Клинико-лабораторное значение оценки экспрессии микро-РНК в диагностике цервикальных интраэпителиальных неоплазий

Актуальность темы исследования
Цервикальные интраэпителиальные неоплазии относятся к заболеваниям, предшествующим инвазивному раку шейки матки. Злокачественные новообразования шейки матки являются одними из самых распространенных заболеваний в мире, занимая четвертое место в структуре женской онкологической заболеваемости [1][2]. В России удельный вес рака шейки матки в структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями
составляет 5,2% [3].
Вирус папилломы человека (ВПЧ) признан основным этиологическим фактором злокачественной трансформации цервикального эпителия [4][5][6]. Папилломавирусная инфекция широко распространена в человеческой популяции [7]. Наибольшая инфицированность наблюдается в возрасте до 25 лет [8][9]. В большинстве случаев происходит спонтанное очищение организма от вируса [10][11]. Персистирование инфекции может привести к внутриэпителиальным поражениям [12], классифицируемым как цервикальные интраэпителиальные неоплазии (CIN) 1-го, 2-го или 3-го класса, или сквамозные интраэпителиальные поражения (SIL) низкой и высокой степени [13].
Основные механизмы ВПЧ – канцерогенеза включают активность двух вирусных онкопротеинов Е6 и Е7, которые деактивируют гены опухолевых супрессоров р53 и ретинобластомы (RB) [14][15]. Кроме того, Е6 и Е7 связаны с изменениями метилирования ДНК хозяина и ДНК вируса. Взаимодействия Е6 и Е7 с клеточными белками и модификациями метилирования ДНК индуцирует повреждения ключевых клеточных путей, регулирующих генетическую
целостность, клеточную адгезию, иммунный ответ, апоптоз и клеточный контроль[16][17][18]. Своевременное выявление наличия, распространенности и тяжести цервикальной интраэпителиальной неоплазии является важной клинической задачей, способствующей снижению заболеваемости раком шейки матки.
Традиционно в качестве скрининга цервикальной онкопатологии используется цитологическое исследование мазков, взятых с экто-эндоцервикса [19][20][21]. Несмотря на широкое применение в качестве основного метода скрининга рака шейки матки, Pap-тест имеет ограничения, что влечет за собой необходимость повторного проведения исследования и высокую частоту проведения кольпоскопии [22][23].
Скрининг на основе ВПЧ-тестирования, а также с цитологическим является более эффективным, чем цитологическое исследование, и позволяет увеличивать межскрининговый интервал [24][25][26][27][28]. Однако высокая распространенность ВПЧ-инфекции в сочетании с низкой специфичностью ограничивают использование тестирования на наличие вируса. Прогностическое значение тестирования на ВПЧ пациенток с уже имеющимися поражениями (CIN или SIL) также является низким, требуя проведения дальнейшего обследования [29][30][31] [32].
Для углубленной диагностики широко используется кольпоскопия с
комбинирование его
прицельной биопсией и гистологической оценкой материала [33]. В роли ранних предвестников тяжелых поражений рака шейки матки предложено иммуноцитохимическое и иммуногистохимическое определение онкобелков p16/Ki67 и тестирование на мРНК ВПЧ E6/E7 [34].
Несмотря на существенные достижения в диагностике патологии шейки матки, в последние годы наблюдается неуклонный рост цервикальных неоплазий. Более 15% случаев злокачественных новообразований шейки матки
диагностируют в возрасте от 20 до 34 лет [35]. В связи с этим большую актуальность имеет разработка и внедрение в клиническую практику новых диагностических и прогностических методов цервикальных интраэпителиальных неоплазий. Степень разработанности темы исследования
В последнее время появляется все больше работ, подчеркивающих важную роль микро-РНК в развитии и прогрессировании различных заболеваний, в том числе злокачественных [36][37][38][39].
Микро-РНК – это короткие (~ 22 нуклеотида), одноцепочечные некодирующие РНК, которые модулируют экспрессию генов за счет активации деградации мРНК или путем ингибирования трансляции мРНК [40]. Одна микро-РНК может влиять на экспрессию многих генов. И наоборот, один ген может регулироваться десятками разных микро-РНК, что резко повышает
разнообразие эффектов [41][42].
