситостерин
Контроль 1 Окислит. стресс
1,03 0,96 0,25 0,67
0,14 0,16
Контроль 2
1,02 0,62
0,1
Гиперосмот. Гипоосмот. стресс стресс
0,65 1,07 0,46 0,83
0,15 0,13
Результаты наших опытов показали, что при окислительном воздействии суммарное содержание гликоглицеролипидов в вакуолярной мембране Beta vulgaris увеличилось почти на 75% (рис. 6). При окислительном стрессе отмечалось резкое повышение количества ДГДГ (на 246,7% от контрольного варианта). Согласно исследованиям, посвященным динамике ДГДГ, повышение содержания этого ГЛ связано со стабилизацией липидного бислоя (Narayanan et al., 2015).
Как и отношение ФХ к ФЭ показатель ДГДГ/МГДГ часто используется для оценки стрессового воздействия и адаптационных возможностей мембраны. При окислительном воздействии ДГДГ/МГДГ в два с половиной раза возрастало (табл. 2). Данный показатель
увеличивался и при высокотемпературном стрессе, что, по мнению автора, способствовало увеличению текучести мембран (Pham-Thi et al., 1987).
Рис. 6. Содержание гликоглицеролипидов в тонопласте корнеплодов Beta vulgaris в условиях окислительного стресса
Примечание: Me, планками погрешностей представлены 25% и 75% процентили. * – наличие значимых различий, значимость различий рассчитана с помощью U-критерия Манна–Уитни.
На рисунке 7 представлены изменения стеринов, которые произошли после окислительного стресса. Количество каждого изучаемого стерина увеличивалось, как и отношение стигмастерина к β-ситостерину (табл. 2). Стерины влияют не только на текучесть и проницаемость мембраны (Mongrand et al., 2004), но и на плотность упаковки других липидов. Так, стерины могут взаимодействовать с насыщенными алкильными цепями ФЛ и сфинголипидов, ограничивая их подвижность (Schuler et al., 1991). Суммарное содержание стеринов в наших экспериментах существенно повышалось при окислительном стрессе. Согласно литературным данным, увеличение содержания стеринов может приводить к снижению текучести мембраны (Kumar et al., 2015). При окислительном стрессе снижение текучести мембран может быть связано с запуском защитных механизмов и являться важным фактором формирования стрессового ответа. Увеличение в мембране содержания стеринов (особенно холестерина) способствует увеличению ее жесткости (Van Blitterswijkay еt al., 1981), что помогает ограничивать фазовый переход в небислойное состояние при высокой температуре (Muramatsu et al., 2000).
Рис. 7. Содержание стеринов в тонопласте корнеплодов Beta vulgaris в условиях окислительного стресса
Примечание: Me, планками погрешностей представлены 25% и 75% процентили. * – наличие значимых различий, значимость различий рассчитана с помощью U- критерия Манна–Уитни.
Интенсивно увеличивалось и содержание β-ситостерина и стигмастерина, на 92% и на 113% соответственно. Известно, что β-ситостерин обладает высокой антиоксидантной активностью (Hidayathulla et al., 2018), а количество стигмастерина увеличивается при всех стрессовых воздействиях (Валитова и др., 2016). И не случайно
11

