Молекулярно-генетическая идентификация антибиотикорезистентных штаммов Histophilus Somni и лечебные мероприятия при гистофилёзе крупного рогатого скота

Описание использованных методов исследований, материалов и
оборудовани.
Работа выполнена в период с 2019 по 2021 гг. на базе отделения биотехнологии
ФГБУ «ВГНКИ» и кафедры эпизоотологии, микробиологии и организации
ветеринарного дела ФГБОУ ВО МГАВМиБ имени К.И. Скрябина.
Разработка методики идентификации и типирования изолятов возбудителя
гистофилёза крупного рогатого скота Histophilus somni методом ПЦР с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме
«реального времени» и тест-системы на ее основе осуществлялась в ФГБУ
«ВГНКИ». Микробиологические исследования проводились на кафедре
эпизоотологии, микробиологии и организации ветеринарного дела ФГБОУ ВО
МГАВМиБ – МВА имени К.И.Скрябина. Научно-хозяйственные экперименты
выполнены на базе ООО «МИРОВЕТ» (Московская область, Пушкинский район,
г.Пушкин).
Схема проводимых исследований и этапы проводимых работ представлены на
рисунке 1.

– определение чувствительности выделенных штаммов
H.somni к аминогликозидам диско-диффузионным
– подбор олигонуклеотидных праймеров и зондов;методом.
– выбор программы амплификации;- подбор олигонуклеотидных праймеров и зондов;
– проверка специфичности работы праймеров;- выбор программы амплификации;
– оценка эффективности и чувствительности.- проверка специфичности работы праймеров;
– оценка эффективности и чувствительности.

методикавыявления ДНКметодикавыявлениягенов
H.somni методом ПЦР в режимеустойчивости к аминогликозидам
реального времениH.somni методом ПЦР в режиме
реального времени

Тест-система для идентификации
итипированияизолятов
Histophilus somni методом ПЦР в
режиме реального времени

Идентификация HistophilusЭксперимен-Идентификация условно патогенной
somni в смывах из носовойтальнаямикрофлоры микробиологическими
полости и выделений изгруппаметодами в смывах из носовой полости и
репродуктивного тракта КРСживотныхвыделений из репродуктивного тракта
КРС

Опробирование схем лечения с применением в
различных комбинациях антибиотка гентамицина
сульфат 4%, внутриматочной суспензии РАСТОЛИН и
тканевого биостимулятора иммунной системы
крупного рогатого скота ТКАНОЛИН

Разработка Методических рекомендаций по
оздоровлению скотоводческих хозяйств,
неблагополучных по инфекционным заболеваниям,
вызванным антибиотикорезистентными штаммами
бактерий Histophilus somni