В иммортализированных клетках могут наблюдаться как сверх-
экспрессии микро-РНК, так и снижение их уровня [43][44], обусловленные генетическими и эпигенетическими влияниями [45] [46] [47]. Большинство генов, кодирующих микро-РНК, расположены в хрупких сайтах и хромосомных областях. Инфицирование высокоонкогенными типами ВПЧ и интеграция вирусной ДНК в хрупкие участки генома человека приводит к аберрантной экспрессии микро-РНК клеток хозяина [48][49].
Молекулы микро-РНК обладают высокой стабильностью [50], что позволяет определять их уровень в биологических средах с помощью
количественной ПЦР и некоторых других методов [51].
В настоящее время имеется определенный опыт тестирования микро-РНК в тканях шейки матки. Тем не менее значимость тестов детектирования экспрессии микро-РНК в диагностике, оценке эффективности лечения и прогнозе течения цервикальных интраэпителиальных неоплазий да настоящего времени в полной мере не определена.
Цель исследования
Повышение эффективности диагностики и прогнозирования цервикальных интраэпителиальных неоплазий на основе оценки экспрессии микро-РНК в клетках цервикального эпителия. Задачи исследования
1. Изучить клинические характеристики, данные микроскопического и кольпоскопического исследования у пациенток с поражениями шейки матки различной степени тяжести, уточнить факторы, определяющие развитие и клиническое течение SIL.
2. Изучить уровень инфицирования папилломавирусами высокоонкогенного типа у женщин с цервикальными неоплазиями различной степени тяжести, определить роль ВПЧ – тестирования в диагностике заболевания.
3. Изучить спектр микро-РНК в материале цервикального мазка у пациенток с эпителиальными аномалиями различной степени тяжести, определить молекулы, использование которых возможно в качестве диагностического маркера неопластических поражений шейки матки.
4. Изучить спектр микро-РНК в материале цервикального мазка у пациенток с различным течением цервикальных интраэпителиальных неоплазий легкой степени, определить молекулы, изменение экспрессии которых коррелирует с прогнозом течения заболевания.
5. Разработать метод анализа ряда «маркерных» молекул микро-РНК и алгоритм клинической интерпретации полученных результатов.
Научная новизна исследования
На основании анализа результатов клинико-лабораторных и инструментальных методов исследования у пациенток с поражениями шейки матки различной степени тяжести, уточнены факторы риска развития и клинического течения цервикальных неоплазий.
Разработан метод на основе определения «реципрокных» пар микро-РНК
в клетках цервикального эпителия, позволяющий повысить эффективность диагностики и прогнозирования цервикальных интраэпителиальных неоплазий.
Впервые показано, что «реципрокные» пары микроРНК-126/микроРНК- 375, микроРНК-20a/микроРНК-375, микроРНК-126/микроРНК-145 могут быть использованы в качестве маркера неопластических поражений шейки.
диагностического
Впервые показано, что для прогноза течения поражений шейки матки легкой степени тяжести могут быть использованы «реципрокные» пары: микроРНК-126/микроРНК-182, микроРНК-21/микроРНК-182, микроРНК- 1246/микроРНК-182, микроРНК-10b/микроРНК-126, микроРНК- 197b/микроРНК-126, микроРНК-29b/микроРНК-126.
В исследование были включены пациентки репродуктивного возраста с 18 до 45 лет, проходившие обследование / лечение в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н. Н. Петрова», в женской консультации No19 (СПбГБУЗ «Городская поликлиника No44), в Центре охраны репродуктивного здоровья (СПбГБУЗ «Городская поликлиника No76), в женской консультации No8 (СПбГБУЗ «Детская городская поликлиника No68») с июля 2017 года по декабрь 2019
года.
Формирование исследовательских групп
Было проведено проспективное когортное исследование по типу случай-контроль.
Из 436 пациенток с цитологически установленным диагнозом
плоскоклеточных интраэпителиальных поражений (SIL) в исследование были включены 143 женщины на основании представленных ниже критериев включения и невключения. Обследованные женщины были разделены на две группы в зависимости от тяжести поражения шейки матки: I группа – с патологией шейки матки стадии LSIL (n=110); II группа – с патологией шейки матки стадии HSIL (n=33).
