Лечение травматических повреждений сухожильно-связочного аппарата дистальных отделов грудных конечностей лошади комбинированным методом

Научные исследования по написанию диссертационной работы проводились на кафедре общей и частной хирургии ФГБОУ ВО «Санкт- Петербургский государственный университет ветеринарной медицины» в период с 2018 по 2021 годы. Клинические эксперименты и анализ ретроспективных данных заболеваемости проводился на базе конноспортивных клубов Ленинградской и Калининградской областей.
Рентгенологическое исследование проводилось на аппарате Eco Ray Orange- 1060HF с использованием портативной панели-детектора PZ Medical 1417.
Ультразвуковая диагностика осуществлялась на портативном аппарате Mindrey DP-50 с применением микроконвексного и высокочастотного линейного датчика.
Гематологический анализ проводился в лаборатории кафедры общей и частной хирургии «ФГБОУ ВО СПбГУВМ» на автоматическом 3 Diff анализаторе Nihon Kohden MEK-6500K.
Изготовление и исследование гистологических препаратов проводилось на кафедре биологии, экологии и гистологии ФГБОУ ВО «СПбГУВМ». Для приготовления гистологических препаратов использовалась стандартная методика. Окраска гистологических препаратов производилась по методикам Ван Гизон, Грам-Вейгерт и ШИК реакция.
В процессе работы были обследованы на предмет наличия заболеваний травматической этиологии сухожилий группы сгибателей дистального отдела грудной конечности 142 лошади с хромотой, из которых для проведения клинических испытаний были отобраны 20 животных (таблицы 1, 2).
Принципом отбора животных в экспериментальную и контрольную группы служило наличие хромоты, вызванной травматическим повреждением сухожильно-связочного аппарата дистальных отделов грудных конечностей, в хронической стадии (таблица 3). Данный факт очень важен, так как применение ударно-волновой терапии в острую стадию воспаления противопоказан. В большинстве случаев в эту группу входили животные, у которых с момента травмы прошло 6-8 недель.
Таблица 1. Данные о контрольной группе животных
No Порода
1 Ганноверская
2 Ганноверская
3 Голштинская
4 Тракененская
5 Тракененская
6 Тракененская
7 Голландская теплокровная
8 Метис
9 Метис
10 Метис
Пол
Мерин Мерин Жеребец Кобыла Мерин Мерин
Мерин
Мерин Кобыла Мерин
Год рождения
2014
2008
2005
2010
2011
2009
2009
2015
2016
2012
Таблица 2. Данные об экспериментальной группе животных
No Порода
11 Метис
12 Тракененская 13 Метис
14 Метис
15 Ганноверская 16 Ахалтекинская 17 Буденновская 18 Тракененская 19 Метис
20 Метис
Пол Год рождения
Мерин Кобыла Мерин Мерин Жеребец Кобыла Кобыла Мерин Мерин Мерин
2011
2015
2007
2013
2009
2016
2004
2009
2006
2012
9

Таблица 3-Характеристика заболеваний лошадей опытной группы
Локализация патологии
N (%)
55% 10%
Количество
11 2
Сухожилие поверхностного сгибателя пальца
Сухожилие глубокого пальцевого сгибателя
Добавочная головка сухожилия глубокого пальцевого сгибателя
35%
7
Определение топографии оптимальных зон воздействия ударно- волновой терапии на поверхностный и глубокий сгибатели пальцев грудной конечности проводили путём комплексного исследования, включающего следующие методики: тонкое анатомическое препарирования, морфометрии и вазорентгенографии. Материалом для данного исследования послужили дистальные участки грудных конечностей пяти лошадей разного пола и возраста, отсечённые по границе верхней трети голени.
Для оценки возможности усиления регенеративной способности сухожилия при помощи плазмы, обогащённой тромбоцитами, нами был проведён лабораторный эксперимент на кроликах. Для этого нами была получена плазма кроликов, обогащённая тромбоцитами до концентрации 1000×103/мкл(+/-10×103/мкл). После чего данный препарат в объёме 0,1 мл был в ведён в заранее травмированное ахиллово сухожилие на левой конечности 5 кроликов калифорнийской породы в возрасте 1,5 лет различной половой принадлежности. В контрольной группе также находились 5 кроликов калифорнийской породы различного пола в возрасте 1,5 лет.
