Клинико-лабораторная характеристика и особенности эритроцитов при хронических воспалительных заболеваниях кишечника

В исследование включены пациенты с воспалительными заболеваниями кишечника, находившиеся на обследовании и лечении в гастроэнтерологиче- ском отделении ЧУЗ «Клиническая больница «РЖД-Медицина» г. Новоси- бирск», кабинете воспалительных заболеваний кишечника в составе Городско- го бюджетного учреждения здравоохранения НСО «Городской инфекционной клинической больницы No1», в медицинском центре «Гастроцентр» в период с 2018 по 2020 годы.
Критерии включения в исследование: верифицированный согласно общепринятым критериям (Клинические рекомендации по диагностике и ле- чению болезни Крона у взрослых, 2020 г.; Язвенный колит. Клинические ре- комендации, 2020 г.) диагноз «болезнь Крона», «язвенный колит», «некласси- фицируемый колит»; подписание информированного согласия на участие в исследовании.
Критерии исключения: патология кишечника другого генеза, клиниче- ски значимая тяжелая сопутствующая патология в острой или стадии обостре- ния (хронические инфекционно-воспалительные заболевания, почечная недо- статочность, дыхательная недостаточность, печеночная недостаточность); известные активные онкологические заболевания; отказ от подписания согла- сия на участие в исследовании.
В обследование включено 110 пациентов с ВЗК в возрасте от 21 до 75 лет, средний возраст (37,7 ± 12,1) года, из них 59 женщин и 51 мужчина, в ста- дии обострения или ремиссии. Среди них – 50 пациентов с язвенным колитом, 41 – с болезнью Крона, 19 – с неклассифицируемым колитом. В последующем 36 пациентов были обследованы в динамике наблюдения через 6–12 месяцев (рис. 1).
Рисунок 1– Группы обследованных
Клинический анализ обследованной группы больных ВЗК проведен по форме, характеру и тяжести течения заболевания, локализации и распростра- ненности воспалительного процесса, эффективности базисной терапии.
В качестве группы контроля были отобраны лица, проходившие профи- лактическое обследование – 53 человека, сопоставимые с основными группами по возрасту, средний возраст (43,3 ± 11,7) года и полу (28 женщин и 25 муж- чин), ведущие здоровый образ жизни, употребляющие алкоголь не чаще 1– 2 раз в месяц в дозах не превышающих 20 г в сутки в пересчете на чистый этанол, без манифестирующей патологии внутренних органов.
Лабораторный блок обследования проводился в Лаборатории клиниче- ских биохимических и гормональных исследований терапевтических заболе- ваний (зав. лабораторией д-р биол. наук, доц. Каштанова Е. В.) НИИТПМ –
филиал ИЦиГ СО РАН.
Электрические и вязкоупругие характеристики эритроцитов методом ди-
электрофореза эритроцитов в неоднородном переменном электрическом поле (ДЭФ в НПЭП) исследованы на базе биохимической лаборатории (группа гемо- стаза) НИИ терапии и профилактической медицины – филиала ИЦиГ СО РАН (руководитель группы ст. науч. сотр., канд. мед. наук Громов А. А.) совместно с сотрудниками из Государственного научного центра вирусологии и биотехноло- гии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребите- лей и благополучия человека (Кольцово, Новосибирская область), Россия.
Методы исследования
1. Клинико-инструментальное обследование (данные анамнеза, фи- зикального обследования, лабораторных, инструментальных методов в соот- ветствии с клиническими показаниями).
Всем пациентам с ВЗК и обследуемым группы контроля выполнен общий анализ крови с использованием автоматического гематологического анализа- тора HTIMicroCC-20 Plus (HighTechnology, Inc, США), регистрационное удо- стоверение от 09.11.2017 NoФСЗ 2010/07756, свидетельство о поверке No 200566 от 11.03.2020; исследованы показатели обмена железа и маркеры
воспаления, что послужило основанием для выделения анемий различного гене- за у пациентов с ВЗК (в соответствии с рекомендациями ВОЗ, 2011 г.).
2. Исследование электрических и вязкоупругих параметров эритроцитов ме- тодом диэлектрофореза с помощью электрооптической системы детекции клеток. Для проведения исследования электрических и вязкоупругих показателей
методом диэлектрофореза кровь объемом 2 мл забирали вакутейнерами в 3,7 % цитратный буфер в соотношении 9:1, через 1 час 9,7–12 мкл крови вно- сили в 0,3 М раствор сахарозы (рН = 7,36) с коэффициентом k 0,9–1,1 : 29–31 и переносили суспензию исследуемых эритроцитов с концентрацией клеток 1,6–1,8.105 /мкл в измерительную кювету. Сразу после разведения эритроцитов производились измерения. В измерительной ячейке на клетки воздействовали неоднородным переменным электрическим полем со следующими параметра- ми: напряженность электрического поля 105 В/м, градиент напряженности электрического поля 1011 В/м2, частотный диапазон 5104–106 Гц. Изучение электрических и вязкоупругих характеристик эритроцитов проводили на четы- рех фиксированных частотах: 5104 Гц, 105 Гц, 5105 Гц и 106 Гц.
Оценивали средний диаметр (м), доли дискоцитов, сфероцитов, деформи- рованных клеток (%), характер поверхности (усл. ед.), поляризуемость клеток на разных частотах диапазона (м3), относительную поляризуемость (соотно- шение величины показателя на 106 Гц к 105 Гц), обобщенные показатели жест- кости (Н/м), вязкости (Па·с), электропроводность мембран (См/м), индексы деструкции (на разных частотах диапазона) (%) и агрегации (усл. ед.), ампли- туду деформации эритроцитов на частоте 106 Гц (м), степень деформации кле- ток на частоте 5×105 Гц ( %), емкость мембран эритроцитов (Ф), скорость дви- жения клеток к электродам (мкм/c), положение равновесной частоты (Гц), величину дипольного момента (Кл.м). Для распознавания образа клеток и ком- пьютерной обработки данных использовали пакет программ CELLFIND. Ошибка воспроизводимости метода составила 7–12 %. По методу аттестован государственный эталон единицы величины электрической поляризуемости биологических объектов 1-го разряда (удостоверение от 17.01.2017). Создана и аттестована референтная методика измерения амплитуды деформации эритро- цитов (ФГУП СНИИМ, 2017 г.). Зарегистрирована программа по обработке данных, полученных методом диэлектрофореза «Определение параметров эритроцитов с помощью неоднородного переменного электрического поля».
