Кинетика и механизм радикальных реакций гидрофильных тиолов

Во Введении обоснована актуальность темы исследования; сформулированы цель и задачи
исследования; описана ее теоретическая и практическая значимость; представлены положения, выносимые на защиту; дана оценка научной новизны полученных результатов и личного вклада автора.
Глава 1 посвящена обзору литературы. Приведены основные сведения о теории жидкофазного окисления липидов, механизмах действия антиоксидантов разных типов. Изложены сведения о содержании тиолов в живых организмах и их физиологическом действии, взаимосвязи с различными заболеваниями; кратко рассмотрено применение тиолов в качестве БАДов и лекарственных средств. Представлены основные данные о физико-химических свойствах природных тиолов, кинетике и механизме реакций природных тиолов с активными формами кислорода.
В Главе 2 представлены материалы и методы, использованные при проведении исследований, описаны методики проведения экспериментов и методы анализа.
Объектами исследования служили биоантиоксиданты: водорастворимые тиолы (глутатион, гомоцистеин, цистеин, N-ацетилцистеин) и природные фенолы, содержащие ненасыщенную связь в боковой цепи (ресвератрол и кофейная кислота) (Рисунок 1).
Реакции биоантиоксидантов с пероксильными радикалами и с Н2О2 проводили, как правило, при 37±0,5оС в бидистиллированной и деионизированной воде (Direct-Q UV Millipore, 18 МОм × см), фосфатных буферах (PBS, натрий-калиевый фосфатный буфер, натриевый- и калиевый-фосфатные буферы), которые готовили с использованием деионизированной воды. pH растворов измеряли рН-метром-милливольтметром рН-410 «Аквилон». Ошибка в измерении рН составляла ± 0,02. Изменение концентрации тиолов в ходе реакции контролировали по методу Эллмана. В качестве источника пероксильных радикалов использовали водорастворимый азоинициатор ААРН (2,2′-азо-бис-(2-амидинопропан) дигидрохлорид).
Глутатион, GSH
Гомоцистеин, HSH Цистеин, CSH
N-Ацетилцистеин, ASH Ресвератрол, RVT Кофейная кислота, CА Рисунок 1. Структурные формулы тиолов и природных фенолов.
Подробно описан выбор в качестве акцептора радикалов анионного полиметинового красителя А (пиридиновая соль 3,3’-ди-Υ-сульфопропил-9-метилтиакарбо-цианинбетаина), концентрацию которого регистрировали спектрофотометрически (в водных растворах  = 0,77 × 105 (М × см)−1 при max = 546 нм). Этот краситель инертен по отношению к тиолам и пероксидам, а с пероксильными радикалами, образующимися в воде при распаде ААРН, реагирует с константой скорости, равной 5,4 × 104 (М × с)−1, и стехиометрическим коэффициентом f = 1 в воде и f = 2 в PBS при рН 7,4.
Представлены методы исследования: 1.Кинетическая спектрофотометрия для анализа скоростей расходования акцептора радикалов и фенолов с использованием Ultraspec 1100 Pro («Amershamplc», США) и «СФ-2000» (ООО «ОКБ Спектр», Россия). 2. Метод ЭПР с использованием спиновой ловушки DMPO (5,5-Диметилпирролин-N-оксид) на спектрометре Bruker EMX (Германия) для определения природы радикалов, образующихся при взаимодействии тиолов с Н2О2. 3. Масс-спектрометрия с электроспрейной ионизацией в режиме измерения положительных ионов для анализа молекулярных продуктов реакций на тандемном масс- спектрометре LTQ FT Ultra (ThermoFinnigan, Бремен, Германия). 4. Изотермическая калориметрия на приборе ДАК-1-1 (ООО ТД “Аналитические приборы”, Россия) для анализа кинетики тепловыделения в реакциях тиолов GSH и ASH с Н2О2. 5. Кинетическое компьютерное моделирование с использованием программы для ЭВМ «Кинетика 2012 – программа для расчета кинетических параметров химических и биохимических процессов» для разработки кинетических моделей взаимодействия GSH с Н2О2 и тиол-ен реакции GSH с RVT.
В Главах 3–5 представлены результаты исследований и их обсуждение.
Глава 3. Кинетические характеристики взаимодействия природных тиолов и фенолов с пероксильными радикалами
Оценку антирадикальной активности тиолов и ресвератрола проводили методом конкурирующих реакций с акцептором А.
На Рисунке 2 показано, что при постоянной скорости инициирования радикалов добавки глутатиона уменьшают скорость его расходования (кр. 2–4) и действуют как конкурирующий акцептор радикалов. Из анализа кинетической схемы расходования двух конкурирующих акцепторов радикалов А и тиолов или фенолов (Х), реагирующих с пероксильными радикалами, образующимися при распаде инициатора ААРН (Схема 1), следует уравнение (1), которое описывает зависимость скорости расходования красителя А от скорости инициирования и концентрации реагентов (А, Х).
