Изучение авторегуляции экспрессии генов, кодирующих белки CPEB семейства, у Drosophila melanogaster.

Основная форма мРНК гена orb, экспрессируемая в яичниках дрозофилы, содержит
примерно 4900 нуклеотидов и имеет 3’НТО длиной 1200 н. В предыдущих исследованиях показано, что 815-нуклеотидная последовательность, фланкированная сайтами рестрикции HindIII и NdeI в 3’НТО orb, необходима для осуществления его положительной авторегуляции на средних стадиях оогенеза. Петля положительной обратной связи обеспечивает локализованное накопление мРНК и последующий синтез белка Orb в определенных областях ооцита. Сформированный паттерн локализации продуктов его гена устанавливает и поддерживает оси полярности развивающегося ооцита и впоследствии – эмбриона.
Для того чтобы проверить, участвует ли положительная авторегуляция orb в определении ооцита на ранней стадии оогенеза, мы с помощью направленного геномного редактирования системой CRISPR/Cas9 получили мутантную линию orb∆3’UTR, в которой был удален фрагмент 3’НТО гена orb длиной 1069 н., тем самым исключив возможность белка Orb связывать свою мРНК. (Рис. 1).
Рисунок 1. Схема делеции фрагмента 3’НТО гена orb. Структура основной формы транскрипта orb, представленной в яичнике и эмбрионе дрозофилы. Пунктирные линии отмечают сайты разрезания Cas9 нуклеазой, которая удаляет участок, содержащий 3 из 4 канонических CPE. Одновременно с делецией посредством сайт-направленной гомологичной рекомбинации в место разрезания встраивается селективный маркер DsRed, attP и LoxP сайты. После отбора трансформантов, DsRed c помощью Cre-Lox рекомбинации был удален и все дальнейшие исследования проводились на orb∆3’UTR без маркера.
Локализация мРНК и белка Orb зависит от 3’НТО
В яичниках дикого типа мРНК orb впервые отчетливо детектировалась внутри 16- клеточных цист в зоне гермария 2a (Рис. 2). На этой стадии две клетки, которые содержат 4 кольцевых канала, вступают в мейоз и становятся предшественниками ооцита (Рис. 2А).
Рисунок 2. 3’НТО гена orb необходима для обогащения его мРНК и белка в ооците. (А) Общая схема оогенеза в гермарии яичника. (Б) Конфокальные микрофотографии гермария и яйцевой камеры на стадиях 1, 2 для дикого типа и orb∆3’UTR, полученные с помощью флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) зондами к мРНК orb. (В) Конфокальные микрофотографии гермария и яйцевой камеры на стадиях 1, 2 для дикого типа и orb∆3’UTR, полученные с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания антителами к белку Orb2. (Г) Cверху: анализ интенсивности флуоресценции мРНК orb в ооците по сравнению с питающими клетками в яйцевых камерах на стадии 1 для WT (n = 14) и orb∆3’UTR (n = 16). Снизу: анализ интенсивности флуоресценции белка Orb в ооците по сравнению с питающими клетками на стадии 1 яйцевых камер дикого типа (n = 21) и orb∆3’UTR (n = 18). **** P < 0.0001. Шкала – 10 мкм. WT, wild type. В этих клетках-предшественницах отмечался более высокий уровень транскрипта orb. Затем в зоне гермария 2б в одной из клеток-предшественниц мРНК orb исчезала и накапливалась только в той из них, которая затем дифференцировалась в ооцит. На рис.2Б приведено сравнение локализации мРНК orb в гермарии и на ранних стадиях развития яйцевой камеры в норме и у мутантов orb∆3'UTR. В отличие от дикого типа, мРНК orb у мутантных особей не демонстрировала признаков локального накопления в гермарии или в ранних яйцевых камерах. Вместо этого в яичниках orb∆3'UTR мРНК orb распределялась внутри цист равномерно во всех 16 герминальных клетках в зонах 2а и 2б, а также на первой и последующих стадиях яйцевой камеры (Рис. 2Г). На рис. 2В показан паттерн распределения белка Orb в яичниках дикого типа и orb∆3'UTR. У мутантов белок Orb неправильно локализовался в яичниках: он не накапливался в двух предшественниках ооцитов в области 2a, не обогащался в формирующемся ооците в области 2б и на первой стадии. Уровень белка Orb в области 2б и на стадии 1 был такой же, что и в питающих клетках (Рис. 2Г). Таким образом, у мутантов orb∆3'UTR базальный уровень транскрипции и трансляции в питающих клетках, не сильно нарушен. Однако, повышенный уровень синтеза мРНК и белка Orb, который обычно наблюдался в двух предшественниках ооцитов в области 2a, в ооците в области 2б и в яйцевой камере первой стадии, зависит от 3’НТО гена orb. Дифференцировка ооцита невозможна без 3’НТО orb Герминальные клетки цисты во время серии митозов претерпевают неполный цитокинез, что приводит к формированию 16 клеточного синцития (Рис.2А). Одна из клеток синцития впоследствии превращается в ооцит, а остальные 15 становятся питающими