Статистическая обработка выполнена с использованием программы IBM SPSS Statistics (версия 26.0). Определялся характер распределения коли- чественных признаков методом Колмогорова – Смирнова. В случае нормаль- ного распределения вычислялось среднее значение (М) и стандартное откло- нение (SD) (M ± SD). При сравнении двух нормально распределенных выборок использовался t-тест Стъюдента. При отсутствии нормального распределения вычислялись медиана (Me), 25% и 75 % процентили, достоверность различия показателей оценивали с помощью непараметрических критериев (U-критерий Манна-Уитни, Краскела-Уоллиса). При сравнении показателей более, чем в двух группах, применена поправка Бонферрони. Во всех процедурах статисти- ческого анализа критический уровень значимости нулевой гипотезы (p) при- нимался равным 0,05.
Номинальные данные представлены в виде относительных частот объек- тов исследования (n, %), для оценки их различий использовался критерий χ2.
Cвязи между признаками оценивались вычислением коэффициента ли- нейной корреляции Пирсона, для интервальных и порядковых переменных, не подчиняющихся нормальному распределению, ранговым коэффициентом кор- реляции Спирмена.
Для определения свойств эритроцитов, являющихся предикторами обострения, проведена процедура нормализации уровней показателей. Для визуализации наблюдаемых отличий в уровнях параметров эритроцитов в ста- дии обострения и ремиссии, а также корреляций показателей красной крови использованы тепловые карты (Heatmap). Выявление различий между пара- метрами эритроцитов, ассоциированными с разными стадиями ВЗК, обеспечил дискриминантный анализ методом наименьших квадратов (Partial least squares- discriminant analysis – ortho PLS-DA). Для выявления электрических и вязко- упругих параметров эритроцитов, являющихся предикторами обострения, ис- пользованы парный (сопоставления уровней параметра одного пациента в ста- дии обострения и ремиссии) и непарный (сравнение уровней параметров всей группы больных в стадии обострения и ремиссии) t-тест и метод Volcano plot, кластерный анализ (K-means clustering) (система методов машинного обуче- ния–RandomForest) с применением программного обеспечения MATLAB (R2019a, Math Works) и языка программирования R [Breiman L., 2001]. Оценка диагностической точности показателей в качестве биомаркеров стадий заболе- вания, предикторов обострения произведена с помощью ROC-анализа.
Статистическая обработка материала проведена под руководством доцен- та кафедры вычислительной техники Новосибирского государственного тех- нического университета канд. техн. наук Яковиной И. Н., при консультирова- нии доцента канд. хим. наук Шестова А. А., Медицинский факультет Перель- мана, Университет Пенсильвании, Филадельфия, Пенсильвания (США).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Группы пациентов с разными вариантами ВЗК были сопоставимы по воз- расту, полу, индексу массы тела, статусу курения (табл. 1). Во всех группах преобладали пациенты со стажем заболевания более 2 лет, рецидивирующим течением средней степени тяжести с умеренной клинической, эндоскопиче- ской активностью. Большая часть пациентов находилась в стадии обостре- ния заболевания. Преимущественная локализация процесса в толстой кишке при БК определила актуальность дифференциальной диагностики ВЗК. Паци- енты с ЯК и БК оказались сопоставимы по проводимой терапии, в группе с НКК было меньшее число пациентов с применением иммуномодуляторов и кортикостероидов. Кроме того, пациенты с НКК отличались более коротким анамнезом и относительно более легким течением процесса, что, вероятно, и затрудняло нозологическую диагностику.
Исследование электрических и вязкоупругих параметров эритроци- тов у пациентов с ВЗК и лиц группы контроля
Эритроциты пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника достоверно отличались от группы контроля: более низкими значениями ам- плитуды деформации, скорости движения к электродам, поляризуемости на всех частотах и более высокими обобщенными показателями вязкости, жест- кости, индекса агрегации, относительной поляризуемости и повышенной
Таблица 1 – Клиническая характеристика пациентов с ВЗК и обследуемых группы контроля (M ± SD)
Группа Группа Группа Группа Показатели контроля пациентов пациентов пациентов
n=53(1) сЯКn=50(2) сБКn=41(3) сНККn=19(4) 12345
Возраст (лет)
Пол (мужчины/женщины) Курение, чел. (%)
Индекс массы тела (кг/м2) Длительность заболевания
0,5–2 года
более 2 лет
Степень тяжести заболевания
легкая средняя тяжелая
Характер течения заболевания острое
рецидивирующее
непрерывное Стадии
обострение
ремиссия Клиническая активность
минимальная умеренная высокая
Эндоскопическая активность минимальная
умеренная
высокая
Локализация процесса
дистальный колит левосторонний колит субтотальный колит
тотальный колит
толстая кишка (включая прямую) терминальный илеит илеоцекальный отдел
сочетанное поражение Стероидозависимость Стероидорезистентность Анемия
железодефицитная воспалительных заболеваний смешанного генеза
Терапия
Аминосалицилаты Иммуномодуляторы Кортикостероиды
Отсутствие терапии или лечение только препаратами 5-АСК на мо- мент обследования в стадии обострения
43,3 ± 11,7 25/28
4 (7,5) 21,9 ± 2,4
– –
– – –
– – –
– –
– – –
– – –
– – – – – – – – – –
– – –
– – – –
35,64 ± 11,03 21/29
5 (10) 20,9 ± 3,1