На Рисунке 3 показано, что уменьшение скорости расходования А в присутствии тиолов и ресвератрола согласуется с уравнением (1). Из наклона линейных зависимостей, представленных

на Рисунке 3 (tg = (kX / kА) / Wi), рассчитаны константы скорости реакций с пероксильными радикалами kX = tg × kА × Wi, которые характеризуют тиолы, как ингибиторы умеренной силы. Наиболее высокую активность в ряду тиолов проявляет цистеин (Таблица 1).
(W) i
(kА) (kX)
D/D0
Схема 1
AAPHr•→ rO• 2
rO2• +AA•
rO2• +XrO2H+X• A• + A•  продукты X• + X•  продукты X• + A•  продукты X• + rO2•  продукты
[ ]
= [], (1)
WRVT / WA = (kRVT [RVT]) / (kA [A]), (2) f = Wi / WХ, где (Х = RVT, тиолы). (3)
10−8 /WA,M−1 ×c 5
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
12 38
2442
0.0 1 0
0 2 4 6 8 10
t, мин
Рисунок 2. Влияние добавок глутатиона на
скорость расходования 10 M акцептора A, инициированного 15 мМ ААРН; 37 оС;
[GSH], M: 1 – 0; 2 – 4; 3 – 10; 4 – 40.
0 1 2 3 4
[TSH] / [A]
Спектры поглощения ресвератрола (RVT) и акцептора А практически не перекрываются, поэтому при близких концентрациях RVT и А в присутствии ААРН наблюдается расходование обоих компонентов (Рисунок 4). Из анализа схемы 1 следует, что отношение скоростей расходования ресвератрола и А пропорционально отношению их концентраций (уравнение (2)). Примечательно, что значения констант скорости взаимодействия ресвератрола с rO2•, определенные по уравнениям (1) и (2) практически совпадают (1,1 × 105 и 1,06 × 105 М−1 × с−1, Рисунки 3 и 5, соответственно).
В Таблице 1 представлены оценки kX и f для изученных соединений по отношению к радикалам, образующимся при распаде ААРН в воде. По величине kX тиолы и ресвератрол можно отнести к ингибиторам средней силы.
Рисунок 3. Зависимость скорости расходования акцептора А (WА) от концентрации тиолов и ресвератрола: GSH (1), ASH (2), RVT (3) HSH (4) и CSH (5) в координатах уравнения (1); [AАРН] = 15 мМ.
1D 10 0,8 8 0,6 6 0,4 4 0,2 2
00 250 350 450 550
λ, нм
0 2 4 6
[RVT] / [A]
WRVT / WA
Рисунок 4. Изменение спектров поглощения Рисунок 5. Зависимость отношения скоростей раствора, содержащего 11 М акцептора А, расходования RVT и акцептора А (WА) от
11 М ресвератрола и 18 мМ ААРН во времени при 37 оС; спектры записаны через 1 мин.
отношения их концентраций в координатах уравнения (2).
Таблица 1. Кинетические характеристики антирадикальной активности тиолов и ресвератрола в воде при 37 оС.
Биоантиоксидант CSH HSH GSH RVT f1112
kx ×105,M−1×с−1 4,4±0,4 2,2±0,2 0,8±0,1 1,1±0,1
Глава 4. Кинетика и механизм взаимодействия глутатиона и других природных тиолов с пероксидом водорода
Глутатион (GSH) и другие природные тиолы гомоцистеин и цистеин достаточно активно взаимодействуют с радикалами и восстанавливают гидропероксиды. В живых организмах восстановление гидропероксидов и регенерация глутатиона происходят ферментативным путем с участием соответственно глутатионпероксидаз и глутатионредуктаз. Однако с пероксидом водорода тиолы (TSH) реагируют непосредственно. Известно и подтверждено многими авторами, что реакция восстановления Н2О2 без ферментов происходит в соответствии со стехиометрическим уравнением:
2TSH + H2O2  TSST + 2H2O. (4) Однако, несмотря на относительно простую стехиометрию реакция протекает по сложному механизму, скорость реакции зависит от соотношения концентраций GSH и H2O2. В деионизированной воде расходование тиолов сопровождается образованием свободных радикалов, сначала обнаруженных методом ингибиторов (Рисунок 6) и затем