при окислительном стрессе мы видим увеличение именно этих стеринов, поскольку они могут принимать участие в защите мембраны от окислительного стресса.
Повышение содержания всех стеринов при окислительном стрессе может также способствовать образованию рафтовых структур, которые были обнаружены и в вакуолярной мембране (Ozolina et al., 2013). Известно, что рафты представляют собой платформы, содержащие рецепторы, участвующие в путях передачи сигналов и регулирующие активность многих мембранных белков, например, аквапоринов, то есть белков, обеспечивающих водную проницаемость мембран (Koffman et al., 2015). Рафтовые структуры, кроме того, представляют собой основу мембранных контактов (Fujimoto et al., 2012). По нашему мнению, мембранные контакты между тонопластом и мембранами поврежденных органелл могут формироваться дополнительно из-за повышенной аутофагии, вызванной окислительным стрессом.
Таким образом, при окислительном стрессовом воздействии общее количество липидов вакуолярной мембраны Beta vulgaris снижалось в два раза. Существенные изменения в жирнокислотном составе липидов были отмечены для короткоцепочечных НЖК. Количество лауриновой, пальмитиновой, и пентадекановой ЖК значительно увеличивалось, а содержание стеариновой ЖК уменьшалось. Среди полярных липидов количество ФЭ и ФК снижалось, а содержание ДГДГ увеличивалось в три с половиной раза. Наиболее интенсивные изменения происходили в составе стеринов тонопласта – все классы стеринов резко возрастали.
Влияние гиперосмотического стрессового воздействия на липидный профиль тонопласта
Общее количество липидов вакуолярной мембраны уменьшилось на 41,8% от контроля после гиперосмотического стрессового воздействия (рис. 8).
Рис. 8. Содержание суммарных липидов в тонопласте корнеплодов Beta vulgaris в условиях гиперосмотического стресса
Примечание: Me, планками погрешностей представлены 25% и 75% процентили. * – наличие значимых различий, значимость различий рассчитана с помощью H-критерия Краскела- Уоллиса. Последующее сравнение проводили по методу Данна.
Данные по содержанию жирных кислот липидов тонопласта обнаруженных после гиперосмотического воздействия приведены в таблице 3. Содержание доминирующих ЖК, таких как линолевая (C18:2(n-6)) и пальмитиновая (C16:0), не изменялось при стрессе.
Интересные изменения произошли с лауриновой ЖК (C12:0), которая полностью отсутствовала в тонопласте нестрессированных корнеплодов Beta vulgaris. Она появилась только после стрессового воздействия. Следует также отметить, что в два раза увеличивалось количество миристиновой (C14:0). Миристиновая ЖК имеет сродство к субъединицам некоторых белков, участвующих в сигналинге. N-миристоилирование может влиять на конформационную стабильность белков (Qi et al., 2000; Qureshi et al., 2013). Кроме того, высокое содержание миристиновой ЖК было обнаружено в фосфатидилинозитах, которые также участвуют в сигнальных каскадах (Leondaritis and Galanopoulou, 2000). Почти в три раза повысилось содержание стеариновой ЖК (С18:0) в тонопласте после стресса и на восемь процентов понизилось количество олеиновой ЖК
(C18:1(n-9)). Десатурация стеариновой ЖК до олеиновой ЖК, катализируемая стеароил- АПБ-десатуразой, является одной из ключевых реакций в пути биосинтеза ЖК, которая определяет соотношение НЖК и ННЖК (Zhao et al., 2015).
Таблица 3
Влияние гиперосмотического стресса на жирнокислотный состав липидов вакуолярных мембран корнеплодов Beta vulgaris, (% от суммы ЖК)
Жирные кислоты
C12:0, лауриновая
C14:0, миристиновая C15:0, пентадекановая C16:0, пальмитиновая C16:1, пальмитолеиновая C17:0, маргариновая C18:0, стеариновая C18:1(n-9), олеиновая C18:1(n-7), цис-вакценовая C18:2(n-6), линолевая C18:3(n-3), линоленовая
C20:1(n-11), гадоленовая C22:0, бегеновая
ИДС
ΣНЖК ΣННЖК ΣННЖК/ΣНЖК
Контроль
˗ 0,32 [0,3; 0,34]
1,04 [0,97; 1,06] 29,53 [29,39; 31,54] 0,8 [0,72; 0,81] 0,24 [0,24; 0,25] 0,92 [0,9; 0,95] 23,01 [22,9; 23,21] 0,93 [0,87; 1,02] 39,97 [37,95; 40,08] 2,77 [2,52; 2,9]
0,39 [0,36; 0,39] 0,21 [0,19; 0,24]
1,14 [1,089; 1,14] 32,16 [31,99; 34,32] 67,84 [65,68; 68,01] 2,11 [1,93; 2,13]
Гиперосмот. стресс
0,17 [0,16; 0,18] 0,68 [0,59; 1,21] * 1,11 [1,05; 1,16] 31,58 [31,32; 34,08] 0,93 [0,84; 1,05] 0,87 [0,6; 1,81]
2,63 [2,19; 9,43] * 21,18 [18,85; 21,38] * 0,98 [0,96; 1,09] 36,27 [29,33; 36,61] 1,97 [1,92; 2,42]
0,33 [0,30; 0,42]
0,33 [0,30; 0,35] 1,03 [0,94; 1,07] 37,58 [36,19; 42,45] 62,42 [57,55; 63,81] 1,66 [1,43; 1,76]
Примечание: Me [25%;75%]. * – наличие значимых различий, значимость различий рассчитана с помощью H-критерия Краскела-Уоллиса. Последующее сравнение проводили по методу Стьюдента-Ньюмена-Кеулса.
Общее содержание ФЛ существенно снижалось (на 45%) после гиперосмотического стрессового воздействия (рис. 9). Статистически значимые различия были выявлены и в содержании ФЭ и ФХ, их количество существенно снижалось (на 41,3 и на 63%, соответственно). Изменения в содержании ФХ могут быть связаны с увеличением фосфолипазной активности, ранее выявленной на вакуолярной мембране (Tavernier and Pugin, 1995). На мембранах, выделенных из дикого типа Arabidopsis thaliana после низкотемпературного стресса, изменения в содержании мембранных липидов также были связаны с повышением липолитической активности и с гидролизом ФЛ (Welti et al., 2002).
Рис. 9. Содержание фосфолипидов в тонопласте корнеплодов Beta vulgaris в условиях гиперосмотического стресса
Примечание: Me, планками погрешностей представлены 25% и 75% процентили. * – наличие значимых различий, значимость различий рассчитана с помощью H- критерия Краскела-Уоллиса. Последующее сравнение проводили по методу Стьюдента-Ньюмена- Кеулса.
Соотношение ФХ/ФЭ при гиперосмотическом стрессе существенно снижалось –
на 36% (табл. 2). По данным, полученным на плазматических мембранах при солевом
стрессе, снижение соотношения ФХ/ФЭ способствовало процессу дегидратации,
увеличению проницаемости мембран и могло приводить к стрессовому повреждению
мембран, нарушению их целостности, вызывало образование каналов, через которые
осуществлялся пассивный транспорт воды
(Wu et al., 2005).
Количество ФС снижалось на 33% после стресса. Такое снижение ФС может быть
связано с уменьшением дестабилизации бислоя мембраны. ФС, ФЭ и ФК определяют электроотрицательные свойства мембраны, которые, в свою очередь, регулирует клеточную активность путем направления белков в определенную область мембраны (Platre et al., 2018). ФС необходим в качестве кофактора для нескольких важных ферментов, таких как протеинкиназа C и Raf-1 киназа, которые участвуют в сигнальных путях (Vance and Steenbergen, 2005). Содержание ФК в тонопласте статистически значимо уменьшалось после гиперосмотического воздействия (рис. 9), как и после окислительного стресса (рис. 5). Следует отметить, что ФК является не только продуктом гидролиза, но и материалом для синтеза других ФЛ.
Результаты исследований динамики изменения содержания ГЛ в тонопласте после гиперосмотического воздействия (рис. 10) показали, что количество МГДГ и ДГДГ существенно снижались, на 50% и на 62% соответственно.
Рис. 10. Содержание гликоглицеролипидов в тонопласте корнеплодов Beta vulgaris в условиях гиперосмотического стресса
Примечание: Me, планками погрешностей представлены 25% и 75% процентили. * – наличие значимых различий, значимость различий рассчитана с помощью H-критерия Краскела-Уоллиса. Последующее сравнение проводили по методу Стьюдента-Ньюмена-Кеулса.
Исследователи пришли к заключению, что более интенсивное снижение содержания МГДГ происходит у устойчивых растений, что объясняется их толерантностью к высокой температуре. Это связано с тем, что увеличение содержания МГДГ может нарушать целостность липидного бислоя, вызывая переход в гексагональную липидную фазу (Su et al., 2009). В результате нашего исследования в тонопласте при гиперосмотическом стрессе не только резко снижалось содержание ДГДГ, а также отношение ДГДГ к МГДГ (табл. 2). По данным других исследователей снижение соотношения ДГДГ/МГДГ встречается редко, но в таких случаях одновременно происходит увеличение МГДГ, что также может быть связано с образованием небислойной гексагональной липидной фазы в мембране. Результаты, полученные в наших экспериментах, свидетельствуют о некотором снижении всех вышеперечисленных показателей при гиперосмотическом стрессе. Такой защитный механизм не был обнаружен на других мембранах, и может быть связан с особенностями строения вакуолярной мембраны, которая, по липидному составу во многом аналогична другим внутриклеточным мембранам, обладает рядом отличий, например, более высоким липид/белковым соотношением (Саляев и др., 1981).
На рисунке 11 показаны изменения содержания стеринов вакуолярных мембран после гиперосмотического воздействия. При гиперосмотическом стрессе, несмотря на то
что содержание общих стеринов в тонопласте корнеплодов Beta vulgaris статистически значимо не изменилось, отмечены изменения среди следующих классов стеринов: уменьшение содержания β-ситостерина и увеличение содержания кампестерина (рис. 22). Кампестерин, как и стигмастерин исследователи считают «стрессовыми» стеринами (Kumar et al., 2015; Валитова и др., 2016). Кроме того, кампестерин используется в синтезе брассиностероидов, которые влияют на мембранный потенциал и состав жирных кислот (Bajguz et al., 2020).
При всех изучаемых нами стрессовых воздействиях увеличивалось соотношение стигмастерин/β-ситостерин, которое, по мнению ряда исследователей, вызывает активизацию защитных механизмов растительной клетки (Han et al., 2009; Griebel and Zeier, 2010). Однако больше всего это соотношение увеличивалось при гиперосмотическом стрессовом воздействии – на 50% (табл. 2).
Рис. 11. Содержание стеринов в тонопласте корнеплодов Beta vulgaris в условиях гиперосмотического стресса
Примечание: Me, планками погрешностей представлены 25% и 75% процентили. * – наличие значимых различий, значимость различий рассчитана с помощью H-критерия Краскела-Уоллиса. Последующее сравнение проводили по методу Стьюдента-Ньюмена-Кеулса.
Таким образом, при гиперосмотическом стрессовом воздействии суммарное количество липидов вакуолярной мембраны Beta vulgaris уменьшалось на 41,8% от контроля. Значительные изменения отмечены в жирнокислотном составе липидов для минорных ЖК. Количество лауриновой, миристиновой и стеариновой ЖК увеличивалось, а содержание линолевой ЖК снижалось. Количество почти всех классов полярных липидов уменьшалось, за исключением ФИ. Установлено, что в условиях стрессового воздействия содержание кампестерина резко возрастало (в два раза), а количество β-ситостерина немного снижалось.
Влияние гипоосмотического стрессового воздействия на липидный профиль тонопласта
При воздействии гипоосмотического стрессового воздействия статистически значимых различий в содержании суммарных липидов не было обнаружено (рис. 12).
Рис. 12. Содержание суммарных липидов в тонопласте корнеплодов Beta vulgaris в условиях гипоосмотического стресса
Примечание: Me, планками погрешностей представлены 25% и 75% процентили. * – наличие значимых различий, значимость различий рассчитана с помощью H-критерия Краскела- Уоллиса. Последующее сравнение проводили по методу Стьюдента-Ньюмена-Кеулса.
15

