Изучение влияния опухолевого микроокружения на противоопухолевую активность CAR T-клеток

Изучение влияния экзосом EV на противоопухолевую активность CAR T-клеток
В качестве объектов исследования влияния опухолевых экзосом на модифицированные лимфоциты были выбраны CAR T-клетки для терапии лимфом и лейкозов (CD19-CAR), а также глиобластомы (Il-13-CAR). Для проведения функциональных экспериментов нами были получены репортерные линии клеток лимфомной (Nalm-6) и глимной (U87) линий, несущие ген нанолюциферазы, слитый с тетраспанином CD63. Также, для получения адекватного отрицательного контроля, в клетках Nalm-6 был проведен нокаут гена CD19, для получения CD19-негативных клеток и, соответственно, везикул.
Для анализа потенциального влияния внеклеточных везикул на функции CAR T- клеток, CAR T-клетки инкубировали с разными экзосомами и измеряли уровень хемилюминесценции нанолюциферазы (Рис. 1). Из полученных данных можно видеть, что экзосомы избирательно связываются и поглощаются CAR T-клетками (наблюдается избирательная аффинность EV Nalm-6 к CD19-CAR, а глиомных экзосом к IL13-CAR Т- клеткам).
Рисунок 1. Экзосомы (EV), содержащие на поверхности CD19 и IL-13mut связывают CD19-CAR и IL13-CAR при инкубации продуцирующими их клетками Nalm-6 (CD19) и U87 (IL13Ra2) с соответствующими CAR T-клетками в эксперименте “transwell” (А) и при непосредственном контакте между CAR T-клетками и очищенными экзосомами (Б).
Чтобы определить, происходит ли при связывании везикул с клетками и их интернализация (и, возможно, передача содержимого везикул клеткам-реципиентам), нами были получены конфокальные изображения CAR T-клеток, предварительно проинкубированных с EV. Результаты микроскопии представлены на Рисунке 2, и демонстрируют избирательное связывание EV CD19+ и их поглощение только теми клетками, которые несут на поверхности CD19-CAR.
Рисунок 2. Конфокальное изображение CAR T-клеток, обработанных EV. A – Конфокальное изображение клеток Jurkat/Jurkat-CD19-CAR, инкубированных с CD19+ экзосомами. (красный – CD19, зеленый – CD3) Б – CD19-CAR T-клетки инкубировали с CD19+ EV и CD19-EV (красный – CD3, зеленый – CD63-GFP, синий – ядро (Hoechst33342)).
Влияние EV на функциональную активность CAR T-клеток
При распознавании CAR T-лимфоцитом опухолевой клетки, взаимодействие химерного антигенного рецептора с антигеном приводит к активации T-клетки и индукции секреции провоспалительных цитокинов (IFNγ, IL-2 и др.). Так как было показано, что опухолевые везикулы несут на своей поверхности опухолевый антиген и специфически взаимодействуют с CAR T-клеткой, была изучена способность EV к индукции
эффекторных функции CAR T-клеток. Методом ИФА IFNγ и IL-2 были проанализированы супернатанты культур CD19-CAR T-клеток, проинкубированных с EV Nalm-6 CD19+ и Nalm-6 CD19-. Было обнаружено, что только экзосомы, содержащие CD19, вызывают продукцию провоспалительных цитокинов CD19-CAR T-клетками, что свидетельствует об их активации (Рис. 3,А).
Продукция цитокинов также может быть предпосылкой изменения цитотоксической активности CAR T-клеток, а именно способности убивать опухолевые клетки. Через 10 часов после начала эксперимента наблюдается заметное различие в цитотоксичности CD19- CAR клеток в отношении различных мишеней – образцы, обработанные CD19+ экзосомами, проявляют сниженную цитотоксическую активность (Рис. 3,В). Данный эффект может быть вызван связыванием CAR T-клетки с присутствующим на EV антигеном еще до встречи с клетками-мишенями. Однако, длительная инкубация CD19-CAR T-клеток с CD19+ экзосомами приводит к небольшому снижению цитотоксической активности CAR T-клеток по сравнению с контролем, что вероятно связано с поглощением EV CD19-CAR T-клеткой и появлением свободного CD19-CAR на поверхности (Рис. 3,Б).