идентифицированных методом ЭПР с использованием спиновой ловушки DMPO (Рисунок 7). На Рисунок 6а показано, что расходование акцептора радикалов А, инертного по отношению к тиолу и H2O2, наблюдается только при их совместном присутствии. Из Рисунка 6б следует, что реакционная способность тиолов в генерировании радикалов при взаимодействии с H2O2 изменяется в ряду: CSH < HSH  GSH. 1 2 3 Рисунок 6. а) Расходование 7 М А в присутствии: 1–5мМ GSH; 2–5мМ H2O2; 3–5мМ GSH с 5 мМ H2O2; б) Зависимость скорости расходования А от концентрации H2O2 в присутствии 5 мM тиолов: 1 – GSH; 2 – HSH; 3 – CSH; [А] = 10 M; водная среда, 37 oC. Рисунок 7. ЭПР DMPO, полученных в смеси GSH с H2O2: (1) сумма аддуктов; (2) с радикалом НО•; (3) с GS•; (4) модельный спектр с константами СТВ GS•. Для идентификации свободных радикалов, образующихся при взаимодействии GSH c Н2О2, был использован метод спиновой ловушки. На Рисунке 7 представлен экспериментальный спектр ЭПР (1), полученный в растворе, содержащем 21,1 мМ DMPO, 33 мМ GSH и 71 мМ H2O2 при рН6,2, который представляет собой суперпозицию сигналов двух разных нитроксильных радикалов. Один из них принадлежит спиновому аддукту с НО•-радикалом, спектр которого (2) с константами СТВ aN = 14,9 ± 0,1 Гс и aH = 15,0 ± 0,1 Гс был получен отдельно при УФ-облучении водного раствора, содержащего 10 мМ H2O2 и 13,3 мМ DMPO. Этот спектр был вычтен из суммарного ЭПР спектра (1). Спектр второго аддукта DMPO с радикалом (спектр 3) совпадает с модельным спектром (4) с константами СТВ нитроксильного радикала: aN = 15,2 ± 0,1 Гс и aH = 16,3 ± 0,1 Гс, которые соответствуют спиновому аддукту DMPO с тиильным радикалом глутатиона GS•, полученным рядом авторов при фотолизе дисульфида GSSG. Тиильные радикалы, образующиеся при взаимодействии GSH с H2O2, зарегистрированы впервые. Скорости расходования глутатиона и скорости инициирования радикалов нелинейно зависят от концентраций GSH и H2O2. Эмпирические зависимости начальной скорости расходования GSH 3480 3500 3520 Магнитное поле, Гс спектры спиновых аддуктов (WGSH) и скорости инициирования радикалов (Wi), от концентраций GSH и H2O2 при разных соотношениях (0,1 < [GSH]0 / [[H2O2]0 < 2,5) имеют вид: WGSH  const [GSH]00,3 [H2O2]01,2, где сonst = (1,7  0,2) × 10−3 М−0,5 × с−1, (5) Wi  const [GSH]00,75 [H2O2]00,75, где сonst = (1,3  0,2) × 10−5 М−0,5 × с−1. (6) Дробные, но разные порядки по концентрациям реагентов указывают на сложный Таблица 2. Скорости расходования GSH, образования радикалов и выход радикалов в реакции GSH с 8,6 мМ Н2О2 (водный раствор, 37 оС). многостадийный механизм процесса. Сопоставление скоростей расходования глутатиона и образования радикалов (уравнения (5), (6) и Таблица 2) при взаимодействии глутатиона с H2O2 показывает, что выход радикалов в этой [GSH], мМ 10,1 ± 1,0 5,4 ± 0,5 2,6 ± 0,3 WGSH × 106, М × с−1 1,9 ± 0,2 1,3 ± 0,1 0,9 ± 0,1 Wi × 109, e М × с−1 7,0 ± 0,7 0,004 5,4 ± 0,5 0,004 2,9 ± 0,3 0,003 реакции, равный е = Wi / WGSH, невелик и составляет доли процента от скорости расходования GSH (WGSH). Однако и небольшой скорости образования радикалов бывает достаточно для инициирования тиол-ен реакций тиолов с ненасыщенными соединениями. Тиол-ен реакция глутатиона с ресвератролом в присутствии пероксида водорода. Кинетическая модель В работе экспериментально исследованы кинетические закономерности взаимодействия GSH с ресвератролом (RVT) в присутствии Н2О2, методом масс-спектрометрии (MS электроспрей положительных ионов) изучен состав продуктов, образующихся в реакциях GSH с Н2О2 и с RVT. C учетом полученных данных о взаимодействии GSH и Н2О2, тиол-ен реакции GSH с RVT, а также имеющихся литературных данных о реакциях GSH, H2O2 и тиильных радикалов разработана кинетическая модель взаимодействия GSH и H2O2 и тиол-ен реакции с RVT, которая хорошо описывает особенности кинетики процесса в широком диапазоне концентраций реагентов в водной среде при физиологической температуре. Анализ состава продуктов, образующихся в реакциях GSH с H2O2 и с RVT (Рисунок 8) показал следующее: 1. В исходном растворе GSH присутствуют достаточно устойчивые димеры [GSH – GSH] (ионы МН+ 615,17). 2. Основным продуктом окисления GSH в реакции с Н2О2 в согласии с уравнением (4) является соответствующий дисульфид GSSG (MН+ 613,16). 