13 (26 %) 37 (74 %)
7 (14 %) 32 (64 %) 7 (14 %)
3(6 %) 43(86 %) 4(8 %)
42 (84 %) 8 (16 %)
15 (30 %) 32 (64 %) 3 (6 %)
8 (16 %) 31 (62 %) 11 (22 %)
17 (34 %) 17 (34 %) 3 (6 %) 13 (26 %) –
–
–
–
12 (24 %) –
32 (64 %) 1 (2 %) 6 (12 %)
48 (96 %) 24 (48 %) 27 (54 %) 22 (44 %)
38,64 ± 12,47 18/23
6 (14,6) 20,1 ± 3,9
9 (21,9 %) 32 (78,1 %)
7 (17,1 %) 26 (63,4 %) 8 (19,5 %)
3 (7,3 %) 38 (92,6 %) 4 (9,7 %)
34 (82,9 %) 7 (17,1 %)
10 (24,4 %) 26 (63,4 %) 4 (9,76 %)
8 (19,5 %) 24 (58,5 %) 9 (21,9 %)
–
–
–
–
27 (65,8 %) 9 (21,9 %) 2 (4,9 %)
3 (7,32 %) 10 (24,4 %) 3 (7,3 %)
– 27(65,85 %)* 4 (9,76 %)
37 (90,2 %) 20 (48,7 %) 21 (51,2 %) 20 (48,7 %)
44,6 ± 13,6 9/10
2 (10,5) 22,0 ± 4,1
9 (47,4 %)*^ 10 (52,6 %)*^
9 (47,4 %)*^ 9 (52,6 %) –
5 (26,3 %)*^ 14 (73,7 %)*^ –
11(57,9 %)*^ 8 (42,1 %)*^
13(68,4 %)*^ 5 (26,3 %)*^ 1 (5,3 %)
9 (47,4%)*^ 9 (47,4%)*^ 1 (5,3 %)*^
6 (31,6 %) 6 (31,6 %) 5 (26,3 %) 2 (10,5 %) –
– – – – –
2 (10,5 %)* –
–
16 (84,2 %) 4 (21,1 %)*^ 5 (26,3 %)*^ 10 (52,6 %)
П р и м е ч а н и е . * – достоверность различий от группы пациентов с язвенным колитом, p < 0,05; ^ – достоверность различий от группы пациентов с болезнью Крона, p < 0,05. Рисунок 2 – Уровни электрических и вязкоупругих параметров эритроцитов у пациентов с ВЗК и лиц группы контроля (M ± SD) склонностью к гемолизу клеток на высоких и низких частотах (p = 0,0001– 0,023) (рис. 2). Исследование электрических и вязкоупругих параметров эритроци- тов у пациентов с разными нозологическими формами ВЗК с учетом про- водимой терапии По данным литературы, проводимая терапия иммуномодуляторами, кор- тикостероидами оказывает выраженное влияние на состояние клеток красной крови [Shen B., 2009; Reinisch W., 2013; Lucendo A. J., 2020], в отличие от пре- паратов 5-АСК, существенно не меняющих свойств эритроцитов. Поэтому отдельно были проанализированы электрические и вязкоупругие параметры эритроцитов в группах пациентов, которые на момент обследования находи- лись в стадии обострения до начала терапии какими-либо препаратами или принимали только препараты 5-аминосалициловой кислоты (рис. 3). В группе пациентов с ЯК их оказалось 22 человека (44 %), с БК – 20 (48,7 %), с НКК 10 больных (52,6 %). Эритроциты пациентов с БК в стадии обострения отличались от эритро- цитов больных активным язвенным колитом сниженным количеством диско- цитарных форм (p = 0,013), с более высоким уровнем сфероцитарных (p = 0,009), деформированных клеток (p = 0,002), с измененным характером поверхности (p = 0,018), с меньшей способностью к деформации на высоких частотах (на частоте 106 Гц (p = 0,005) и на (0,5 × 106 Гц) (p = 0,004)), с боль- шими значениями обобщенных вязкости (p = 0,003) и жесткости клеток (p = 0,017). Клетки красной крови пациентов с БК в стадии обострения прояв- ляли большую тенденцию к образованию агрегатов (p = 0,06) и гемолизу на разных частотах электрического поля (p = 0,072), чем при активном ЯК. Паци- енты с БК в стадии обострения имели более низкие уровни поляризуемости на высокой частоте 0,5 × 106 Гц (p = 0,017) и низкой частоте 0,05 × 106 Гц (p = 0,099)), а также относительной поляризуемости (p = 0,019). Эритроциты пациентов с БК в стадии обострения имели достоверно более низкие уровни скорости поступательного движения к электродам (p < 0,001), дипольного мо- мента (p < 0,0001) и емкости мембран(p < 0,0001), чем эти показатели при ак- тивном ЯК. Кроме того, при активной БК в сравнении с активным ЯК уровень электропроводности оказался значительно выше (p < 0,0001), а равновесная частота – резко сдвинутой в высокочастотный диапазон (p < 0,001) (рис. 3). При этом по степени тяжести заболевания и активности обострения группа больных БК от пациентов с ЯК не отличалась. Эритроциты пациентов с активным НКК по уровню ряда параметров (от- носительная поляризуемость, электропроводность, емкость мембран, положе- ние равновесной частоты) занимали промежуточное положение между тако- выми у больных с ЯК и БК. Значения целого перечня показателей эритроцитов оказались близкими к таковым при активной болезни Крона, отличаясь от ЯК, это – средний диаметр клеток, доля дискоцитов, сфероцитарных (p = 0,038), деформированных форм (p = 0,026), характер поверхности клеток, амплитуда деформации клеток на высоких частотах (p < 0,01), обобщенные показатели вязкости (p < 0,01), жесткости (p = 0,033), индекс агрегации, величина диполь- ного момента (p = 0,002) и скорость движения к электродам (p < 0,00001). Рисунок 3 – Уровни электрических и вязкоупругих параметров эритроцитов у пациентов с разными нозологическими формами ВЗК в стадии обострении 14 Вместе с тем, поляризуемость на частоте 106 Гц у пациентов с активным НКК имела тенденцию к снижению по сравнению с ее уровнем при активных ЯК и БК, а на низких частотах она оказалась выше, чем в других группах с ВЗК. Клетки красной крови у больных с НКК в обострении оказались менее склон- ны к гемолизу, чем в других группах, хотя без уровня достоверности. Поскольку одна из возможных причин наблюдаемых различий в обследу- емых группах – наличие анемий различного генеза, данный аспект был про- анализирован отдельно в данных подгруппах (табл. 2). Критерий ANOVA между группами по наличию анемий разного генеза свидетельствовал о наличии достоверных различий по данному показателю – F 3,392; (р = 