Критерии включения в группу LSIL:
• наличие информированного согласия пациентки,
• цитологически подтвержденный диагноз поражения шейки матки,
• отсутствие вакцинации против ВПЧ,
• отсутствие деструктивных методов лечения в анамнезе, • отсутствие онкологических заболеваний в анамнезе,
• возраст с 18 до 45 лет.
Критерии невключения в группу LSIL:
• возраст менее 18 или более 45лет,
• применение деструктивных методов лечения за время наблюдения,
• беременность,
• лактация,
• наличие тяжелой экстрагенитальной патологии,
• отсутствие информированного согласия.
Результаты повторного цитологического исследования, проведенного через 6-12 месяцев, определили распределение 110 пациенток группы LSIL на три подгруппы. В первую подгруппу – «с персистенцией» – вошли 54 женщины с сохраняющимися плоскоклеточными поражениями легкой степени. Вторую подгруппу – «выздоровления» – составили 40 пациенток без клеточной атипии и отрицательным тестом на ВПЧ. Третья подгруппа – «прогрессирования» – была сформирована из 16 пациенток, у которых наблюдалось прогрессирование процесса до стадии H-SIL.
Критерии включения в группу HSIL:
• наличие информированного согласия пациентки,
• возраст от 18 до 45 лет,
• гистологически подтвержденнный диагноз HSIL,
• история заболевания до 4 месяцев,
• отсутствие онкологических заболеваний в анамнезе. Критерии невключения в группу HSIL:
• возраст менее 18 или более 45 лет,
• деструктувные методы лечения патологии шейки матки в анамнезе,
• беременность,
• лактация,
• наличие тяжелой экстрагенитальной патологии,
• отсутствие информированного согласия. Контрольная группа из 30 пациенток формировалась за аналогичный период времени из контингента женщин без заболеваний шейки матки, обратившихся в женскую консультацию No8 СПб ГБУЗ «Детской городской поликлиники No68», в женскую консультацию No19 СПб ГБУЗ «Городской поликлинике No44» и в Центр охраны репродуктивного здоровья СПбГБУЗ «Городской поликлиники No76 для прохождения профилактического осмотра.
Критерии включения в группу контроля:
• наличие информированного согласия пациентки,
• возраст с 18 до 45 лет,
• отсутствие аномальных кольпоскопических изменений,
• отрицательный цитологический скрининг,
• отсутствие воспалительных типов мазка,
• отсутствие в анамнезе неопластических заболеваний шейки матки. Критерии невключения в группу контроля:
• положительный тест на ВПЧ,
• возраст менее 18 или более 45лет,
• беременность,
• лактация,
• наличие тяжелой экстрагенитальной патологии,
• отсутствие информированного согласия.
Группа сравнения была сформирована из 30 женщин с диагнозом
инвазивного рака шейки матки, проходивших лечение в ФГБУ«НМИЦ онкологии им. Н. Н. Петрова» с июля 2017 года по декабрь 2019 года.
Критерии включения в группу сравнения:
• наличие информированного согласия пациентки,
• возраст от 18 до 45 лет,
• впервые поставленный диагноз РШМ,
• гистологически подтвержденный диагноз РШМ,
• отсутствие в анамнезе онкологических заболеваний (кроме РШМ). Критерии невключения в группу сравнения:

• возраст менее 18 или более 45 лет,
• беременность,
• лактация,
• наличие тяжелой экстрагенитальной патологии, • отсутствие информированного согласия.
От каждой пациентки было получено письменное информированное согласие на исследовательское использование биологического материала и клинических данных, которые были деперсонализированы. Протокол данного исследования был рассмотрен и одобрен Этическим комитетом СЗГМУ им.
И.И. Мечникова.
Клинико-лабораторные методы исследования
Всем пациенткам основных клинических групп и группы контроля были выполнены общеклинический и гинекологический осмотр, сбор жалоб и анамнеза, ознакомление с представленной медицинской документацией, микроскопическое исследование отделяемого влагалища и шейки матки, pH- метрия вагинального отделяемого, цитологическое исследование цервикальных мазков, расширенная кольпоскопия, биопсия шейки матки и выскабливание цервикального канала (по показаниям) с последующим гистологическим
исследованием, ВПЧ – генотипирование (14 типов) методом ПЦР, определение уровня экспрессии микро-РНК методом ОТ-ПЦР Real-time.