3. В смеси GSH, RVT и Н2О2 в исходно деионизированной воде основные продукты – дисульфид GSSG (MН+ 613,16) и продукт МН+ 568,16, масса которого соответствует гидропероксиду (PO2H), который может получиться в результате последовательного присоединения тиильного радикала GS• и кислорода к RVT: GS• +RVTP•→ PO2• → PO2H+GS•. (7) Скорость расходования RVT (WRVT) линейно возрастает с ростом его начальной концентрации (Рисунок 9). Примечательно, что значения скоростей, отсекаемые линейными зависимостями WRVT – [RVT] на оси ординат, практически (в пределах ошибки) совпадают с расчетными значениями Wi по уравнению (6) для соответствующих концентраций GSH и H2O2. Скорость расходования RVT удовлетворительно описывается уравнением (8), характерным для цепных реакций окисления и полимеризации с квадратичным обрывом цепей на ведущих цепи радикалах: WRVT = Wi + а [RVT] Wi0,5. (8) Здесь параметр а  1,0 (М × с)−0.5 аналогичен отношению констант скорости реакций продолжения (kp) и обрыва цепей (kt) а = kp / (2kt). Рисунок 8. Масс-спектры исходного глутатиона (a), продуктов реакции 10 мМ GSH с 2 мМ Н2О2 (б) и продуктов, образующихся в смеси 2,3 мМ GSH, 1,3 мМ RVT и 3,2 мМ Н2О2 (в) в деионизированной воде. Рисунок 9. Зависимости скоростей расходования RVT (WRVT) от концентрации RVT в реакционной смеси 4,55 мМ Н2О2 с разными начальными концентрациями GSH (мМ): 1 – 10; 2 – 5; 3 – 2,5. 30 24 1 18 2 63 012345 [RVT] × 105, M Для анализа кинетики взаимодействия GSH с RVT в присутствии Н2О2 использовали компьютерное моделирование. Кинетическую модель (Таблица 3) для описания взаимодействия GSH с Н2О2 (реакции (I)–(X)) и инициированной образующимися радикалами тиол-ен реакцию GSH с RVT (реакции (XI)–(XIX)) разрабатывали с учетом полученных экспериментальных и имеющихся в литературе данных. Реакции (I)–(III) образования комплекса [GSH – Н2О2] и окисления его в дисульфид GSSG (хотя в масс-спектрах продуктов реакции (Рисунок 8б) не обнаруживается соответствующий комплексу ион MH+ 342) введены в модель, поскольку в литературе приводятся достаточно убедительные результаты спектроскопических (УФ и ИК) исследований и теоретического анализа образования комплексов [GSH – Н2О2] не только в буферных растворах с нейтральным и физиологическим рН, но и в чистой воде, когда образуется WRVT × 109, М × с−1 15 кислая реакционная смесь с рН 2. При конструировании модели было принято, что образование радикалов происходит, в основном, в реакции (VII) димера [GSH – GSH] с Н2О2, поскольку было установлено, что при рН  7, когда димеры не образуются, резко уменьшается вплоть до нуля скорость образования радикалов. Реакции (VII) и (VIII), в которых генерируются радикалы, практически не влияют на скорость расходования GSH (WGSH). Тиоловая группа –SH в комплексах с Н2О2 и димерах определяется реактивом Эллмана так же, как в свободном GSH. Величина Таблица 3. Кинетическая модель взаимодействия GSH с RVT в присутствии Н2О2 NoNo Реакции I GSH + H2O2 → [GSH – H2O2] II III IV GSH+GSH→[GSH–GSH] V VI VIII GSH+H2O2 →•OH+GS• +H2O IX •OH+GSH→H2O+GS• X GS•+GS•→GSSG XI GS• +RVT→P• XII P• →GS• +RVT XIII P• +GSH→GS• +PH XIV P•+(O2)→PO2• XV PO2•+GSH→POOH+GS• XVI GS• +PO2• →GSH+O2 XVII GSH+RVT→[GSH–RVT] XVIII [GSH – RVT] → GSH + RVT XIX [GSH–RVT]+GS• →P• +GSH Константы Значение скорости ki, (М × с)−1 k1 5 k2 k3 k4 1,3 k5 k6 VII • k7 2 × 10−5 k8 1 × 10−3 k9 1 × 106 k10 1 × 109 k11 2,5 × 105 k12 *1 × 104 k13 5 × 104 k14 **1 × 106 k15 5×103 k16 1×109 k17 5 k18 *2 × 10−4 k19 1 × 106 GS• [GSH – H2O2] + GSH  GSSG + 2H2O в водной среде при 37 оС. *4 × 10−3 [GSH – H2O2] → GSH + H2O2 6 × 10−2 *9 × 10−4 [GSH – GSH] → GSH + GSH 1,5 × 10−3 [GSH – GSH] + H2O2 → GSSG + 2H2O [GSH – GSH] + H2O2 → 2GS к двойной связи RVT; PO2• + 2H2O Примечание. P• – алкильный радикал, образующийся в результате присоединения тиильного радикала * Константа скорости имеет размерность с−1. и POOH – соответствующие пероксильный радикал и гидропероксид. **k14= k [O2] имеет размерность с–1; [O2] = 1 × 10−4 M. • к k10 = 109 (М × с)−1 известна для быстрой рекомбинации тиильных радикалов и была определена нами методом флеш-фотолиза дифенилдисульфида для рекомбинации фенилтиильных радикалов. Реакции (XI)–(XVI) имеют место при добавках RVT и вместе с остальными реакциями описывают