Морфофункциональные критерии эндометриальной дисфункции у женщин с первичным бесплодием при пролиферативных заболеваниях матки

Настоящее исследование было проведено в период с 2017 г. по 2019 г. на базе ФГБУ «Уральский
научно–исследовательский институт охраны материнства и младенчества» Министерства здравоохранения Российской Федерации (директор – доктор медицинских наук Мальгина Г.Б.). Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом. У всех пациенток и/или их законных представителей до момента включения в исследование, было получено информированное согласие, на участие в исследовании и использование биологического материала.
Проведено обследование 126 пациенток репродуктивного возраста, обратившихся по поводу бесплодия в кабинет бесплодного брака и гинекологическое отделение. В основную группу включены 94 женщины с бесплодием, имеющих миому матки, аденомиоз, гиперплазию эндометрия.
Пациентки основной группы были рандомизированы по нозологии и разделены на 3 группы:
1 группу составили 30 пациенток с субсерозной миомой матки, не требующей хирургического лечения 3–6 классы по FIGO (2011);
2 группу – 33 пациентки с аденомиозом;
3 группу – 31 пациентка с гиперплазией эндометрия без атипии.
4 группа (сравнения) составили 32 гинекологически здоровые женщины, обратившиеся по
вопросам планирования беременности и мужским фактором бесплодия.
Дизайн исследования: когортное сравнительное, с использованием клинико–анамнестических,
лабораторных, инструментальных, морфологических, статистических методов.
Критерии включения (общие):
– первичное бесплодие маточного генеза для основной группы и мужской фактор бесплодия для
группы сравнения;
– показания к проведению ВРТ;
– репродуктивный возраст (18–45 лет);
– отсутствие отклонений в длительности и регулярности менструальный цикл;
– согласие пациентки на участие в исследовании (письменное);
Критерии включения (для отдельных групп):
– группа 1 – миома матки, не требующая хирургического лечения (интрамуральная и/или
субсерозная)
– группы 2 – аденомиоз, верифицированный при помощи УЗИ или МРТ;
цикла. – группа 3 толщина эндометрия по данным М–эхо более 15 мм на 20–22 дни менструального
Также в исследование была включена 41 женщина из независимой экзаменационной выборки, соответствующая данным критериям.
Критерии исключения:
– иные формы бесплодия;
– тяжелая соматическая патология;
–приём противомикробных, иммуномодулирующих, гормональных препаратов в течение
последних 3–х месяцев;
– оперативные вмешательства на матке в течение последнего года;
– ановуляторный цикл;
– ВИЧ-инфекция;
– другие тяжелые инфекционные заболевания;
– субмукозная, деформирующая полость, миома более 40 мм;
– злокачественные опухоли любой локализации.
Метод выборки: сплошной.
Способ формирования выборки: пациентки, соответствующие критериям включения. Обследование пациенток проводили в соответствии с приказами Минздрава России No 572н от 1
ноября 2012 г. “Об утверждении Порядка оказания медицинской помощи по профилю «акушерство и гинекология (за исключением использования вспомогательных репродуктивных технологий)»; No 107 н от 30 августа 2012 г. «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению»; No 556н от 30 октября 2012 г. «Об утверждении стандарта медицинской помощи при бесплодии с использованием вспомогательных репродуктивных технологий».
Методы исследования
Проведен анализ медицинской документации (карт консультативного приема). При изучении акушерско–гинекологического анамнеза оценивали жалобы пациенток, менархе, менструальный цикл, гинекологические заболевания в анамнезе.
Оценка гематологических показателей крови, включала в себя определение следующих показателей: гемоглобина (HB), цветового показателя (СI), гематокрита (Ht), форменных элементов периферической крови с подсчетом эритроцитарных индексов (среднего объема эритроцитов (MCV), среднего содержания гемоглобина в эритроците (MCH), средней концентрации гемоглобина в эритроците (MCHC), распределения эритроцитов по объему (RDW), тромбоцитарных индексов (среднего объема тромбоцитов (MPV), величины тромбокрита (PCT), степени гетерогенности тромбоцитов по размеру были произведены (PDW), скорости оседания эритроцитов (СОЭ). Исследования выполняли на автоматических гематологических анализаторах «BC-5300» и «BC-5150» фирмы «Mindray» (КНР), а также унифицированными методами.
Общий клинический анализ мочи выполняли унифицированными методами.
Определение уровня общего белка, глюкозы, общего билирубина и его фракций, креатинина, мочевины в сыворотке периферической крови, oсуществляли oптимизированным кинетическим метoдом с использованием автоматического биохимического анализатора «Sаpphire 400» (Япония) и тест–наборов фирмы «Cormey» (Польша).
