Молекулярно-генетические подтипы серозной аденокарциномы яичника, их малоинвазивная диагностика и ассоциация с выживаемостью больных

Работа выполнена в ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России. Проанализированы данные комплексного клинического и молекулярно- генетического обследования 200 больных серозной аденокарциномой яичника (основная, ретроспективная группа), 30 доноров без онкологической патологии (группа условно здоровых доноров) и 100 пациентов тестовой (проспективной) группы (больных серозной аденокарциномой яичника).
На рисунке 1 представлен упрощенный дизайн исследования
Рисунок 1. Схема дизайна исследования
Первым этапом работы явился биоинформационный анализ баз данных, который включал анализ баз TCGA (The Cancer Genome Atlas), DisGeNET и cBioPortal. На втором этапе для высококачественной дифференцировки опухолевых и нормальных клеток яичников использовали лазерную микродиссекцию с бесконтактным захватом. Определение относительной копийности генетических локусов, в нормальных, опухолевых клетках яичников и во внДНК проводили методом Real-Time qPCR.
Биоинформационный анализ данных. Первичный биоинформационный анализ данных выполнялся с использованием баз данных TCGA (The Cancer

Genome Atlas, https://portal.gdc.cancer.gov/), DisGeNET (https://www.disgenet.org) и cBioPortal. Для получения данных из Genomic Data Commons Data Portal (https://portal.gdc.cancer.gov/) использовали пакет TCGABiolinks языка R v.4.0.0 в оболочке Rstudio. Для идентификации областей генома, размер которых значительно увеличивался или уменьшался в ряде образцов опухолей применяли алгоритмы GISTIC версии 2.0.22, MutSig и RAE (Gao J. et al., 2013).
Лазерная микродиссекция с бесконтактным захватом. Материалом для исследования послужили срезы тканей из FFPE (Formalin-fixed paraffin- embedded)-блоков 200 пациенток (ретроспективная группа). Выделение и разделение опухолевых и нормальных клеток яичников осуществляли с помощью лазерной микродиссекции с бесконтактным захватом (Колесников Е.Н., Максимов А.Ю., Кит О.И., Кутилин Д.С., 2019).
Определение показателя относительной копийности генов в клетках и внДНК. Из клеток, извлеченных путем лазерной микродиссекции, методом фенол-хлороформной экстракции было выделено 400 образцов ДНК (200 из опухолевых и 200 из нормальных клеток). Полученная ДНК, после нормализации, использовалась для определения относительной копийности генов метод ПЦР в режиме реального времени (Real-Time qPCR). Предварительно, с использованием базы данных NCBI GenBank, были сконструированы последовательности 37 пар синтетических олигонуклеотидов (праймеров), включая пары для референсных локусов (ACTB, B2M, GAPDH). Список генов, выбранных в ходе биоинформационного анализа, включал 34 локуса. Real-Time qPCR с интеркалирующим красителем EvaGreen®Dye (Biotium, США) проводилась на термоциклере Bio-Rad CFX96 в 3 технических повторах. Копийность гена (rCN) вычисляли по формуле rC=Е-ΔC(t), где Е-эффективность реакции амплификации, рассчитанная по формуле E=10-1/h, где h – коэффициент уравнения C(t) = h•log P0 + b, полученного путем линейной аппроксимации экспериментальных данных (Е=1,944) (Кутилин Д.С., 2020).
Для получения внеклеточной ДНК (внДНК) использовали кровь, полученную в процессе венопункции у больных серозной аденокарциномой яичников высокой (n=50) и низкой (n=50) степени злокачественности, а также у 30 условно-здоровых доноров. Выделение внДНК осуществляли следующим
способом, описанным Кутилиным Д.С. с соавторами (2017). Оценку показателя относительной копийности генов проводили методом RT-qPCR. Относительную копийность (rCN) для образцов плазмы крови рассчитывали по формуле, представленной выше и описанной Д.С. Кутилиным (Кутилин Д.С., 2020).