0,049); хи-квадрат 15,187; (p < 0,01). Из данных таблицы следует, что у большей части пациентов с активным ЯК (11 человек, 50 %) выявлена железодефицитная анемия, в группе больных с активной болезнью Крона преобладала анемия воспалительных заболеваний (в 13 случаях, что составило 65 % от числа всех пациентов в группе), что со- гласуется с рядом исследований [Wells C. W., 2006; Gisbert J. P., 2009; Rejler M., 2012; Reinisch W., 2013; Testa A., 2016]. Корреляционный анализ выявил прямые связи доли дискоцитарных форм, амплитуды деформации, поляризуемости, скорости движения к элек- тродам, величины дипольного момента с количеством эритроцитов, уровнем гемоглобина, цветовым показателем, гематокритом, MCV, MCH, MCHC, уровнем железа сыворотки, трансферрином, коэффициентом насыщения трансферрина железом и альбумином. В то же время, те же вязкоупругие ха- рактеристики эритроцитов отрицательно коррелировали с маркерами воспале- ния. Причем сила и достоверность связей наиболее ярко проявлялись в группе с БК. Для уровня ферритина обратные ассоциации с амплитудой деформации (r = –0,255, p < 0,05), с емкостью мембран (r = –0,421; p < 0,006), скоростью поступательного движения клеток к электродам (r = –0,311; p < 0,05), величи- ной дипольного момента (r = –0,302; p < 0,02) и прямые – с положением рав- новесной частоты (r = 0,361; p < 0,007) выявлены лишь у пациентов с БК. Уро- вень ферритина в общей группе обратно коррелировал с жесткостью клеток (r = –0,154; p < 0,047); электропроводностью (r = –0,232; p < 0,007). А в под- группе с БК связи между показателями оказались прямыми – (r = 0,325; p < 0,023) для жесткости;( r = 0,365; p < 0,004) для электропроводности. По- добная разнонаправленность, вероятно, обусловлена различной ролью этого белка при разных нозологических формах ВЗК (низкий уровень ферритина - Таблица 2 – Анемии различного генеза у пациентов с ВЗК в стадии обострения (до начала терапии или на фоне терапии препаратами 5-АСК) Группа пациентов с ЯК, обострение n = 22 (2) Группа пациентов с БК, обострение n = 20 (3) Группа пациентов с НКК, обострение n = 10 (4) Показатели Анемия, n (%) Железодефицитная анемия, n (%) Анемия воспалительных заболеваний, n (%) Анемия смешанного генеза, n (%) 14 (63,6 %) 11 (50%) — 3 (13,6 %) 15 15 (75 %) 1 (5%) 13 (65 %) 1 (5 %) 1 (10 %) 1 (10 %) — — Всего 30 (57,7 %) 13 (25 %) 13 (25 %) 4 (7,7 %) показатель дефицита железа при ЖДА у больных ЯК и высокий уровень - мар- кер активности воспаления при анемии воспалительных заболеваний у паци- ентов с БК). Более высокие уровни маркеров воспаления при активной БК – феррити- на, СРБ, фибриногена, СОЭ, количества лейкоцитов, вероятно, оказались зна- чимыми факторами для электрических и вязкоупругих параметров эритроци- тов, что подтверждает сила и степень достоверности выявленных корреляций. Преобладание эритроцитов со сниженными размерами, повышенной ем- костью мембран у больных ЯК косвенно может отражать активацию эритро- поэза. Возникающий при напряженном эритропоэзе ускоренный ритм клеточ- ного деления сопровождается нарушениями во всех звеньях аппарата синтеза белков (в том числе гемоглобина, белков мембраны и цитоскелета клетки), что приводит к появлению функционально неполноценных клеток с редуцирован- ным метаболизмом [Shiffman F. D., 2000; Murav'yev A. V., 2016]. Исследование электрических и вязкоупругих параметров эритроци- тов у пациентов с разными стадиями ВЗК При исследовании электрических и вязкоупругих параметров эритроци- тов у пациентов с ВЗК (без учета нозологической формы заболевания) в ак- тивной и неактивной стадии (рис. 4) обнаружено, что в стадии обострения пациенты имели клетки красной крови меньшего диаметра, с меньшей долей дискоцитов, большей – сфероцитов, деформированных клеток с измененным характером поверхности, чем у лиц группы контроля и больных в стадии ре- Рисунок 4 – Уровни электрических и вязкоупругих параметров эритроцитов у пациентов с разными стадиями ВЗК 16 миссии (p < 0,0001). С высокой достоверностью в активной стадии ВЗК эрит- роциты отличались сниженной способностью к деформации, более высокими значениями обобщенной вязкости и жесткости по сравнению с группой кон- троля и пациентами в неактивной стадии (p < 0,00001–0,0001). Индексы агрегации, деструкции в стадии обострения ВЗК имели тенден- цию к повышению, но уровня достоверности различия не достигали. Поляри- зуемость на всех частотах у пациентов с активными ВЗК оказалась ниже пока- зателей в неактивной фазе и в контроле, при этом на частоте 106 Гц различия между группами оказались высоко достоверными (p < 0,00001–0,0001). Стадия обострения у пациентов с ВЗК ассоциирована с более высокими уровнями электропроводности мембран эритроцитов и более низкими показателями ско- рости движения к электродам, дипольного момента, емкости по сравнению с группой контроля и пациентами в стадии ремиссии (p < 0,00001). Равновесная частота оказалась резко сдвинутой в высокочастотный диапазон при активных ВЗК по сравнению с неактивными (p = 0,0039). Выявленные различия в параметрах эритроцитов у пациентов с ВЗК в стадии обострения и ремиссии, вероятно, обусловлены влиянием маркеров воспаления – выявлены обратные корреляции амплитуды деформации эритро- цитов с уровнями С-реактивного белка, фибриногена; электропроводности