клетками, ДНК которых многократно эндореплицируется без деления ядра. В результате питающие клетки становятся полиплоидными. В процессе развития яйцевые камеры увеличиваются в размерах в основном за счет растущего ооцита. В отличие от контрольной, в мутантной линии orb∆3'UTR все герминальные клетки в яйцевых камерах были полиплоидными, а сами яйцевые камеры не увеличивались в размере, и ни одна из питающих клеток не определялась как ооцит (Рис. 3). При этом мутантные самки не были способны откладывать яйца. Рисунок 3. Конфокальная микрофотография овариол. Окрашивание выполнено с помощью антител к актину и агглютинином зародыша пшеницы (WGA). Шкала - 50 мкм. Эти данные указывают на функциональную связь между 3’НТО-зависимой локализацией мРНК и белка Orb и образованием будущего ооцита. Неправильная локализация мРНК orb и отсутствие повышенного синтеза его белка в мутантных яичниках orb∆3'UTR приводит к нарушению дифференцировки ооцита. 3’НТО orb необходима на раннем этапе развития ооцита Чтобы лучше понять природу дефектов оогенеза в мутантной линии orb∆3'UTR, мы сравнили локализацию нескольких специфических маркеров ооцита в мутантных и нормальных овариолах. Локализация мРНК BicD и osk в ооцитах. В яичниках дикого типа мРНК генов BicD и osk первоначально обнаруживались в зоне гермария 2а, где они присутствовали в высокой концентрации в двух предшественниках ооцита. Затем, в зоне 2б и в яйцевых камерах 1-й стадии обе мРНК аккумулировались только в одной из клеток - ооците. Такое поэтапное изменение локализации мРНК BicD и osk нарушалось у мутантов orb∆3'UTR. На той стадии, когда BicD и osk уже могли быть обнаружены в области гермария 2а в контроле, у мутантов отсутствовали признаки локального накопления этих мРНК (Рис. 4А, Б). Рисунок 4. Локализация мРНК BicD и osk в ооците зависит от 3’НТО orb. (A) FISH мРНК BicD в гермарии и яйцевой камере на стадии 1 в норме и у мутантов orb∆3'UTR. Стрелки указывают на локализацию мРНК BicD в цистах WT. (Б) FISH мРНК osk в гермарии и яйцевой камере стадии 1 в контроле и у мутантов orb∆3'UTR. Cтрелки указывают на локализацию мРНК oskar внутри 16- клеточных цист WT, в мутантных яйцевых камерах стрелки указывают на мРНК oskar локализованную в 2-х клетках. (В) Анализ локализации мРНК BicD в яйцевых камерах стадии 1 в контроле (n = 11) и у мутантов orb∆3'UTR (n = 13). (Г) Количественная оценка клеток, обогащенных мРНК osk в яйцевых камерах на стадии 1 в контроле (n = 32) и у мутантов orb∆3'UTR (n = 23). Шкала – 10 мкм. В 60% яйцевых камер orb∆3'UTR стадии 1 мРНК BicD были либо не локализованы, либо локализованы в двух клетках (Рис. 4В). У мутантов во всех яйцевых камерах стадии 1 мРНК osk не концентрировалась в единичной клетке, а вместо этого распределялась между двумя и более клетками (Рис. 4Г). Локализация белков Egl и BicD. В формирующихся 16-клеточных цистах белки Egl и BicD распределялись равномерно, однако по мере прохождения через зону 2a, оба белка концентрировались сначала в двух предшественниках ооцита, а затем в зоне 2б и на 1 стадии яйцевой камеры обогащались только в ооците, расположенном в постериальной зоне. В мутантах orb∆3'UTR такой постепенный механизм обогащения ооцита этими белками нарушался (Рис 5А, В). В 80% мутантных яичников в зоне 2б Egl локализовался в двух и более клетках (Рис. 5А, Б). Рисунок 5. 3’НТО orb влияет на локализацию белков Egl и BicD. (A) Иммуноокрашивание гермария WT и orb∆3'UTR в зоне гермария 2б антителами к Egl. (Б) Количественный анализ клеток, обогащенных Egl, в зоне гермария 2б для WT (n = 13) и orb∆3'UTR (n = 47). (В) Конфокальная микрофотография яйцевой камеры на стадии 1, полученная с помощью антител к BicD и Actin. (Г) Анализ локализации белка BicD в яйцевых камерах у WT (n = 10) и мутантов orb∆3'UTR (n = 10) на стадии 1. Шкала – 10 мкм. Похожая картина нарушений наблюдалась и для белка BicD. В большинстве яйцевых камер первой стадии BicD аккумулировался в двух или более клетках, либо не обогащался. В небольшом проценте камер BicD, по-видимому , локализовался в единичной клетке, однако в таком случае эта клетка располагалась ближе к антериальной области яйцевой камеры (Рис. 5В, Г). Сборка центра организации микротрубочек. Ключевым этапом дифференцировки клетки в будущий ооцит является сборка центра организации микротрубочек (ЦОМТ). По мере роста сети микротрубочек, ЦОМТ сначала собирается в двух клетках- предшественницах ооцита, имеющих четыре кольцевых канала, а затем, к 1 стадии яйцевой камеры остается только в одной клетке – ооците. В яйцевых камерах стадии 1 у мутантов orb∆3'UTR α-тубулин не накапливался