В нашем исследовании при гипоосмотическом воздействии на тонопласт статистически значимые различия были обнаружены в изменении содержания только минорных ЖК, миристиновой (C14:0), пальмитолеиновой (С16:1(n-9) и С16:1(n-7)) и стеариновой (С18:0), а также появилась лауриновая ЖК (С12:0) (табл. 7). Причем увеличение уровня стеариновой ЖК наблюдалось только при осмотических стрессах. В настоящее время доказана важная роль короткоцепочечных ЖК как сигнальных молекул, принимающих участие в регуляции экспрессии целого ряда генов, регулирующих клеточные функции и поддерживающие гомеостаз (Tan et al., 2014). Кроме того, в исследованиях (Zemanova et al., 2015) по изучению влияния стресса, вызванного ионами кадмия на жирнокислотный состав липидов Noccaea caerulescens, было высказано предположение об эффективной стратегии ослабления повреждений, вызванных окислительным стрессом, насыщенными короткоцепочечными ЖК (12:0, 14:0), которые являются предшественниками различных НЖК (в основном пальмитиновой).
Таблица 4
Влияние гипоосмотического стресса на жирнокислотный состав липидов вакуолярных мембран корнеплодов Beta vulgaris, (% от суммы ЖК)
Жирные кислоты C12:0, лауриновая
C14:0, миристиновая C15:0, пентадекановая
C16:0, пальмитиновая
C16:1, пальмитолеиновая
C17:0, маргариновая C18:0, стеариновая C18:1(n-9), олеиновая C18:1(n-7), цис-вакценовая C18:2(n-6), линолевая C18:3(n-3), линоленовая C20:0, арахиновая C20:1(n-11), гадоленовая C20:2(n-9)
C22:0, бегеновая C22:1(n-11) ИДС
ΣНЖК ΣННЖК ΣННЖК/ΣНЖК
Контроль
˗ 0,32 [0,3; 0,34]
1,04 [0,97; 1,06] 29,53 [29,39; 31,54] 0,8 [0,72; 0,81] 0,24 [0,24; 0,25] 0,92 [0,9; 0,95] 23,01 [22,9; 23,21] 0,93 [0,87; 1,02] 39,97 [37,95; 40,08] 2,77 [2,52; 2,9]
˗ 0,39 [0,36; 0,39]
˗ 0,21 [0,19; 0,24]
˗
1,14 [1,089; 1,14]
Гипоосмот. стресс
0,12 [0,12; 0,13] 0,46 [0,42; 0,46] * 1,13 [1,08; 1,18] 29,3 [29,11; 30,16] 1,06 [0,99; 1,12] * 0,25 [0,24; 0,25] 1,38 [1,28; 1,67] * 22,54 [22,33; 23,04] 1,05 [1,02; 1,06] 38,45 [37,91; 38,74] 2,5 [2,31; 2,58]
0,4 [0,28; 0,41] 0,45 [0,3; 0,46] 0,11 [0,1; 0,22] 0,31 [0,27; 0,31] 0,19 [0,16; 0,21] 1,1 [1,09; 1,11] 33,55 [33,02; 34,37] 66,45 [65,63; 66,98]
32,16 [31,99; 34,32] 67,84 [65,68; 68,01] 2,11 [1,93; 2,13]
1,98 [1,91; 2,03] Примечание: Me [25%;75%]. * – наличие значимых различий, значимость различий рассчитана с помощью H-критерия Краскела-Уоллиса. Последующее множественное сравнение
проводили по методу Стьюдента-Ньюмена-Кеулса.
По сравнению с окислительным и гиперосмотическим воздействиями, после
гипоосмотического стресса статистически значимые изменения произошли только с ФИ и ФК (рис. 13). В наших экспериментах только при гипоосмотическом воздействии произошло увеличение ФИ (почти в 2 раза).
Обычно в клеточных мембранах ФИ содержится немного – от 2 до 8% от всех ФЛ, но их функциональная роль велика, особенно в процессах сигналинга (Xue et al., 2009). ФИ участвуют в регуляции содержания внутриклеточного кальция, и повышение количества ФИ может быть связано с процессами адаптации (Berridge and Irvine, 1984). Известно, что ФИ выполняют также «якорную» функцию. ФИ с присоединенным к
одной из гидроксильных групп инозита олигосахаридом называют гликозилфосфатидилинозитами (ГФИ). С ГФИ некоторые белки образуют ковалентную связь через ФЭ. ГФИ могут направлять белки в микродомены, а также гидролиз ГФИ может регулировать функции белков, позволяя заякоренным белкам диффундировать вне мембраны и участвовать в других клеточных процессах (Yeats et al., 2018).
Рис. 13. Содержание фосфолипидов в тонопласте корнеплодов Beta vulgaris в условиях гипоосмотического стресса
Примечание: Me, планками погрешностей представлены 25% и 75% процентили. * – наличие значимых различий, значимость различий рассчитана с помощью H- критерия Краскела-Уоллиса. Последующее сравнение проводили по методу Стьюдента-Ньюмена- Кеулса.
Количество ФК в тонопласте снизилось на 74% после гипоосмотического стресса, такое снижение наблюдалось и при других стрессах, изучаемых нами (рис. 5, 9, 13). В работах других исследователей количество ФК увеличивалось, но в исследовании воздействия высокой температуры (34 °С) на Kalanchoe daigremontiana ФК в тонопласте уменьшалась в два раза (Behzadipour et al., 1998). Некоторое снижение ФК может стабилизировать ламеллярную структуру мембраны (Welti et al., 2002).
Несмотря на то, что статистически значимых различий в содержании ФЭ и ФХ не было обнаружено, но отношение ФХ к ФЭ все-таки немного изменялось в сторону увеличения (на 4,9%) (табл. 2). Отношение ФХ к ФЭ показывает устойчивость мембран, поэтому повышение ФХ/ФЭ снижает образование небислойных фаз в мембране.
В условиях гипоосмотического воздействия при анализе содержания ГЛ вакуолярной мембраны обнаружено, что количество МГДГ, а также сумма ГЛ снизились (рис. 14), но такое снижение было не так сильно выражено по сравнению с гиперосмотическим стрессом.
Рис. 14. Содержание гликоглицеролипидов в тонопласте корнеплодов Beta vulgaris в условиях гипоосмотического стресса
Примечание: Me, планками погрешностей представлены 25% и 75% процентили. * – наличие значимых различий, значимость различий рассчитана с помощью H-критерия Краскела-Уоллиса. Последующее сравнение проводили по методу Стьюдента-Ньюмена-Кеулса.
Детальное сравнение растений с различной восприимчивостью к стрессу, вызванному обезвоживанием, показало, что снижение уровня МГДГ сопровождалось увеличением олигогалактолипидов, ФИ и ФК (Okazaki and Saito, 2014). Исследователи предположили, что механизм снижения содержания МГДГ в листьях Arabidopsis thaliana
17