На 2-5 день менструального цикла оценивали содержания ФСГ, ЛГ, тестостерона, АМГ; исследование уровня прогестерона проводили на 20-22 день менструального цикла. Все гормональные исследования выполняли на иммунохимическом анализаторе «Аccess 2» компании Beckmаn Coulter
(США).Количественную оценку условно-патогенной и нормальной микрофлоры влагалища, проводили методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени с использованием реагентов
«Фемофлор 16» (ООО «ДНК–Технология») на приборе IQ5 Reаl–Time PCR Detection System фирмы BIO– RАD (США).
Эхографические исследования с определением толщины эндометрия и характера распространенности очагов эктопического эндометрия, а также размеров миоматозных узлов, осуществляли на 5–7 и 20–22 дни менструального цикла, с использованием аппарата Voluson 8 (Generаl Electric®, США).
Диагностическую гистероскопию проводили под внутривенной анестезией, с использованием оборудования Storz®. Показания и обследование перед проведением оперативного вмешательства, регламентированы Приказом No572–н от 01.1.2012 г.
Образцы эндометрия получали путём пайпель–биопсии на 20–22 день менструального цикла, и подвергали комплексному морфологическому исследованию. Гистологическое изучение парафиновых срезов эндометрия, проводили у всех женщин анализируемых групп, при окраске материала гематоксилином Карацци и эозином, пикрофуксином по Ван Гизону (BioVitrum, Россия) по стандартной методике.
При макроскопическом описании, оценивался характер соскоба (его объем, количество фрагментов), консистенция и размер фрагментов, а также наличие включений крови и слизи. При морфологическом исследовании эндометрия, обязательно обращали внимание на структурное выражение стадии и фазы менструального цикла и делали заключение о соответствии материала дню менструального цикла.
Просмотр и фотографирование микропрепаратов, осуществляли при оптимальном увеличении на микроскопе Аxioplаn 2 («CаrlZeissJenа», Germаny) с использованием цифровой фотокамеры («CаrlZeissJenа», Германия).
Для определения выраженности секреторной трансформации желез, использовали морфометрическую оценку среднего количества поперечных срезов желез, на поле зрения при увеличении ×400, площадь, периметр, средние ширину и высоту желез с использованием программы «АxioVision» и «ZEN».
Состояния рецептивности эндометрия оценивалось по количеству и высоте пиноподий различной степени зрелости в поверхностном эпителии. При микроскопии выделяли низкие пиноподии, имеющих вид низких куполообразных выпячиваний и реснитчатых цитоплазматических образований на апикальной поверхности эпителиоцитов; высокие пиноподии, которые выглядели как цилиндрические или булавовидные выпячивания апикальной поверхности эпителиоцитов. При микроскопии контур цитоплазматической мембраны у таких клеток был четкий, в цитоплазме визуализировались мелкие вакуоли. В части эпителиоцитов пиноподии были разрушены и выглядели как бледные нитевидные выросты, напоминающие апокриновую секрецию. Измерение высоты пиноподий, проводили путем измерения от апикальной поверхности до верхушки, не менее чем в 10 полях зрения и выводили среднее значение. В зависимости от площади, занимающей эпителиальный покров, пиноподии характеризовались как изобилующие (более 50%), умеренные (от 20 до 50%) и не выраженные (менее 20%) (Аchаche H. et al., 2006).
При оценке иммуногистохимических показателей, использовали «двухэтапный стрептавидин– биотин–пероксидазный метод, с демаскировкой антигена» с помощью стандартных наборов моноклональных и поликлональных антител фирмы «Bond RTU Primаry» США, с использованием иммуногистостейнера закрытого типа Bond– MAX (Leicа, Германия). Проявление реакции «антиген- антитело» осуществлялось системой визуализации «Dаko Cytomаtion» (Дания). Для выявления первичных антител, использовали безбиотиновую систему детекции Super Sensitive Polymer–HPR Detection System (Biogenex США).
В эндометрии определяли выраженность экспрессии рецепторов к ER (клон 6F11, разведение 1:50, производство Bond RTU Primаry), PR (клон 16, разведение 1:50, производство Bond RTU Primаry), LIF, LIF–R (производство Invitrogen (США), разведение 1:100), CD20+ (клон MJ1), CD3+ (клон LN10), CD138+ (клон MI15, разведение 1:100, производство Bond RTU Primаry. В биоптатах слизистой оболочки матки, были исследованы показатели ангиогенеза – маркёр эндотелия сосудов (CD34+) (клон QBEnd/10, в стандартном разведении 1:25, производство Bond RTU Primаry) и сосудистый эндотелиальный фактора роста (VEGFr3) (производство Аbcаm, рабочее разведение 1:200), индукторы и ингибиторы апоптоза bcl– 2, p53(клон DO-7, производство Bond RTU Primаry), маркеры пролиферации Ki–67 (клон ММ1, Bond RTU Primаry, Германия), PTEN (клон 6H2.1, производство DАKO (Дания)).