Рисунок 1. Схема исследований
При разработке методики молекулярно-генетической идентификации
бактерии Histophilus somni для определения ее специфичности использовали
штаммы микроорганизмов, представленные в таблице 1.
Таблица 1 – Штаммы микроорганизмов, используемые в работе
№
Наименование образца
п/п
1Штамм Histophilus somni ATCC-700025
2Штамм Pasterella multocida ATCC43137
3Штамм Pasterella multocida ATCC23639
4Штамм Pasterella multocida ATCC11039
5Штамм Pasterella multocida ATCC15742
6Культура Mannheimia haemolytica
7Штамм Haemophilus parasuis АТСС S19417
8Штамм Actinobacillus pleuropneumoniae
9Штамм Mycoplasma bovis ATCC-25523
10Штамм Mycoplasma bovirhinis ATCC-27748
11Штамм Mycoplasma bovigenitalium ATCC 19852
12Штамм Campylobacter fetus 25936
13Штамм Brucella abortus 82 сер. 022 07.01.1980 г.
14Штамм Yersinia enterocolitica № Му 03 ВНИПЧИ «Микроб»
15Штамм Yersinia pseudotuberculosis
16Штамм Salmonella Dublin 6 (Salmonella enterica)
17Штамм Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
18Штамм Staphylococcus aureus ВКПМВ 6646
19Штамм Mycobacterium bovis AN5 2/5-69-MS-07
20Штамм Mycobacterium intracellulare 539
21Штамм Mycobacterium avium D-4
22Штамм Leptospira interrogans Pomona ВГНКИ-6
23Штамм Bacillus cereus ВКПМ В-8076
24Штамм Arcanobacterium pyogenes ATCC-8164
25Штамм Neospora caninum ATCC-50977
26Штамм Escherichia coli 0157:Н7
27Штамм Clostridium perfringens тип С
28Штамм Streptococcus pyogenes; АТСС 19615
29Штамм Candida albicans ATCC 10231
30Штамм Aspergillus brasiliensis (niger) ATCC 16404
31Штамм Enterococcus faesalis ATCC 29212
32Штамм Proteus mirabilis АТСС 35659
33Культура Chlamydia pecorum
34Штамм Bovine Herpesvirus 1 MBA 2
35Штамм Bovine Herpesvirus 2 ATCC-VR-845
36Штамм Bovine Herpesvirus 4 DN-599
37Вирус нодулярного дерматита (положительный материал)
38Штамм вируса диареи КРС (Орегон C24V 04.02.98)
39Штамм вируса диареи КРС (NADL 23.05.91)
40Штамм вируса парагриппа КРС (ПТК 45186)
41Вирус Шмалленберга (положительный материал)
42Вирус респираторно-синцитиальной инфекции КРС (кДНК)
43Bordetella bronchiseptica
№
Наименование образца
п/п
44Pasteurella multocida 20.03.2008
45Pasteurella multocida «5» 15.04.04
46Pasteurella multocida «15»18.05.05
47Pasteurella multocida «Elepant» 23.03.03
48Pasteurella multocida «796» 15.04.04
49Pasteurella multocida «1997» 20.03.00
50Pasteurella multocida «1059» 23.03.00
51Pasteurella multocida «Liver» 23.03.00
52Pasteurella multocida «AB» 18.04.05
В работе также использовали культуры изолятов Histophilus somni и
биологический материал от животных разных возрастных, половых и
физиологических групп с признаками респираторных и репродуктивных поражений
(респираторные и вагинальные смывы, сперма, молоко, паренхиматозные органы
КРС), собранный в хозяйствах Тульской, Тверской, Московской, Калужской,
Владимирской, Воронежской, Челябинской, Курской областях, республиках
Хакасия, Татарстан, Удмуртия, Мордовия.
В качестве гена-мишени был выбран ген 16S рРНК. При подборе праймеров
использовали базу данных GenBank. Использованные в работе олигонуклеотидные
праймеры были синтезированы в ЗАО «Евроген». амидофосфитным методом на
синтезаторе ASM 2000 (ООО «Биоссет», Новосибирск).
Экстракцию нуклеиновых кислот проводили по методу лизиса с последующем
осаждении нуклеиновых кислот изопропанолом (Sambrook et al.,1989), а также с
использованием набора Рибо-преп (ФБУН ЦНИИЭ) согласно инструкции
производителя. Автоматизированное выделение ДНК из культур клеток и отдельных
образцов биологического материала проводили методом сорбции на магнитных
частицах с помощью автоматической станции для экстракции NucliSENS easyMAG
(bioMérieux, Франция) в режиме «ON-BOARD» («Лизис в приборе») согласно
рекомендациям производителя.
Реакцию амплификации с помощью подобранных в работе праймеров и
олигонуклеотидных зондов при проведении ПЦР с гибридизационно-
флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» проводили на приборах
RotorGene 6000 и RotorGene Q (Corbett Research, Австралия, Qiagen, Германия). ПЦР
с электрофоретической детекцией осуществляли с использованием амплификаторов
«Терцик» производства ООО «НПО ДНК-Технология».
В каждой постановке ставили контрольные образцы: отрицательный контроль
ПЦР; положительный контроль ПЦР, а также отрицательный контроль экстракции
ДНК. Эффективность экстракции ДНК из образцов материала оценивали по
прохождению реакции амплификации внутренних контролей (ВКО).
Результаты амплификации в режиме «реального времени» интерпретировали
на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с
установленной на соответствующем уровне пороговой линией. ПЦР с
электрофоретической детекциией результатов амплификации проводили с
использованием реагента «ПЦР-смесь-2 blue» (ФБУН ЦНИИЭ, Россия) и метода
«горячего старта» с использованием прослойки воска на амплификаторах «Терцик»
(ООО «НПО ДНК-технология»).
Секвенирование фрагментов амплификации по Сенгеру выполняли методом
«cycle sequence» с набором ABI PRISM Big Dye v.1.1, согласно инструкции
изготовителя c использованием капиллярного автоматического секвенатора ABI-
3100 PRISM Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США).
Полученные нуклеотидные последовательности фрагмента генома сравнивали
с известными последовательностями из баз данных NCBI. Для поиска гомологичных
последовательностей в базах данных NCBI использовали алгоритм BLAST (Ye J et
al., 2012) на поисковом интернет-ресурсе www.ncbi.nlm.nih.gov.
Клинико-гинекологическое исследование проводили по общепринятой
методике, предложенной Н.И. Полянцевым (1989). Обследованию было подвергнуто
50 коров экспериментальной группы (животные с признаками акушерско-
гинекологических заболеваний) и столько же животных контрольной группы.
Состояние половых органов определяли клиническими методами, которые
подразделялись на наружные (устанавливали состояние вульвы, присутствие и
отсутствие выделений из половых органов, обращали внимание на цвет и
консистенцию), вагинальные (использовали влагалищное зеркало с осветителем и
учитывали состояние слизистых оболочек влагалища и шеечной части матки, ее
положение и степень раскрытия, объем истечений) и ректальные исследования
(устанавливали с помощью датчика величину). При проведении ректального
исследования использовали ректальный УЗИ сканер.
Состояние органов дыхания оценивали первоначально по частоте и глубине
дыхания согласно методике И.П. Кондрахина (1980) «Диспансеризация коров в
крупных специализированных хозяйствах».
Микробиологические методы использовали для исследования 300 проб
маточных выделений и смывов из носовой полости от животных экспериментальной
группы. Посев маточных и носовых выделений для идентификации представителей
состава микрофлоры осуществляли на специальные дифференциальные среды
фирмы Хаймедиа Лаб (Индия). Идентификацию возбудителя гистофилёза крупного
рогатого скота H. somni осуществляли разработанным нами методом ПЦР в режиме
«реального времени».
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты разработки методики молекулярно-генетической
идентификации бактерии Histophilus somni
Для достижения поставленной цели были проведены микробиологические
исследования проб патологического материала (кусочки лёгких, сердца), а также
смывов с препуция и вагинальных смывов КРС, взятых от животных разных
половозрастных и физиологических групп, с признаками респираторных
заболеваний и репродуктивных поражений. Также исследовали образцы
стабилизированной криоконсервированной спермы быков из отечественных и
иностранных (Великобритания, Нидерланды) племенных центров. Изоляты H. somni
были выделены из образцов легких КРС с признаками бронхопневмонии, из
сердечной мышцы КРС с признаками миокардита, а также из смывов с препуция и
семенной жидкости. В качестве контроля использовали штамм Histophilus somni
АТСС 700025.
Изоляты H. somni образовывали мелкие колонии диаметром до 1 мм на
колумбийском агаре с добавлением 5% дефибринированной крови барана, при
культивировании в условиях 10% CO2 атмосферы в течение 48 ч. (рисунок 2).