Для каждой пациентки составлялась индивидуальная карта учета, в которую были внесены анамнестические данные, результаты общего и гинекологического осмотра, инструментальных и лабораторных исследований.
При сборе анамнеза внимание уделяли следующим факторам: возраст пациентки; менархе и менструальная функция; возраст начала половой жизни; количество половых партнеров; методы контрацепции; курение; носительство ВПЧ в анамнезе и дебют неопластических заболеваний шейки матки; акушерский анамнез (число беременностей, родов и абортов); наличие в настоящий момент или в анамнезе сексуально-трансмиссивных инфекций (Сhlamidia trachomatis, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Ureaplasma species, Trichomonas vaginalis, Herpes genitalium, ВИЧ-инфекция, сифилис, гепатит В, гепатит С), наличие сопутствующих гинекологических заболеваний (инфекционно-воспалительных, гиперпластических процессов матки, нарушений менструального цикла, бесплодия); наличие экстрагенитальной патологии.
Цитологическое исследование мазков с экзо – и эндоцервикса
Забор материала с шейки матки для цитологического исследования не
проводился во время менструации, после вагинального исследования, в период терапии инфекций, передающихся половым путем, в течение 48 часов после полового акта.
Для цитологического исследования шейку матки визуализировали в зеркалах и бережно удаляли слизь. Взятие эпителия производили с наружной части шейки матки и из цервикального канала с помощью одноразовых инструментов cyto-brush и cervix-brush. После 4–5 вращательных движений цитощёткой материал с эндо- и экзоцервикса наносили тонким слоем на стекла для приготовления традиционных цитологических препаратов. Окрашивание мазков – соскобов цервикального эпителия проводили гематоксилином Майера – эозином, микроскопию – с помощью оптического микроскопа Olympus BX-46 с системой визуализации и анализа микроизображений.
Описание цитологических препаратов проводилось в соответствии с терминологической системой Бетесда (The Bethesda System – TBS) [182][183]:
 NILM (negative for intraepithelial lesion or malignancy) – негативный в отношении интраэпителиальных поражений или злокачественного процесса результат;
 LSIL (low grade squamous intraepithelial lesion) – плоскоклеточное интраэпителиальное поражение низкой степени (включая койлоцитоз и CIN I);
 НSIL (high grade squamous intraepitelial lesion)- плоскоклеточное интраэпителиальное поражение высокой степени (включая CIN II, CIN III,
карциному in situ).
Цитологическое исследование цервикальных мазков проводилось двумя
независимыми цитологами. При сомнительных или взаимоисключающих заключениях образцы изымались из исследования.
Исследование биоценоза урогенитального тракта
Для оценки состояния
биоценоза урогенитального тракта
проводили
вагинального мазка, окрашенного по Грамму. Материал для
микроскопию
исследования из заднего свода влагалища и цервикального канала получали с помощью специальных одноразовых стерильных инструментов.
При микроскопии мазка оценивали количество лейкоцитов и эпителиальных клеток; морфологию, отношение к красителям, размер, расположение и количество бактерий; наличие ключевых клеток, грибов, простейших.
проводилось с помощью тест-полосок
Определение рН среды влагалища
«Кольпо-тест рН» (производитель ООО «Биосенсор»). Сравнивая окраску рН индикаторов с эталоном на цветовой шкале, величина рН вагинальной жидкости оценивалась полуколичественным методом. В норме кислотность влагалища варьирует в границах 3,7— 4,5. Ощелачивание среды с показателями рН более 4,5 способствует активации условно-патогенной флоры и указывает на наличие дисбиотического состояния.
Диагноз бактериального вагиноза ставился при выявлении у женщин не менее трех критериев Амселя: однородных, серовато-белых выделений, покрывающих стенки влагалища тонкой пленкой; pH влагалища >4,5; положительного аминного теста; визуализации ключевых клеток в мазке.
При выявлении воспаления или бактериального вагиноза проводили
санацию урогенитального тракта антибактериальными препаратами местного и системного действия с последующим восстановлением нормальной флоры
согласно Федеральным клинические рекомендациям и протоколам.