может быть вызван усилением деградации и снижением биосинтеза этого ГЛ (Chen et al., 2006). Возможно также, что МГДГ используется для синтеза ДГДГ путем галактозилирования МГДГ с УДФ-галактозой в качестве донора сахара с помощью ДГДГ-синтаз (Kelly et al., 2003). ДГДГ благодаря своей структуре образуют стабильные ламеллярные (двуслойные) структуры.
Суммарное содержание стеринов в наших экспериментах снижалось при гипоосмотическом стрессе (рис. 15). Уменьшение содержания общих стеринов при гипоосмотическом стрессе в вакуолярной мембране связано со снижением количества β- ситостерина, преобладающего среди стеринов. Увеличение содержания стигмастерина и снижение содержания β-ситостерина, вероятно, связано с тем, что β-ситостерин является предшественником стигмастерина. Они оба относятся к 24-этилстеринам, тогда как кампестерин относится к 24-метилстеринам. Его молекула имеет меньшую свободу вращения С-17 углеводородной цепи благодаря более короткому размеру цепи, что позволяет плотнее упаковывать липидный бислой, и это приводит к снижению проницаемости мембраны для заряженных ионов (Edwards and Green, 1972). Отношение стигмастерина к β-ситостерину возрастало (табл. 2).
Рис. 15. Содержание стеринов в тонопласте корнеплодов Beta vulgaris в условиях гипоосмотического стресса
Примечание: Me, планками погрешностей представлены 25% и 75% процентили. * – наличие значимых различий, значимость различий рассчитана с помощью H-критерия Краскела-Уоллиса. Последующее сравнение проводили по методу Стьюдента-Ньюмена-Кеулса.
Таким образом, при гипоосмотическом стрессовом воздействии среди жирнокислотного состава липидов вакуолярной мембраны Beta vulgaris возрастало количество минорных ЖК (лауриновой, миристиновой, стеариновой, пальмитолеиновой). При изучении изменений полярных липидов отмечено значительное увеличение количества ФИ и снижение МГДГ и ФК. Среди стеринов возрастало содержание кампестерина и стигмастерина и снижалось количество β-ситостерина.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Роль липидов тонопласта в защите растительной клетки от стресса в настоящее время мало исследована. Изучение состава липидов вакуолярной мембраны ранее проводились только при температурных стрессах. В наших экспериментах были обнаружены изменения жирнокислотного состава, фосфолипидов, гликоглицеролипидов и стеринов вакуолярной мембраны корнеплодов Beta vulgaris при окислительном, гипер- и гипоосмотическом стрессах.
Оценка изменения содержания различных классов липидов в условиях окислительного и осмотических стрессовых воздействий позволяет выделить ряд стратегий защиты растительных клеток от стресса, связанных с липидами вакуолярной мембраны. Можно выделить специфические и неспецифические стратегии. Неспецифические стратегии (табл. 5) характерны для всех изученных видов стресса.
Таблица 5
Неспецифические стратегии защитного действия липидов тонопласта при окислительном, гипер- и гипоосмотическом стрессах
Окислит. Гиперосмот.
Гипоосмот. стресс Повышение
(на 4,3%) Снижение (на 74%) Снижение
(на 2,5%) Повышение (на 14%) Повышение
образом минорных ЖК – лауриновой (C12:0), миристиновой (C14:0) и стеариновой (C18:0) кислоты. Можно также отнести в данную категорию снижение содержания ФК, ФЭ и изменения в содержании стигмастерина, кампестерина и соотношения стигмастерин/ситостерин, которое увеличивалось при всех стрессах.
Специфические стратегии связаны с изменениями содержания липидов, которые различались при разных стрессах (табл. 6). К ним относятся изменения содержания общих и отдельных ГЛ (МГДГ, ДГДГ), изменение содержания суммы стеринов и соотношения ФХ/ФЭ. Из литературных данных известно, что такие изменения часто приводят к активации защитных реакций и стабилизации липидного бислоя. Снижение соотношения ФХ/ФЭ среди мембранных липидов приводит к увеличению проницаемости мембраны, образованию водных каналов. Мы наблюдаем результаты реализации этой стратегии при гиперосмотическом стрессе. Тогда как при гипоосмотическом стрессе для защиты клетки нужно снизить проницаемость тонопласта и соотношение ФХ/ФЭ изменяется в сторону увеличения.
Таблица 6
Липиды
НЖК
ФК
Снижение (на 41,25%) Повышение (на 27,9%) Повышение (на 122,7%) Стигмастерин/ Повышение Повышение
β-ситостерин (на 14%) (на 50%)
К неспецифическим стратегиям относятся: увеличение количества НЖК, главным
стресс
стресс
Повышение (на 16,85%) Снижение (на 45%)
ФЭ
Повышение (на 5,7%) Снижение (на 68%) Снижение
Стигмастерин
(на 8,7%) Повышение (на 113%) Повышение
Кампестерин
(на 38,7%)
(на 60,8%) Повышение (на 30%)
Специфические стратегии защитного действия липидов тонопласта при окислительном, гипер- и гипоосмотическом стрессах
Липиды
ФХ/ФЭ
∑ ГЛ
МГДГ
ДГДГ ДГДГ/МГДГ ∑ СТ
Окислит. стресс
Снижение (на 6,8%) Повышение (на 74,7%) Повышение (на 28,3%) Повышение (на 246,7%) Повышение (на 168%) Повышение (на 89,2%)
Гиперосмот. стресс
Снижение (на 37,2%) Снижение (на 45,5%) Снижение (на 49,8%) Снижение (на 62,4%) Снижение (на 25,8%) Снижение (на 3,6%)
Гипоосмот. стресс
Повышение (на 4,9%) Снижение (на 13%) Снижение (на 21,7%) Повышение (на 4,8%) Повышение (на 33,9%) Снижение (на 7,4%)
19