В ходе научной работы нами была применена новая комбинированная методика лечения сухожильно-связочного аппарата лошадей. Обогащённая тромбоцитами до концентрации 1000×103/мкл(+/-10×103/мкл) плазма
вводилась под контролем ультрасонографии в область патологии сухожилий-
сгибателей дистальных отделов грудной конечности лошадей. Далее производилась её активация при помощи ударно-волновой терапии при настройках аппарата: давление – 0,2 МПа, частота импульсов – 10 Гц, количество импульсов – 2500. В экспериментальной группе находилось 10 животных различного пола и возраста.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Одним из первых этапов нашей научной работы стало исследование воздействия ударной волны на сухожилия, так как для проведения лечения нам было необходимо точно установить режим настройки аппарата, при котором мы можем оказать воздействие на ткани ударной волной необходимой силы для достижения разрушения введённых тромбоцитов и при этом не нарушить структуру сухожилия (таблица 5). Для этого нами был проведён эксперимент на кадаверном материале. Мы произвели воздействие ударной волной на заранее отпрепарированное сухожилие поверхностного сгибателя пальца лошади при различных режимах настройки аппарата.
Таблица 5-Режимы настройки аппарата ударно-волновой терапии
Давление МПа
0,2 0,25 0,3
в
Количество импульсов
2500
2500
2500
Частота импульсов в Гц
10 10 10
Оценка полученных результатов проводилась в сравнении с гистологическими срезами сухожилия, не подвергавшимся воздействию ударной волны (рисунок 1).
На рисунке 2 представлен фотоснимок гистологического среза сухожилия после воздействия ударной волны при следующих настройках аппарата: давление- 0,3 МПа, количество импульсов 2500, частота импульсов 10 Гц.
На данном препарате наблюдается неравномерное расположение
коллагеновых волокон сухожильного типа с признаками разрывов и разволокнения
с образованием мелких воздушных полостей между пучками волокон.
Рисунок 1 − Гистологический срез сухожилия поверхностного сгибателя пальца лошади до воздействия ударной волной, окраска по Ван Гизон, ув. ×1500
Рисунок 2 − Гистологический срез сухожилия поверхностного сгибателя пальца лошади после воздействия УВТ (0,3 МПа, 2500 импульсов, 10 Гц),
окраска по Ван Гизон, ув. ×1500
Такая картина свидетельствует о том, что произошло значительное нарушение структуры коллагеновых волокон, а также их разрушение, что определяет данный режим как неприемлемый для применения в клинической практике при лечении тендинитов.
Рисунок 3-Гистологический срез сухожилия поверхностного сгибателя пальца лошади после воздействия УВТ (0,25 МП, 2500 импульсов, 10 Гц), окраска по Ван Гизон, ув. ×1500
Рисунок 4-Гистологический срез сухожилия поверхностного сгибателя пальца лошади после воздействия УВТ (0,2 МПа, 2500 импульсов, 10 Гц), окраска по Ван Гизон, ув. ×1500
На рисунке 3 представлена фотография гистологического среза сухожилия после воздействия УВТ при настройках аппарата: 2500 импульсов, 0,25 МПа, 10 Гц. На данном снимке также видно существенное разволокнение, разрывы волокон коллагена и наличие значительных воздушных полостей. После оценки данного гистологического среза нами был сделан вывод о том, что давление 0,25 МПа тоже является излишним и не пригодно для применения в комбинированной методике.
Далее мы понизили давление ещё на 0,05 МПа и провели воздействие ударной волной в количестве 2500 импульсов при частоте 10 Гц (рисунок 4).
На представленном срезе наблюдается отсутствие выраженного нарушения структуры сухожилия, не наблюдается разрыва коллагеновых волокон, имеется лишь незначительное количество воздушных полостей. Из чего мы делаем вывод о возможности применения данного режима на опытной группе животных.
Следующим этапом перед применением комбинированной методики было выявление режима настройки аппарата ударно-волновой терапии, позволяющего максимально эффективно произвести активацию плазмы после её введения в толщу сухожилия в районе патологического очага.