Кольпоскопическое исследование шейки матки
Для оценки состояния экзо-эндоцервикса, определения показаний и места для биопсии проводили расширенную кольпоскопию по стандартной методике с помощью оптического кольпоскопа Carl Zeiss E (Germany). Для выявления аномального эпителия применяли пробу с 3-5% водным раствором уксусной кислоты и 3% раствором Люголя (проба Шиллера). Интерпретацию данных
проводили согласно Международной классификации кольпоскопических терминов, одобренной в 2011 г. в Рио-де-Жанейро на 14 Всемирном Конгрессе Международной Федерации по кольпоскопии и цервикальной патологии (IFCPC) [184].
Выявление ДНК вируса папилломы человека
Детекцию ДНК ВПЧ проводили
в научной лабораторией субклеточных технологий с группой онкоэндокринологии ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России, (заведующая – к.м.н. Малек А.В.) методом полимеразной цепной реакции с применением тест-систем «Реал-Бест ДНК ВПЧ ВКР генотип», «РеалБест ДНК ВПЧ 66», «РеалБест ДНК ВПЧ 68» (АО Вектор-Бест, Россия). Набор «ВПЧ ВКР генотип» предназначен для дифференциального выявления в эпителии слизистых оболочек ДНК вирусов папилломы человека 12 типов (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 и 59), два других набора – соответственно для выявления ДНК вируса папилломы человека 66 и 68 типов. Все амплифицируемые фрагменты имели сходную
длину.
Гистологическое исследование биоптатов шейки матки Всем женщинам с диагнозом HSIL проводилась радиохирургическая эксцизия или конизация шейки матки и выскабливание цервикального канала с последующим гистологическим исследование.
Показаниями к выполнению биопсии шейки матки и выскабливанию цервикального канала у женщин с LSIL являлись выраженные изменения при расширенной кольпоскопии. Противопоказанием для биопсии были воспалительные заболевания урогенитального тракта в острой фазе.
Взятие материала для гистологической верификации проводилось под контролем кольпоскопа с помощью биопсийной петли для радиоволновой
хирургии на электрохирургическом аппарате SURGITRON “СУРГИТРОНTM DF 120” ( Ellman, США).
Определение экспрессии микро-РНК в цитологических препаратах
неопластической трансформации цервикального эпителия проводили определение уровня экспрессии микро-РНК методом ПЦР.
Материалом для исследования служили образцы эпителия с экзо- и эндоцервикса на стеклах. Забор материала из урогенитального тракта женщины проводили с использованием одноразовых цервикальных цитощеток Cervix-
С целью диагностики и прогнозирования развития и течения
brush и Cytobrush.
Количественную экспрессию микро-РНК определяли в научной лабораторией субклеточных технологий с группой онкоэндокринологии ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России, (заведующая – к.м.н. Малек А.В.).
Выделение тотальной РНК со стекол с цитологическими мазками
Для выделения тотальной РНК использовали препараты (цитологические мазки) с достаточным количеством материала, который был подвержен стандартной процедуре фиксации и окрашивания. В исследование были включены препараты, полученные с 2017 до 2019 года, и хранившиеся до начала исследования в обычных условиях. Выделение тотальной фракции РНК (включавшей различные классы РНК) из цервикальных образцов проводили по
следующему протоколу: материал соскоба смывали со стекла 600 мкл лизис- буфера (4М ГНТЦ, 25 мМ цитрат натрия, 0,3% лаурилсаркозил натрия, 0,1% β- меркаптоэтанол) (в 3 шага по 200 мкл), переносили в 1,5 мл пробирку и инкубировали на термошейкере при температуре 650С в течение 15 минут.
Далее пробирку центрифугировали при 10000g 10 минут, отбирали супернатант (~550мкл), добавляли к нему 550 мкл изопропанола и 20 мкл магнитных частиц («ALPREP», Альгимед Техно, Беларусь), перемешивали на
вортексе и инкубировали при комнатной температуре 10-15 минут. Затем пробы центрифугировали при 18000g 15 минут и удаляли супернатант. Полученный осадок дважды промывали в 500 мкл 70% этанола и однократно в 300 мкл ацетона и вновь центрифугировали при 10000g 5 минут.