кинетические кривые расходования RVT. Известно, что тиильные радикалы с высокими константами скорости обратимо ( 105 (М × с)−1) присоединяются к двойным –С=С– связям, поэтому в модель введены реакции (XI) и (XII). Образующийся в результате присоединения GS RVT алкильный радикал P• может прореагировать с GSH (k13  105–106 (М × с)−1) или с кислородом, поскольку опыты проводили в аэробных условиях (k14  109–1010 (М × с)−1). Расчеты по модели показывают, что в присутствии О2 доминирует квазистационарная концентрация пероксильных радикалов PO2•, и увеличивается содержание молекулярных продуктов присоединения тиильных радикалов к RVT. В литературе также отмечается определяющая роль О2 в изучении кинетики присоединения тиильных радикалов к олефинам методом флеш-фотолиза. Реакции (XVII)–(XIX) введены в модель, поскольку экспериментально обнаружено, что при сопоставимых по масштабу концентрациях глутатиона и ресвератрола вопреки ожиданиям, в присутствии RVT скорость расходования GSH не увеличивается за счет дополнительного расходования в цепной реакции с RVT, а уменьшается. Представленная кинетическая модель с оптимизированными константами скоростей вполне удовлетворительно описывает экспериментальные кинетические кривые расходования RVT и GSH в реакции GSH с RVT в присутствии Н2О2 и экспериментальные концентрационные зависимости для WRVT и WGSH. Дополнение модели обратимыми реакциями образования комплексов RVT с компонентами процесса (реакции (XVII)–(XIX)) позволило описать нетривиальный эффект заметного уменьшения скорости расходования GSH при повышенных концентрациях RVT. N-ацетилцистеин – тиильный аналог глутатиона в реакциях с активными метаболитами кислорода N-ацетилцистеин (ASH) - синтетический тиол, используется с конца 1980-х гг. в качестве муколитического и противовоспалительного лекарственного препарата, а также в условиях окислительного стресса при снижении уровня эндогенного глутатиона. Подобно реакциям окисления кислородом, окисление тиолов пероксидом водорода является экзотермическим процессом. На Рисунке 10 сопоставлены кинетические кривые тепловыделения при взаимодействии GSH и АSH с Н2О2, взятых в стехиометрических соотношениях реакции (4). Видно, что кинетические кривые тепловыделения (1,2) и удельных скоростей тепловыделения (1, 2) практически совпадают. Это указывает на относительную автономность связей S–H и S–S в тиолах и дисульфидах, на которые не оказывают влияния другие группы в молекуле. 1 2 1 17 В деионизированной воде и при рН  7 ASH в реакции Н2О2 подобно GSH и другим тиолам генерирует радикалы. На Рисунке 11 представлены экспериментальный спектр суммы аддуктов DMPO с радикалами НО• и AS• (1), полученный в растворе с pH 6,2, содержащем 36,9 мМ DMPO, 22 мМ АSH и 59,6 мМ Н2О2; спектр аддукта DMPO с АS• (2), полученный вычитанием спектра аддукта DMPO с НО• из суммарного спектра (1), и моделирующий спектр (3), совпадающий с (2), который выявил следующие константы СТВ нитроксильного радикала: aN = 15,2 ± 0,1 Гс и aH = 16,8 ± 0,1 Гс, которые характеризуют спиновый аддукт DMPO с захваченным АS• радикалом. 1 2 2000 t, мин 4000 3480 Рисунок 10. Кинетика тепловыделения в реакции Рисунок 11. ЭПР спектры спиновых аддуктов 4 2 2 4 3 Q, кал / г (W/[M])0 ґ 103, кал / (г ґ мин) ASH (1; 1’) и GSH (2; 2’) с Н2О2 в деионизованной воде при 37,7 оС; концентрации тиолов – 0,1 М, Н2О2 – 0,05 М. DMPO, полученных в смеси АSH с H2O2: (1) сумма аддуктов; (2) с АS•; (3) модельный спектр с константами СТВ АS•. Радикалы, образующиеся при взаимодействии ASH с Н2О2, могут инициировать цепные процессы. Было установлено, что ресвератрол не взаимодействует с ASH и Н2О2, взятых по отдельности, и расходование RVT наблюдается только при их совместном присутствии. Из Рисунка 12, на котором сопоставлены зависимости скорости расходования RVT от его концентрации в растворах ASH и GSH при одинаковой концентрации в присутствии 1,5 мМ Н2О2, видно, что для обоих тиолов WRVT линейно возрастает с ростом концентрации RVT в соответствии с уравнением (8). На оси ординат отсекаются отрезки, близкие по величине к скорости инициирования радикалов, измеренной методом ингибиторов по расходованию акцептора А (Таблица 4). Можно ожидать, что тиол-ен реакция N-ацетилцистеина с ресвератролом происходит, аналогично (7), в результате радикально-цепного последовательного присоединения тиильного радикала АS• и кислорода к RVT: АS• +RVTP’•→ P’O2• → P’O2H+АS•. _ __(9) 3500 3520 Магнитное поле, Гс 2,6 2,2 1,8 1,4 1,0 1 2 01234 [RVT] × 105, M Таблица 4. Кинетические характеристики расходования ресвератрола при взаимодействии с тиолами (2,5 мМ) в присутствии Н2О2 (1,5 мМ), водный раствор, 37 оС. GSH 3,28 ASH 3,31 1,4 0,8 1,2 0,75 Рисунок 12. Зависимости скорости расходования RVT (WRVT) от концентрации RVT в реакционной смеси 1,5 мМ Н2О2 с 2,5мМ тиола: 1 – GSH; 2 – ASH. Из Таблицы 4 видно, что значения параметра a, который, согласно уравнению (8), характеризует относительную активность ведущих цепи радикалов в продолжении и обрыве цепей, практически одинаковы для АSH и GSH. Это согласуется с измерениями тепловыделения в реакции с Н2О2 (Рисунок 10) и свидетельствует о том, что тиольные группы в АSH и GSH действуют автономно. Глава 5. Влияние рН и ионного состава среды на взаимодействие глутатиона с активными метаболитами кислорода В последнее десятилетие большое внимание уделяют сигнальной роли глутатиона (часто в сочетании с Н2О2) в регулировании окислительного стресса и организации ответа живых организмов на внешние воздействия. Молекула GSH содержит две карбоксильных группы c рКа 2,5 и 3,7. Поэтому в воде GSH образует кислые растворы (рН << 7), а в щелочных растворах миллимольная добавка глутатиона может смещать рН в кислую сторону. На Рисунке 13 показано, что скорости расходования GSH в реакции с Н2О2 увеличиваются, а скорости инициирования радикалов уменьшаются в фосфатных буферных растворах. При этом при введении GSH в воду рН уменьшается с 7 до 3,25, в фосфатно-солевом буфере PBS с 7,4 до 5,2, а в натрий-калиевом фосфатном буфере (PB) с 7,2 до 6,5. Фосфатные буферные растворы PBS и РВ при близких значениях рН сильно отличаются содержанием катионов К+ и Na+. На Рисунке 14 представлена нетривиальная зависимость начальной скорости расходования GSH в реакции с Н2О2 от рН реакционной смеси. Видно, что ближе к рН 7 скорость резко, более, чем на порядок, возрастает, и в области рН, близкой к физиологическим значениям рН 6,8–7,4, описывается экспоненциальной зависимостью (Рисунок 14б). Это означает, что при рН  7 Wi × 10−9, (М × с)−1 Тиол рН a, (М × с)−0,5 ± 0,02 ± 0,15 ± 0,08 ± 0,02 ± 0,15 ± 0,08 WRVT × 109, M × c−1 GSHGS− +H+, Ka = ([GS−] [H+]) / [GSH]0 − [GS−], [GS−] = Ka [GSH] / ([H+] + Ka). Подставляя выражение [GS−] из уравнения (13) в (11), получаем: _ (12) __ (13) Рисунок 13. Влияние фосфатных буферных Рисунок 14. а) Влияние рН на скорость растворов PBS и РВ на скорости расходования GSH и инициирования радикалов в реакции с H2O2 ([GSH] = 5 мМ; [H2O2] = 2 мМ). расходования 10 мМ GSH в реакции с 2 мМ Н2О2 в фосфатных буферных растворах; б) Зависимость lg WGSH от рН в диапазоне рН 6,8– 7,4. изменяется механизм процесса: расходование GSH определяется концентрацией тиолат-аниона и происходит в основном в реакциях: GSH+OH− GS− +H2O, GS− +H2O2 GSOH+OH−, GSOH + GSH  GSSG + H2O, k* (10) 2GSH + H2O2  GSSG + 2H2O. В этих реакциях, как и в кислой среде, образуются дисульфид и вода, но лимитирующей стадией является реакция тиолат-аниона (10): WGSH = 2WH2O2 = 2k* [GS−] [H2O2]. (11) Концентрация тиолат-аниона связана с концентрацией ионов водорода константой равновесия диссоциации глутатиона по связи S–H (Ка): WGSH = (2k* × Ka [GSH]0 [H2O2]) / ([H+] + Ka), т.е. в буферном растворе WGSH пропорциональна произведению концентраций глутатиона и пероксида водорода и зависит от концентрации Н+. Логарифмирование уравнения (14) приводит к логарифмической зависимости начальной скорости реакции GSH с H2O2 от рН в интервале физиологических значений рН 6,8–7,4, где Ka / ([H+] << 1 (15): (14) lg WGSH = lg (2k* × Ka) + lg ([GSH]0 [H2O2]0) – lg [H+] = const + pH, (15) где const = lg (2k* × Ka) + lg ([GSH]0 [H2O2]0). 