Статистическая обработка данных. Cтатистический и биоинформационный анализ выполняли в различных программах и средах программирования, включая Statistica 10.0 (StatSoft, США) и Rstudio (v4.0.1). Для оценки различий значений количественных показателей применяли непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Для учета множественного сравнения использовали поправку Бонферрони. Критерий Краскела-Уоллиса использовали для оценки различий между 3 и более независимыми группами. Метод Кaплана-Мейера и лoг-рaнг тест использовали для оценки продолжительность жизни и времени до прогрессирования. Кластерный анализ (Hierarchical Clustering, Euclidean distance) и построение тепловых карт (heat maps) осуществляли на языке R. Для выбора минимального набора генов и создания предсказательных моделей использовали LASSO-пенализованную логистическую регрессию. Анализ выполняли в оболочке Rstudio (v4.0.1) на языке программирования R. Данные были случайным образом разделены на обучающую и тестовую выборки. Эффективность модели построенной на основе обучающей выборки оценивали на данных тестовой выборки: вычисляли площадь под ROC-кривой и показатель Бриера. Важность переменной определяли путем подсчета доли bootstrap моделей с ненулевым коэффициентом этой переменной. Окончательную модель строили, используя оптимальное значение L1.
Результаты исследования
Анализ данных проектов The Cancer Genome Atlas и cBioPortal. Чтобы подобрать перечень потенциальных молекулярных маркеров для типирования и диагностики серозных опухолей яичника мы использовали данные проекта The Cancer Genome Atlas (TCGA), которые были извлечены с портала Genomic Data Commons. Для анализа нам были доступны данные по пациенткам с кистозными, муцинозными и серозными опухолями/аденокарциномами яичников (TCGA-OV, n=2541), но только для 585 пациенток были доступны данные по копийности
генов в образцах опухоли и прилежащей здоровой ткани. Эти данные были использованы для анализа изменения копийности генов с помощью алгоритма GISTIC2, который идентифицирует области генома, изменяющие размер в ряде образцов опухолей. Было обнаружено 32 значимых результата на уровне фрагментов хромосом, 33 значительных очаговых амплификации и 40 значительных очаговых делеций (рисунок 2).
Рисунок 2. Геномное положение амплифицированных (левая часть рисунка) и делетированных (правая часть рисунка) областей, вычисленное с помощью алгоритма GISTIC2: на оси X представлены нормализованные уровни амплификации (вверху) и значимость по Q-value (внизу)
Таким образом, было проанализировано изменение копийности 20795 генов. Из них было выбрано 429 генов, наиболее часто повышающих свою копийность (от 9,2 до 53,9% рассмотренных случаев) и 429 генов, наиболее часто снижающих свою копийность (от 4,8 до 44,9% рассмотренных случаев). Из 858 генов, повышающих и понижающих свою копийность в опухолевой ткани яичника, 274 гена являются перекрывающимися, т.е. на выборке из 585 пациенток можно выделить 274 гена, копийность которых наиболее часто изменена относительно нормальной ткани, при чем также часто наблюдается как увеличение копийности этих генов, так и ее снижение. В качестве маркерных генов приемлемо рассматривать не перекрывающиеся генетические локусы.

Используя данные с CBioPortal for Cancer Genomics были также выявлены генетические локусы, наиболее часто изменяющие копийность в опухолевой ткани у больных серозной аденокарциномой яичника. Проведя сравнительный анализ результатов работы двух алгоритмов было подобрано 34 гена (CYP1-A1, -A2, -B1, CYP19A, ESR1/2, GPER, STS, SULT1-A, -E1, BAX, BCL-2, TP-53, MDM2, CASP-9, CASP-3, CASP-7, CASP-8, PRKCI, SOX2, OCT4, PIK3, PTEN, CMYC, SOX18, AKT1, NOTCH1, BRCA1/2, EXO1, SCNN1A, KRAS, EGFR и BRAF), показатель копийности которых можно использовать в качестве маркеров серозной аденокарциномы яичников.
Показатель копийности генетических локусов в опухолевых клетках больных серозной аденокарциномой яичника. Вариации в числе копий генов (Copy Number Variation (CNV)) – вид генетического полиморфизма, результатом которого является уменьшение или увеличение количества копий определенного гена, а, следовательно, снижение или увеличение экспрессии продукта этого гена. Показатель CNV может рассматривать как высокоспецифичный и высокочувствительный биологический маркер, подходящий как для ранней диагностики, так и для молекулярного типирование опухолей (Кутилин Д.С. и соавт., 2017, 2019).