Для этого мы смоделировали данную манипуляцию на кадаверном материале. Мягкостенный сосуд был помещён за естественные преграды в конечности лошади и проведено воздействие ударной волной при различных режимах настройки аппарата, с учётом ранее полученных результатов, оптимальным режимом настройки являлось давление – 0,2 МПа, количество импульсов 2500 и частота 10 Гц. Мы применили данный режим в нашем эксперименте с тромбоцитарной плазмой, так как практического смысла превышения данного порога по результатам предыдущего эксперимента не было, а понижение силы ударной волны априори приведёт к меньшему уровню разрушения тромбоцитов, что негативно скажется на эффективности активации и скорости высвобождения факторов заживления.
Оценка полученных результатов производилась при помощи
микроскопии мазка плазмы, обогащённой тромбоцитами, с окраской Дифф- Квик. При этом также производилось сравнение с мазком обогащённой плазмы, не подвергавшейся воздействию ударной волны (рисунок 5).
Рисунок 5− Мазок плазмы, обогащённой тромбоцитами, окраска Дифф-Квик, ув. ×400
Рисунок 6 − Мазок плазмы, обогащённой тромбоцитами, после воздействия ударными волнами, окраска Дифф-Квик, ув. ×400
На мазке тромбоцитарной плазмы, не подвергавшейся воздействию ударной волны, видно значительное количество целых тромбоцитов, скопление клеточных конгломератов, а также наличие нитей фибрина в мазке. Высвобождение факторов заживления из такой плазмы будет происходить значительно медленнее.
Микроскопическая картина препарата, приготовленного аналогичным способом, но из плазмы, подвергшейся воздействию ударной волны, выглядит иначе (рисунок 6). Количество целых тромбоцитов значительно меньше, разрушены клеточные конгломераты, отсутствуют нити фибрина, присутствуют части разрушенных тромбоцитов. По результатам данного исследования мы можем сделать вывод о том, что при режиме воздействия ударной волной при режиме настройки аппарата с давлением 0,2 МПа, количеством импульсов 2500 и частотой волн 10 Гц происходит активация плазмы, и данный режим настройки оптимально подходит для применения в комбинированной методике.
Действующим веществом в плазме, обогащённой тромбоцитами(PRP), являются факторы роста, содержащиеся в тромбоцитах. Для получения необходимого терапевтического эффекта необходимо провести высвобождение
факторов заживления из тромбоцитов, то есть активацию PRP.
В настоящее время самым распространённым способом активации PRP
является применение растворов кальция. Но в случае лечения сухожильно- связочного аппарата лошадей, как правило, объём вводимой жидкости существенно ограничен. При этом считается, что количество тромбоцитов за одну инъекцию должно быть не меньше 300,0млн или 0.3мл при концентрации 1,0млнмкл. Соответственно, вполне логичным является вывод о том, что применение дополнительных растворов приводит к понижению концентрации тромбоцитов в единице объёма вводимой плазмы. Поэтому разработка методики активации PRP физическим методом является актуальной.
Для достижения поставленной цели нами была получена плазма лошадей, обогащённая тромбоцитами до концентрации 1,0 млн/мкл. Обогащённая тромбоцитами плазма (PRP) была помещена в специальную пробирку с мягкой стенкой по плотности приближенную к мягким тканям животного. После чего на пробирку, наполненную PRP до 1 мл произвели воздействие аппаратом ударно- волновой терапии (Impactis M) при настройках 0,2 МПа, 2000 импульсов и частоте 10,0 Гц. Контрольную пробирку методом УВТ не обрабатывали. После обработки опытные и контрольные пробирки центрифугировали при 3000 оборотах в минуту в течение 5 минут. Далее в надосадочной жидкости контрольной и опытной групп определяли содержание МСМ.