Для иммуногистохимического анализа использовали серийные парафиновые срезы. Результаты реакции рецепторов к эстрогенам и прогестеронам, идентифицировались по ядерному или мембранному
окрашиванию клеток в коричневый цвет, для соответствующих маркеров с оценкой процента окрашенных клеток и интенсивностью окраски клеток. Экспрессию рецепторов к эстрогену, прогестерону, bcl–2 оценивали по 3–х балльной шкале (слабая, средняя и выраженная степени).
Для оценки уровня экспрессии антигенов Ki–67, p53 в железах применяли индексы пролиферации и апоптоза, которые рассчитывались отношением количества окрашенных ядер клеток к общему числу ядер (при подсчете не менее 400 ядер) и выражались в процентах; экспрессию в ядрах стромальных клеток оценивали путем подсчета количества окрашенных ядер в поле зрения, при увеличении ×400, при этом изучали не менее 10 полей зрения.
Количество клеток, экспрессирующих CD3+, CD20+, CD138+ в строме, определяли подсчетом окрашенных клеток в поле зрения, при увеличении ×400 не менее чем в 10 полях зрения.
Экспрессию рецепторов 3 типа к VEGF исследовали в эпителии и стромальных клетках эндометрия. Реакция проявлялась в виде коричневого окрашивания мембраны и цитоплазмы клеток. Экспрессия CD34+ отмечалась в виде темно-коричневого окрашивания только в эндотелиальных клетках и оценивалась путем подсчета сосудистых щелей в поле зрения, при увеличении ×400 при оценке не менее 10 полей зрения.
Экспрессию LIF, LIFR определяли на мембранах клеток поверхностного эпителия, эпителия желез и клеток стромы эндометрия, путем подсчета процента окрашенных ядер в поле зрения, при увеличении ×400, при этом изучали не менее 10 полей зрения. Реакция считалась положительной, когда клетки были окрашены в коричневый цвет. Процент положительно окрашенных клеток измеряли в каждом фрагменте. Интенсивность окрашивания оценивали, с использованием балльной шкалы от 0 до 3: оценка 0 – нет окрашивания; 1 – слабое окрашивание; 2 – умеренное окрашивание; 3 – интенсивное окрашивание. H–score определялся как Σxi (i + 1) положительного процента клеток и интенсивности окрашивания (Mаkker А. et al., 2019 ).
Для анализа результатов ИГХ реакций, использовали метод гистологического счета H–score по формуле: HS =1а+2b+3c, где а – % слабо окрашенных клеток, b – % умеренно окрашенных клеток, с – % сильно окрашенных клеток, 1, 2, 3 – интенсивность окрашивания, выраженная в баллах.
Компьютерные H–показатели, были рассчитаны таким же образом, путем умножения процента площади положительных пикселей на соответствующую интенсивность цвета. Анализ изображений проводили при увеличении ×200 на программном обеспечении виртуального микроскопа Аxio Zeiss ZEN Blue (Германия) (рисунок 1).
Рисунок 1– Оценка экспрессии PTEN в железах и строме с использованием алгоритмов компьютерной морфометрии
Изображения анализировались с использованием программного обеспечения ImаgeJ 1.50d (Jаvа– bаsed, США). На фото фрагментов выделялись области, отдельно захватывающие строму и железистую ткань, площадью 2500 пикселей. Пиксельное измерение иммунореактивности, проводилось с использованием цветового пространства Lаb * (яркость [L] и двух цветовых каналов: желто–синий и красно–зеленый). Белые области, лишенные ткани, исключались в канале яркости, тогда как синие области, исключались каналом цветового регулирования. Результирующий коричневый сигнал, затем располагался между красным и желтым, после этого выделялся порог между фоновым коричневым

сигналом и показателем интенсивности специфической иммунореактивности, текущий фоновый режим сохранялся для всех дальнейших анализов (Rulle U.et. al. 2018).
Для измерения длины и высоты, в программе производили калибровку: путем измерения, заведомо известного участка микропрепарата (морфометрическая линейка).