преимущественно в ооците, как у дикого типа, а микротрубочки распределялись равномерно между двумя и более клетками (Рис. 6). Рисунок 6. Дефекты сборки ЦОМТ и нарушения локализации белка Corolla в orb∆3'UTR. Конфокальная микрофотография яйцевой камеры на стадии 1, полученная иммуноокрашиванием с помощью антител к α-тубулину и Corolla. Шкала - 10 мкм. Локализация синаптотемного комплекса (СК). В формирующихся 16-клеточных цистах, расположенных в зоне гермария 2а происходит сборка СК. В зоне гермария 2б СК в норме остаются в 2 клетках-предшественницах ооцита, а к первой стадии яйцевой камеры сохраняются только в ооците. Маркером СК служит белок Corolla, который, как показано на рис. 6Б, в яйцевых камерах первой стадии у мутантов orb∆3'UTR аккумулировался в двух и более клетках, а на более поздних стадиях – не обогащался. Гены orb и aPKC функционирует вместе в процессе реполяризации ооцита Правильная локализация детерминант, определяющих A-P и D-V-оси эмбриона, устанавливается в ооците на средних стадиях оогенеза во время ремоделирования его цитоскелета. Этот процесс сопровождается миграцией ядра из постериальной области ооцита в антерио-латеральный угол (Bernard, Lepesant, and Guichet 2018). Анализ положения ядра ооцита в генетических линиях, в которых одновременно нарушена работа обоих генов orb и aPKC, показал, что они функционирует вместе в процессе реполяризации (Рис 7). Рисунок 7. Взаимодействие генов orb и aPKC влияет на позиционирование ядра в ооците на средней стадии оогенеза. График частоты нарушений локализации ядра в ооците. WT (0%, n = 60), aPKCk06403/+ (2%, n = 50), orb343/orbmel (7%, n = 110), aPKCk06403/+; orb343/orbmel (27%, n = 118), orb343/orbmel, HD19 (22%, n = 84) и aPKCk06403/+; orb343/orbmel, HD19 (46%, n = 100). В нуль-аллеле orb343 последнее митотическое деление, предшествующее формированию 16-клеточной цисты, не завершается, что приводит к ее дегенерации. У гипоморфа orbmel нарушен сплайсинг, вследствие чего теряется 5’НТО. Комбинация двух 12 мутаций приводила к нарушению локализации ядра ооцита в 7% яйцевых камер orbmel/orb343. В случае, когда самки orbmel/orb343 трансгетерозиготны по aPKCk06403 - аллелю с сильной потерей функций aPKC, частота дефектов позиционирования ядра возрастала до 25%. Похожий эффект усиления мутантного фенотипа наблюдался, когда aPKCk06403 комбинировался с orbmel/orb343 HD19. В данном мутанте аллель orbmel/orb343 комбинировался с доминантно-негативным трансгеном HD19, экспрессирующим химерную мРНК lacZ-orb3’UTR, которая конкурирует с эндогенной мРНК orb, что разрывает положительную авторегуляторную петлю гена orb, благодаря которой он активирует собственную экспрессию (Lantz et al. 1994; Tan et al. 2001). В яйцевых камерах orbmel/orb343 HD19 около 20% имели нарушенную локализацию ядер ооцитов, в то время как частота дефектов возрастала до 50% когда orbmel/orb343 HD19 были также гетерозиготными по aPKCk06403. Важно отметить, что в случае гаплонедостаточности aPKС без мутантного влияния orb дефекты локализации ядер ооцитов практически не проявлялись (Рис. 7). Локализации мРНК aPKC и белка Orb взаимозависимы После анализа взаимодействий генов aPKC и orb в среднем оогенезе, мы изучили влияние нарушенной экспрессии orb на паттерн накопления мРНК aPKC. В яйцевых камерах после 9-й стадии мРНК aPKC внутри ооцита локализовалась в латеральном поверхностном слое с преимущественным обогащением в антериальной зоне (Рис. 8А). Рисунок 8. Локализация мРНК aPKC и белка Orb в яйцевых камерах на средних стадиях развития. (A) FISH яйцевой камеры дикого типа. Стрелки указывают на мРНК aPKC, которая в ооците обогащается субкортикально в антерио-латеральной зоне. (Б) В линии orb RNAi (#64002) мРНК aPKC неоднородно распределяется вдоль поверхности ооцита (стрелки) либо (В) полностью теряет локализацию в этой области. (Г) Иммуноокрашивание яйцевых камер WT антителами к Orb. (Д) В ооцитах aPKC RNAi (35140) теряется субкортикальная локализация белка Orb. На всех панелях шкала – 50 мкм. В яйцевых камерах дикого типа белок Orb на средней стадии оогенеза также накапливался вдоль поверхности в латеральном слое ооцита и в антерио-латеральном углу (Рис 8Г). Мы обнаружили что при подавлении экспрессии orb с помощью РНК- 13 интерференции, в линии orb RNAi (#64002), ассоциация мРНК aPKC с латеральной поверхностью ооцита либо частично (Рис. 8Б), либо полностью (Рис. 8В) исчезала. Чтобы проверить возможность взаимного влияния на локализацию, мы использовали активируемый в среднем оогенезе GAL4-драйвер под контролем промотора материнского гена α-tubulin67C (7063, Bloomington Stock