Рисунок 3. Анализ изменения функциональной активности CAR T-клеток под действием EV. А – Анализ секреции провоспалительных цитокинов при инкубации CD19- CAR T-клеток с CD19+ экзосомами (EV CD19+) или с CD19- экзосомами (EV CD19-), (Mock-T) – анализ базового уровня провоспалительных цитокинов. Б – Анализ цитотоксичности CD19-CAR-T клеток (CAR19), которые были предварительно проинкубированы с EV CD19+ и EV CD19-. Не-трансдуцированные (Mock-Т) клетки
использованы в качестве отрицательного контроля. В – Анализ цитотоксичности CD19- CAR-T клеток (как в Б), измеренный через 10 часов после начала эксперимента.
Эта преждевременная активация, возможно, приводит к проявлению эффекторных функций, что может влиять на пролиферацию и цитотоксичность CAR Т-клеток. Для более детальной характеристики изменения эффекторной функции при поглощении EV клеткой, нами был проведен анализа транскриптома CAR T-клеток, обработанных EV. Основываясь на полученных данных, было установлено, что происходит глобальное увеличение экспрессии тех генов, которые ответственны за активацию Т-клеток (Рис. 4). Примечательно то, что, кроме увеличения экспрессии генов, которые непосредственно свидетельствуют об активации CAR-T клетки (IL-5, IL-2, CSF2, IL13, IFNG, IL21, IL10,
NFAT5), также наблюдается увеличение транскриптов генов, которые ответственны за функциональное истощение и гибель активированных Т-клеток, а именно гены белков апоптотических путей – FASLG, TNFRSF4, TNFRSF9 и гены белков маркеров истощения – CD274 (PDL-1), CD273(PDL-2), CTLA-4.
Рисунок 4. Транскриптомный анализ CD19-CAR T-клеток, выделенных из двух доноров (1 и 2), проинкубированных с CD19+EV и CD19-EV. Данные представлены в виде тепловой карты и отображают изменение экспрессии mRNA, выделенной из CAR T-клеток. На тепловой карте представлены гены с p<0.05. Влияние искусственных антигенных везикул (AV) на противоопухолевую активность CAR-T клеток Везикулы, секретируемые опухолевыми клетками, несущие опухолевый антиген показали способность специфически взаимодействовать и активировать CAR T-клетки. Такие свойства неклеточных структур могут быть крайне востребованы в процессе получения и экспансии CAR T-клеток. Так как выделение EV является крайне трудоемкой задачей, нами был разработан метод получения искусственных везикул (AV), основанный на обработке клеток цитохалазином B, который разрушает актиновый цитоскелет, что приводит к экструзии ядра, отслоению плазматической мембраны и отпочковыванию мембранных микроцитосфер. Эти микроцитосферы можно отделить от клеток встряхиванием суспензии клеток с образованием пузырьков, которые несут поверхностные белки, экспрессируемые «родительской» клеткой. Для создания AV, содержащих опухолевые антигены, была создана панель клеток HeLa, экспрессирующих опухолеассоциированные маркеры (CD33, CD123, CD19, IL13R2a, Her2). Размер и изображения, полученных AV, оценивали методами проточной цитофлуориметрии и трансмиссионной микроскопии. Обработка полученных на конфокальном микроскопе изображений AV с помощью программного пакета ImageJ позволила установить средний диаметр AV, который составил примерно 2400 нм. Кроме того, в полученные стабильные клеточные линии в составе лентивирусных частиц вводили ген мембранно-заякоренного флуоресцентного белка dTomato, что обеспечивало флуоресцентное маркирование везикул. Связывание CAR T-клеток с AV, несущими антигены и флуоресцентный белок dTomato-MTA Чтобы продемонстрировать потенциал AV для детекции CAR T-клеток была создана панель генетических конструкций (CD19-CAR, IL13-CAR, HER2-CAR, CD33-CAR и CD123-CAR T-клеток), которая охватывает широкий спектр опухолевых заболеваний. Способность AV специфически связываться с соответствующими CAR T-клетками была исследована методом проточной цитофлуориметрии, где CAR T-клетки инкубировали с AV, содержащими флуоресцентный белок dTomato (Рис. 5). В качестве контроля использовались везикулы, не несущие опухолевых антигенов, для окрашивания использовались CAR T-клетки с различным процентом CAR-положительной популяции. Полученные результаты демонстрируют, что