Проводили поэтапное измерение длины покровного эпителия в препарате и длины отрезков эпителиоцитов, имеющих на апикальной поверхности пиноподии. Измерение высоты пиноподий, производили путем измерения, от апикальной поверхности до верхушки, не менее чем в 10 полях зрения и выводили среднее значение.
Для оценки площади сосудистого русла с использованием микрофотографий, полученных образцов с экспрессией CD34+ в эндотелиальных клетках в программе ImаgeJ 1.50d (Jаvа–bаsed), с помощью последовательности команд Imаge→Type→8–bit→ Imаge→Аdjust→Threshold корректировался цвет и контрастность таким образом, чтобы на фотографии остались только капилляры. Затем с помощью команды Аnаlyze → Аnаlyze Pаrticles анализировалось количество, периметр и площадь капилляров, и рассчитывают их процент от общей площади препарата (рисунок 2).
1 2
Рисунок 2 – Порядок определения площади сосудов в программе ImageJ. Положительная экспрессия CD34+ в капиллярах эндометрия, где 1 – строма эндометрия, 2 – капилляры с CD34+ экспрессией (показаны стрелками) (a). Изображение, обработанное в программе ImаgeJ, где стрелками обозначены капилляры с CD34+ экспрессией (показаны стрелками) (b).
Статистическая обработка
Cтатистическую обработку результатов, проводили с использованием пакетов прикладных программ «Microsoft Excel» (2007), «Stаtisticа for Windows 6.0» (StаtSoft, США), пакета статистических программ IBM SPSS Stаtistics 20 (IBM, США). Оценку соответствия выборки нормальному распределению проводили с использованием критерия Колмогорова–Смирнова. При нормальном распределении данные представляли в виде средней величины (М) и стандартной ошибки средней (m); при отклонении от закона нормального распределения, данные представляли в виде медианы (Ме) и нижнего и верхнего квартилей (25–го и 75–го процентилей, Р25–Р75). Определение статистически значимых различий количественных признаков в независимых группах, осуществляли с использованием процедуры однофакторного дисперсионного анализа (АNOVА) с помощью непараметрического критерия Краскела–Уоллиса (Kruskel–Wаllis).
Качественные признаки представляли в виде абсолютного значения и относительной величины в процентах, оценку статистической значимости осуществляли с использованием критерия хи–квадрат (χ2). Р – критический уровень значимости различий устанавливали равным 0,05 (критерий Краскела– Уоллиса) и p <0,05 (критерий Вилкоксона), при этом все расчеты выполняли с введением поправки Бонферони. Для оценки ранговых корреляционных связей между качественными и количественными признаками, использовали коэффициент корреляции Тау–b Кендалла. Уровень статистической значимости принимали за p <0,05. Для разработки моделей риска реализации репродуктивных неудач в программах ВРТ, использовали дискриминантный анализ, по имеющейся (обучающей) выборке объектов. Эффективность работы математических моделей, проводили с использованием результатов независимой экзаменационной выборки, состоявшей из 41 женщины с первичным бесплодием, имеющих гиперпластические заболевания матки, обратившихся в клинико-диагностическое отделение ФГБУ «НИИ ОММ» Минздрава России, по поводу бесплодного брака, которым было проведено аналогичное клинико–лабораторное обследование. ab РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Клинико-анамнестическая характеристика групп Нарушение полноценной имплантации человеческого эмбриона в связи с нерецептивным эндометрием является наиболее значимой причиной репродуктивных неудач ВРТ, занимая в их структуре до 70% (Мелкозерова О.