мембран – с уровнем ферритина. Обобщенный показатель жесткости прямо коррелировал с СОЭ, емкость клеточной мембраны – с коэффициентом насы- щения трансферрина железом; величина дипольного момента прямо ассоции- рована со средним корпускулярным объемом эритроцитов (рис. 5). Возможности использования параметров эритроцитов для оценки степени воспаления определяются тесной связью свойств клеток красной крови с марке- рами воспаления [Lippi G., 2009]. Известно, что эритроциты способны адсорби- ровать на своей поверхности крупномолекулярные белки (включая фибиноген, Рисунок 5 – Корреляция электрических и вязкоупругих показателей эритроцитов с маркерами воспаления, показателями обмена железа 17 С-реактивный белок, иммуноглобулины классов А, М и G), что приводит к су- щественной модификации структуры их мембран [Новицкий В.В., 2004]. С од- ной стороны, это значительно изменяет поверхностный заряд клеток, «экрани- руя».нейраминовые кислоты, связанные с его величиной. Это сказывается на скорости движения эритроцитов к электродам, величине дипольного момента, которые в большей степени снижены у пациентов с активными ВЗК. Снижение поверхностного заряда эритроцитов приводит к повышенной склонности к обра- зованию клеточных агрегатов, что наблюдалось у пациентов с обострением ВЗК. Уменьшение потенциала на мембране эритроцита приводит к нарушению взаи- модействия между ее компонентами (фосфолипидами, эфирами холестерина, триглицеридами), усиливая процессы перекисного окисления [Shiffman F. D., 2000; Новицкий В.В., 2004]. Следствием этого является повышенная способ- ность мембран проводить электрический ток. С другой стороны, крупномолеку- лярные белки влияют на толщину мембран эритроцитов, сказываясь на уровне емкости. Резкое снижение ее отмечено именно у пациентов с активными ВЗК по сравнению с неактивными и группой контроля. Хроническое воспаление у пациентов с ВЗК вследствие воздействия цито- кинов, а именно: интерлейкина-1, интерлейкина-6, фактора некроза опухоли- альфа, интерферона гамма – может привести к нарушению выработки эритропоэ- тина, изменению продолжительности жизни эритроцитов, снижению чувстви- тельности костного мозга к эритропоэтину и нарушению метаболизма железа, нарушению нормального процесса кроветворения [Weiss G., 2005; Price E.A., 2010]. Вероятно, влияние провоспалительных цитокинов на поляризуемость кле- ток [Borish L. C., 2003], которая определяет адаптационные возможности эритро- цитов [Генералов В.М., 2011]. Значительное снижение этого показателя на всех частотах электрического поля у пациентов с ВЗК в стадии обострения по сравне- нию с ремиссией приводит к избыточному гемолизу эритроцитов. У лиц группы контроля, пациентов с разными стадиями ВЗК были определе- ны значения биомаркера кишечного воспаления фекального кальпротектина:в контрольной группе его величины находились в пределах от 2 до 50 мкг/г, в стадии обострения ВЗК – более 200 мкг/г, в стадии ремиссии ВЗК – от 51 до 200 мкг/г. Описание способа диагностики активности воспалительных заболе- ваний кишечника на базе комплексного использования электрических и вязкоупругих параметров эритроцитов и уровня фекального кальпротектина Из перечня электрических и вязкоупругих показателей эритроцитов определены восемь параметров, которые обеспечили разделение между груп- пами «активное ВЗК», «ремиссия ВЗК», «контроль», определены их диффе- ренцирующие значения (табл. 3). После определения восьми наиболее информативных параметров эритро- цитов и уровня фекального кальпротектина у конкретного пациента нужно их сравнить с соответствующими дифференцирующими значениями. При попа- дании более 60 % параметров в диапазон показателей конкретной группы (контроль, обострение ВЗК, ремиссия ВЗК), указанных в табл. 3, с высокой диагностической точностью можно сделать вывод об обострении ВЗК, ремис- сии ВЗК или отсутствии ВЗК. Таблица 3 – Дифференцирующие значения электрических и вязкоупругих па- раметров эритроцитов, фекального кальпротектина для пациентов с ВЗК с разными стадиями заболевания и лиц группы контроля 7,5·10–6 ÷ 7,7·10–6 6,7 ÷ 8,8 6,3·10–15 ÷ 7,5·10–15 4,6·105 ÷ 5,6·105 4,6·10–5 ÷ 5,1·10–5 0,50 ÷ 0,64 5,6·10–6 ÷ 9,1·10–6 7,5·10–6 ÷ 8,8·10–6 7,1·10–6 ÷ 7,3·10–6 2,8 ÷ 3,9 3,4·10–15 ÷ 4,0·10–15 9,7·105 ÷ 12,8·105 6,9·10–5 ÷ 8,9·10–5 0,73 ÷ 0,77 9,5·10–6 ÷ 10,0·10–6 5,6·10–6 ÷ 6,3·10–6 Группа контроля Группа паци- ентов с ак- тивными ВЗК Группа паци- 7,3·10–6 ентовснеак- ÷ –6 тивнымиВЗК 7,5·10 2 ÷ 50 Более 200 4,6 5,1·10–15 ÷ ÷ –15 5,6 5,7·10 3,9·105 ÷ 5 4,2·10 5,1·10–5 ÷ 6,9·10–5 0,67 8,3·10–6 ÷ ÷ –6 0,71 9,1·10 6,3·10–6 ÷ 51 Диагностическая эффективность предлагаемого малоинвазивного способа определения активности ВЗК и его пригодность для практического применения подтверждена сравнением с результатами биохимических, инструментальных исследований, проведенных у пациентов с ВЗК. По формулам, приведенным в [Гринхальд Т., 2006], были получены сле- дующие показатели диагностической эф- фективности: чувствительность заявленно- го способа составила 91,9 %, специфич- ность – 93,1 %, показатель прогностиче- ской ценности «+» результата (т. е. выяв- ление случаев с активными ВЗК) – 96,6 %, показатель прогностической ценности «-» результата – 84,3 %, индекс точности со- ставил 92,3 %. Таким образом, данный малоинвазивный