Рисунок 2. Рост культуры Histophilus somni, выделенной из сердечной мышцы
коровы на кровяном агаре (48 ч)
Для выявления ДНК H. somni на основании изучения литературных
источников (Angen O., 1998) и множественных выравниваний нуклеотидных
последовательностей микроорганизмов семейства Pasteurellaceae, представленных в
базе данных GenBank, нами подобраны три пары праймеров и олигонуклеотидный
зонд для флуоресцентной детекции. В качестве гена-мишени выбран ген 16S рРНК.
На основании проведенных исследований для дальнейшей работы был выбран
фрагмент генома H. somni длиной 153 п.н., фланкируемый праймерами H.smn_F и
H.smn_R_ADK (таблица 2).
Таблица 2 – Выбор размера ампликона для амплификации фрагмента генома
H. somni
Размер ампликона 153 п.н.Размер ампликона 411 п.н.
Положительный

Положительный
результат ВКО

Schmallenberg
Значения Ct

Значения Ct

Название образца
Среднее Ct

Среднее Ct

результат

virus

24,9526,56
ПКО ДНК H. somni,
24,7225,08100%26,7626,72100%
концентрация 1105 копий/см3
25,5626,85
28,8229,25
ПКО ДНК H. somni,
28,9728,81100%29,1929,13100%
концентрация 1104 копий/см3
28,6428,95
ПКО ДНК H. somni,
32,2232,2233%–100%
концентрация 1103 копий/см3
ПКО ДНК H. somni,
–0%–0%
концентрация 1102 копий/см3
В качестве флуоресцентной метки для TaqMan зонда был выбран
флуоресцентный краситель ROX и тушитель флуоресценции BHQ1. Выбранные
флуоресцентные красители для зондов при амплификации ДНК H. somni и ВКО
позволяют проводить одновременное детектирование результата амплификации
ДНК H. somni на канале ROX/Orange, а детекцию экзогенного неконкурентного ВКО,
добавляемого на этапе экстракции ДНК, — на канале FAM/Green приборов
RotorGene 6000, RotorGene Q и CFX.
В результате полученных экспериментальных данных выбраны концентрации
праймеров H.smn_F/H.smn_R_ADK — 3 пмоль/реакцию и концентрация зонда
H.smn_probe_ADK – 2 пмоль/реакцию.
Наилучшая эффективность амплификации и разгорания подобранного нами
зонда наблюдалась при температуре отжига 60С (таблица 3).
Таблица 3 – Программа амплификации ДНК H. somni для Rotor Gene Q (QIAGEN)
и Rotor Gene 6000
Измерение
ЭтапТемпература, °СВремяКоличество циклов
флуоресценции
195–15 мин1
95–10 с
263–20 с5
72–10 с
95–10 с
3ROX/Orange
6020 с35
FAM/Green