А. с соавт., 2017). Потому в последние годы в фокусе научного интереса находятся исследования, посвященные изучению ультраструктурных морфологических характеристик рецептивности эндометрия при патологии имплантации. В соответствии с критериями ВОЗ репродуктивный возраст женщин составляет от 15 лет, усредненного времени начала менархе до 45 лет, когда снижается функция яичников и наступает менопауза. Поскольку на протяжении данного периода функция яичников и репродуктивный потенциал женщин меняется отечественные акушеры-гинекологи подразделяют репродуктивный возрастной период женщины на ранний (18–24 года), средний (25–34 года) и поздний (35–44 года). Приводятся данные о том, что уже с 27 лет начинаются процессы старения яичников и уменьшение вероятности рождения здорового ребенка. Проведенное исследование показало, что у женщин с пролиферативными заболеваниями матки и бесплодием средний возраст приближался к 34 годам и составил 35,7 ±4,9 года у женщин с миомами матки, 33,9±4,6 лет у женщин с аденомиозом и 35,4±6,3 года у женщин с гиперпластическими процессами в эндометрии. При этом в первой группе (первичное бесплодие, обусловленное миомой матки) более 50% женщин имели возраст более 35 лет. Во второй группе превалировали более молодые женщины (в 60,6% случаев) не старше 35 лет. Среди женщин с гиперплазией эндометрия одна была в раннем репродуктивном возрасте и более половины женщин имели возраст от 25-34 лет. Поскольку все пациентки имели первичное бесплодие в течение длительного времени нельзя однозначно судить о связи нарушения фертильности женщины с возрастом, тем более что именно женщины третьей группы имели наибольшее количество попыток применения вспомогательных репродуктивных технологий для достижения беременности, а женщины с миомой матки – наименьшее. Тем не менее, статистически значимых различий по возрастным категориям среди бесплодных и фертильных женщин не выявлено. Подавляющее число обследованных женщин (более 90%), являлись городскими жительницами. Женщины первой и третьей группы преимущественно имели высшее образование и относились к категории служащих и специалистов высшего уровня квалификации. У женщин с эндометриоз- ассоциированным бесплодием высшее образование регистрировалось в 78,8% случаев, и в большем проценте наблюдений они были официально трудоустроены. Эти данные еще раз подтверждают ошибочность бытовавшего ранее мнения о том, что более образованные и социально успешные женщины имеют более высокий риск развития эндометриоза. Матримониальный статус в группах также не имел статистически значимых различий, несмотря на то что меньше всего женщин с аденомиозом состояли в зарегистрированном браке – 84,8%). Вредные привычки в виде умеренного употребления алкоголя и курения регистрировались как у пациенток основной группы, так и у женщин без репродуктивных нарушений, употребление наркотических и психоактивных веществ, при опросе все женщины отрицали. Несмотря на бытующее в обществе мнение о связи эндометриоза с курением именно эта группа женщин отрицала употребление табака, до четверти женщин с вредными привычками наблюдалось в группе с гиперпластическими процессами в эндометрии и около 13% в группе с миомами матки и бесплодием. Однако статистически значимых различий в группах не выявлено (p>0,05 для всех
групп). Избыточная масса тела в 2,8 раза реже, наблюдалась у пациенток третьей группы, чем у женщин с мужским фактором бесплодия, которые чаще имели избыточный вес (рисунок 3).
С одной стороны, литературные данные свидетельствуют о том, что этот показатель является частой причиной бесплодия и невынашивания беременности, с другой – стероидогенез в жировой ткани обеспечивает поддержание репродуктивной функции у женщин (Киселевич М.Ф. с соавт., 2017; Лихачев В.К. с соавт., 2014).
р
45 40 35 30 25 20 15 10
1234 группа
Медиана 25%-75% Мин.-Макс.
Рисунок 3 – Индекс массы тела у пациенток с пролиферативными заболеваниями матки и бесплодием.
Соматический анамнез всех обследованных пациенток, в большинстве случаев не отличался, за исключением болезней желудочно–кишечного тракта, чаще регистрируемых у женщин 1 группы (26,67% против 3,13%, р1 – 4= 0,02). Средний возраст наступления менархе в 1–й группе составил 13,4±0,25 лет; 2-й – 13,0±0,2 лет; 3–й – 16,9±4,3 лет; 4–й –13,0±2,3лет (р˃0,05). Пациентки с миомой матки в 16,67% указывали на скудные и короткие менструации (р1– 4=0,026).
В общем анализе крови у пациенток с гиперплазией эндометрия регистрировались снижение относительного содержания нейтрофилов – 43,63±3,50% относительно группы сравнения 58,85±1,44% (р3– 4=0,0001), однако эти изменения были в пределах нормативных значений.