Особенно заметную роль в специфических стратегиях тонопласта играют ГЛ, что, вероятно, связано с их влиянием на переход мембраны из ламеллярного состояния в гексагональное. Это состояние может присутствовать в мембране при гиперосмотическом стрессе, и оно может приводить к активизации определенных ферментов. Из всех изучаемых классов липидов наиболее существенные изменения происходили в содержании стеринов, что связано с их ролью в регуляции таких характеристик мембраны как проницаемость, микровязкость и жесткость. По нашему мнению, именно стерины являются основным компонентом адаптационных механизмов тонопласта.
Изучаемые стрессовые воздействия вызывали изменения в содержании мембранных липидов, что можно рассматривать как элемент фенотипической адаптации (рис. 16).
Рис. 16. Схема изменений липидного состава вакуолярной мембраны корнеплодов Beta vulgaris в условиях окислительного и осмотических стрессовых воздействиях Обозначения: ↑ – повышение количества липидов, ↓ – снижение количества липидов.
Различные классы липидов вакуолярной мембраны могут принимать участие в защите растительной клетки от абиотических стрессов, с использованием специфических и неспецифических стратегий. Главные из них направлены на стабилизацию липидного бислоя, увеличение содержания липидов, ответственных за активизацию защитных сил (стигмастерин, кампестерин), изменение таких свойств мембраны как проницаемость и микровязкость.
ВЫВОДЫ
1. При изучаемых стрессовых воздействиях отмечены изменения в составе всех классов липидов, что говорит об их участии в защитных механизмах растительной клетки.
2. Наиболее существенные изменения отмечены среди мембранных стеринов, особенно после окислительного стресса.
3. Одна часть выявленных изменений в содержании и составе липидов была присуща всем изучаемым стрессовым воздействиям, другая была характерна только определенному стрессу.
4. При окислительном стрессовом воздействии существенные изменения были отмечены для короткоцепочечных НЖК (лауриновой, пентадекановой, пальмитиновой), ФЭ, ФК и ДГДГ, но наиболее интенсивные изменения происходили в составе стеринов тонопласта – существенно возрастали все классы стеринов.
5. Исследования липидного профиля тонопласта при гиперосмотическом воздействии показали увеличение количества минорных ЖК (лауриновой, миристиновой и стеариновой). Кроме того, снижалось содержание всех полярных липидов и β- ситостерина. Однако количество кампестерина повышалось в два раза.
6. При изучении гипоосмотического воздействия на липидный состав вакуолярной мембраны установлено, что возрастает содержание минорных ЖК (лауриновой, миристиновой, стеариновой, пальмитолеиновой). Отличительной особенностью этого стресса было двукратное увеличение количество ФИ. Отмечен также рост содержания кампестерина и стигмастерина.