В объединенной выборке (200 пациентов: 104 пациента с lgSC – серозная аденокарцинома низкой степени злокачественности, 96 пациентов с hgSC – серозная аденокарцинома высокой степени злокачественности), обнаружено статистически значимое (p<0,005) увеличение копийности генов PIK3CA и BCL2 в 2,0 раза и 4,2 раза соответственно, и снижение копийности BAX, CASP-3 и CASP-8 в 2,0 раза, 1,7 раза и 1,7 раза соответственно в опухолевых клетках относительно нормальных клеток яичника (рисунок 3в). На рисунке 3г, представляющем из себя тепловую карту, совмещенную с кластерным анализом, представлены данные по копийности 34 генетических локусов у 200 больных серозным раком яичников. Эти данные свидетельствуют о значительной гетерогенности показателя копийности у этих больных. Проведенный кластерный анализ разделил имеющуюся выборку (n=200) на 2, соответствующие 2 гистологическим подтипам: высокой (кластер 1, n=96) и низкой (кластер 2, n=104) степени злокачественности (рисунок 3г и 3е). Рисунок 3. Гистологические и молекулярно-генетические характеристики серозной аденокарциномы яичника. Гистологическое исследование (Ув. 200х): А – серозная аденокарцинома низкой степени злокачественности (однородные ядра, редкие митотические фигуры), Б – серозная аденокарцинома высокой степени злокачественности (ядерный плеоморфизм, частые митотические фигуры). В – кратность изменения копийности генетических локусов в опухолевых клетках серозной аденокарциномы относительно нормальных клеток яичников (n=200; * – статистически значимые отличия, р<0.05). Г – тепловая карта, визуализирующая гетерогенность показателя копийности генов в опухолевых клетках и результаты кластерного анализа. Д - показатели копийности генов в двух кластерах (n=96 и 104 соответственно), * – статистически значимые отличия копийности в опухолевых клетках относительно нормальных, р<0,05; * – статистически значимые отличия копийности генов в кластере 1 и 2, р<0.05); Е – профиль копийности генов, отражающий гетерогенность выборки и её подразделение на подгруппы (аналог Г) Данные кластеры статистически значимо отличались по копийности генов (р<0,005): в кластере 1 была повышена копийность MDM2, SOX2, ESR1, CYP1-B1 и SULT1-E1 в 3,4, 5,3, 4,2, 4,0 и 2,9 раза соответственно и снижена копийность TP-53 и BRCA2 в 2,0 и 2,5 раза соответственно; в кластере 2 была повышена копийность PIK3CA, PTEN и BCL2 в 2,5, 2,5 и 4,7 раза соответственно и снижена копийность BAX, CASP-3 и CASP-8 в 2,5, 2,0 и 2,0 раза соответственно в опухолевых клетках яичника относительно нормальных. При этом число копий PIK3CA, PTEN и BCL2 в 2,4, 2,6 и 3,9 раза соответственно было выше (р<0,05), а BAX, MDM2, CYP-1B, ESR1, SULT1-E1 и SOX2 в 2,3, 2,7, 3,8, 3,3, 2,0 и 4,0 раза соответственно ниже (р<0,05) в опухолевых клетках lgSC по сравнению с опухолевыми клетками hgSC (рисунок 3д). Также при проведении кластерного анализа удалось выделить несколько подгрупп в 2 основных кластерах: в кластере 1–3 подгруппы (n1к-1=20, n1к-2=41, n1к-3=35), а в кластере 2–4 подгруппы (n2к-1=21, n2к-2=30, n2к-3=29, n2к-4=24) (рисунок 3г). Подгруппы первого кластера статистически значимо (р<0,05) отличались по копийности генов SULT1-E1 (1 и 3 подгруппа) и SOX2. Подгруппы 1, 3 и 4 кластера 2 отличались по копийности гена PTEN, а подгруппа 1 и 2 по копийности гена BCL2. Выживаемость больных с различными молекулярными подтипами серозной аденокарциномы. Анализ динамики показателя кумулятивной выживаемости в группах пациенток в зависимости от молекулярно- генетического и гистологического типа опухолей показал, что выживаемость в течение 12 мес. при lgSC была на уровне 78.6%, тогда как при hgSC значение этого показателя было статистически значимо ниже и составляло 57,7%. При оценке двухгодичной выживаемости выявленное соотношение значений кумулятивной выживаемости сохранялось, их уровни составили через 2 года 64,3 и 40,4% соответственно в группах с lgSC и с hgSC. Трехлетняя выживаемость в этих группах составила 46,4 и 20,2% соответственно, то есть у пациенток с hgSC уровень