AV могут связывать и окрашивать клетки CAR-T с такой же эффективностью, что и mAb и рекомбинантные белки. Следовательно, AV могут стать альтернативным и доступным методом для детекции CAR, при отсутсвии соответсвующих коммерчески-доступных антител, как это было показано нами в случае CD33-CAR и CD123-CAR (Рис. 5). Рисунок 5. AV, экспрессирующие антигены CAR, связывают клетки CAR-T специфическим и дозозависимым образом и могут использоваться в качестве реагентов для обнаружения CAR. Параллельные окрашивания CAR-T искусственными везикулами и специфическими антителами (реагенты для обнаружения CAR). Данные представлены в виде гистограмм. Для выяснения особенностей взаимодействия везикул с CAR T-клетками, была проведена сканирующая (Рис. 6,А) и конфокальная (Рис. 6,Б) микроскопии CD19-CAR-T или Т-клеток (в качестве отрицательного контроля) после их инкубации с CD19-AV. В результате данных экспериментов можно утверждать, что CD19-AV остаются прикрепленными только к поверхности CD19-CAR T-клеток, а не к контрольным T- клеткам. На изображениях, полученных с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), видно, что везикулы круглой формы приклеиваются к поверхности клетки или располагаются на выступах мембраны (Рис. 6). Рисунок 6. Сканирующая электронная микроскопия (Б) и конфокальные (А) изображения CAR T-клеток, связанных с AV. Активация CAR T-клеток AV, несущими опухолеассоциированные антигены Способность AV активировать CAR T-лимфоциты была протестирована в эксперименте ко-инкубации репортерной линии Jurkat-CAR-NFAT-fluc, модифицированной CAR, с различным количеством AV (положительных и негативных по антигену). Как и ожидалось, увеличение количества везикул, приходящееся на клетку Jurkat-CAR-NFAT-fluc приводило к значительному росту сигнала люминесценции. Примечательно, что контрольные везикулы, полученные из исходной клеточной линии, лишенной антигена, не активировали Jurkat-CAR-NFAT-fluc. Этот результат демонстрирует способность AV стимулировать CAR T-клетки (Рис. 7,А). Также было показано, что AV могут дозозависимо и антиген- специфично индуцировать секрецию провоспалительных цитокинов IFNγ и IL-2 CAR T- клетками (Рис. 7,В). При высоких соотношениях AV:CAR-T везикулы были сопоставимы или лучше для стимуляции и активации CAR T-клеток, чем соответствующие антиген- экспрессирующие клетки HeLa. Стоит отметить, что в обоих типах CAR T-клеток (CD19- CAR и IL13-CAR) продукция IL-2 была намного выше как при промежуточных, так и при высоких соотношениях AV:CAR-T, чем в случае ко-инкубации CAR Т-клеток с фидерными антиген-содержащими клетками HeLa. Лучшую способность к активации можно объяснить доступностью AV для взаимодействия с CAR - общая поверхность цитоплазмы клетки HeLa должна быть намного больше, чем поверхность AV, но доступ к прикрепленным клеткам HeLa может быть затруднен для большого числа CAR Т-клеток, в то время как AV свободно плавают в растворе, следовательно, антиген на их поверхности более доступен для связывания с CAR T-клеткой. Рисунок 7. Инкубация с AV стимулирует CAR T-клетки. А - Анализ активации CAR-T Jurkat-NFAT-luc после культивирования с AV или контрольными антиген-отрицательными везикулами при различных соотношениях CAR T-клетки:AV. Б - Количественная оценка секреции IFNγ и IL-2 клетками IL13-CAR-T или CD19-CAR-T, культивированными при различном соотношении CAR-T: AV (E:T) с IL13R2a-AV или CD19-AV соответственно, или с не содержащими антиген контрольными везикулами (neg-AV). Параллельно Т-клетки CD19-CAR и IL13-CAR инкубировали при различных соотношениях CAR-T:клетки- мишени с антиген-экспрессирующими клетками HeLa-IL13R2a или HeLa-CD19, соответственно. В - Оценка дегрануляции IL13-CAR T-клеток после культивирования в течение 4 часов с IL13R2a-AV или c контрольными AV. В качестве отрицательного контроля использовали CAR-T клетки, не подвергавшиеся действию активирующих стимулов. A-Б - Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение из трех экспериментальных повторности. Статистический анализ проводился с использованием дисперсионного анализа ANOVA. Секреция