Актуальность проблемы. В силу прикрепленного образа жизни
растения зависят от сезонных или глобальных климатических колебаний.
Неблагоприятные факторы окружающей среды отрицательно влияют на
метаболические процессы в растениях, вызывая молекулярные, биохимические,
физиологические и морфологические изменения (Chaudhry and Sidhu, 2021).
Так, например, гиперосмотический стресс вызывает потерю тургора клеток,
нарушение функционирования мембран, снижение активности или
денатурацию белков, образование избыточных концентраций активных форм
кислорода (АФК), приводящих к окислительному стрессу, ингибирование
фотосинтеза, метаболическую дисфункцию, повреждение клеточных структур,
что в дальнейшем приводит к снижению роста и продуктивности растений. В
процессе эволюции у растений выработались различные механизмы адаптации
при стрессовых условиях (He et al., 2018).
В живой клетке с различными внешними воздействиями первыми
сталкиваются именно биологические мембраны. Это высокоупорядоченные
структуры, состоящие из липидов и белков, ответственные за выполнение
основных процессов жизнедеятельности клетки (Лось, 2001). Они
обеспечивают поступление в клетку и клеточные органеллы всех необходимых
веществ и вывод из клетки продуктов ее жизнедеятельности. Мембранные
липиды отвечают за поддержание текучести, проницаемости, целостности
мембраны, влияют на регуляцию белков и функционирование мембранного
транспорта (Orvar et al., 2000; Rawat et al., 2021). При абиотических стрессовых
воздействиях функции клеточных мембран изменяются, при этом нарушается
синтез липидов, а также происходит их гидролиз.
Способность растений изменять липидный и белковый состав мембран
играет решающую роль в адаптации к стрессам. Изменения липидного состава
влияют не только на физические свойства мембраны. Показано, что при стрессе
может увеличиваться синтез уникальных липидов, которые в нормальных
условиях содержатся в следовых количествах (Welti, 2002; Okazaki and Satio,
2014). Такие липиды могут являться сигнальными молекулами или быть
предшественниками вторичных мессенджеров. В сигнальные системы
вовлечены различные классы липидов, включая жирные кислоты, фосфатидную
кислоту, фосфатидилинозиты, лизофосфолипиды, диацилглицерины,
сфинголипиды, оксилипины и N-ацилэтаноламины (Moradi et al., 2017).
Определенные мембранные липиды (стерины и сфинголипиды) участвуют в
образовании рафтовых структур. Липидные рафты – это особые области
(микродомены) бислоя, которые характеризуются более высокой плотностью и
температурой плавления. Предполагается, что эти структуры обеспечивают
мембранные контакты (места сближения мембран двух органелл), участвуют в
сигналинге, транспорте и апоптозе (Annunziata et al., 2015; Kapustina et al.,
2021).
У растений для запасания, детоксикации и деградации эндогенных и
экзогенных соединений, а также для защиты при стрессе на клеточном уровне
служит центральная вакуоль. Наличие этой органеллы является отличительной
особенностью растительных клеток. Внутреннее пространство вакуоли
отделено от цитоплазмы вакуолярной мембраной (тонопластом) (Taiz and
Zeiger, 2010). Как и плазмалемма, вакуолярная мембрана относится к
пограничным мембранам растительной клетки, и принимает активное участие
не только в поддержании тургора клетки, но и в регуляции транспорта
метаболитов, обеспечивая запасающую, регуляторную и защитную функции.
На вакуолярной мембране также были обнаружены и рафтовые структуры
(Ozolina et al., 2013).
В настоящее время достаточно хорошо изучены качественные и
количественные изменения в липидном профиле плазмалеммы, мембран
хлоропластов и митохондрий в ответ на стрессовые воздействия окружающей
среды (Okazaki and Saito, 2014). Исследования липидного состава тонопласта
проводились только при разных видах температурного стресса (Kasamo et al.,
1992; Behzadipour et al., 1998; Lin et al., 2008; Zhou et al., 2014). Влияние
осмотического стресса на липидный состав тонопласта ранее подробно не
проводилось. Изучение изменений липидного состава тонопласта при
осмотическом и окислительном стрессовых воздействиях может быть полезным
при селекционировании и создании генетически модифицированных растений
для получения значительных урожаев при неблагоприятных условиях
окружающей среды.
Цель работы. Исследовать липидный состав тонопласта корнеплодов
Beta vulgaris при абиотических стрессах для выяснения возможной роли
липидов в защитных механизмах растительной клетки.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие
задачи:
1. Создать и оценить условия стрессового воздействия на корнеплоды
Beta vulgaris.
2. Провести анализ качественных и количественных изменений
преобладающих липидов (фосфолипидов, гликоглицеролипидов), стеринов и
жирнокислотного состава общих липидов вакуолярной мембраны в условиях
окислительного стресса.
3. Исследовать качественные и количественные изменения
преобладающих липидов (фосфолипидов, гликоглицеролипидов), стеринов и
жирнокислотного состава общих липидов вакуолярной мембраны в условиях
гиперосмотического стресса.
4. Изучить качественные и количественные изменения преобладающих
липидов (фосфолипидов, гликоглицеролипидов), стеринов и жирнокислотного
состава общих липидов вакуолярной мембраны при гипоосмотическом
стрессовом воздействии.
5. Оценить возможную роль липидов тонопласта в защите растительной
клетки от стресса.
Положение, выносимое на защиту. Липиды вакуолярной мембраны
принимают участие в защите растительной клетки от абиотических стрессовых
воздействий. Для каждого стресса характерны общие и специфические
изменения липидного состава, которые определяют стратегию защиты
растительных клеток в окислительных и осмотических условиях стресса.
Научная новизна. Впервые получены данные о количественных и
качественных изменениях содержания фосфолипидов, гликоглицеролипидов,
стеринов и жирных кислот вакуолярных мембран корнеплодов Beta vulgaris при
окислительном, гипер- и гипоосмотическом стрессах, что позволило выявить
специфические и неспецифические стратегии защиты растительных клеток от
стресса, связанные с липидами вакуолярной мембраны. При всех изучаемых
стрессовых воздействиях отмечено увеличение содержания минорных жирных
кислот и кампестерина, снижение количества фосфатидной кислоты и
отношения стигмастерин/β-ситостерин. Особенностью реакции мембранных
липидов на окислительный стресс было существенное увеличение всех классов
стеринов, что, по-видимому, связано с усилением такого важного процесса как
аутофагия. При гиперосмотическом стрессе было отмечено уменьшение
гликоглицеролипидов, а также отношения
фосфатидилхолин/фосфатилэтаноламин. Гипоосмотическое стрессовое
воздействия особенно повлияло на рост уровня фосфатидилинозитов. Большая
часть выявленных изменений липидного состава тонопласта связана со
стабилизацией бислойной структуры мембраны и сигнальными функциями
липидов, что характерно и для других мембран растительной клетки.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты
детального исследования изменения липидного состава вакуолярных мембран
корнеплодов Beta vulgaris при окислительном и осмотических стрессах
значимы для понимания механизмов адаптации растений к изменяющимся
условиям окружающей среды. Особенности изменения липидного состава при
изучаемых стрессовых воздействиях важны для создания толерантных к
стрессу растений сельскохозяйственного назначения.
Материалы диссертации могут быть рекомендованы при разработке
курсов лекций по физиологии растений и биохимии на кафедрах
соответствующего профиля.
Апробации работы. Результаты исследования по теме научно-
квалификационной работы были представлены и обсуждались на
Международной молодежной научно-практической конференции Россия-
Монголия (Иркутск, 2016), 20-й Международной Пущинской школе-
конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2016),
IX Всероссийском конгрессе молодых ученых-биологов «Симбиоз – Россия
2016» (Томск, 2016), Всероссийской конференции и Школе-семинаре с
международным участием «Роль свободнорадикальных процессов в этиологии
и патогенезе распространенных патологий» (Иркутск, 2016), Всероссийской
научной конференции с международным участием и школе молодых ученых
«Факторы устойчивости растений и микроорганизмов в экстремальных
природных условиях и техногенной среде» (Иркутск, 2016), II Всероссийской
научной конференции с международным участием «Механизмы регуляции
функций органелл эукариотической клетки» (Иркутск, 2018), Годичном
собрание Общества физиологов растений России, Всероссийской научной
конференции с международным участием и школы молодых ученых
«Механизмы устойчивости растений и микроорганизмов к неблагоприятным
условиям среды» (Иркутск, 2018), Международной научно-практической
конференции студентов, аспирантов и молодых ученых, посвященной 100-
летию Иркутского государственного университета «Социально-экологические
проблемы Байкальского региона и сопредельных территорий» (Иркутск, 2018),
IX Съезде общества физиологов растений России «Физиология растений –
основа создания растений будущего» (Казань, 2019), Всероссийской научной
конференции с международным участием «Липиды 2021» (Москва, 2021).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, в
том числе 5 статей в журналах из Перечня ВАК РФ и 1 статья в иностранном
журнале.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из следующих
разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования,
результаты и обсуждение, заключение, список литературы, включающий 247
источника. Работа изложена на 124 страницах, содержит 27 рисунков и 9
таблиц.
Работа выполнена в лаборатории физиологии растительной клетки
Сибирского института физиологии и биохимии растений Сибирского отделения
Российской академии наук (СИФИБР СО РАН, г. Иркутск).
Личный вклад автора. Диссертация написана автором самостоятельно.
Автор принимал непосредственное участие на всех этапах подготовки
диссертационной работы: планирование и постановка экспериментов, оценка
условий стрессовых воздействий, подготовка материала, анализ липидов,
стеринов, жирнокислотного состава общих липидов, статистическая обработка
данных, подготовка публикаций на основе полученных результатов, апробация
на конференциях.
Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность и
признательность научному руководителю д.б.н. Н. В. Озолиной за
профессиональную помощь, научные дискуссии по работе с публикациями и
рукописи. Автор благодарит за помощь в работе, важные замечания и
поддержку к.б.н. И. С. Капустину, к.б.н. Е. В. Спиридонову, Н. В. Семенову,
к.б.н. В. Н. Нурминского, Т. И. Лаптеву, Л. А. Ситневу, В. А. Галиченко и всех
сотрудников лаборатории физико-химических методов исследования. Автор
искренне благодарен за ценные рекомендации при обсуждении работы д.б.н. Т.
П. Побежимовой, д.б.н. Л. Е. Макаровой, к.б.н. Н. В. Дорофееву и к.б.н. А. В.
Поморцеву.