Осадок высушивали при комнатной температуре 2-3 минуты, добавляли 100 мкл элюирующего буфера (50 mM Tris-HCl, pH 6-7), инкубировали на термошейкере при 650С 5 минут, центрифугировали при 10000g 3 минуты и отбирали супернатант в чистую пробирку. Концентрацию и качество выделенной РНК оценивали на спектрофотометре NanoPhotometr N50 (Implen, Германия/США). Количество и качество РНК, выделенной из материала
цитологического препарата, оценивалось как достаточное для последующего анализа при значении концентрации более 0,2 мкг/мкл и значении коэффициента абсорбции при длине волны 260/280 нм в диапазоне 1,7 – 2,0.
Профайлинг микро-РНК
Для отбора молекул, применение которых потенциально возможно для прогноза течения поражений легкой степени, был проведен скрининговый анализ экспрессии 85 микро-РНК на ограниченном материале, полученном от пациенток групп LSIL. Образцы выделенной РНК в эквивалентных количествах объединялись в два пула, каждый из которых анализировался путем последовательного проведения реакций полиаденилирования, неспецифической обратной транскрипции и ПЦР.
Для профилирования 85 микро-РНК применялась система ПЦР miRCURY LNA miRNA (SYBR Green) датской компании Exiqon A/S. ПЦР проводили на аппарате CFX96 TouchTM Real-Time PCR Detection System (Bio- Rad, США). Все результаты, соответствующие значения Ct > 38, признавались отрицательными. Техническая разница между результатами анализа двух “пулов” нивелировалась с помощью межпластинчатых калибраторов.
Анализ отдельных молекул микро-РНК
Оценку индивидуальной экспрессионной изменчивости «потенциальных маркерных» молекул микро-РНК проводили методом обратной транскрипции и последующей количественной ПЦР в реальном времени на приборе CFX96 TouchTM Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Labo ratories, США).
Для генерации комплиментарной ДНК РНК подвергали обратной транскрипции с помощью набора обратной транскрипции «РеалБест Мастер микс ОТ» (ЗАО «Вектор-Бест», Россия). Анализируемый образец инкубировали при температуре + 420 С в течение 30 минут. Для инактивации обратной транскриптазы реакционную смесь подвергали температурному воздействию +950 С в течение 2 минут. В качестве экзогенного контроля малая ядерная РНК (яРНК) U6 была интегрирована в виде шаблона в синтез кДНК, чтобы обеспечить правильный процесс амплификации и надежную количественную ПЦР -конструкцию.
Количественный анализ методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени выполнялся с помощью реагентов ЗАО «Вектор-Бест» (Россия) «РеалБест Мастер микс», прямого и обратного праймеров (5,0 мкМ) и зондов (2,5 мкМ). В реакционный объем 30 мкл вводили 2,5 мкл раствора, содержащего комплиментарную ДНК. После предварительного прогрева в течение 2 минут при температуре +940 С проводилось 50 циклов
амплификации : этап денатурации – нагрев до +940 С в течение 10 сек, этап отжига и этап элонгации – нагрев до + 600 С в течение 20 секунд.
Пороговые циклы, превышающие значения Ct = 38, признавались
отрицательными и не использовались для дальнейших расчетов. Полученные
результаты уровня экспрессии микро-РНК нормализовывались относительно
значения Ct, среднего для каждого образца, по стандартной методике подсчета dCt = 2 (Ct микроРНК – Ct norm).
Методы статистической обработки результатов исследования
Статистическая обработка результатов исследования выполнялась на персональном компьютере с операционной системой Windows 2010. Полученные данные вносились в базу данных, созданную для каждой группы в офисном приложение MS Excel 2016. Расчеты и визуализация полученных результатов проводились с использованием лицензионного пакета статистического анализа Statistica for Windows (Stat Soft, США) версии 10.0 , (лиц. BXXR310F964808FA-V) и графиков Excel.
Данные описательной статистики всех количественных показателей, в том числе оценка мер средних тенденций и показателей вариабельности, отображены в виде средних значений и их стандартных отклонений М ± а,
медианой, нижним и верхним квартилями в виде Me [25%; 75%]; максимальным и минимальным значениями.
Соответствие количественных переменных теоретическому закону Гаусса проверялось критерием Колмогорова – Смирнова. В связи с несоответствием полученных данных критерию нормального распределения при проверке статистической значимости выявленных различий применялись непараметрические методы.