Center) для экспрессии aPKC RNAi (35140). На таком генетическом фоне, когда мРНК aPKC истощена, изменялся паттерн белка Orb. Вместо субкортикального расположения вдоль всей поверхности ооцита, как в диком типе, белок накапливался в антериальной области ооцита на границе с питающими клетками (Рис. 8Д). Orb связывает мРНК aPKC Предсказано наличие 12 изоформ мРНК aPKC обладающих 6 различными 3’НТО, в 4 из которых имеются канонические CPE. Одна из изоформ, aPKC-RA содержит 3’НТО с тремя каноническими CPE, другие aPKC транскрипты (RD, RF RJ, RK, RL и RM) имеют перекрывающиеся 3’НТО с 2 каноническими CPE. Мы иммунопреципитировали белок Orb c ассоциированными РНК из экстракта яичников и обнаружили, что все варианты транскриптов aPKC, содержащие CPE обогащались в иммунопреципитатах Orb (Рис. 9). Рисунок 9. Белок Orb связывает мРНК aPKC. (А) Иммунопреципитация Orb с последующей ОТ-ПЦР показывает обогащение нескольких транскриптов aPKC. В качестве положительного контроля выступает транскрипт orb-RA. Планки погрешности отмечают стандартное отклонение. Эксперимент выполнен для трех биологических повторностей. **P <0,005; ***P <0,0005. aPKC влияет на авторегуляцию Orb Orb активирует экспрессию собственного гена через последовательности в составе 3’НТО своей мРНК. В трансгене HD19 3’НТО orb объединена с кодирующей последовательностью β-галактозидазы E. coli (hsp83: lacZ-orb 3’UTR). В такой генетической конструкции экспрессия β-галактозидазы становится зависимой от авторегуляторной активности гена orb (Tan et al. 2001). На рисунке 10А можно видеть, что экспрессия β-галактозидазы у трансгена HD19 также зависела и от активности гена aPKC. У мутантов aPKCk06403/aPKCex48 экспрессия β-галактозидазы снижалась в 2 раза по сравнению с контролем (Рис. 10Б). Рисунок 10. Мутанты aPKC снижают экспрессию orb-зависимого β-gal. (А) Вестерн-блот анализ уровня β-галактозидазы (β-gal) в яичниках HD19, orb343/+ и aPKCk06403/aPKCex48; HD19, orb343/+. (Б) Денситометрия результатов вестерн-блот анализа. Результаты получены тремя независимыми экспериментами, + стандартное отклонение, P <0.005 aPKC фосфорилирует Orb в яичниках Подобно CPEB белкам у других видов, активность orb регулируется фосфорилированием (Burns et al.). В яичниках дикого типа содержатся несколько фосфорилированных изоформ белка Orb, которые в стандартных полиакриламидных SDS гелях обычно мигрируют в виде близкого дублета (Wong et al. 2011). Вестерн-блот анализ лизатов дикого типа показал, что более фосфорилированные изоформы двигались медленнее и давали больший сигнал, чем менее фосфорилированные. Однако, у мутантов aPKCk06403/aPKCex48 соотношение этих типов изоформ Orb изменялось (Рис. 11А). Рисунок 11. Мутанты aPKC влияют на фосфорилирование Orb. (А) Вестерн-блот анализ уровня Orb в яичниках. (Б) Денситометрия результатов вестерн-блот Планка погрешности стандартное отклонение, получены в результате трех независимых экспериментов, P <0.05. На рисунке 11Б мы сравнивали относительное количество верхних (более фосфорилированных) и нижних (менее фосфорилированных) изоформ белка в контрольных и мутантных aPKCk06403/aPKCex48 яичниках. В генетической комбинации aPKCk06403/aPKCex48 отношение верхней полосы к нижней снижено по сравнению с WT. Делеция 3’НТО гена orb2 Подобно 3’НТО orb, большинство 3’НТО мРНК orb2 довольно длинные и содержат несколько канонических CPE и десятки неканонических CPE-подобных мотивов. Более того, в ряде работ показано, что Orb2 связывается с транскриптом orb2 in vivo (Mastushita-Sakai et al. 2010; Stepien et al. 2016; Xu et al. 2012). Поэтому мы задались анализа. показывает данные вопросом, необходима ли 3’НТО orb2 и, соответственно, имеющиеся в ней CPE мотивы для выполнения важных функции в сперматогенезе. Чтобы ответить на этот вопрос, мы использовали систему CRISPR/Cas9 для удаления 3’НТО orb2 и проанализировали сперматогенез у мутантов. Ген orb2 кодирует пять различных транскриптов, которые отличаются точками начала транскрипции, паттерном сплайсинга и длиной своих 3’НТО. Транскрипт RA кодирует меньшую изоформу Orb2A массой 60 кДа. RA имеет очень короткую 3’НТО, в которой отсутствуют как канонические CPE UUUUAU, так и альтернативные CPE- подобные мотивы. Остальные транскрипты гена orb2 кодируют большую изоформу Orb2B массой 75 кДа. Распределение канонических CPE в этих транскриптах отличается. Поскольку 3’НТО RD и RH содержат наибольшее количество канонических и неканонических CPE, мы спроектировали делецию таким образом, чтобы выборочно удалить большую часть 3’НТО этих транскриптов. Как показано на рис. 12, с помощью технологии CRISPR/Cas9 