Таблица 6 – Исследование молекул средней массы (МСМ) в PRP после активации
Условия эксперимента
280 нм (Ароматические аминокислоты)
254 нм (пептиды)
230 нм (рибонуклеиды)
No
1 Чистая плазма 2
3 Плазма с тромбоцитами
Количество МСМ, выраженное в условных единицах(Е*×1000)
690±25 730±23** 860±31
800±45 820±** 770±43
Сыворотка, полученная после активации свёртывания чистой плазмы ионами кальция
790±35
720±41**
660±28
15

Сыворотка,получённая после активации свертывания тромбоцитарной плазмы ионами кальция
980±67
1300±71**
1130±73
Бесклеточная плазма, полученная после отделения центрифугированием тромбоцитов, обработанных аппаратом УВТ
980±73
980±55**
900±70
4
* – Экстинкция при светофильтрах разной оптической плотности; ** – Р <0,05 Результатами исследования установлено, что в надосадочной жидкости опытной пробы повышается количество МСМ (таблица 6). Результаты лабораторного эксперимента по оценке регенеративного воздействия плазмы, обогащённой тромбоцитами, на сухожилия. В результате проведённого эксперимента нам удалось оценить эффективность плазмы, обогащённой тромбоцитами, на регенеративную функцию сухожилия. Гистологическое исследование сухожилий кроликов после введения плазмы показало, что дифференцировка структуры сухожилия и образование соединительно-тканных рубцов на месте разрывов сухожильных волокон происходит на 33% быстрее, чем без её использования. Для наглядности эксперимента нами представлены гистологические срезы здорового сухожилия кролика (рисунок 7), на которых продемонстрированы плотные, оформленные, параллельно уложенные, коллагеновые волокна сухожильного типа, без видимых нарушений. Рисунок 7 – Гистологический срез здорового ахиллова сухожилия кролика, окраска по Ван-Гизон, Рисунок 8 – Гистологический срез повреждённого ахиллова сухожилия кролика, окраска по Ван-Гизон, увеличение ×1000 увеличение ×1000 Рисунок 9 - Гистологический срез сухожилия кролика в экспериментальной группе спустя 2 недели, окраска гематоксилином и эозином, ув. ×1000. Красным цветом отмечено скопление клеток рыхлой соединительной ткани Рисунок 11 - Гистологический срез сухожилия кролика в экспериментальной группе спустя 1 месяц, окраска гематоксилином и эозином, ув. ×1000. Красным цветом отмечено скопление клеток рыхлой соединительной ткани Рисунок 10 - Гистологический срез сухожилия кролика в контрольной группе спустя 2 недели, окраска гематоксилином и эозином, ув. ×1000. Красным цветом отмечено скопление клеток рыхлой соединительной ткани На гистологических срезах повреждённых сухожилий кроликов наблюдаются рыхлые, плохо оформленные волокна соединительной ткани с нарушением параллельной направленности и прерыванием сухожильных волокон (рисунок 8). Первое гистологическое исследование для оценки области поражения Рисунок 12 - Гистологический срез сухожилия кролика в контрольной группе спустя 1 месяц, окраска гематоксилином и эозином, ув. ×1000. Красным цветом отмечено скопление клеток рыхлой соединительной ткани сухожилия в экспериментальной и контрольной группах проводилось через 2 недели после травмы. Плазму, обогащённую тромбоцитами, вводили в область патологии в день повреждения. На рисунке 9 представлен гистологический срез сухожилия, полученный от животного из опытной группы. На рисунке 10 продемонстрировано сухожилие животного из контрольной группы. Второе исследование производилось спустя 1 месяц после нанесения травматического повреждения и введения плазмы, обогащённой тромбоцитами (рисунки 11, 12). Результаты лечения животных в контрольной группе. В контрольной группе находилось 10 животных (таблица 7). Всем им было проведено лечение при помощи ударно-волновой терапии без применения плазмы, обогащённой тромбоцитами. Лечение проводилось в 4 сеанса с промежутком в 1 неделю. В контрольную группу были отобраны животные, имевшие хронический тендинит. Животные с острой травмой участие в эксперименте не принимали. Таблица 7 – Степень хромоты животных в контрольной группе до и после лечения ЭУВТ No животного 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Порода Ганноверская Ганноверская Голштинская Тракененская Тракененская Тракененская Голландская теплокровная Пол Мерин Мерин Жеребец Кобыла Мерин Мерин Мерин Мерин Кобыла