Сравнение изучаемых количественных параметров (возраст, количество беременностей, родов, абортов и выкидышей, длительность менструального цикла и др.) в клинических группах и подгруппах проводилось с использованием критериев Колмогорова-Смирнова, Манна-Уитни, медианного хи-квадрата.
РНК между двумя группами осуществлялся с помощью критерия Манна–Уитни (U-test Mann-Whitney), при множественных сравнениях – с помощью рангового дисперсионного анализа по Краскелу-Уоллису (Kruskal-Wallis Anova).
Для нахождения зависимостей между количественными признаками рассчитывался коэффициент ранговой корреляции Спирмена с оценкой тесноты связи по шкале Чеддока.
Статистическая значимость наблюдаемой разницы в экспрессии микро-
качественных показателей (курение, методы контрацепции, наличие сопутствующей патологии и др.) выполнялась с построением таблиц сопряженности и подсчетом критерия 2, критерия 2 с поправкой Йетса (для малых групп), критерия Пирсона, критерия Фишера. Данные представлены в виде абсолютных значений и процентных долей.
Обработка
В качестве критического порога значимости был установлен общепринятый в медицине уровень р <0,05. Вывод о достоверности различий делался при получении идентичных результатов по всем применявшимся методам анализа. Оценка диагностической и прогностической значимости выявленных различий микро-РНК проводилась с помощью ROC-анализа (ROC - receiver operating characteristic – рабочая характеристика приёмника, с англ.). Вычислялись операционные характеристики диагностических методов. Чувствительность (Sensitivity, Se) – это доля истинно положительных случаев (TPR - True Positives Rate), которые были правильно идентифицированы тестируемым методом: Se (TPR) = TP × 100% TP+FN Специфичность (Specificity, Sp) – это доля истинно отрицательных случаев (TNR - ), которые были правильно идентифицированы тестируемым методом: True Negatives Rate Sp (TNR) = TN × 100% TN+FP TP (True Positives) - истинно положительные случаи; TN (True Negatives) - истинно отрицательные случаи; FN (False Negatives) - ложно отрицательные случаи; FP (False Positives) - ложно положительные случаи. Далее определялись пороговые значения (Cut off), обеспечивающие максимальную суммарную чувствительность и специфичность модели при дихотомической диагностике пациенток. Для сравнительной оценки ROC- кривых, построенных для каждого включенного в анализ показателя микро- РНК, вычислялось значение площади под кривой (AUC - Area Under Curve), которое может варьировать от значения 1,0 (идеальный классификатор) до 0,5 (бесполезная модель) (таблица 2) [185][186]. ТАБЛИЦА 1 - Шкала значений AUC для оценки качества модели [186] Интервал AUC Качество модели 0,9-1,0 Отличное 0,8-0,9 Очень хорошее 0,7-0,8 Хорошее 0,6-0,7 Среднее 0,5-0,6 Неудовлетворительное Положения, выносимые на защиту 1. На основании сравнительного анализа результатов клинико- лабораторных и инструментальных метод исследования у пациенток с поражениями шейки матки различной степени тяжести показано, что факторы риска развития цервикальных интраэпителиальных неоплазий отличаются от факторов, способствующих прогрессированию уже имеющихся изменений плоскоклеточного эпителия. 2. Общий уровень инфицирования ВПЧ женщин с LSIL составляет 70,91%, с HSIL - 93,33%. Ко-инфекция несколькими генотипами являются факторами риска развития и прогрессирования предраковых заболеваний шейки матки. Отсутствие ВПЧ не позволяет исключить развитие плоскоклеточных интраэпителиальных поражений и их прогрессирование. 3. Злокачественная трансформация цервикального эпителия является мультистадийным процессом, характеризующимся прогрессивным изменением экспрессии некоторых молекул микро-РНК: активацией экспрессии микроРНК-20а, микроРНК-126, микроРНК-106, микроРНК-196 и угнетением экспрессии микроРНК-375 и микроРНК-145 (р < 0,05). Пары микро-РНК с разнонаправленными изменениями экспрессионной активности: микроРНК-20а / микроРНК -375, микроРНК -106/ микроРНК-375 и микроРНК-196/ микроРНК-145 могут быть использованы в качестве диагностического маркера неопластических поражений шейки. 