способ эффективен и пригоден в определении активности воспа- лительных заболеваний кишечника. По предложенному способу был оформлен патент на изобретение, 26.03.2021 из ФИПС получен документ о Рисунок 6 – ROC-анализ при исполь- приоритете заявки. Проведение ROC-анализа с целью оценки диагностической точности разли- чения активного ВЗК от стадии ремиссии при использовании только электрических и вязкоупругих параметров эритроцитов позволило получить AUC – 0,834, чув- зовании только уровней фекального кальпротектина (кривая 1), только электрических и вязкоупругих пара- метров эритроцитов (кривая 2), со- четания параметров эритроцитов и фекального кальпротектина (кривая 3) в различении активного ВЗК от стадии ремиссии заболевания 7,1·10–6 ÷ 200 Группы Средний диаметр эритроцита х1 (Dср), м Скорость поступа- тельного движения клетки в эл. поле х2 мкм/с Поляризуемость (кл) на частоте 106 Гц, х3, м3 Равновесная часто- та х4 (fр), Гц Электропровод- ность х5 (), См/м Обобщенный пока- затель вязкости х6 (ηкл), Па∙с Обобщенный пока- затель жесткости х7 (cкл), Н/м Амплитуда дефор- мации х8 (A), м Фекальный каль- протектин x9, мкг/г ствительность – 82 %, специфичность – 78 %. При использовании только уровня фекального кальпротектина (cut-off более 50 мкг/г) AUC составила 0,871 с чувствительностью 87 %, специфичностью 83 % (рис. 6). Полученные результаты демонстрируют преимущество по диагностической точности сово- купного использования электрических, вязкоупругих параметров эритроцитов и уровня фекального кальпротектина в различении стадий ВЗК (AUC – 0,927). Параметры эритроцитов как прогностические маркеры течения воспалительных заболеваний кишечника У 36 пациентов с ВЗК (23 – с язвенным колитом, 8 – с болезнью Крона, 5 – с НКК) исследование электрических и вязкоупругих параметров эритроцитов проведено дважды в ходе динамического наблюдения за пациентами в течение 6–12 месяцев. У 13 пациентов отмечено сохранение активного заболевания в течение данного периода, в 23 случаях выявлено наступление ремиссии у паци- ентов, находившихся при первом обследовании в стадии обострения. Из 23 пациентов, вошедших в ремиссию ВЗК, средний возраст (37,9 ± 4,3) года, оказалось 10 пациентов с язвенным колитом, 9 – с болезнью Крона, 4 – с неклассифицируемым колитом. Первое исследование электриче- ских и вязкоупругих показателей эритроцитов проведено в стадии обострения до начала терапии. У всех пациентов с ВЗК диагностировано поражение тол- стой кишки. Преобладали пациенты с рецидивирующим течением заболева- ния, средняя продолжительность заболевания в группе составила (5,1 ± 3,6) года. По тяжести заболевания преобладали пациенты со среднетяжелым тече- нием – 17 человек (73,9 %) и легким течением (6 пациентов – 23,1 %). При оценке тяжести настоящей атаки, согласно индексу Мейо, у 4 пациентов (17,4 %) (по два пациента с ЯК и НКК) сумма баллов находилась в пределах 3– 5, что соответствовало легкой атаке; у большей части больных с ЯК и НКК – десяти человек (43,5 %) индекс находился в пределах от 6 до 9 баллов (сред- нетяжелая атака). При оценке индекса активности болезни Крона – индекса Беста пациенты в стадии обострения имели средние значения показателя, со- ставляющие (173,2 ± 28,5) балла, что соответствовало легкой атаке. Второе исследование параметров эритроцитов у пациентов с ВЗК прове- дено через 6–12 месяцев. К моменту второго обследования индекс Мейо у пациентов с ЯК и НКК не превышал 2 баллов, у больных с БК индекс Беста составил (135 ± 6,5) балла, что соответствовало ремиссии. После проведенных в динамике исследований параметров эритроцитов наблюдение за пациентами с ВЗК продолжалось еще в течение последующих 6– 12 месяцев с целью оценки сохранения ремиссии или наступления обострения. Для установления параметров эритроцитов, претендующих на роль пре- дикторов обострения, у пациентов, обследованных в динамике с трендом «обострение → ремиссия», были определены показатели, обеспечивающие наибольшее различение стадий заболевания как для каждого пациента (обострение против ремиссии) – парные методы статистического анализа, так и для групп пациентов (группа в стадии обострения против группы в стадии ремиссии) – непарные методы статистики (t-test). Использование метода Vol- cano plot (парный и непарный) обеспечило выявление параметров эритроци- тов, претендующих на роль биомаркеров предикции обострения. Проведенный анализ с использованием t-test (парный и непарный) вы- явил 8 показателей, потенциальных биомаркеров предикции обострения, при пользовании парным методом и 11 параметров – при использовании непарного подхода (рис. 7). На первом этапе к числу наиболее значимых параметров предикции были отнесены доля деформированных клеток, обобщенные показатели вязкости и жесткости, амплитуда деформации клеток на частоте 106 Гц. Применение метода Volcano plot (парная статистика) на втором этапе вы- явило пять вязкоупругих показателей, претендующих на роль маркеров пре- дикции обострения – доля деформированных клеток, характер поверхности клеток, электропроводность, дипольный момент и скорость поступательного движения клеток к электродам (рис. 8, табл. 4). Применение метода Volcano plot (непарная статистика) для выявления маркеров предикции обострения позволило выявить ряд совпадающих с ре- зультатами