72–20 с

С использованием контрольной панели, включающей 52 штамма различных
микроорганизмов, представленных в таблице 1, а также геномную ДНК крупного
рогатого скота, определена специфичность работы праймеров. Выбранные праймеры
амплифицируют только фрагмент генома микроорганизмов H. somni и не
амплифицируют ДНК/кДНК других микроорганизмов, вирусов и геномную ДНК
крупного рогатого скота.
Проведена оценка эффективности ПЦР с помощью программного
обеспечения амплификаторов Rotor Gene Q (Qiagen). Исследования проведены
способом последовательного разбавления ПКО H. somni c известной концентрацией
плазмидной ДНК (1106 копий/см3). Использовали серии десятикратных разведений
ПКО H. somni в РНК-буфере с концентрациями от 1105 копий/см3 до 1102
копий/см3 (рисунок 3).
Рисунок 3. Оценка эффективности амплификации. Графики накопления
флуоресцентного сигнала при амплификации ПКО H. somni.
Эффективность амплификации фрагментов генома H. somni составила 95 %.
Проанализирована аналитическая чувствительность праймеров, используемых
для амплификации фрагмента генома H. somni для разных видов биоматериала от
крупного рогатого скота: вагинальные смывы, пробы молока, внутренние органы
(кусочки легких). Для всех видов биоматериала чувствительность методики
составила 1104 копий/см3.
Разработанная тест-система была апробирована при исследовании 484
образцов биологического материала от КРС (сперма, мазки из репродуктивного и
респираторного трактов, легкие, молоко), собранного в хозяйствах Тульской,
Тверской, Московской, Калужской, Владимирской, Воронежской, Челябинской,
Курской областях, республиках Хакасия, Татарстан, Удмуртия, Мордовия и др.
(рисунок 4).

48471,4%
80,0%
40060,0%
34,6%
32,1%
30040,0%
111 (22.9%)
20,0%
0,0%
Сперма КРС
Всего пробСодержит H.somniМазки из репродуктивного тракта
Пат. материал (легкие)

Рисунок 4. Выявление ДНК H. somni методом ПЦР с помощью разработанной
методики в биологическом материале от крупного рогатого скота
Сравнение чувствительности разработанной тест-системы с чувствительностью
коммерческого набора реагентов LSI VetMAX™ Histophilus somni (Life Technologies
Corporation, Франция) показало сопоставимые результаты для всех отрицательных
образцов, а также проб, содержание ДНК H. somni в которых было выше 1103
копий/мл.
Идентификация антибиотикорезистентности H. somni
На основании литературных данных (Fussing et al., 1993; Klima et al., 2014;
Wang et al., 2017) для поиска генов устойчивости к аминогликозидам нами выбраны
гены strA и strB. В связи с тем, что гены резистентности передаются не только внутри
одного вида бактерий, но и между различными видами микроорганизмов, что
обусловлено их расположением на мобильных генетических элементах, при подборе
праймеров в выравнивание включались не только гены резистентности H. somni,
Pasteurella multocida и Manheimia haemolytica, но и гены представителей семейства
Enterobateriaceae (E. coli, Salmonella spp.).
Последовательности генов strA и strB являются высокогомологичными
(степень гомологии составляет 99–100%). С использованием подобранных
праймеров и расчетных условий ПЦР нами протестированы культуры H. somni на
наличие генов антибиотикорезистентности. Результаты тестирования представлены
в таблице 4.
Таблица 4 Тестирование H. somni на наличие генов антибиотикорезистентности
№№
strAstrBstrAstrB
штаммаштамма