Жеребец Год Степень хромоты рождения До После лечения лечения 2014 2/5 1/5 2008 3/5 1/5 2005 2/5 2/5 2010 3/5 1/5 2011 2/5 2/5 2009 2/5 1/5 2009 3/5 1/5 2015 4/5 3/5 2016 2/5 0/5 2007 2/5 1/5 Метис Метис Тракененская Из данных таблицы 7 мы видим, что у 80% животных произошло значительное снижение степени хромоты, у 10% хромота прошла полностью и не проявлялась ни при каких условиях, и у 10% хромота не изменилась никак. При этом во всех случаях в первые двое суток отмечено значительное обезболивание и закономерное снижение степени хромоты, после двух суток анальгезии хромота возникала вновь, но уже с меньшей силой. Это можно связать с действием частичного анальгетического эффекта от процедуры. Факт того, что хромота после прохождения курса лечения не проходила полностью можно объяснить периодом наблюдения: один месяц — это маленький срок для заживления сухожилия и оценки конечного результата лечения, особенно в случае использования монотерапии. Что касается 10% случаев, в которых не произошло никаких улучшений, стоит обратить внимание на условия содержания и темперамент животного. В процессе лечения травматических повреждений сухожилия необходимо строго соблюдать моцион и не превышать рекомендованный уровень нагрузок. В случае с данным животным эти требования не выполнялись. В фазу анальгезии животное испытывало повышенные нагрузки на сухожилие, что препятствовало процессу заживления. В экспериментальной группе находилось 10 животных с травматическими заболеваниями глубокого и поверхностного сгибателя пальцев грудной конечности. Всем им было проведено лечение при помощи комбинированной методики (таблица 8). Таблица 8 – Степень хромоты животных в экспериментальной группе до и после лечения при помощи комбинированной методики No Порода животного 11 Метис 12 Тракененская 13 Метис 14 Метис 15 Ганноверская 16 Ахалтекинская 17 Буденновская 18 Тракененская 19 Метис 20 Метис Пол Год рождения Степень хромоты До После лечения лечения Мерин Кобыла Мерин Мерин Жеребец Кобыла Кобыла Мерин Мерин Мерин 2011 2/5 0/5 2015 3/5 1/5 2007 3/5 2/5 2013 1/5 0/5 2009 2/5 1/5 2016 3/5 3/5 2004 2/5 1/5 2009 2/5 0/5 2006 2/5 3/5 2012 3/5 1/5 19 Оценка качества лечения при помощи комбинированной методики оценивалась по изменению степени хромоты спустя месяц после начала лечения, так же, как и в группе контроля (таблица 8). В 30% случаев хромота у животных ушла полностью. У 50% животных произошло значительное снижение степени хромоты. В 10% случаев степень хромоты осталась неизменной. И у 10% животных произошло усиление хромоты на 1 балл. В качестве дополнительного метода исследования для оценки системного воздействия комбинированной методики на организм животного нами был проведён клинический анализ крови животных до и после проведения лечения (таблица 9). Таблица 9 - Результаты клинического исследования крови Показатель Лейкоциты (×109 /л) Эритроциты (×1012/л) Гематокрит (%) Тромбоциты(×103/мкл) Лимфоциты (×109 /л) Гемоглобин(г/л) Норма 5,4-14,3 6,8-12,9 32,0-53,0 20-350 1,6-6,5 110-190 Результат до лечения 7,3 ±0,7 7,82±0,4 37,3±3,1 103±26,9 1,9±0,2 121±12,8 Результат после лечения 6,5±0,6 7,45±0,4 35,2±3,0 106±27,1 2.1±0,1 128±12,9 Из данных таблицы 9 мы видим, что статистически значимых изменений в результатах клинического исследования крови до и после проведённого лечения не обнаружены. Значительное отклонение отдельных показателей крови наблюдалось лишь в единичных случаях и не может быть статистически связано с травматическим повреждением сухожильно- связочного аппарата дистальных отделов конечностей лошади или/и проведённым лечением. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Главной целью нашего исследования было установление уровня эффективности применения комбинации экстракорпоральной ударно-волновой терапии и аутоплазмы, обогащённой тромбоцитами, для лечения травматических повреждений сухожильно-связочного аппарата дистальных отделов конечности лошади. Была всесторонне изучена комбинированная методика сочетания экстракорпоральной ударно-волновой терапии и плазмы, обогащённой тромбоцитами. Методики изучались нами как вместе, так и в форме монотерапии. Определены безопасные с ангиологической точки зрения зоны воздействия экстракорпоральной ударной волной на сухожильно-связочный аппарат дистальных отделов конечности лошади. Нами были опробованы различные и определены оптимальные настройки аппарата ударно-волновой терапии для воздействия на сухожильно-связочный аппарата дистальных отделов грудных конечностей лошади и применения в комбинации с плазмой. Удалось смоделировать и оценить возможность активации плазмы, обогащённой тромбоцитами, в толще структуры сухожилия. Разработана и изучена методика активации плазмы, обогащённой тромбоцитами, при помощи ударной волны. Нами были изучены и оптимизированы методики получения и обогащения тромбоцитами плазмы лошадей. Нами было произведено сравнение скорости заживления сухожилия с применением плазмы, обогащённой тромбоцитами, и без её применения. Таким образом, цель исследования была достигнута. Поставленные задачи выполнены. ВЫВОДЫ 1. Наиболее безопасным и эффективным режимом настройки аппарата ударно-волновой терапии Impactis-M для лечения травматических повреждений сухожильно-связочного аппарата дистальных отделов грудных конечностей лошади в комбинации с аутоплазмой, обогащённой тромбоцитами, является следующий режим настройки: давление – 0,2 МПа, частота импульсов – 10 Гц, количество импульсов – 2500. 2. Активация плазмы, обогащённой тромбоцитами, при помощи экстракорпоральной ударно-волновой терапии, путём разрушения тромбоцитов в толще сухожилий сгибателей грудной конечности лошади возможна при настройках аппарата: давление – 0,2 МПа., количество импульсов 2500, частота импульсов -10 Гц. 3. Оптимальный режим настройки аппарата ударно-волновой терапии Impactis-M для активации тромбоцитарной аутоплазмы: давление-0,2 МПа, количество импульсов - 2500, частота импульсов-10 Гц. При этом происходит разрушение значительного числа тромбоцитов, и в тоже время не возникает альтернативного эффекта на структуру сухожилий дистальных отделов грудной конечности лошади, что обеспечивает лечебный эффект комбинированного метода. 4. Процесс морфо-функционального восстановления травматических повреждений сухожильно-связочного аппарата дистальных отделов грудных конечностей лошади завершается быстрее, в среднем на 2 недели при использовании комбинированного лечения в сравнении с монотерапией УВТ. 5. Комбинированный метод сочетанного применения плазмы, обогащенной тромбоцитами и ударно-волновой терапии, в условиях клинического эксперимента, показал высокую эффективность. При этом осложнений в виде обострения патологического процесса у животных не наблюдалось. Практические рекомендации Полученные в результате проведённой научной работы данные можно рекомендовать к использованию: в клинической практике ветеринарных врачей при лечении сухожильно-связочного аппарата лошадей; при использовании экстракорпоральной ударно-волновой терапии для лечения сухожильно-связочного аппарата лошадей; при получении обогащённой тромбоцитами аутоплазмы лошадей; в учебном процессе для изучения влияния экстракорпоральной ударно-волновой терапии на сухожилия; для изучения влияния аутоплазмы, обогащённой тромбоцитами, на процесс заживления травматических повреждений сухожилий; при написании атласов, справочников, учебных пособий и учебников по общей и частной хирургии. Разработанная в ходе научной работы комбинированная методика лечения травматических повреждений сухожильно-связочного аппарата дистальных отделов конечности лошади может быть рекомендована в качестве базовой. Перспективы дальнейшей разработки темы исследования Полученные данные об эффективности применения комбинированной методики для лечения травматических повреждений сухожильно-связочного аппарата дистальных отделов грудных конечностей лошади также в значительной мере обогащают и дополняют сведения о процессе получения и активации аутоплазмы, обогащённой тромбоцитами, физическим методом. Дальнейшие исследования должны быть направлены на: точное определение, выделение в чистом виде факторов заживления, содержащихся в тромбоцитах; определение точных дозировок факторов заживления и придания им оптимальной лекарственной формы; усовершенствование и автоматизацию процесса введения данного препарата; изучение возможности применения комбинированной методики для лечения других хирургических заболеваний.