мы удалили участок ДНК длиной 4522 нуклеотида, который содержит все канонические CPE в RC, RD и RH. Рисунок 12. Структура гена orb2 и схема делеции фрагмента его 3’НТО. Ген orb2 кодирует пять мРНК, которые различаются длиной своих 3’НТО и содержат разные наборы канонических и неканонических последовательностей CPE (список справа). Пунктирные линии отмечают зоны разрезания Cas9 нуклеазой, которая удаляет участок, содержащий наибольшее количество CPE в самых длинных 3’НТО. Поскольку делеция находилась дальше сигналов полиаденилирования RA и RB, эти транскрипты не были затронуты. Что касается транскрипта RC, его единственный канонический CPE был удален вместе с одним неканоническим и предсказанным полиА- сигналом. Предполагаемый сигнал полиаденилирования для RC и RD в результате делеции оказался таким же, как и для RH. Для трех этих транскриптов 3’НТО приобрела длину 1008 нт и сохранила пять неканонических CPE двух вариантов: UUUUUGT и UUUUUGUU. В исходной линии мух на место удаленного фрагмента ДНК был вставлен селективный маркер DsRed, фланкированным сайтами loxP, и сайт attP. В дальнейшем маркер был вырезан и для последующих исследований уже использовалась линия мух с геном orb2, содержащим сайты attP и loxP, вместо 4522 нуклеотидной делеции. Удаление фрагмента 3’НТО было подтверждено секвенированием, а полученную мутантную линию мух мы обозначили как orb2R. Большинство orb2R самцов стерильны Чтобы выяснить оказывает ли делеция 3’НТО orb2 влияние на фертильность самцов orb2R, мы скрещивали отдельных мутантных самцов с самками дикого типа, а затем подсчитывали количество самцов, давших потомство. Мы обнаружили, что около 75% самцов orb2R были полностью стерильными (Рис. 13A). Рисунок 13. Анализ фертильности. (А) Результаты анализа фертильности самцов: WT n = 287; orb2R n = 358; orb2R/+ n = 175; orb2R/orb236 n = 145. (Б) Анализ количества потомков, полученных от каждого отдельного самца. Количество протестированных самцов дикого типа составило 175, для orb236/+ самцов - 173, фертильных orb2R самцов - 43. Статистический анализ проводился с использованием непарного двустороннего t-критерия, ***P <0,001; ****P <0,0001. В orb2R/orb236 – трансгетерозиготных линиях на нуль-аллеле, стерильными были все самцы. Более того, в эксперименте по количественной оценке потомства, показанном на рис. 13Б, мы выяснили, что фертильная доля самцов линии orb2R (25%), давала существенно меньшее количество потомства по сравнению с самцами дикого типа или гетерозиготными orb236/+. Самцы WT обычно имели 60 или более потомков, тогда как самцы orb236/+ имели от 30 до 90 потомков. Большинство же фертильных самцов orb2R производили менее 30 потомков. Уровень мРНК и белка Orb2 снижен в orb2R семенниках Чтобы лучше понять природу нарушений сперматогенеза у мутантов orb2R, мы измерили уровень мРНК и белка Orb2 в семенниках. С помощью ПЦР в реальном времени мы измерили относительный уровень транскрипции orb2 в семенниках WT и orb2R. В качестве контроля мы использовали транскрипт GADPH, в котором отсутствуют канонические CPE. На рис. 14A показано, что уровень мРНК orb2 в семенниках orb2R был снижен примерно в два раза по сравнению с диким типом. Рисунок 14. Делеция 3’НТО гена orb2 снижает его экспрессию в семенниках. (А) Уровень общей транскрипции мРНК orb2 в семенниках мутантов orb2R и orb236/+ и уровень непроцессированных транскриптов orb2 в семенниках orb2R. Данные представлены как среднее значение кратного изменения 2-ΔΔCt в мутантных семенниках относительно контрольных (красная пунктирная линия). Сплайсированные транскрипты: WT, n = 27; orb2R, n = 27; orb236/+, n = 18; несплайсированные транскрипты: WT, n = 10; orb2R, n = 10. Планки погрешности показывают стандартные ошибки средних, **** P <0,0001; ns (незначимо) P> 0,05. (Б) Вестерн-блот анализ белка Orb2 в семенниках. (В) Денситометрический анализ уровня Orb2 в мутантных семенниках по сравнению с диким типом (красная пунктирная линия). WT/orb2R, n = 7; WT/orb236/+, n = 4. Планки погрешности показывают стандартные отклонения.
Снижение
стабильностью зрелых транскриптов, поскольку уровень первичных транскриптов orb2 (несплайсированных форм, обнаруженных с помощью праймеров, расположенных на стыке интрон-экзон) в семенниках orb2R был близок к таковому у WT.
Далее, с помощью вестерн-блот анализа, мы определили, что уровень белка Orb2 снижен в экстрактах семенников orb2R (Рис. 14Б). Денситометрический анализ серийных разведений экстрактов семенников WT и orb2R указал на то, что, как и в случае с мРНК, уровень изоформы Orb2 массой 75 кДа снижается примерно в два раза (Рис. 14В).