1отрицательныйотрицательный6отрицательный отрицательный

2отрицательныйотрицательный7отрицательный отрицательный

3отрицательныйотрицательный8отрицательный отрицательный

4отрицательныйотрицательный9отрицательный отрицательный

5отрицательныйотрицательный10отрицательный отрицательный

Положительные образцы подтверждены методом секвенирования.
Для генов антибиотикорезистентности strA, strB на основе полученных
положительных продуктов амплификации были сконструированы плазмиды,
несущие фрагменты этих генов. Плазмиды далее использовались в качестве
положительных контрольных образцов (ПКО).
Для выявления генов strA и strB в ПЦР в режиме реального времени
подобраны зонды с близкими температурами плавления и детекцией на разных
каналах для возможности амплификации в процессе мультиплексной ПЦР — зонд
для strA с флуоресцентным красителем ROX и strB с красителем HEX.
Подобраны оптимальные условия амплификации. Наивысшая эффективность
амплификации и разгорания зондов наблюдалась при температуре отжига 60С.
Программа амплификации представлена в таблице 5.
Таблица 5 – Программа ПЦР для выявления генов strA, strB
Rotor Gene Q (QIAGEN)
ЭтапТемпература,Измерение
ВремяКоличество циклов
°Сфлуоресценции
195–15 мин1
95–10 с
263–20 с5
72–10 с
95–10 с
HEX/Yellow
36020 с35
ROX/Orange
72–10 с
Проведена оценка чувствительности ПЦР в режиме реального времени путем
исследования четырёх последовательных десятикратных разведений (от 10–8 до 10–11)
плазмиды, содержащей вставку искомых генов (strA, strB) (рисунки 5,6).

0,6

0,5
Norm. Fluoro.

0,4

0,3

0,2

0,1

Threshold
0,0
510152025303540
Цикл

Рисунок 5. Результаты анализа чувствительности ПЦР фрагмента гена strA при
использовании десятикратных разведений плазмиды с целевой вставкой (от 10–8 –
красный цвет кривой, до 10–11 – зелёный цвет кривой на графике)

0,25

0,20
Norm. Fluoro.

0,15

0,10

0,05

Threshold
0,00
510152025303540
Цикл

Рисунок 6. Результаты анализа чувствительности ПЦР фрагмента гена strB при
использовании десятикратных разведений плазмиды с целевой вставкой (от 10–8 –
красный цвет кривой, до 10–11 – зелёный цвет кривой на графике)
Чувствительность реакции амплификации гена strA составила 7×103 коп/мл.
Чувствительность реакции амплификации гена strB составила 6×103 коп/мл.
При анализе эффективности реакции амплификации участка каждого из
исследуемыхгеновантибиотикорезистентностипроводилсярасчетс
использованием десятикратных разведений плазмиды, несущей участок гена-
мишени с известной концентрацией (стандартов). Эффективность моноплексной
реакции амплификации генов резистентности находилась в диапазоне от 93 % для
strA до 99 % для strB.
Была разработана мультиплексная полимеразная цепная реакция с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации для
идентификации генов strA и strB. С этой целью в зонды для генов strA и strB были
ввведены флуоресцентные красители, детектирующиеся на разных каналах.
Для оценки чувствительности ПЦР использовали две плазмиды, содержащие
вставки генов strA и strB, соответственно.
Чувствительность определения гена strA в мультиплексной реакции в
сравнении с моноплексной снизилась и составила 7×104 копий/см3.
Чувствительность определения гена strB в мультиплексной реакции составила 6×103
копий/см3.
При смешении ПКО генов strA и strB в концентрации 7×103 копий/см3 и 6×103
копий/см3, соответственно, в соотношении 1:1 чувствительность выявления гена strA
составила 3,5×104 копий/см3, гена strB-3×104 копий/см3. Ложноположительных
результатов в мультиплексной ПЦР не обнаружено. Перекрёстной реакции между
плазмидами не выявлено.
Проведеносравнениерезультатов ПЦРдлявыявлениягенов
антибиотикорезистентности с результатом анализа устойчивости штаммов H. somni
диско-диффузионным методом.
Таблица 6 – Результат определения чувствительности штаммов H. somni диско-
диффузионным методом
НомерЗона ингибирования, мм
штаммаНеомицинГентамицин
21518
31012
6–
7–
81211
9-10
121410

Оценка осуществлялась по рекомендациям Института клинических и
лабораторных стандартов CLSI. У штаммов 6 и 7 чувствительность к исследуемым
аминогликозидам отсутствовала, в них с использованием разработанной
мультиплексной ПЦР было выявлено одновременное присутствие генов strA и strB.
Штамм 9 был устойчив к неомицину и малочувствителен к гентамицину, у него
также обнаружено одновременное присутствие генов strA и strB.
Штаммы 12, 8 обладали средней чувствительностью по результатам анализа с
использованием диско-диффузионного метода. У штамма 12 выявлен ген strB, у
штамма 8 – оба гена strA и strB. У штаммов 2 и 3, чувствительных к действию
неомицина и гентамицина, гены strA и strB не идентифицированы. Таким образом,
результаты тестирования штаммов с использованием мультиплексной ПЦР
согласуются с результатами анализа, проведенного с использованием традиционного
диско-диффузионного метода, т.е. в работе показано 100% соответствие результатов
молекулярно-генетического тестирования на наличие генов strA и strB данным
фенотипического определения устойчивости изолятов H. somni к аминогликозидам
неомицину и гентамицину.
По результатам тестирования органов от животных с признаками и без
признаков респираторных поражений на присутствие H. somni было отобрано 20
образцов лёгких КРС, 10 из которых положительны на H. somni, а также 10
отрицательных образцов для проверки разработанных методик на возможные
ложноположительные результаты. Данные образцы протестированы с
использованием ПЦР с электрофоретической и флуоресцентной детекцией. Образцы,
положительные на H. somni, проходили на 13–32 цикле ПЦР (таблица 7).
Таблица 7 – Результаты тестирования образцов лёгких на наличие
генов strA и strB
ЭлектрофоретическаяФлуоресцентная детекция
ПЦРдетекция
Номер образца(Ct)
H. somni(Ct)
strAstrBstrAstrB
29613,38POSPOS23,9118,56