Роль липидов тонопласта в защите растительной клетки от стресса в
настоящее время мало исследована. Изучение состава липидов вакуолярной
мембраны ранее проводились только при температурных стрессах. В наших
экспериментах были обнаружены изменения жирнокислотного состава,
фосфолипидов, гликоглицеролипидов и стеринов вакуолярной мембраны
корнеплодов Beta vulgaris при окислительном, гипер- и гипоосмотическом
стрессах.
Оценка изменения содержания различных классов липидов в условиях
окислительного и осмотических стрессовых воздействий позволяет выделить
ряд стратегий защиты растительных клеток от стресса, связанных с липидами
вакуолярной мембраны. Можно выделить специфические и неспецифические
стратегии. Неспецифические стратегии (табл. 8) характерны для всех
изученных видов стресса.
Таблица 8
Неспецифические стратегии защитного действия липидов тонопласта
при окислительном, гипер- и гипоосмотическом стрессах
Липиды Окислит. стресс Гиперосмот. стресс Гипоосмот. стресс
Повышение Повышение Повышение
НЖК
(на 5,7%) (на 16,85%) (на 4,3%)
Снижение Снижение Снижение
ФК
(на 68%) (на 45%) (на 74%)
Снижение Снижение Снижение
ФЭ
(на 8,7%) (на 41,25%) (на 2,5%)
Повышение Повышение Повышение
Стигмастерин
(на 113%) (на 27,9%) (на 14%)
Повышение Повышение Повышение
Кампестерин
(на 38,7%) (на 122,7%) (на 60,8%)
Стигмастерин/ Повышение Повышение Повышение
β-ситостерин (на 14%) (на 50%) (на 30%)
К неспецифическим стратегиям относятся: увеличение количества НЖК,
главным образом минорных ЖК – лауриновой (C12:0), миристиновой (C14:0) и
стеариновой (C18:0) кислоты. Можно также отнести в данную категорию
снижение содержания ФК, ФЭ и изменения в содержании стигмастерина,
кампестерина и соотношения стигмастерин/ситостерин, которое увеличивалось
при всех стрессах.
Специфические стратегии связаны с изменениями содержания липидов,
которые различались при разных стрессах (табл. 9). К ним относятся изменения
содержания общих и отдельных ГЛ (МГДГ, ДГДГ), изменение содержания
суммы стеринов и соотношения ФХ/ФЭ. Из литературных данных известно,
что такие изменения часто приводят к активации защитных реакций и
стабилизации липидного бислоя. Снижение соотношения ФХ/ФЭ среди
мембранных липидов приводит к увеличению проницаемости мембраны,
образованию водных каналов. Мы наблюдаем результаты реализации этой
стратегии при гиперосмотическом стрессе. Тогда как при гипоосмотическом
стрессе для защиты клетки нужно снизить проницаемость тонопласта и
соотношение ФХ/ФЭ изменяется в сторону увеличения.
Таблица 9
Специфические стратегии защитного действия липидов тонопласта
при окислительном, гипер- и гипоосмотическом стрессах
Липиды Окислит. стресс Гиперосмот. стресс Гипоосмот. стресс
Снижение Снижение Повышение
ФХ/ФЭ
(на 6,8%) (на 37,2%) (на 4,9%)
Повышение Снижение Снижение
∑ ГЛ
(на 74,7%) (на 45,5%) (на 13%)
Повышение Снижение Снижение
МГДГ
(на 28,3%) (на 49,8%) (на 21,7%)
Повышение Снижение Повышение
ДГДГ
(на 246,7%) (на 62,4%) (на 4,8%)
Повышение Снижение Повышение
ДГДГ/МГДГ
(на 168%) (на 25,8%) (на 33,9%)
Повышение Снижение Снижение
∑ СТ
(на 89,2%) (на 3,6%) (на 7,4%)
Особенно заметную роль в специфических стратегиях тонопласта играют
ГЛ, что, вероятно, связано с их влиянием на переход мембраны из
ламеллярного состояния в гексагональное. Это состояние может
присутствовать в мембране при гиперосмотическом стрессе, и оно может
приводить к активизации определенных ферментов. Из всех изучаемых классов
липидов наиболее существенные изменения происходили в содержании
стеринов, что связано с их ролью в регуляции таких характеристик мембраны
как проницаемость, микровязкость и жесткость. По нашему мнению, именно
стерины являются основным компонентом адаптационных механизмов
тонопласта. Изучаемые стрессовые воздействия вызывали изменения в
содержании мембранных липидов, что можно рассматривать как элемент
фенотипической адаптации (рис. 27).

Рис. 27. Схема изменений липидного состава вакуолярной мембраны
корнеплодов Beta vulgaris в условиях окислительного и осмотических
стрессовых воздействиях
Обозначения: ↑ – повышение количества липидов, ↓ – снижение количества липидов.
Различные классы липидов вакуолярной мембраны могут принимать
участие в защите растительной клетки от абиотических стрессов, с
использованием специфических и неспецифических стратегий. Главные из них
направлены на стабилизацию липидного бислоя, увеличение содержания
липидов, ответственных за активизацию защитных сил (стигмастерин,
кампестерин), изменение таких свойств мембраны как проницаемость и
микровязкость.
ВЫВОДЫ
1. При изучаемых стрессовых воздействиях отмечены изменения в
составе всех классов липидов, что говорит об их участии в защитных
механизмах растительной клетки.
2. Наиболее существенные изменения отмечены среди мембранных
стеринов, особенно после окислительного стресса.
3. Одна часть выявленных изменений в содержании и составе липидов
была присуща всем изучаемым стрессовым воздействиям, другая была
характерна только определенному стрессу.
4. При окислительном стрессовом воздействии существенные изменения
были отмечены для короткоцепочечных НЖК (лауриновой, пентадекановой,
пальмитиновой), ФЭ, ФК и ДГДГ, но наиболее интенсивные изменения
происходили в составе стеринов тонопласта – существенно возрастали все
классы стеринов.
5. Исследования липидного профиля тонопласта при гиперосмотическом
воздействии показали увеличение количества минорных ЖК (лауриновой,
миристиновой и стеариновой). Кроме того, снижалось содержание всех
полярных липидов и β-ситостерина. Однако, количество кампестерина
повышалось в два раза.
6. При изучении гипоосмотического воздействия на липидный состав
вакуолярной мембраны установлено, что возрастает содержание минорных ЖК
(лауриновой, миристиновой, стеариновой, пальмитолеиновой). Отличительной
особенностью этого стресс было двукратное увеличение количество ФИ.
Отмечен также рост содержания кампестерина и стигмастерина.

Заказать новую

Лучшие эксперты сервиса ждут твоего задания

от 5 000 ₽

Не подошла эта работа?

Закажи новую работу, сделанную по твоим требованиям

Читать

Публикации автора в научных журналах

Влияние окислительного стресса на состав жирных кислотлипидов вакуолярной мембраны корнеплодов столовой свеклы

Гурина В. В. Влияние окислительного стресса на состав жирных кислотлипидов вакуолярной мембраны корнеплодов столовой свеклы / В. В. Гурина, Н. В. Озолина, И. С. Нестеркина, Н. В. Семенова, В. Н. Нурминский // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. – 2– Т. 6, No – С. 57-doi: 21285/2227- 2925-2016-6-2-57-

Жирнокислотный состав общих липидов вакуолярной мембраны при абиотическом стрессе

Н. В. Озолина, В. В. Гурина, И. С. Нестеркина, Л. В. Дударева, А. И. Катышев, В. Н. Нурминский // Биологические мембраны. – 2– Т. 34, No – С. 63-doi: 7868/S0233475517010Озолина Н. В. Динамика содержания фосфолипидов вакуолярной мембраны корнеплодов столовой свеклы при абиотических стрессах / Н. В. Озолина, В. В. Гурина, И. С. Нестеркина, В. Н. Нурминский // Физиология растений. – 2– Т. 65, No – С. 358-doi: 1134/S0015330318050