показателя был ниже в 2,3 раза, чем в группе lgSC. При этом отмечены статистически значимые межгрупповые отличия выживаемости в этих группах больных (F-критерий Кокса =2,34; р=0,02). Оценка выживаемости в кластере 1 (hgSC) пациенток в зависимости от молекулярного подтипа выявила, что выживаемость в течение 12 месяцев для подтипа 1 была на уровне 48,0%, в то время как для подтипа 2 значение этого показателя составляла 65,4%, а для подтипа 3 выживаемость была на уровне 58,1% (рисунок 4). Через 2 года выявленное соотношение значений кумулятивной выживаемости практически не изменилось. При этом выживаемость пациентов с 1 и 2 подтипом hgSC статистически значимо различалось в 1,8 раза. Трехлетняя выживаемость для этих подтипов была соответственно на уровне 28,9, 25,2 и 12,0%. При этом отмечены статистически значимые межгрупповые отличия в выживаемости для больных с этими подтипами РЯ: между подтипами 2 и 1 различие было в 2,4 раза, а между подтипами 3 и 1 различие было в 2,1 раза. Рисунок 4. Общая выживаемость больных РЯ в зависимости от молекулярных типов и подтипов опухоли. Оценка выживаемости в кластере 2 (lgSC) пациенток в зависимости от молекулярного подтипа выявила, что выживаемость в течение 12 месяцев больных с подтипом 1 была на уровне 93%, подтипом 2 – 90,1%, подтипом 3 – 57,8%, а с подтипом 4 была на уровне 82,6%. При этом выживаемость для подтипа 3 статистически значимо отличалась от выживаемости для подтипов 1, 2 и 4 (рисунок 4). В дальнейшем наблюдалось постепенной снижение значения показателя кумулятивной выживаемости для больных этими подтипами РЯ. Через 24 месяца значения этого показателя были 63,7, 75,3, 42,2 и 60,9% для подтипов 1, 2, 3 и 4 соответственно. При этом выживаемость больных с подтипом 3 статистически значимо отличалась от этого показателя для больных с подтипом 2. Трехлетняя выживаемость больных этими подтипами РЯ была соответственно на уровне 35,9, 47,2, 24,3 и 39,7%. При этом отмечено статистически значимое межгрупповое отличия в выживаемости больных РЯ между подтипами 2 и 3 (таблица 1). Таблица 1 – Общая выживаемость больных РЯ в зависимости от молекулярных типов и субтипов опухоли Серозная аденокарцинома яичника Низкой степени злокачественности Высокой степени злокачественности Выживаемость в подгруппах, % Выживаемость в подгруппах,% 1234123 Таким образом, было установлено, что 2 основных типа серозной аденокарциномы яичника (высокой и низкой степени злокачественности) существенно отличаются по такому показателю как общая выживаемость. Важно отметить, что каждый из этих типов обладает внутригрупповой молекулярно- генетической гетерогенностью, которая позволила выделить в каждом из них дополнительные молекулярные подтипы, также отличающиеся по выживаемости пациенток. Показатель копийность генов во внеклеточной ДНК как диагностический маркер серозной аденокарциномы яичника высокой и низкой степени злокачественности. На современном этапе развития молекулярной онкологии разработка высокоэффективных и малоинвазивных подходов ранней диагностики невозможна без скрининг молекулярно- генетических маркеров во внеклеточной ДНК (внДНК) плазмы крови. В качестве таких маркеров большим потенциалом обладает показатель вариации числа 12 мес. - 78,6% 24 мес. - 64,3% 36 мес. - 46,4% 12 мес. - 57,7% 24 мес. - 40,4% 36 мес. - 20,2% 12 мес.-93,0 24 мес.-63,7 36 мес.-35,9 12 мес.-90,1 24 мес.-75,3 36 мес.-47,2 12 мес.-57,8 24 мес.-42,2 36 мес.-24,3 12 мес.-82,6 24 мес.-60,9 36 мес.-39,7 12 мес.-48,0 24 мес.-28,0 36 мес.-12,0 12 мес.-65,4 24 мес.-49,5 36 мес.-28,9 12 мес.-58,1 24 мес.-36,4 36 мес.-25,2 Кластер 1 (hgSC) Кластер 2 (lgSC) копий генов (Copy Number Variation (CNV)). Внеклеточная ДНК (внДНК) в плазме крови, как правило, происходит из ядерной и митохондриальной ДНК соматических или опухолевых клеток, подвергшихся апоптозу/некрозу; ДНК клеток крови, вирусной и бактериальной ДНК (Кутилин Д.