провоспалительных цитокинов лимфоцитами также сопряжена с дегрануляцией - процессом выброса перфорина и гранзимов CAR T-клетками в ответ на распознавание антигена. Данный процесс можно детектировать по появлению лизосомного маркера CD107a на поверхности Т-клеток. Нами было выяснено, что дегрануляция в CAR T-клетках возникает только в случае добавления антиген-положительных AV (Рис. 7,В). Рисунок 8. AV усиливают цитотоксические свойства CAR T-клеток. A - In vitro активность контрольных CD19-CAR T-клеток и культивированных с CD19-AV при соотношении CAR-T: AV 10: 1 или 5: 1. На 4 день после начала обработки везикулами CAR T-клетки инкубировали с клетками-мишенями Jeko-1 при различных соотношениях эффекторных клеток и клеток-мишеней. Б - IncuCyte анализ элиминации Jeko-1 CD19-CAR T клетками, необработанными или обработанными CD19-AV при соотношении эффекторных клеток и клеток-мишеней 3: 1. В - A - In vitro активность CD19-CAR-T, полученных из клеток больных ОЛЛ, которые были культивированы с CD19-AV при соотношении CAR-T:AV 5:1. CAR-T анализировали на уровень цитотоксической активности против клеток Jeko-1. Г – Репрезентативное представление полученных данных Incucyte по рассчитанной площадью под кривой (AUC). A-Г - Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение из четырех экспериментальных повторов и представляют не менее двух независимых экспериментов. Статистический анализ проводили, используя дисперсионный анализ ANOVA. Далее было изучено влияние искусственных везикул на функциональную активность CAR T-клеток. Полученные данные свидетельствуют, что даже при низком соотношении CAR-T:AV (10:1) способность CD19-CAR T-клеток убивать клетки-мишени значительно увеличивается при стимуляции CD19-AV (Рис. 8,А). Этот феномен наблюдали и в случае CAR T-клеток, полученных от здоровых доноров, и CAR T-клеток, полученных из клеток больных ОЛЛ (Рис. 8,Б,В,Г). Также стимуляция CD19-CAR Т-клеток CD19-AV позволяет клеткам сохранять свою цитотоксичность и пролиферативный потенциал в течение 21 дня инкубации с клетками-мишенями. Следовательно AV способны не только активировать CAR T-клетки, но и поддерживать их пролиферацию и цитотоксичность дольше, чем в стандартных условиях стимуляции с помощью рекомбинантных цитокинов или фидерных клеток (Рис 9). Рис 9. «Sequential killing» клеток-мишеней Jeko-1 CD19- CAR клетками, обработанными CD19-AV или контрольными везикулами. Количество клеток-мишеней и CAR T-клеток анализировали каждые 3 дня путем иммуноокрашивания с последующей проточной цитометрией. Оставшиеся CAR T-клетки смешивали со свежими клетками-мишенями в прежнем соотношении и инкубировали еще 3 дня. Процедуру повторяли семь раз в течение 21 дня. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение из четырех экспериментальных повторов и представляют данные двух независимых экспериментов. Изучение влияния AV на пролиферацию и дифференцировку CAR T-клеток Так как была показана способность AV активировать CAR T-клетки, логично было предположить, что их можно использовать для антиген-специфической экспансии CAR T- клеток в культуре в процессе их приготовления. Чтобы проверить эту гипотезу, CD19- положительные (CD19-AV) и контрольные AV добавляли к клеткам CD19-CAR. Мембрана CD19-CAR T-клеток была мечена CFSE, что позволило наблюдать за пролиферативной активностью клеток (уровень свечения меченных клеток пропорционален числу делений). Как и ожидалось, в образце CAR T-клеток, инкубированных с контрольными AV, отсутствовал прирост числа клеток, в то время как скорость пролиферации и увеличение числа CAR T-клеток в присутствии CD19-AV была сопоставима со скоростью, наблюдаемой при стимуляции IL-2 (Рис. 10,A). Так как стимуляция AV является антиген- специфичной, только CAR-положительные клетки активно пролиферируют, что подтвердила инкубация клеток IL13-CAR с IL13R2a-положительными (IL13R2a-AV) или IL13R2a-негативными контрольными AV. В образцах, стимулированных контрольными AV, доля CAR-положительной фракции почти не менялась, а в образцах, стимулированных IL13R2a-AV, доля CAR T-клеток резко увеличилась с 22% в день 1 до 55% в день 7 (Рис. 10,Б). Рисунок 10. Антиген-специфическая экспансия CAR-T-клеток. A - Анализ CD19-CAR T-клеток, меченных CFSE. Клеки культивировали в присутствии IL-2, CD19-AV или контрольных AV в соотношение 5:1 в течение 4 дней. Уменьшение сигнала CFSE оценивали с помощью проточной цитометрии. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение из трех экспериментальных повторов и представляют не менее двух независимых экспериментов. Статистический анализ проводили с использованием t- критерия Стьюдента. Б -Увеличение процентного содержания IL13-CAR T-клеток, которые культивировали в присутствии антиген-положительных (IL13R2a-AV) или не содержащих антиген контрольных AV в соотношении 5:1 в течение 7 дней. Значения на графиках показывают долю CAR T-клеток в суспензии. Известно, что процесс активной пролиферации в условиях хронической стимуляции T- клеток неминуемо ведет к их истощению и смерти. Использование AV в процессе создания CAR T-клеток также может привносить дополнительные риски ранней гибели Т-клеток. Для изучения возможного негативного эффекта был проведен анализ маркеров истощения и дифференцировки Т-клеток у CD19-CAR T-клеток, активированных различными стимулирующими агентами, в том числе CD19-AV. Анализ клеток, инкубированных с различными активирующими агентами (Dynabeads/IL-2, IL-2, CD19-AV и HeLa CD19) показал, что на 7 и 14 день скорость пролиферации CAR T-клеток, стимулированных AV, была в пять раз выше в сравнении с клетками, в присутствии Dynabeads/IL-2 или HeLa CD19 (Рис. 11,А). Существенное увеличение CAR-положительной популяции наблюдалось только при стимуляции CD19- AV, причем как для CD4+, так и для CD8+ Т-клеток (c 23% до 31% для CD4+ Т-клеток и c 13% до 22% для CD8+) (Рис. 11,Б,В). Анализ фенотипа CAR T-клеток спустя 7 и 14 дней культивации в случае стимуляции CD19-AV показал сохранение T-клеток в состоянии Tnaive (популяция наивных Т-клеток) и Tcm (популяция Т-клеток центральной памяти), в то время как стимуляция Dynabeads/IL-2 или фидерными клетками приводила к преобладанию популяций Tem (популяция Т-клеток эффекторной памяти) и Temra (популяция терминально- дифференцированных Т-клеток) (Рис. 12). Проанализировав количество Т-клеток, экспрессирующих маркеры истощения PD-1 и TIGIT, мы установили, что на 14-й день для CAR T-клеток, стимулированных CD19-AV, процент TIGIT+ клеток был самым низким по сравнению с другими группами (Рис. 11,Г). Рисунок 11. Анализ популяционных и фенотипических изменений CD19-CAR T- клеток, вызванных стимуляцией CD19-AV. А – Анализ экспансии CAR T-клеток, подвергшихся воздействию различных стимулов активации. Статистический анализ проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Б - Оценка изменений соотношения CD4/CD8 в популяции клеток CD19-CAR-T, подвергшихся воздействию различных стимулов активации (фидеров, Dynabeads / IL-2, IL-2 или HeLa CD19). В - Анализ CD19- CAR-положительных клеток в субпопуляциях CD4 и CD8, измеренных с помощью проточной цитометрии на 4, 7 и 14 дни. Г - Анализ фракций клеток CD19-CAR, экспрессирующих маркеры истощения PD-1, CD57 и TIGIT среди CD3+ клеток, подвергшиеся воздействию тех же стимулов, что и в Б. А-Г Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение из трех экспериментальных повторов и представляют не менее двух независимых экспериментов. Статистический анализ проводили, используя дисперсионный анализ ANOVA. В то же время стимуляция IL-2 постепенно увеличивала долю TIGIT+. Стоит также отметить, что процент PD-1+ Т-клеток резко возрастал в образцах с фидерными клетками HeLa CD19. Совместная инкубация CAR T-клеток с IL-2 приводила к более сильной нежелательной активации CAR T-клеток по сравнению с CD19-AV и другими группами, что было заметно по увеличению уровня маркера CD57 (Рис. 11,Г). Рисунок 12. Количественная оценка изменения состояния дифференцировки клеток CD19- CAR в ответ на различные стимулирующие агенты: CD3/CD28 Dynabeads/IL-2, IL-2, CD19-AV или фидерные клетки HeLa CD19. Данные представлены как среднее значение трех независимых экспериментов. Стимуляция