Изменение содержания стеринов тонопласта при осмотическом стрессе

И. С. Нестеркина, В. В. Гурина, Н. В. Озолина, В. Н. Нурминский // Биологические мембраны. – 2– Т. 36, No – С. 301–doi: 1134/S0233475519040Gurina V. V. Effects of abiotic stresses on the content of glycoglycerolipids in the vacuolar membrane of red beetroot / V. V. Gurina, N. V. Ozolina, I. S. Nesterkina, V. N. Nurminsky // Biochem. Moscow Suppl. Ser. A. – 2– V. – P. 92–doi: 1134/S1990747818040

Variations in the content of tonoplast lipids under abiotic stress

N. V. Ozolina, V. V. Gurina, I. S. Nesterkina, V. N. Nurminsky // Planta. – 2– V. 251, N – Art. doi: 1007/s00425-020-03399-x.Работы, опубликованные в материалах научных мероприятий

Влияние окислительного стресса на содержание диеновых конъюгатов в корнеплодах столовой свеклы

В. В. Гурина, И. С. Нестеркина //21БИОЛОГИЯ – НАУКА XXI ВЕКА : Сборник тезисов 20-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых (Пущино, 18 - 22 апреля 2016 г.). Изд-во МГУ им. М.В. Ломоносова. – 2– С.

Влияние окислительного стресса на проницаемость клеточных мембран корнеплодов столовой свеклы

В. В. Гурина, И. С. Нестеркина, Н. В. Озолина // Симбиоз-Россия 2016 : Сборник материалов IX Всерос. Конгр. молодых ученых- биологов (Пермь, 4-6 июля 2016 г.). Изд-во Перм. гос. нац. исслед. ун-т. – 2– С. 11- Гурина В. В. Влияния разных видов абиотического стресса на жирнокислотный состав вакуолярной мембраны / В. В. Гурина, Н. В. Озолина, И. С. Нестеркина, В. Н. Нурминский // Факторы устойчивости растений и микроорганизмов в экстремальных природных условиях и техногенной среде : Сборник материалов всероссийской научной конференции с международным участием и школы молодых ученых (Иркутск, 12-15 сентября 2016 г.). Изд-во Института географии им. В.Б. Сочавы СО РАН. – 2– С. 77

Помогаем с подготовкой сопроводительных документов

Совместно разработаем индивидуальный план и выберем тему работы Подробнее

Помощь в подготовке к кандидатскому экзамену и допуске к нему Подробнее

Поможем в написании научных статей для публикации в журналах ВАК Подробнее

Структурируем работу и напишем автореферат Подробнее

Хочешь уникальную работу?

Больше 3 000 экспертов уже готовы начать работу над твоим проектом!

Имеется большой опыт написания творческих работ на различных порталах от эссе до кандидатских диссертаций, решения задач и выполнения лабораторных работ по любым напра... Читать все

Имеется большой опыт написания творческих работ на различных порталах от эссе до кандидатских диссертаций, решения задач и выполнения лабораторных работ по любым направлениям физики, математики, химии и других естественных наук.

#Кандидатские #Магистерские

5 Выполненных работ

Журналист. Младший научный сотрудник в институте РАН. Репетитор по английскому языку (стаж 6 лет). Также знаю французский. Сейчас занимаюсь написанием диссертации по и... Читать все

Журналист. Младший научный сотрудник в институте РАН. Репетитор по английскому языку (стаж 6 лет). Также знаю французский. Сейчас занимаюсь написанием диссертации по истории. Увлекаюсь литературой и темой космоса.

#Кандидатские #Магистерские

11 Выполненных работ

Преподаватель ВУЗа, опыт выполнения студенческих работ на заказ (от рефератов до диссертаций): 20 лет. Образование высшее . Все заказы выполняются в заранее согласован... Читать все

Преподаватель ВУЗа, опыт выполнения студенческих работ на заказ (от рефератов до диссертаций): 20 лет. Образование высшее . Все заказы выполняются в заранее согласованные сроки и при необходимости дорабатываются по рекомендациям научного руководителя (преподавателя). Буду рада плодотворному и взаимовыгодному сотрудничеству!!! К каждой работе подхожу индивидуально! Всегда готова по любому вопросу договориться с заказчиком! Все работы проверяю на антиплагиат.ру по умолчанию, если в заказе не стоит иное и если это заранее не обговорено!!!

#Кандидатские #Магистерские

21 Выполненная работа

Окончил КазГУ с красным дипломом в 1985 г., после окончания работал в Институте Ядерной Физики, защитил кандидатскую диссертацию в 1991 г. Работы для студентов выполня... Читать все

Окончил КазГУ с красным дипломом в 1985 г., после окончания работал в Институте Ядерной Физики, защитил кандидатскую диссертацию в 1991 г. Работы для студентов выполняю уже 30 лет.

#Кандидатские #Магистерские

2271 Выполненная работа

Выполняю работы по экономическим дисциплинам. Маркетинг, менеджмент, управление персоналом. управление проектами. Есть опыт написания магистерских и кандидатских диссе... Читать все

#Кандидатские #Магистерские

31 Выполненная работа

Красный диплом референта-аналитика информационных ресурсов, 8 лет преподавания. Опыт написания работ вплоть до докторских диссертаций. Отдельно специализируюсь на повы... Читать все

Красный диплом референта-аналитика информационных ресурсов, 8 лет преподавания. Опыт написания работ вплоть до докторских диссертаций. Отдельно специализируюсь на повышении уникальности текста и оформлении библиографических ссылок по ГОСТу.

#Кандидатские #Магистерские

132 Выполненных работы

Здравствуйте! Опыт написания работ более 12 лет. За это время были успешно защищены более 2 500 написанных мною магистерских диссертаций, дипломов, курсовых работ. Явл... Читать все

Здравствуйте! Опыт написания работ более 12 лет. За это время были успешно защищены более 2 500 написанных мною магистерских диссертаций, дипломов, курсовых работ. Являюсь действующим преподавателем одного из ВУЗов.

#Кандидатские #Магистерские

177 Выполненных работ

Работы пишу, начиная с 2000 года. Огромный опыт и знания в области экономики. Закончил школу с золотой медалью. Два высших образования (техническое и экономическое). С... Читать все

Работы пишу, начиная с 2000 года. Огромный опыт и знания в области экономики. Закончил школу с золотой медалью. Два высших образования (техническое и экономическое). Сейчас пишу диссертацию на соискание степени кандидата экономических наук.

#Кандидатские #Магистерские

692 Выполненных работы

Я научный сотрудник федерального музея. Подрабатываю написанием студенческих работ уже 7 лет. 3 года назад начала писать диссертации. Работала на фирмы, а так же помог... Читать все

Я научный сотрудник федерального музея. Подрабатываю написанием студенческих работ уже 7 лет. 3 года назад начала писать диссертации. Работала на фирмы, а так же помогала студентам, вышедшим на меня по рекомендации.

#Кандидатские #Магистерские

37 Выполненных работ