Вышеупомянутые эксперименты показали, что удаление фрагмента 3’НТО orb2, содержащего CPE и CPE-подобные мотивы, приводило к двукратному снижению уровня его мРНК и белка. Поскольку при этом транскрипция не была затронута, возможно, причиной падения экспрессии стало уменьшение стабильности мРНК orb2.
В экспериментах по анализу фертильности выяснено, что гетерозиготные самцы по нуль аллелю orb2, orb236, давали почти столько же потомков, сколько самцы WT (Рис. 13Б) и не демонстрировали очевидных аномалий в сперматогенезе. Чтобы подтвердить,
мРНК в
мутантных
семенниках,
по-видимому , связано с пониженной
что нуль мутация привела к ожидаемому снижению продуктов гена orb2, мы измерили уровни мРНК и белка в семенниках мутанта orb236. Как показано на рис. 14A, количество мРНК orb2 в семенниках orb236/+ было примерно вдвое меньше, чем у orb2R, и на четверть меньше, чем у дикого типа. Схожие результаты получены при сравнении уровней белка у дикого типа с orb236/+ и orb2R/orb236 (Рис. 14В). Относительное количество белка Orb2 в orb236/+ составляло примерно одну треть от WT и примерно одну четверть от orb2R/orb236.
Эти данные показали, что уменьшение мРНК и белка Orb2 в гомозиготных семенниках orb2R было сходным с таковым у гетерозигот orb236. Однако, поскольку плодовитость этих мух сильно различается, маловероятно, что такое снижение является причиной нарушения фертильности orb2R.
3’НТО orb2 необходима для правильной локализации его мРНК и белка Для лучшего понимания причин стерильности большинства самцов orb2R, мы исследовали экспрессию продуктов гена orb2 во время сперматогенеза. Обнаружено, что паттерны локализации мРНК и белка Orb2 в премейотических и мейотических цистах
оставались без изменений в orb2R и соответствовали таковому у дикого типа.
Ряд существенных дефектов стал проявляться уже после завершения мейоза, когда сперматиды начали дифференцироваться. Сперматидные цисты, состоящие из 64 гаплоидных клеток, при нормальном процессе сперматогенеза сначала имеют округлую форму и диаметр около 10 мкм. Затем аксонемы жгутиков начинают расти в сторону апикального конца семенников и в конечном итоге образуют очень вытянутые клетки – сперматозоиды, имеющие длину почти 2 мм (Рис. 15А) (Fabian and Brill 2012; Tokuyasu 1975; Tokuyasu, Peacock, and Hardy 1972). Во время удлинения сперматидной цисты мРНК и белок Orb2 концентрируются в концах аксонем жгутика таким образом, что паттерн их распределения напоминает комету, с хвостом простирающимся назад к
ядрам.
На рисунке 15 Б, В представлен анализ градиентной локализации продуктов гена
orb2 на концах хвостов растущих сперматидных цист. Тогда как распределение транскрипта и белка Orb2 вдоль аксонем жгутиков количественно определено на рисунке 15 Г, Д. В семенниках orb2R комето-подобный паттерн распределения мРНК и белка Orb2 исчезал. Вместо того, чтобы накапливаться на концах аксонем жгутиков, транскрипты orb2 распределялись вдоль хвоста сперматидной цисты более-менее равномерно (Рис. 15 Б, Г). Подобный паттерн локализации демонстрировал и белок Orb2, который в семенниках orb2R не накапливался на концах растущих сперматид, как у дикого типа, а равномерно распределялся по всей длине аксонем жгутиков (Рис. 15 В, Д).
Рисунок 15. 3’НТО гена orb2 необходима для локализации его мРНК и белка в сперматидных цистах. (А) Общая схема сперматогенеза. ГСК – герминальные стволовые клетки. (Б) Конфокальные микрофотографии целых семенников, полученные с помощью FISH мРНК orb2 для WT, orb2R. (В) Конфокальные микрофотографии целых семенников, полученные с помощью иммуноокрашивания антителами к белку Orb2 для WT, orb2R. Желтые стрелки указывают на преимущественную локализацию мРНК orb2, а белые стрелки – аккумуляцию белка Orb2 в цистах; скобки ограничивают зону концов хвостов сперматидных цист без соответствующего обогащения мРНК и белка Orb2 в мутантных семенниках. (Г) График интенсивности флуоресцентного сигнала мРНК и (Д) белка Orb2 вдоль концов сперматидных цист, нормированный на средний уровень сигнала в сперматоцитах, для WT (n = 21) и orb2R (n = 14). ****P <0.0001, ***P <0.0005, **P <0.005; ns, not significant (не значимы). Шкала – 40 мкм. Эти результаты указывают на то, что удаленная последовательность 3’НТО orb2 необходима для правильной локализации его мРНК и белка на стадии роста сперматидных цист. Мутация orb2R влияет на локализацию других транскриптов и белков в сперматидах Известно, что некоторые транскрипты и белки, также как и orb2, имеют комето- подобное распределение в хвостах растущих сперматид (Barreau et al. 2008; Xu et al. 2012). Одним из них является orb. В WT мРНК orb накапливается преимущественно в области конца растущих жгутиковых аксонем (Рис. 16A); однако она, по-видимому, не транслируется до тех пор, пока не прекратится