AV позитивно влияет на персистенцию и противоопухолевую активность CAR-T в ксенотрансплантационной мышиной модели лимфомы (B-ALL) Чтобы изучить функциональную активность in vivo CD19-CAR T-клеток, полученных с помощью стимуляции CD19-AV, был осуществлен эксперимент на мышах NSG с привитой лейкозной линей клеток человека Nalm-6 (Рис. 13). Для прижизненной визуализации роста опухоли и терапевтического эффекта CAR-T были созданы стабильные репортерные линии клеток Nalm-6, несущие ген люциферазы ffluc под контролем конститутивного промотора. На 6 день после введения мышам Nalm-6-ffluc клеток мышей случайным образом разделили на 3 группы: Mock-T (контрольные Т-клетки); CD19-CAR (CAR клетки, поученные классическим способом с IL-2); CD19-CAR&AVs (CD19-CAR Т клетки, обработанные CD19-AV). Через 14 дней в группах CD19-CAR и CD19-CAR&AVs наблюдалось полное подавление роста опухолевых клеток, что резко контрастировало с контрольной группой (Рис. 13,Б). Рисунок 13. Биолюминесцентная визуализация NSG мышей, которым ввели клетки лимфомы человека Nalm-6, синтезирующие люциферазу, а затем CD19-CAR T- клетки, предварительно стимулированные CD19-AV или IL-2. А - Мышам с развившейся опухолью на 6 день вводили равное количество контрольных Т-клеток (Mock- T) человека или CD19-CAR Т-клеток, которые размножили в присутствии либо IL-2, либо CD19-AV; Б - Опухолевая нагрузка по данным биолюминесцентной визуализации, измеренная с течением времени; Статистический анализ проводили с использованием t- критерия Стьюдента. В - Кривая выживаемости Каплана – Мейера. Статистическая значимость рассчитывали с использованием логарифмического рангового критерия Мантеля – Кокса. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (n=5). Однако, на 19-й день у мышей из группы CD19-CAR, начался рецидив опухоли, в то время как в группе CAR-T, стимулированными CD19-AV, сохранялась продолжительная ремиссия. Животные в группах, получавших CD19-CAR, показали равную выживаемость по сравнению с группой, получавшей контрольные Mock-Т (Рис. 13,В). Суммируя, можно сказать, что антигенные искусственные везикулы AV позволяют повысить эффективность CAR-T терапии in vivo. AAV-опосредованный перенос гена ДНКазой I в печень снижает рост метастазов колоректального рака в печени кДНК ДНКазы I человека, встроенную в плазмидный вектор на основе аденоассоциированного вируса AAV под контролем специфического для печени промотора, использовали для эктопической секреции этого фермента клетками гепатомы. Вирус AAV-ДНКаза I эффективно трансдуцировал клетки HepG2, что приводило к значительному увеличению активности ДНКазы I в супернатантах вплоть до 72 часов после трансдукции. Чтобы определить, может ли инъекция AAV-ДНКаза I ингибировать прогрессирование метастазов колоректального рака (colorectal cancer, CRC) в печень, мышам через воротную вену вводили клеточную линию рака толстой кишки MC38. Через четыре дня после инъекции клеток MC38 мышей однократно инъецировали 1,05×1012 копий генов AAV- ДНКаза I или AAV-null (в качестве отрицательного контроля) на мышь и наблюдали за ростом опухоли в течение 21 дня (Рис. 14,А). Биолюминесцентная визуализация опухоли показала, что развитие метастазов у мышей, обработанных AAV-ДНКаза I, было снижено по сравнению с мышами в группе, которым вводили AAV-null (Рис. 14,Б). Развитие плотных метастазов, вероятно, было снижено в результате ферментативной активности ДНКазы I, расщепляющей нити ДНК, содержащиеся в составе NET. Также было показано, что однократное введение AAV- ДНКазы I ингибировало прогрессирование метастазов в печень (у самцов и самок) по сравнению с мышами, получавшими AAV-null (Рис. 14,Д, Е). Введение AAV-ДНКаза I также значительно уменьшало количество метастатических узелков (Рис. 14,В, Г). Эти результаты дополнительно подтверждают, что обработка AAV-ДНКаза I ингибирует прогрессирование метастазов в печени в модели CRC. Рисунок 14. Анализ активности ДНКазы I in vivo на мышиной модели колоректального рака (перевиваемая клеточная линия MC38). А – характеристика эксперимента на мышах с временными точками. Б - Мышам с