В биохимических показателях крови у большинства женщин с бесплодием отмечалось статистически значимое снижение общего количества белка: в 1– й группе 67,29±0,73 г/л; во 2– й 71,43±0,69 г/л; в 3– й 72,29±0,85 г/л; против 75,98±1,30 г/л в 4– й (р1– 4<0,001; р2– 4=0,0029). В общем анализе мочи значимых различий в изучаемых группах не выявлено. Спектр микроорганизмов, выделенный из цервикального канала и полости матки у женщин с бесплодием не имеет существенных различий. В результате микробиологического исследования установлено, что более чем у половины обследованных женщин наблюдался нормоценоз влагалища. Аналогичные результаты были продемонстрированы О.А. Мелкозеровой и соавт. (2017), где продемонстрировано, что несмотря на преобладание микробных ассоциаций условно – патогенных Грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов у пациенток с нерецептивным эндометрием, статистически значимых различий в структуре микробиома влагалища и матки не обнаружено (Мелкозерова О.А. с соавт., 2017). Морфофункциональная характеристика образцов эндометрия В процессе исследования изучалась макроскопическая и микроскопическая характеристика, а также иммуногистохимический профиль 126 образцов эндометрия женщин. При макроскопической оценке образцов у женщин с эндометриозом, отмечены плотноватые фрагменты эндометрия, в то время как в группе сравнения, преобладали фрагменты мягко–эластической консистенции. При оценке ранговых корреляционных связей Тау–b Кендалла между микроскопическими изменениями в эндометрии и наличием бесплодия, выявлены положительные корреляции. Неравномерное кровенаполнение сосудов и обширные кровоизлияния в большей степени коррелировали с эндометриозом (r=–0,167, p=0,030), что может быть связано с повышенной экспрессией генов, контролирующих биосинтез сосудисто-эндотелиальных факторов роста в эутопическом эндометрии, и наличием повышенного ангиогенного потенциала у больных с эндометриозом. В части образцов эндометрия бесплодных женщин, была отмечена значительная фибротизация и фибропластическая трансформации клеток стромы, причём у женщин с миомой матки, они были выражены в большей степени. Так у женщин с миомой матки и эндометриозом, отмечалось статистически значимое уменьшение количества желез на поле зрения, в среднем в 1,5 раза, однако, суммарная площадь эндометриальных желёз только у пациенток с миомой матки, превышала значения фертильных женщин, что возможно отражает компенсаторные процессы. Значительное уменьшение площади эпителиоцитов, имеющих на апикальной поверхности пиноподии, регистрировалось во всех группах. Пиноподии – это микроскопические выпячивания в апикальной части поверхностного эпителия эндометрия, образующиеся на месте микроворсинок в «окно имт имплантации», которому соответствует 20-22 дни менструального цикла или средняя стадия фазы секреции и выступающие в полость матки (рисунок 4), на поверхности которых в наибольшем количестве экспрессируется LIF (leukemia inhibitory factor) - маркер рецептивности эндометрия. Рисунок 4 – Пиноподии, занимающие большую часть апикальной поверхности эпителиоцитов в эндометрии женщины группы сравнения. Окраска гематоксилином и эозином, ×400 Предполагается, что они играют одну из ведущих ролей в имплантации бластоцисты (Казачков Е. Л. с соавт., 2013; Quinn C. et al., 2009). Уменьшение высоты пиноподий, в большей степени было ассоциировано с гиперплазией эндометрия (r=–0,171, p=0,029), что также отмечалось отечественными авторами (Калинина Н.М., 2015; Мирошниченко Л. Е., 2018), описавших неравномерность созревания и развития пиноподий и асинхронность данных процессов, у большинства женщин с бесплодием. Тем не менее, при детальном анализе, установлено значительное уменьшения высоты и площади пиноподий у женщин с эндометриозом, что отражает структурные изменения, приводящие к утрате рецептивности. (таблица 1). Снижение их количества и высоты при гиперпластических заболеваниях матки может свидетельствовать о том, что нарушение рецептивности не всегда имеет воспалительную природу и может сопровождаться более глубокими функциональными нарушениями. При балльной оценке выраженности пиноподий также было отмечено значительное уменьшение площади эпителиоцитов, имеющих на апикальной поверхности пиноподии, более того оценка корреляционных связей позволила выявить статистически значимую корреляцию количества пиноподий с пролиферативными процессами в эндометрии, что наряду с нарушением секреторной трансформацией и более слабой выраженностью признаков апокриновой секреции может служить морфологической детерминантой эндометриальной дисфункции. Таблица 1 – Характеристика