С. и соавт., 2017). Проведенный анализ позволил сформировать список генетических локусов, пoказатeль кoпийнoсти которых обладает большим потенциалом для малоинвазивной диагностики серозной аденокарциномы яичников (таблица 2). Таблица 2 – Потенциальные маркеры для малоинвазивной диагностики серозной аденокарциномы яичников CNV повышено MDM2 SOX2 ESR1 CYP1B1 SULT1E1 CNV понижено TP53 BRCA2 CNV повышено PIK3CA PTEN BCL2 CNV понижено BAX CASP3 CASP8 На внДНК, выделенной из плазмы 50 пациенток с hgSC и 50 пациенток с lgSC, а также 30 условно здоровых доноров, проведена валидация потенциальных маркеров, представленных в таблице 2. В ходе валидации обнаружено статистически значимое (р<0,005) увеличение числа копий генов SULT1-E1, CYP1-B1 и ESR1 в 2,8 раза, 3,0 раза и 5,0 раз соответственно во внДНК у 80,0, 75,0 и 85,0% соответственно обследованных больных hgSC относительно внДНК плазмы крови условно здоровых доноров (рисунок 5). Рисунок 5. Показатель относительного количества копий генететических локусов во внДНК пациенток с hgSC (левый график) и lgSC (правый график). * – статистически значимые изменения относительно количества копий генетических локусов во внДНК плазмы крови условно-здоровых доноров (р<0,005) Обнаружено статистически значимое (р<0,05) увеличение копийности генетических локусов PTEN и BCL2 в 1,9 и 4,1 раза соответственно во внДНК плазмы крови у больных lgSC относительно внДНК плазмы крови условно здоровых доноров. При этом наблюдалось статистически значимое (р<0,05) снижение числа копий генов BAX и CASP-3 в 3,3 и 2,5 раза во внДНК плазмы крови у 75,0 и 80,0% соответственно обследованных больных lgSC относительно внДНК плазмы крови условно здоровых доноров (рисунок 5). Основываясь на полученных результатах (рисунок 5), далее формирование диагностической панели генов маркеров hgSC и lgSC производили на основе 49 пар генов, копийность которых значимо и стабильно отличалась между больными раком и условно здоровыми донорами. Вначале для оценки диагностической значимости выбранных генов был проведен анализ их способности классифицировать доноров на группу больных раком или здоровых при помощи ROC-кривых. ROC-кривые со значением площади под кривой (AUC) не менее 0,70 представлены на рисунке 6. Для пары генетических локусов ESR1/BCL2 значение AUC было равно 0,80, для PTEN/BCL2 – 0,76; BAX/CASP3 – 0,76; BAX/BCL2 – 0,70; PTEN/BAX – 0,72 и CYP1B1/ESR1 – 0,73 (рисунок 6). Как видно из представленных на рисунке 6 данных, ни одна из пар маркеров не позволяла полностью разделить группы доноров. Поэтому для получения надежной диагностической панели генов применили математический подход, основанный на LASSO-пенализованной логистической регрессии и оптимизированный при помощи множественных перевыборочных (bootstrap) наборов данных (рисунок 7). Регрессионные модели формировали из 14-ти пар генов с наиболее высоким значением AUC. Выбранные модели позволили правильно классифицировать образцы с точностью среднего значению AUC=0.93 (95% CI 0.9305-0.9320). Высокая важность перемеренных (рисунок 7Б) указывает на устойчивость классификатора к изменению состава выборки и на успешность методов отбора пар генов на предшествовавших этапах. На основании bootstrap-моделей получена финальная панель генов: PTEN/SULT1E1, ESR1/BCL2, PTEN/BCL2, BAX/BCL2, ESR1/BAX, PTEN/BAX и CYP1B1/ESR1. Рисунок 6. ROC-кривые классификации групп больных hgSC и условно-здоровых доноров (сплошная линия) или больных lgSC и условно-здоровых доноров (прерывистая линия) на основании показателя копийности генов Рисунок 7. LASSO-пенализованная модель для логистической регрессии уровня относительной копийности генов во внДНК плазмы крови. (A) Распределение регрессионных коэффициентов в bootstrap наборах данных; (Б) Важность переменных в bootstrap-моделях; (В) ROC-кривые для классификации образцов при помощи оптимизированной модели (непрерывная линия) и неоптимизированной модели (прерывистая линия) Такое сочетание генов обеспечивает диагностическую чувствительность на уровне 95%, а специфичность на уровне 90% (AUC 0.98) при разделении доноров на группу онкологических больных и здоровых (рисунок 7В). Однако, информативность такой панели