парной статистики и ряд дополнительных значимых параметров эритроцитов (рис. 8, табл. 4). Данные парной и непарной статистики при использовании метода Volca- no plot совпали по перечню параметров эритроцитов – доля деформированных клеток, величина дипольного момента, электропроводность мембран, скорость поступательного движения эритроцитов к электродам, характер поверхности клеток. Вместе с тем, непарная статистика позволила выявить еще два значи- мых показателя эритроцитов, претендующих на роль предикторов обостре- ния – степень изменения амплитуды деформации на частоте (5 × 105) Гц Рисунок 7 – t-test (парный и непарный) для выявления предикторов обострения среди электрических и вязкоупругих параметров эритроцитов и уровни некоторых из них в форме диаграмм размаха у пациентов с ВЗК, обследованных в динамике Красные столбики – уровни показателей в стадии обострения; зеленые – в стадии ремиссии; в диаграммах размаха («ящик с усами») границами ящика служат первый и третий квартили, линия в середине ящика – медиана. Рисунок 8 – Применение метода Volcano plot (парная и непарная статистика) при анали- зе электрических и вязкоупругих показателей эритроцитов, претендующих на роль мар- керов предикции обострения, и уровни некоторых из них в форме диаграмм размаха у пациентов с ВЗК, обследованных в динамике. Volcano диаграмма состоит из отрица- тельного логарифма статистически значимого различия на Y оси (по основанию 10). Эти точки на диаграмме с низким значением p-value стремятся вверх. Ось-X – логарифм различий между двумя значениями. Логарифм различий показывает отличия равноуда- лённо в оба направления от центра Красные столбики – уровни показателей в стадии обострения; зеленые – в стадии ремиссии. (p = 0,0098) и емкость мембран эритроцитов (p = 0,029). Возможности корректного различения электрических и вязкоупругих па- раметров эритроцитов при применении парной статистики модифицирован- ным методом главных компонентов (ortho PLS-DA) представлены на рис. 9. Для проверки предиктивных возможностей установленных параметров эритроцитов (доля деформированных клеток, доля клеток с измененным ха- рактером поверхности, электропроводность мембран, дипольный момент, ско- рость поступательного движения эритроцитов к электродам, степень измене- ния амплитуды деформации на частоте (5 × 105) Гц, и емкость мембран эрит- роцитов) они были проанализированы у 36 пациентов с ВЗК, находившихся в стадии ремиссии в момент первого обследования. Средний возраст Таблица 4 – Электрические и вязкоупругие параметры эритроцитов – потенци- альные предикторы обострения, исследованные методом Volcano plot (парная и непарная статистика), у пациентов с ВЗК, обследованных в динамике Электрические и вязкоупругие параметры эритроцитов Кратность изменений log2(FC) Значения «р» (raw.p val) 0,000442 0,000125 0,006872 0,011436 0,009948 0,001918 0,011346 0,001572 0,013671 0,005699 0,00988 0,029885 −log10(p) 3,3546 3,9046 2,1629 1,9417 2,0023 2,7171 1,9451 2,8037 1,8642 2,2442 2,0052 1,5245 Доля деформированных клеток, % Характер поверхности клеток, услов. коэффициент Электропроводность, См/м Дипольный момент, Кл/м Скорость движения эритроцитов к электродам, мкм/с Степень изменения амплитуды дефор- мации на частоте 0,5 × 106 Гц, % Емкость клеточной мембраны, Ф (FC) парный 0,50977 непарный 0,53491 парный 0,70711 непарный 0,7000 парный 0,77197 непарный 0,76876 парный 1,4839 непарный 1,4503 парный 1,4064 непарный 1,3684 непарный 1,2598 непарный 1,718 −0,97208 −0,90262 −0,5 −0,51457 −0,37338 −0,37939 0,56943 0,53632 0,49202 0,45251 0,33315 0,78076 пациентов был (38,1±5,7)года, ста- дия ремиссии длилась от 6 до 12 ме- сяцев. Из них 13 пациентов с ЯК, 10 – с БК, 13 – с НКК; в 25 (69,4 %) случа- ях со среднетяжелым рецидивирую- щим течением, у 11 пациентов – с легким течением. На момент обследо- вания неактивная стадия заболевания была подтверждена клинически, эндо- скопически, лабораторными тестами и фекальными маркерами. Течение за- болевания в данной группе монитори- ровалось на протяжении последующе- го года. Применение кластерного ана- лиза разделило 36 пациентов на три основных группы по уровням данных параметров эритроцитов (рис. 10). В кластере с максимально изме- ненными уровнями параметров эрит- роцитов (голубой – 7 пациентов) оказались по три пациента с ЯК и БК и один – с НКК. У шестерых боль- ных данной группы развилось обост- рение заболевания в сроки от 2,5 до Рисунок 9 – Метод orthoPLSDA в различе- нии электрических и вязкоупругих показа- телей эритроцитов (парная статистика) у пациентов с ВЗК, обследованных в дина- мике Зеленое облако – в стадии обострения; розовое облако – в стадии ремиссии Рисунок 10 Кластерный анализ (K-means clustering) электрических и вязкоупругих параметров эритроцитов – предикторов обострения у пациентов с ВЗК в стадии ремиссии (n = 36). Зеленое облако – кластер пациентов с ВЗК в стадии ремиссии с минимально измененными уровнями параметров эритроцитов; розовое – кластер пациентов с ВЗК в стадии ремиссии с промежуточными уровнями параметров эрит- роцитов; голубое – кластер пациентов с ВЗК в стадии ремиссии с максимально измененными уровнями параметров эритроцитов; красные точки – пациенты с болезнью Крона; синие – пациенты с язвенным колитом; зеленые – пациенты с неклассифицируемым