фаза роста сперматид, когда белок Orb2 начинает исчезать. Рисунок 16. Локализация ряда транскриптов и белков в семенниках зависит от 3’НТО orb2. (A) FISH мРНК orb в семенниках дикого типа и orb2R. Стрелки указывают на аккумуляцию транскрипта на концах хвостов сперматидных цист в диком типе, скобки ограничивают концы хвостов сперматидных цист мутантов. Шкала – 50 мкм. (Б) Иммуноокрашивание антителами к белку Orb в семенниках дикого типа и orb2R. Стрелки указывают на локализацию белка Orb на концах цист сперматид WT; скобки указывают на концы сперматидных цист в мутантных семенниках. Шкала – 50 мкм. (В) Иммуноокрашивание антителами к белку Boule в контрольных и мутантных семенниках. Скобками обозначены концы хвостов сперматид. Шкала – 40 мкм. В orb2R семенниках наблюдаются нарушения в локализации транскрипта и белка Orb. Вместо обогащения на концах растущих сперматид, мРНК orb распределяются вдоль большей части их хвостов (Рис. 16A). Белок Orb также не накапливается на концах аксонем жгутиков, а синтезируется преждевременно и распределяется вдоль хвостов сперматид. Другой РНК-связывающий белок Boule (Bol), который является гомологом фактора фертильности млекопитающих DAZ, также имеет «кометный» паттерн локализации в сперматидах (Cheng, Maines, and Wasserman 1998). Белок Bol способен формировать комплексы с Orb2 и во время фазы роста сперматид локализуется совместно с Orb2 на концах аксонем жгутиков (Xu et al. 2012). На рис. 16В можно видеть, что в мутантных orb2R семенниках Bol не обогащается на концах удлиняющихся сперматид, как в диком типе, а вместо этого распределяется в них относительно равномерно. Ранние этапы поляризации сперматидных цист нарушены в orb2R семенниках Дефекты локализации мРНК и белков в сперматидах, а также аномальная морфология их хвостов побудили нас исследовать ранние этапы поляризации в сперматидных цистах. В процессе поляризации 64 ядра внутри сперматидной цисты собираются на ее базальной стороне, в то время как 64 кинетосомы, каждая из которых объединена со своим ядром, ориентируется в апикальную сторону цисты и инициируется сборка жгутиковых аксонем. Далее аксонемы начинают удлиняться к апикальному концу семенников, и, в конечном итоге, образуют очень длинные хвосты (Рис.15А). Для изучения поляризации и цитоскелетной организации ранних сперматидных цист мы использовали антитела против белков βNACtes. Как показано на рисунке 17, в диком типе белки βNACtes преимущественно группируются в серии отдельных и равномерно расположенных продольных полос вдоль апикально-базальной оси поляризующейся сперматидной цисты. Рисунок 17. 3’НТО orb2 необходима для поляризации ядер на раннем этапе удлинения сперматид. Иммуноокрашивание выполнено антителами к βNACtes, которые маркируют герминальные клетки семенников. Скобки ограничивают зону, в которой аккумулируются ядра (DAPI) во время поляризации цист в диком типе. Стрелки указывают на неполяризованные ядра мутантов. Шкала – 30 мкм. Предполагается, что эта регулярная организация отражает ассоциацию с зарождающимися аксонемами жгутиков или с какой-то другой повторяющейся структурой цитоскелета в цисте. В ранних сперматидах orb2R нарушается процесс поляризации. Вместо кластеризации на базальной стороне цист, ядра обнаруживаются 22 разбросанными вдоль всей апикально-базальной оси в большей части orb2R семенников. Регулярное расположение полос белков βNACtes в формирующихся хвостах сперматид на апикальной стороне цист также нарушается: полосы белка неупорядоченные, хаотичны, местами протягиваются зигзагообразно вдоль апикально-базальной оси, либо преждевременно прерываются (Рис. 17). Эти результаты указывают на то, что 3’НТО orb2 необходима для правильной поляризации формирующихся сперматидных цист и, вероятно, возникшие на раннем этапе нарушения этого процесса являются причиной последующих дефектов в дифференцировке мутантных сперматид. Аномалии дифференцировки сперматидных ядер в orb2R семенниках По мере роста хвостов сперматид их ядра претерпевают ряд морфологических изменений. Первоначально они имеют сферическую форму, но затем проходят через несколько промежуточных стадий, включающих стадию листа, раннего каноэ, позднего каноэ и, наконец, стадию иглы (Fabian and Brill 2012; Tokuyasu 1975; Tokuyasu, Peacock, and Hardy 1972). Наряду с этими морфологическими изменениями, ядра сливаются в плотный пучок, чтобы сформировать колпачковидную структуру на базальном конце сперматидных цист (Рис. 15A, 18А). Рисунок 18. Делеция 3’НТО orb2 приводит к нарушению поздних этапов дифференцировки сперматид. (A) Конфокальные микрофотографии базальной стороны семенников, окрашенных DAPI. В контрольном семеннике стрелка указывает на колпачковидную структуру, сформированную группой из 64 плотно упакованных игловидных ядер одной