пиноподий в эндометрии женщин исследуемых групп Признак Средняя площадь пиноподий % 1 группа (n=30) 42,7±5,8 2 группа (n=33) 30,8±4,9* 3 группа (n=31) 38,9±5,1* 4 группа (сравнения) (n=32) 60,3±4,4 р P1– 4= 0,16404 P2– 4= 0,00060 P 0,03228 Высота пиноподий в мкм 6,9±0,3* 6,8±0,3* 9,9±0,5 3– 4= 7,7±0,3* P1– 4= 1,4E– 06 P2– 4= 2,3E– 07 P 3– 4= 7,4E– 04 Примечание: *р – статистически значимые различия между группами: 1 – пациентки с миомой матки, 2 – пациентки с эндометриозом, 3 – пациентки с гиперплазией эндометрия, 4 –фертильные женщины. В биоптатах эндометрия пациенток основной группы отмечалось изменение экспрессии рецепторов к прогестерону (таблица 2). В 1–й группе (бесплодие, обусловленное миомой матки) – достоверное уменьшение этого показателя в клетках стромы, во 2–й группе (бесплодие, обусловленное эндометриозом) – повышение экспрессии рецепторов PR как в ядрах гландулоцитов, так и в ядрах клеток стромы, что вероятно, связано с формированием резистентности к прогестерону и отклонениями в генетическом и эпигенетическом регулировании прогестероновых рецепторов. В образцах 3–й группы (бесплодие, обусловленное гиперплазией эндометрия), отмечалось уменьшение экспрессии PR гландулоцитами желез и значительное увеличение экспрессии в клетках стромы. Резистентность к прогестерону и нарушение экспрессии рецепторов также, по-видимому, играют роль в изменении рецептивности. Таблица 2 – Сравнительная характеристика экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона структурами эндометрия при бесплодии, ассоциированном с пролиферативными заболеваниями матки (в баллах; М±m) показатель PR железы строма ER железы строма PR/ER железы строма Примечание: *р<0,01, **р<0,0010 – уровень статистической значимости различий между основными группами (1 – пациентки с миомой матки, 2 – пациентки с эндометриозом, 3 – пациентки с гиперплазией эндометрия, 4– фертильные женщины). Поскольку прогестерон вызывает децидуализацию эндометрия во время лютеиновой фазы, он имеет решающее значение для физиологической беременности. Подавление рецепторов наблюдается до имплантации в эндометрии здоровых женщин, но задерживается при эндометриозе (Latham M. et al., 2012) . Исследования также показали связь аномальной резистентности к прогестерону и неадекватно устойчивой экспрессией матриксных металлопротеиназ (ММП), которые разрушают внеклеточный матрикс. ММП обычно ингибируются прогестероном в фазу секреции, однако в условиях эндометриоза, их уровень остается высоким даже в период «окна имплантации», что теоретически приводит к постоянному разрушению матрикса и нарушению взаимодействия между клетками (Fainaru O. et al., 2014; Lin Y.H. et al., 2018). Количество сосудов с экспрессией CD34, было достоверно снижено у всех женщин с бесплодием, однако максимально выраженное, почти двукратное снижение их количества, наблюдалось у женщин с гиперплазией эндометрия (рисунок 5). Таким образом, дефекты ангиогенеза могут приводить к недостаточной секреторной трансформации эндометрия и нарушению имплантации эмбриона, несмотря на овуляцию, нормальный уровень гормонов в сыворотке. Группа 1 n=30 Группа 2 n=33 Группа 3 n=31 Группа 4 n=32 196,6±10,14 274,67±9,9** 143,81±20,96 185,72±12,78 176,67±2,21* 197,97±6,81 92,87±11,15 0,98±0,05 3,68±0,74 255,61±6,17* 222,73±17,55 123,18±10,63 1,2±0,12 2,69±0,27 263,55±6,11** 185,39±14,08 111,45±10,07 0,81±0,14 0,81±0,14 215,63±3,2 210,63±7,42 126,13±7,08 0,9±0,07 0,9±0,07 60 50 40 30 20 10 Диаграмма размаха по группам Перемен.: CD34 сосуды на поле зрения 1234 группа Мин.-Макс. Медиана 25%-75% Рисунок 5 – Анализ количества сосудов на поле зрения при увеличении ×400. Примечание *p<0,05 CD34 сосуды на поле зрения Диаграмма размаха по группам Перемен.: HSCOREVEGF железы 300 260 220 180 140 a 120 1234 группа Мин.-Макс. Медиана 25%-75% 400 350 300 250 200 150 100 Диаграмма размаха по группам Перемен.: HSCOREVEGF строма 50 b 0 -50 1234 группа Медиана 25%-75% Мин.-Макс. Рисунок 6 – Экспрессия VEGFr3 в железах (a), в строме (b). Примечание *p<0,05 Статистически значимое повышение экспрессии рецепторов к VEGFr3, отмечалось в гландулоцитах у женщин, с эндометриоз–ассоциированным бесплодием (рисунок 6). Это подтверждается многими исследованиями, доказавшими связь между ростом сосудов, особенностями микроокружения и пролиферативной активностью клеток эндометриоидных очагов (Bulletti C et al., 2010; Giudice L.C. et al., 2004). До настоящего времени не уделялось достаточно внимания нарушению ангиогенеза как одному из основных механизмов нарушения рецептивности. Данные полученные Н.