28416,84NEGNEGNEGNEG
32517,61NEGPOS29,4527,37
32617,04POSPOS22,5422,25

28519,25POSPOS27,2527,50
8624,61NEGPOSNEG23,88
28025,58POSPOS19,5318,72
29125,02POSPOS24,9423,52
29026,16NEGPOS31,0727,02
28732,26POSPOS27,5826,23
278,279,281,
286,288,293,NEGNEGNEGNEGNEG
294,322,323, 324
В большинстве образцов, положительных на H. somni, были
идентифицированы гены устойчивости к аминогликозидам (strA и/или strB). Ген strB
был обнаружен в 90% (9/10) положительных по H. somni образцах. В 6 из 10 образцов
обнаружено одновременное присутствие генов strA и strB. Во всех образцах,
отрицательных по H. somni, по результатам, полученным с использованием
разработанной нами тест-системы, гены резистентности к аминогликозидам strA и
strB не выявлены. В двух образцах (№ 325 и № 290) ген strA был идентифицирован
по результатам ПЦР с флуоресцентной детекцией, однако по результатам ПЦР с
электрофоретической детекцией не был выявлен. Такое расхождение результатов
может быть связано с большей чувствительностью флуоресцентной детекции по
сравнению с электрофоретической.
Разработка методических рекомендаций по оздоровлению скотоводческих
хозяйств, неблагополучных по инфекционным заболеваниям, вызванных
антибиотикорезистентными штаммами бактерий
Экспериментальное применение различных схем лечения осуществляли на
поголовье крупного рогатого скота в ООО «МИРОВЕТ» (Московская область,
Пушкинский район, г. Пушкин).
С этой целью проведен ветеринарный осмотр всего стада, а также клиническое
обследование животных экспериментальной группы (50 коров). Результаты
клинического обследования представлены в таблице 8.
Таблица 8 – Результаты клинического обследования экспериментальной
группы коров
Количество
№
ДиагнозживотныхПримечание
п/п
(гол.)
1Острый катаральный34Из носовых отверстий слизисто-гнойное
ринитистечение, слизистые оболочки припухшие,
дыхание сопящее и свистящее
2Острый послеродовой32Увеличение матки, гнойные выделения
эндометрит
3Хронический21Выделения из влагалища гнойные с кровяными
эндометритвключениями
4Цервицит17Эндоцервицит – воспаление слизистой
оболочки шейки матки, отечность слизистой
оболочки, канал шейки матки приоткрыт
5Фолликулярная киста11Между корнем хвоста и седалищным бугром
правого яичниказаметны ярко выраженные впадины
6Атония матки5Матка увеличена, атонична, болезненная