гораздо шире, чем выявление серозной аденокарциномы яичника. Из вошедших в панель генов пары PTEN/BCL2, BAX/BCL2, PTEN/BAX и PTEN/BCL2 связаны с опухолями низкой степени злокачественности, а CYP1B1/ESR1 – с опухолями высокой степени злокачественности. При этом важно отметить, что применение панели, состоящей из PTEN, SULT1E1, ESR1, BAX, BCL2 и CYP1B1 позволяет выявлять больных серозной аденокарциномой яичника двух групп: низкой и высокой степени злокачественности (AUC=0.96). На основании полученных данных было разработано два способа малоинвазивной диагностики: – Малоинвазивный способ диагностики серозной аденокарциномы яичников высокой степени злокачественности на основании показателя копийности генов CYP1-B1 и ESR1; – Малоинвазивный способ диагностики серозной аденокарциномы яичников низкой степени злокачественности на основании показателя копийности генов PTEN, BCL2 и BAX. Таким образом, полученные данные позволили разработать способы дифференциальной малоинвазивной диагностики серозной аденокарциномы яичников высокой и низкой степени злокачественности. Результаты исследования подтвердили наличие молекулярно-генетической гетерогенности серозной аденокарциномы яичников и позволили сформировать перечень генов, показатель копийности которых обеспечивает разделение серозной аденокарциномы яичников высокой и низкой степени злокачественности на несколько молекулярных подтипов, отличающихся уровнем общей выживаемости больных. ВЫВОДЫ 1. Биоинформационный анализ выявил 34 генетических локуса (BAX, BCL2, TP-53, MDM2, CASP-9, CASP-3, CASP-7, CASP-8, PRKCI, SOX2, OCT4, PIK3, PTEN, CMYC, SOX18, AKT1, NOTCH1, BRCA1/2, EXO1, SCNN1A, KRAS, EGFR, BRAF, CYP1-A1, -A2, -B1, CYP-19A, ESR1/2, GPER, STS, SULT-1A, SULT1-E1), показатель копийности которых можно использовать в качестве маркеров серозной аденокарциномы яичников. 2. Серозная аденокарцинома яичника высокой степени злокачественности характеризуется статистически значимым (р<0,005) повышением копийности генов MDM2, SOX2, ESR1, CYP1-B1 и SULT1-E1 в 3,4, 5,3, 4,2, 4,0 и 2,9 раза соответственно, и снижением копийности генов TP-53 и BRCA2 в 2,0 и 2,5 раза соответственно, а серозная аденокарцинома яичника низкой степени злокачественности – статистически значимым (р<0,005) повышением копийности PIK3CA, PTEN и BCL2 в 2,5, 2,5 и 4,7 раза соответственно и понижением копийности генов BAX, CASP-3 и CASP-8 в 2,5, 2,0 и 2,0 раза соответственно в опухолевых клетках яичника относительно нормальных. 3. Серозную аденокарциному яичника высокой степени злокачественности можно разделить на 3 молекулярных подтипа, отличающихся уровнем копийности генов SULT1-E1 и SOX2, а также общей выживаемостью больных. Серозную аденокарциному яичника низкой степени злокачественности можно разделить на 4 молекулярных подтипа отличающихся уровнем копийности генов PTEN и BCL2 и общей выживаемостью больных. 4. Одновременное определение показателей копийности генов PTEN, SULT1-E1, ESR1, BAX, BCL2 и CYP1-B1 во внеклеточной ДНК плазмы крови (положительно коррелируют с данными показателями в опухолевых клетках), позволяет выявлять больных серозной аденокарциномой яичника двух групп: низкой и высокой степени злокачественности. 5. Разработан способ малоинвазивной диагностики серозной аденокарциномой яичника низкой степени злокачественности с чувствительностью 95% и специфичность 91%, основанный на определении показателя копийности генов PTEN, BAX и BCL2 во внеклеточной ДНК плазмы крови. 6. Разработан способ малоинвазивной диагностики серозной аденокарциномой яичника высокой степени злокачественности с чувствительностью 98% и специфичность 90%, основанный на определении показателя копийности генов CYP1-B1 и ESR1 во внеклеточной ДНК плазмы крови. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Для эффективной малоинвазивной диагностики серозной аденокарциномой яичника низкой и высокой степени злокачественности целесообразно проводить определение показателя копийности генов PTEN, SULT1E1, ESR1, BAX, BCL2 и CYP1B1 во внеклеточной ДНК плазмы крови.