колитом 4,5 месяцев после проведенного исследования клеток красной крови. Три па- циента с БК и один с ЯК, оказавшихся в зоне перекрытия голубого и розового кластеров оказались в активной фазе заболевания через 4–6 месяцев. У паци- ентов, входящих в розовый кластер, выявлено обострение через 8–12 месяцев (n = 15) или сохранялась ремиссия (n = 3). У пациентов, входящих в кластер с минимально измененными параметрами эритроцитов (зеленый кластер) сохра- нялась ремиссия в течение года. Предсказательная точность предложенного подхода составила 92 %. В литературе имеются данные, что некоторые традиционно используе- мые показатели эритроцитов могут служить предикторами ухудшения течения заболевания. Так, исследование параметров клеток красной крови в динамике у беременных женщин позволило выявить снижение концентрации гемогло- бина в эритроците и увеличение среднего объема клеток за месяц до развития гестоза [Михайленко Е.Г., 1991]. Есть сведения об изменении электрических параметров эритроцитов за несколько месяцев до развития обострения рассе- янного склероза [Соколова А.А., 2005; Иерусалимский А.П., 2006]. Вероятно, изменения параметров эритроцитов, выявляемые методом диэлектрофореза, происходят гораздо раньше, чем сдвиги показателей обострения, доступных к измерению в рутинной клинической практике [Генералов В.М., 2011]. ВЫВОДЫ 1. Эритроциты пациентов с ВЗК отличаются от эритроцитов лиц кон- трольной группы сниженными амплитудой деформации клеток, скоростью движения к электродам, поляризуемостью на всех частотах электрического поля, и более высокими обобщенными показателями вязкости, жесткости, индексами агрегации и деструкции (p < 0,0001–0,001). 2. Эритроциты больных с язвенным колитом отличались от клеток красной крови пациентов с болезнью Крона более низкими уровнями среднего диаметра клеток, обобщенных вязкости, жесткости, электропроводности, индекса агрега- ции и более высокими амплитудой деформации эритроцитов, скоростью движе- ния клеток к электродам, емкостью мембран (p = 0,001–0,05). У пациентов с активным неклассифицируемым колитом часть значений электрических пара- метров эритроцитов (относительная поляризуемость, электропроводность, ем- кость мембран, положение равновесной частоты) занимали промежуточное по- ложение между показателями пациентов с ЯК и БК. Такие параметры эритроци- тов, как средний диаметр клеток, доля дискоцитов, сфероцитарных, деформиро- ванных форм, характер поверхности клеток, амплитуда деформации клеток на высоких частотах, обобщенные показатели вязкости, жесткости, индекс агрега- ции, величина дипольного момента и скорость движения к электродам , у паци- ентов с неклассифицированным колитом в стадии обострения приближались к соответствующим показателям при активной болезни Крона, но достоверно от- личались от таковых при язвенном колите (p = 0,00001–0,038). 3. Выявленные различия в показателях эритроцитов у пациентов с ЯК и БК могут быть обусловлены преобладанием железодефицитной анемии при язвенном колите и анемии хронических воспалительных заболеваний и анемии смешанного генеза при болезни Крона (F 3,392); (р = 0,049); хи-квадрат 15,187; (p < 0,01). 4. Активность ВЗК прямо ассоциирована с долей деформированных клеток, высокими уровнями обобщенных вязкости, жесткости, электропроводности, индексов агрегации, деструкции, смещением равновесной частоты в высокоча- стотный диапазон и обратно коррелирует с амплитудой деформации, поляризу- емостью на высоких частотах, емкостью, скоростью движения к электродам и величиной дипольного момента (p < 0,001–0,02). Выявленные изменения корре- лируют с уровнями белков острой фазы (СРБ, фибриноген, ферритин). 5. Предложенный способ определения активности ВЗК, основанный на комплексном использовании 8 наиболее значимых вязкоупругих параметров эритроцитов (средний диаметр клетки, скорость поступательного движения к электродам, поляризуемость на частоте 1 МГц, положение равновесной часто- ты, электропроводность, обобщенные показатели вязкости и жесткости, ам- плитуда деформации) и уровня фекального кальпротектина (отражающего наличие воспалительного процесса именно в кишке) превышает диагностиче- ские возможности изолированного их применения и позволяет отличать ста- дию обострения ВЗК от ремиссии с чувствительностью 91,9 %, специфично- стью 93,1 %, диагностической точностью 92,3 %. 6. Установлен перечень параметров эритроцитов, являющихся предикто- рами обострения ВЗК: доля деформированных клеток, величина дипольного момента, электропроводность мембран, скорость поступательного движения эритроцитов к электродам, характер поверхности клеток, степень изменения амплитуды деформации на частоте (5 × 105) Гц, емкость мембран эритроцитов (p = 0,0,0004–0,029). ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Пациентам с ВЗК целесообразно исследовать электрические и вязкоупру- гие параметры эритроцитов как дополнительные неинвазивные биомаркеры с целью: а) верификации диагноза (определения нозологической формы, активно- сти, прогноза течения) для раннего выбора адекватной терапии; б) мониторинга за течением заболевания для своевременной коррекции назначенного лечения и достижения конечных целей (заживления слизистой, трансмурального заживления при БК, профилактики осложнений, повышения качества жизни).