Всего обследовано 50 коров
Структура акушерско-гинекологических патологий была представлена
следующими заболеваниями: на первом месте острый послеродовой эндометрит (32
коровы), на втором месте хронический эндометрит (21 корова), на третьем месте
цервицит (17 коров), на четвертом месте фолликулярная киста правого яичника (11
коров), на пятом месте атония матки (5 коров).
Клиническая картина болезней органов дыхания была представлена у
животных экспериментальной группы острым катаральным ринитом (воспаление
слизистой оболочки носовой полости) у 34 коров.
При микробиологическом исследовании материала от животных с
клиническими признаками инфекционных патологий дыхательных и половых путей
(смывы из носовых ходов и истечения из половых органов) были обнаружены и
выделены 7 видов различных микроорганизмов (таблица 9).
Таблица 9 – Основные возбудители острого ринита и гинекологических
патологий
Количество выделений
ВозбудительИстечения из носаматочные выделения
гол.%гол.%
Escherichia coli14283264
Candida albicans8162754
Arcanobacter pyogenes002040
Staphylococcus spp.10201734
Pseudomonas aeruginosa17341326
Histophilus somni918714
Streptococcus spp.19381326
Изолированная нами микрофлора в основном была представлена условно-
патогенными видами бактерий и грибов: E. coli, Candida albicans, Staphylococcus spp.,
Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus spp. При этом наиболее часто в пробах
обнаруживали кишечную палочку, грибы рода Candida, синегнойную палочку и
стрептококки. Частота выделения микроорганизмов зависела и от вида
биологического материала. Так, в пробах из носовых ходов наиболее часто
обнаруживали стрептококки, а в маточных выделениях – кишечную палочку.
H.somni при этом был выделен в 18% случаев из носовых ходов и в 14% – из маточных
выделений. Данный возбудитель обнаруживали в пробах не в монокультуре, а в
ассоциации с другими видами условно-патогенной микрофлоры, но при этом H.
somni значительно преобладал в посевах. Кроме H. somni, такие ассоциации были
представлены Pseudomonas aeruginosa и Candida albicans. Клиническая картина
заболеваний у животных, в материале которых обнаруживали такие ассоциации,
носила критически острый характер с ярко выраженными гнойно-воспалительными
процессами как в половых путях, так и в органах дыхания. Локализация H. somni
чаще всего нами диагностировалась в области преддверных желез влагалища, а не в
области шейки матки.
Для осуществления лечебных мероприятий были отобраны особи, в
биологическом материале от которых были обнаружены H. somni, всего 16 голов. Из
них у 7 голов обнаруживали данный возбудитель в маточных выделениях, а у 9 голов
– в истечениях из носовой полости, при этом у 2 животных H. somni обнаруживали и
в дыхательных путях, и в маточных выделениях. Животных разделили на 4 группы
по 4 головы в каждой. В каждой группе присутствовали особи с локализацией
данного возбудителя и в дыхательных путях, и в урогенитальном тракте.
Для каждой группы животных была применена комплексная схема лечения
(см. таблицу 10) с обязательным использованием антибактериального препарата
Гентамицина сульфат 4%, чувствительность к которому была подтверждена
классическим диско-диффузным и молекулярно-генетическими методами, а также в
комбинации антибактериального препарата и инновационных биопрепаратов
отечественного производства РАСТОЛИН и ТКАНОЛИН:
– группа 1: применение только антибиотика Гентамицина сульфат 4 %
внутримышечно в дозе 0,7 мл/10 кг живой массы в течение 7 дней;
– группа 2: внутримышечное применение антибиотика Гентамицина сульфат 4
% в дозе 0,7 мл/10 кг живой массы в течение 7 дней и внутриматочное введение
суспензии РАСТОЛИН по 100 см3 1 раз в день 3 дня подряд;
– группа 3: антибиотикотерапия, в тех же дозах и по той же схеме как в группах
1 и 2, и применение тканевого биостимулятора ТКАНОЛИН подкожно 5 мл
двукратно с интервалом 14 суток;
– группа 4: комплексное лечение следующими препаратами: внутримышечное
применение антибиотика Гентамицина сульфат 4 % в дозе 0,7 мл/10 кг живой массы
в течение 7 дней, внутриматочное введение суспензии РАСТОЛИНА по 100 см3 1 раз
в день 3 дня подряд и применение тканевого биостимулятора ТКАНОЛИН подкожно
5 мл двукратно с интервалом 14 суток.
У всех животных были отобраны пробы для микробиологических
исследований до начала лечения, на 3 день терапии, на 7 день терапии, через 14 дней
и на 28 день после начала лечения. Данное исследование не учитывало факт
изменения состава микробных ассоциаций влагалища и верхних дыхательных путей,
а было направлено только на индикацию в материале Histophilus somni.
Таблица 10 – Оценка эффективности различных схем терапии при
инфекционных патологиях дыхательных путей и урогенитального тракта
крупного рогатого скота, вызванных Histophilus somni
Выделение H. somni из носовой слизи и маточных истечений
Группыдо начала3-й день7-й день14-й день28-й день
животныхтерапиитерапиитерапиитерапиитерапии
гол%гол%гол%гол%гол%
Группа 1,4100410025012500
n=4
Группа 2,
41002501250000
n=4
Группа 3,
4100410025012500
n=4
Группа 4,
4100250000000
n=4