5 4 3 2 1 2 3 4 0123 [RVT] × 105, M Рисунок 15. Зависимость скорости расходования RVT (WRVT) от концентрации RVT в реакции 10 мМ GSH с RVT в присутствии 2 мМ Н2О2 в 4 мМ растворах солей: 1 (■) – AChCl, 2 (●) – NaCl, 3 (▲) – деионизированная вода, 4 (♦) – KCl. Опираясь на детально изученную кинетику расходования RVT и GSH в присутствии H2O2 в бидистилляте и исходно деионизированной воде как на реперную, можно провести оценку влияния ионного состава среды, в частности влияния однозарядных биологически значимых катионов, на реакционную способность глутатиона в этих реакциях. В последние годы возобновился интерес к реакциям биологического связывания однозарядных катионов Li+, Na+, K+ и органических катионов, + производных холина (R4N ) с модельными соединениями и биологическими сайтами и влияния этих ионов на поведение тиильных радикалов. К производным холина относится важнейший нейромедиатор ацетилхолин (AСh+), играющий существенную роль в нервно-мышечной и когнитивной активности живых существ. На Рисунке 15 показано, что скорость расходования RVT (WRVT) в растворах разных солей в присутствии 10 мМ GSH и 2 мМ Н2О2 линейно возрастает с ростом концентрации RVT в соответствии с уравнением (8). В Таблице 5 представлены значения Wi и рН исходного раствора соли и рН реакционной смеси, показывающие, что 10 мМ GSH существенно подкисляют даже буферные растворы. Видно, что в 4 мМ растворах AChCl, NaCl, KCl и деионизированной воде величины Wi уменьшаются в ряду: ACh+ > Na+ > деионизированная вода > K+. __ _(16) Известно, что в органических средах ацетилхолин образует микроагрегаты с гидропероксидами и ускоряет их распад на радикалы. В водных растворах гидрофильный ACh+ не влияет на распад гидропероксидов. Участие ACh+ в увеличении скорости образования радикалов в
присутствии GSH и Н2О2 в водной среде обнаружено впервые.
На Рисунке 16 показано, что расходование в реакции с Н2О2 небольшой концентрации GSH,
при которой рН водного раствора близок к нейтральному, при добавке в раствор AChCl
WRVT × 109, M × c−1

21
ускоряется по сравнению с расходованием в чистой воде. В качестве рабочей гипотезы можно предположить, что АCh+ образует комплексы-микроагрегаты с GSH, в которых облегчается радикальный распад Н2О2, а GSH дополнительно расходуется в реакциях с образующимися радикалами.
Таблица 5. Кинетические характеристики расходования RVT в системе 10 мМ GSH и 2 мМ Н2О2 в присутствии 4 мМ хлоридов К+, Na+ и ACh+ и фосфатных буферных смесей, 37 оС.
а, (М × с)−0,5 1,9 0,9
2,4 0,8 3,4 0,75 5,4 0,1
00 00
Соль, 4мМ
КСl
Вода
NaCl
AChCl K-фосфатный буфер Na-фосфатный буфер
рН раствора
6,15 7,00 6,47 4,90 7,43 7,43
рН реакционной смеси
3,04 3,10 3,07 3,02 7,29 7,27
Wi × 109, М × c−1
10 8 6 4 2 0
1 2 3
0 50
t,мин 100
9
1 2
0 50 t,мин 100
Рисунок 16. Кинетические кривые расходования 0,1 мМ GSH при взаимодействии с 0,02 мМ Н2О2 в чистой воде (■1) и в 4 мМ водном растворе AChCl (●2), 37 оС.
Рисунок 17. Кинетические кривые расходования 0,1 мМ GSH при взаимодействии с 0,02 мМ Н2О2 в чистой воде (♦1) и в буферных растворах PBS (■2); Na-фосфатном буфере (▲3); K-фосфатном буфере (●4); 37 оС, рН 7,35.
На Рисунке 17 сопоставлено влияние фосфатных буферных систем PBS, Na-фосфатного и K- фосфатного буферов с одинаковыми значениями рН в реакционной смеси на скорость расходования такой же, как на Рисунке 16, небольшой концентрации GSH при взаимодействии с Н2О2, взятой в стехиометрическом соотношении 2 : 1. Видно, что в буферных растворах WGSH значительно больше, чем в деионизированной воде. Но несмотря на одинаковые рН 7,35, скорость расходования GSH увеличивается в ряду: вода  PBS  Na-фосф.  K-фосф. в соотношении 1 : 1,4 : 3,4 : 8,4. Ионы К+ специфически взаимодействуют с GSH: увеличивают скорость
[GSH] × 105, M
[GSH] × 105, M
окисления GSH пероксидом водорода, но при этом уменьшают выход радикалов в этой реакции по сравнению с другими катионами.