4. Повышение экспрессии микроРНК-126, микроРНК-375, микроРНК- 21, микроРНК-1246 и снижение экспрессии микроРНК-182 коррелируют с неблагоприятным течением интраэпителиальных поражений легкой степени. Снижение уровней микроРНК-126 и микроРНК-29b характеризуют регресс аномалий цервикального эпителия. «Реципрокные» пары: микроРНК- 126/микроРНК-182, микроРНК-21/микроРНК-182, микроРНК-1246/микроРНК- 182, микроРНК-10b/микроРНК-126, микроРНК-197b/микроРНК-126 , микроРНК-29b/микроРНК-126 могут рассматриваться в качестве потенциальных биомаркеров прогноза течения предраковых заболеваний шейки матки легкой степени. Теоретическая и практическая значимость работы Высокий диагностический потенциал микро-РНК позволит использовать метод «реципрокных пар» в ситуациях, когда невозможно или нежелательно проведения прицельной биопсии с последующим гистологическим исследованием полученного материала: во время беременности, на фоне выраженного воспалительного процесса, при соматических противопоказаниях. Высокая прогностическая ценность микро-РНК в оценке риска прогрессирования цервикальных интраэпителиальных неоплазий до рака позволит уменьшить чрезмерную диагностическую и лечебную агрессию в отношении женщин с поражениями шейки матки. Использование результатов диссертационного исследования позволит врачам акушерам-гинекологам и онкологам выявлять факторы риска развития и прогрессирования предраковых заболеваний шейки матки и своевременно проводить первичную и вторичную профилактику рака шейки матки. Разработка диагностических и прогностических методов на основе анализа пар микро-РНК с разнонаправленными изменениями экспрессионной активности позволит включить определения уровня микро-РНК, наряду с ВПЧ – тестированием и расширенной кольпоскопией, в программы комплексного обследования женщин с патологией шейки матки с целью снижения заболеваемости цервикальными неоплазиями. Апробация и реализация результатов исследования Результаты исследования и основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на следующих научно-практических конференциях и конгрессах: 92-ая Всероссийская научно – практической конференции с международным участием «Мечниковские чтения-2019» (Санкт-Петербург, 2019 г.), II Всероссийская конференция с международным участием (Горно- Алтайск, 2-5 июля 2019 г.), VI Петербургского международного онкологического форума «Белые ночи 2020» (Санкт-Петербург, 11 сентября 2020 г.), 4th ESGO State of the Art Conference of the European Society of Gynaecological Oncology, (Copenhagen, Denmark, December 14–16, 2020 г. (постерный доклад), 9-я всероссийская научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов «Трансляционная медицина: от теории к практике» (Санкт-Петербург, 22 апреля 2021 г.), 94-ая Всероссийская научно – практической конференции с международным участием «Мечниковские чтения-2021» (Санкт-Петербург, 28-29 апреля 2021 г.). Апробация работы проведена на заседании кафедры акушерства и гинекологии федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (протокол No 2 от 23.01.2021 года) и на заседании научной проблемной комиссии No8 «Здоровье матери и ребенка» федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации ( протокол No2 от 01.03.2021 г.). Внедрение результатов исследования Результаты исследования внедрены в лечебную деятельность хирургического онкогинекологического отделения и научно-исследова- тельскую деятельность научной лаборатории субклеточных технологий с группой онкоэндокринологии федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 3 публикации в рецензируемых научных журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией для публикации основных научных результатов диссертаций, 2 публикации в англоязычных журналах. имени Н.Н. Петрова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, в учебный процесс кафедры акушерства и гинекологии федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Личный вклад автора Автором лично выполнены анализ литературных данных, определены цель и задачи исследования, проанализированы амбулаторные карты и сформированы исследовательские группы. Автором лично проводилось клинико-лабораторное и инструментальное обследование женщин, выделение микро-РНК из материала цитологических мазков пациенток с цервикальными неоплазиями. Автором самостоятельно проводилось статистическая обработка, обобщение и анализ материалов исследования. Текст диссертации и автореферата написаны лично автором. Структура диссертации Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 2 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и 4 приложений. Текст иллюстрирован 21 таблицой, 26 рисунками. Указатель литературы содержит названия 24 работ отечественных и 237 зарубежных авторов.