Как видно из таблицы 10, все схемы лечения оказались достаточно
эффективны в отношении микроорганизмов вида H. somni.
Однако при применении комплексной терапии тремя препаратами:
антибиотик Гентамицина сульфат 4%, внутриматочная суспензия РАСТОЛИН и
биостимулятор иммунной системы крупного рогатого скота ТКАНОЛИН данные
микроорганизмы не обнаруживались в материале от всех животных группы 4 уже на
7 день терапии, в то время как в группах 1 и 3 мы не выделили H. somni только на 28
день исследований, а в группе 2 – на 14 день.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
1. Разработана методика и тест-система для выявления Histophilus somni методом
полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией
продуктов амплификации в режиме «реального времени», обладающая высокой
специфичностью.
2. Показана высокая встречаемость H. somni в образцах биологического
материала КРС: в сперме быков она составила 71,4%, в исследованных образцах
легких – 32,1%, в мазках со слизистой репродуктивного тракта – 34,6%.
3. Абсолютная чувствительность праймеров для амплификации фрагментов
генома H. somni составила 1х104 коп/мл, аналитическая чувствительность тест-
системы при исследовании вагинальных смывов, молока, спермы и
паренхиматозных органов КРС составила 1х104 копий/мл.
4. Подобрана система праймеров для выявления генов strA и strB,
детерминирующих устойчивость H. somni к аминогликозидам гентомицину и
неомицину. Разработанная методика выявления генов устойчивости к
аминогликозидам показала высокую специфичность. Чувствительность выявления
гена strA составила 3,5×104 копий/мл. Чувствительность выявления гена strB 3×104
копий/мл.
5. Доказано высокое (до 100%) соответствие фенотипической и генотипической
устойчивости H. somni к неомицину, что позволяет рекомендовать разработанную
методику на основе ПЦР для прогнозирования устойчивости H.somni к данному
антибиотику.
6.У животных с клиническими признаками острых инфекционных
патологий дыхательных и половых путей H. somni встречается не в монокультуре, а
в ассоциации с Pseudomonas aeruginosa и Candida albicans.
7.При использовании различных схем лечения крупного рогатого скота с
наличием возбудителя H. somni, включающих в себя применение
антибиотикотерапии, препарата с иммуномодулирующим эффектом и биопрепарата,
обеспечивающего санацию местного действия, наибольшую эффективность
продемонстрировал комбинированный подход, а именно сочетанное применение
антибиотика Гентамицина сульфат 4%, внутриматочной суспензии РАСТОЛИН и
биостимулятора иммунной системы крупного рогатого скота ТКАНОЛИН.
СВЕДЕНИЯ О ПРАКТИЧЕСКОМ ИСПОЛЬЗОВАНИИ РЕЗУЛЬТАТОВ
ИССЛЕДОВАНИЙ
Материалы диссертационной работы внедрены в учебный процесс ФГБОУ ВО
«Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии –
МВА имени К.И.Скрябина».
Результаты работы вошли в Методические рекомендации по оздоровлению
скотоводческих хозяйств, неблагополучных по инфекционным заболеваниям,
вызванным антибиотикорезистентными штаммами бактерий (молекулярно-
генетический метод выявления гистофилеза крупного рогатого скота и способы его
лечения), утвержденные 15.10.2021 секцией зоотехнии и ветеринарии Отделения
сельскохозяйственных наук РАН.
Разработанная тест-система обладает высокой специфичностью и позволяет не
только эффективно выявлять ДНК H. somni в различном биологическом материале
от крупного рогатого скота, но также обнаруживать гены устойчивости к
антимикробным препаратам группы аминогликозидов. В связи с этим
представленная тест-система широко используется для диагностики заболевания при
проведении мониторинговых программ надзора за устойчивостью к
противомикробным препаратам в акредитованныхлабораторияхсистемы
Россельхознадзора Российской Федерации.
РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ РЕУЛЬТАТОВ
Научные результаты, полученные в ходе выполнения исследований, могут
быть рекомендованы в качестве инновационных подходов в ветеринарии для
успешного исполнения Федерального закона №492-ФЗ в части обеспечения
биологической безопасности в животноводстве согласно пункту 14 – разработка и
применение мер по выявлению, предупреждению и устранению биологических
угроз, связанных с действием инфекций при осуществлении ветеринарной
деятельности:
С целью своевременной идентификации возбудителя гистофилеза крупного
рогатого скота Histophilus somni в отечественных скотоводческих хозяйствах и
принятия решений для стабилизации эпизоотической ситуации в различных
регионах страны рекомендуем применять разработанную тест-систему в
лабораториях зооветеринарной системы АПК Российской Федерации.
Для лечения акушерско-гинекологических заболеваний и патологий органов
дыхания рекомендован комплексный подход по оздоровлению отечественных
скотоводческих хозяйств, неблагополучных по инфекционным заболеваниям,
вызванным антибиотикотолерантными изолятами гистофилеза. Данный подход
позволит проводить профилактические и лечебные мероприятия, исходя из реальных
возможностей хозяйств. По результатам введения в эксплуатацию данной
программы будут целенаправленно вестись работы организационно-хозяйственного
направления по устранению акушерско-гинекологических, андрологических и
респираторных заболеваний с применением инновационных лечебных средств
отечественного производства.