Заключение
В лаборатории жидкофазного окисления Института химической физики имени Н. Н. Семёнова РАН было обнаружено, что взаимодействие тиола меркаптоэтанола с гидропероксидами сопровождается выходом радикалов, которые приводят к ускорению окисления липидов в органической среде. Для того, чтобы выяснить имеет ли место выход радикалов при взаимодействии Н2О2 с глутатионом, известным, как основной эндогенный биоантиоксидант, кинетика этой реакции была изучена в чистой деионизированной воде с целью исключить влияние примесей переходных металлов и богатых водородом фосфатных ионов в буферных растворах. Образование радикалов было обнаружено, и скорости инициирования радикалов были измерены методом ингибиторов с использованием оригинального акцептора радикалов. Методом спиновой ловушки было показано образование именно тиильных радикалов в реакции глутатиона с Н2О2. Выход радикалов низкий (< 1%), однако достаточный для инициирования цепных тиол-ен реакций между GSH и ненасыщенными соединениями. Детально исследовано взаимодействие GSH с ресвератролом (RVT), растительным фенолом, имеющим ненасыщенную связь в боковом заместителе ароматического кольца, в присутствии Н2О2. Разработана кинетическая модель реакции GSH с Н2О2 и сопряженной тиол-ен реакции GSH с RVT в исходно деионизированной воде. Компьютерное моделирование на основе модели удовлетворительно описывает особенности кинетики процессов в широком диапазоне концентраций реагентов. Совокупность полученной кинетической информации может служить реперным (стандартным) кинетическим пакетом при изучении влияния компонентов водной среды на поведение тиолов в реакциях с активными метаболитами кислорода и разработке потенциальных лекарственных препаратов. Скорости потребления GSH (WGSH) и образования радикалов (Wi) в реакции GSH с Н2О2 чувствительны к значению рН и ионному составу среды. При pH7 WGSH увеличивается экспоненциально с ростом рН, а Wi резко уменьшается до 0. Поэтому организмы млекопитающих, в клетках и биологических жидкостях которых физиологическое значение рН выше 7,2, защищены от образования радикалов, а глутатион наилучшим образом проявляет антиоксидантные свойства. Однако обнаруженные реакции с участием глутатиона в нейтральной и кислой средах могут быть важны, например, для растений или при использовании глутатиона в виноделии, косметике или пищевых добавках. Системы на основе тиолов выполняют множество функций в клеточном окислительно-восстановительном метаболизме, антиоксидантной защите и передаче сигналов и, следовательно, могут предложить обширный и разнообразный ассортимент функций для применения в современной синтетической биологии. Количественная информация о реакционной способности тиолов в реакциях с АФК и влиянии компонентов среды на эти реакции является существенным вкладом в реализацию принципов проектирования систем, включающих тиолы. Основные результаты и выводы 1. Детально изучена кинетика и механизм радикальных реакций природных тиолов с пероксильными радикалами и Н2О2 в деионизированной воде; определены константы скорости реакций с пероксильными радикалами. 2. С использованием методов ингибиторов и ЭПР установлено образование свободных радикалов при взаимодействии тиолов (глутатиона, цистеина, гомоцистеина, N-ацетилцистеина) с Н2О2 в деионизированной воде; при рН > 7 радикалы не образуются.
3. Разработана кинетическая модель тиол-ен реакции глутатиона с фенолом, содержащим ненасыщенную связь в боковой цепи, ресвератролом в присутствии Н2О2 в деионизированной воде.
4. Установлена зависимость скорости реакций глутатиона и других тиолов с пероксильными радикалами и Н2О2 от рН: в фосфатных буферных растворах при рН7 увеличивается конкурентная активность тиолов (TSH) в реакциях с пероксильными радикалами; в диапазоне физиологических рН 6,8–7,4 скорость реакции ТSH с Н2О2 описывается экспоненциальной зависимостью lg WТSH = const + pH.
5. Обнаружено влияние катионов ацетилхолина (ACh+) и К+ на взаимодействие GSH и H2O2. Нейромедиатор ацетилхолин более чем в два раза увеличивает, а катионы К+, напротив, почти в полтора раза уменьшают скорость образования радикалов при взаимодействии GSH и Н2О2.
6.Синтетический тиол N-ацетилцистеин близок к природному тиолу глутатиону по кинетическим характеристикам в реакциях с активными формами кислорода в деионизированной воде и может рассматриваться как его кинетический аналог.
7.Предложен анионный полиметиновый краситель с установленными спектрально- кинетическими характеристиками для оценки антирадикальной активности водорастворимых антиоксидантов и измерения скоростей инициирования радикалов методом ингибиторов.