сперматидной цисты. Мутантные семенники orb2R содержат лишь частично упакованные ядра (длинная стрелка) либо полностью разбросанные ядра (короткие стрелки). В семенниках orb2R/orb236 все ядра рассеяны (короткие стрелки). Шкала – 20 мкм. (Б) Частота встречаемости дефектов кластеризации игловидных ядер в контрольных (n = 86), orb2R (n = 61) и orb2R/orb236 (n = 57) семенниках. (В) Комплекс индвидуализации (длинная стрелка на увеличенном изображении контрольного семенника), маркируемый окрашиванием актина, состоит из 64 плотно собранных актиновых конусов, которые образуются на стадии индивидуализации сперматид. В семенниках orb2R, как и в случае с игловидными ядрами, актиновые конусы либо собраны частично (длинная стрелка), либо полностью рассеяны вдоль сперматидной цисты (короткие стрелки). В семенниках orb2R/orb236 отсутствуют комплексы индивидуализации, а составляющие их актиновые конусы полностью рассеяны (короткие стрелки). Шкала – 100 мкм (левые панели), 10 мкм (правые панели). (Г) Количественная оценка семенников с различными вариантами нарушений индивидуализации в WT (n = 86), orb2R (n = 60) and orb2R/orb236 (n = 56). (Д) Окрашенные с помощью DAPI семенные мешки, в которых отмечается существенное уменьшение количества зрелых сперматозоидов в orb2R по сравнению с диким типом, а семенные мешки orb2R/orb236 полностью пусты. Шкала – 40 мкм. (Е) Процентная доля самцов с различной степенью заполненности семенных мешков зрелыми сперматозоидами в WT (n = 74), orb2R (n = 47) и orb2R/orb236 (n = 37). В семенниках orb2R большинство ядер в цистах, по-видимому, развивались до стадии иглы, но их последующее слияние в колпачковидную структуру нарушалось (Рис. 18A, Б). Примерно 40% семенников orb2R содержали сперматидные цисты с плотно упакованными игловидными ядрами, как в диком типе и одновременно цисты с рассеянными ядрами. В остальных orb2R семенниках все цисты имели рассеянные ядра (~45%). В orb2R/orb236 семенниках обнаруживались цисты исключительно с разбросанными ядрами (Рис. 18Б). Комплекс индивидуализации не собирается должным образом в мутантах После завершения стадии роста сперматиды переходят в стадию индивидуализации. Вокруг игловидных ядер, составляющих колпачковидную структуру на базальной стороне сперматидной цисты, начинает собираться комплекс индивидуализации (ИК), который состоит из 64 актиновых конусов, каждый из которых крепится к отдельному ядру. ИК успешно собирался только примерно в 15% семенников orb2R (Рис. 18В, Г). В остальных случаях происходила либо только частичная сборка комплексов, либо ИК не формировал единую структуру . Сборка ИК у трансгетерозигот orb2R/orb236 была полностью нарушена и во всех семенниках содержались рассеянные актиновые конусы. Вследствие нарушений процессов сборки ИК, только около 30% семенных пузырьков в orb2R содержали зрелые сперматозоиды, тогда как другие оказывались пустыми, либо заполненными частично (Рис. 18Д, Е). Семенные пузырьки в orb2R/orb236 не содержали функциональных сперматозоидов. Эти результаты согласуются с данными о фертильности самцов orb2R и orb2R/orb236 (Рис. 13А). ВЫВОДЫ 1. 3’НТО гена orb является критически важной для правильного протекания оогенеза у дрозофилы. Делеция большей части указанной области приводит к нарушению образования ооцита на ранних стадиях оогенеза и его дифференцировки на последующих стадиях, следствием чего становится неспособность самок откладывать яйца. 2. У мутантов с делецией 3’НТО гена orb нарушается локализация мРНК orb, белка Orb, а также многих важных факторов, участвующих в определении ооцита: продуктов экспрессии гена bicD, транскриптов osk, белков Egl, α-тубулина и Corola. 3. Взаимодействие генов orb и aPKC обеспечивает ремоделирование цитоскелета ооцита на средних стадиях оогенеза. Белок Orb способен связывать мРНК aPKC в яичниках и при этом является субстратом киназы aPKC. Подавление экспрессии гена orb нарушает локализацию транскриптов aPKC в ооците на средних стадиях оогенеза, а подавление экспрессии aPKC вызывает дефекты распределения белка Orb на этих же стадиях. Авторегуляторная активность гена orb на средних стадиях оогенеза зависит от aPKC. 4. 3’НТО гена orb2 является критически важной для правильного протекания сперматогенеза у дрозофилы, делеция этой области существенно нарушает фертильность самцов. 5. Экспрессия мутантного аллеля orb2, с удаленной 3’НТО, в семенниках снижена. Транскрипты orb2, лишенные 3’НТО, теряют специфическую градиентную локализацию в растущих хвостах сперматидных цист. У мутантов также нарушается локализация белка Orb2, продуктов гена orb, белка Bol. 6. Мутанты, несущие делецию 3’НТО гена orb2, демонстрируют нарушения поляризации сперматид, локализации ядер и сборки комплекса индивидуализации в дифференцирующихся сперматидных цистах.