развившейся опухолью на 4 день вводили равное количество AAV-ДНКаза I либо AAV-null. В– Опухолевая нагрузка по данным биолюминесцентной визуализации, измеренная с течением времени в двух группах, пролеченных либо AAV-ДНКаза I либо AAV-null. Г – Изображения, характеризующие количество метастазов на 21 день после введения опухоли в группах мышей, пролеченных либо AAV-ДНКаза I, либо AAV-null. Д- Зависимость количества метастазов от пола мыши, измеренная с течением времени в двух группах, пролеченных либо AAV-ДНКаза I, либо AAV-null. Е - Зависимость отношения веса печени к весу тела от пола мыши, измеренная с течением времени в двух группах, пролеченных либо AAV- ДНКаза I либо AAV-null. AAV-опосредованный перенос гена ДНКазы I в печени позволяет активировать иммунный ответ в микроокружении опухоли Полученные результаты демонстрируют, что AAV-опосредованный перенос гена ДНКазы I в клетки печени может усилить врожденный иммунный ответ против опухоли. Однако, адаптивные иммунные клетки в TME играют не менее важную роль в борьбе с опухолью. Для анализа присутствия иммунных клеток в TME было проанализировано количество CD4+ и CD8+ Т-клеток в метастатической ткани с помощью иммуногистохимии (Рис. 15). По сравнению с группой, обработанной AAV-null, процент CD8+ Т-клеток в участке опухоли был значительно увеличен в группе AAV-ДНКаза I (Рис. 15,А). Следовательно, введение ДНКазы I позволяет облегчить проникновение CD8+ Т-клеток в опухоль. Однако, процент CD4+ Т-клеток в области метастазов у мышей, обработанных AAV-ДНКаза I, существенно не отличался от такового в группе, обработанной контрольным AAV-null (Рис. 15,Г). Рисунок 15. Анализ иммунных клеток в опухолях мышей, пролеченных либо AAV- ДНКаза I, либо AAV-null. А – Иммуногистохимия опухолей, окрашенных на CD45 Б - Иммуногистохимия опухолей, окрашенных на CD8 В – Цитофлуориметрический анализ клеток, выделенных из опухолевого микроокружения, на присутствие опухолеассоциированных нейтрофилов. Г - Иммуногистохимия опухолей, окрашенных на CD4. Аналогичные результаты по различающемуся процентному содержанию CD4+ и CD8+ Т-клеток в опухолевых тканях также были подтверждены методом проточной цитометрии. Доля CD8+ Т-клеток была значительно выше у мышей, обработанных AAV-ДНКаза I, по сравнению с мышами, обработанными AAV-null. В то время как, хоть и незначительно, доля CD4+ Т-клеток имела тенденцию к повышению у мышей, получавших AAV-ДНКаза I. Также, методом проточной цитометрии, было обнаружено, что ДНКаза I позволяет снизить количество опухолеассоциированных нейтрофилов в опухолевом микроокружении (Рис. 15,В). Эти результаты свидетельствуют о том, что AAV опосредованный перенос гена ДНКазы I индуцировал противоопухолевый иммунный ответ посредством модуляции как врожденных, так и адаптивных механизмов иммунитета. ВЫВОДЫ 1. Впервые подробно охарактеризовано взаимодействие опухолевых экзосом, выделенных из клеток лимфом и глиом, с CAR T-клетками и показано, что их влияние на активность CAR-T зависит от присутствия опухолевого антигена на поверхности экзосом. 2. Показано, что опухолевые экзосомы, выделенные из клеток лимфом и глиом могут как активировать, так и подавлять, функцию CAR T-клеток, влияя на цитотоксичность, секрецию воспалительных цитокинов, а также изменять профиль экспрессии генов CAR T-клеток. 3. Впервые разработан способ получения искусственных антигенных везикул, несущих опухолевый антиген для детекции химерного антигенного рецептора на поверхности Т клеток. Доказано, что эти везикулы можно с успехом применить для идентификации и выделения CAR-положительной популяции T-клеток. 4. Искусственные везикулы, специфично активируя CAR Т-клетки, позволяют получить CAR T-клеточный продукт с повышенной функциональной активностью in vitro и in vivo. 5. Использование ДНКазы I при терапии колоректального рака не только позволяет эффективно бороться с внеклеточными ловушками нейтрофилов, но и может восстановить иммунный ответ в микроокружении опухоли, обеспечив иммунный контроль над раковыми клетками, что приводит к ингибированию развития метастазов CRC в печени.