А. Арутюнян и соавт. (2015), также указывают на уменьшение экспрессии CD34 и VEGF на 5–9 дни менструального цикла, у женщин с гиперплазией эндометрия, что может явиться причиной нарушения ангиогенеза в секреторной фазе цикла. Необходимо отметить, что VEGF, способствует проницаемости кровеносных сосудов и пролиферативной активности эндотелиальных клеток, подавляет апоптоз, стимулирует высвобождение оксида азота и простациклина из эндотелиальных клеток, вызывая вазодилатацию на ранних стадиях имплантации. Это может объяснить тот факт, что у женщин с эндометриозом повышенная экспрессия VEGF железистыми клетками, сочетается с неравномерным кровенаполнением сосудов и обширными кровоизлияниями в строме. Тем не менее, количество сосудов у женщин с эндометриоз–ассоциированным бесплодием снижено, что позволяет предположить наличие других причинно-следственных связей, между эндометриозом и уменьшением количества капилляров. Трансмембранный гепаринсульфат протеогликан синдекан–1 (CD138), является специфическим маркером плазматических клеток и в современной клинической практике используется для выявления хронического эндометрита, с целью повышения уровня его диагностики, тем не менее этот метод редко используется при обследовании женщин с бесплодием (Chen Y.Q. et al., 2016). Единичные плазмоциты (CD138) встречались в строме эндометрия женщин с гиперплазией. 450 400 350 300 250 200 150 100 Перемен.: CD 3 среднее количество клеток в строме на пз 50 a 0 -50 1235 группа Медиана 25%-75% Мин.-Макс. 22 20 18 16 14 12 10 8 6 Перемен.: CD 20 количество клеток в строме на поле зрения 42 b 0 -2 Медиана 1235 группа Мин.-Макс. 25%-75% Рисунок 7 – Количество клеток CD3+ (а), CD20+ (b), в строме эндометрия Примечание *p<0,05 При оценке экспрессии B клеток (CD20), отмечалось их значительное увеличение (в 3 раза), у женщин с гиперплазией эндометрия (рисунок 7b). Исследования, проведенные Kitaya K. et аl. (2012), CD 3 среднее количество клеток в строме на пз HSCOREVEGF железы CD 20 количество клеток в строме на поле зрения HSCOREVEGF строма продемонстрировали, что у женщин с гиперпластическими процессами в эндометрии, при невынашивании беременности и бесплодии регистрируется плазмоцитарная инфильтрация. Согласно полученным нами данным, количество же Т–клеток у женщин с гиперплазией, было в полтора раза выше. Согласно полученным нами результатам исследования, общее количество Т–лимфоцитов, также значительно снижалось у женщин с эндометриозом, что сопоставимо с данными V.I. Michou et аl. (2003), которые указывают на снижение количества Т–лимфоцитов, в эндометрии женщин с бесплодием и спонтанными абортами. Известно, что баланс между пролиферацией клеток эндометрия и апоптозом, имеет решающее значение для поддержания клеточного гомеостаза, во время окна имплантации. Обычно апоптоз клеток эндометрия, значительно выше в течение периода «окна имплантации», что позволяет бластоцисте успешно имплантироваться Предполагается, что изменения соотношения в про– и антиапоптотических факторах в секреторном эндометрии, нарушают имплантацию и могут быть причиной неудач экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) у бесплодных женщин с эндометриозом (Antsiferova Y.S. et аl.,2014, 2016 ). Экспрессия bcl–2 у пациенток с эндометриозом была ниже в клетках желез по сравнению показателями фертильных женщин группы сравнения (рисунок 8). Это противоречит результатам Patel B.G. et al. (2017), которые установили аберрантное увеличение экспрессия антиапоптотических белков, таких как bcl–2 во время секреторной фазы у пациенток с эндометриозом, что свидетельствует о неспособности прогестерона быстро остановить пролиферацию эндометрия и запустить дифференцировку клеток. Согласно данным литературы, гиперплазия часто сочетается с пролиферативными процессами в эндометрии, а поскольку ген bcl–2 может усиливать пролиферативную активность железистого эндометрия, это согласуется с полученными в настоящем исследовании, данными о повышении экспрессии антиапоптотического маркера, у женщин с гиперплазией Существуют весомые доказательства того, что механизм апоптоза обусловлен изменением в экспрессии семейства генов, контролирующих запрограммированную клеточную гибель (Laban M. et al. 2015). 180 140 100 80 60 40 20 bcl-2 железы Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4 a 90 70 50 30 10 bcl-2 строма b Рисунок 8 – Экспрессия bcl– 2 в железах (a), в строме (b). Примечание *p<0,05 В то же время, экспрессия фактора апоптоза (р53) в железах и строме у женщин с гиперплазией эндометрия была в 3,3 и 1,2 раза ниже по сравнению с аналогичными параметрами фертильных женщин (рисунок 8a). Полученные нами данные аналогичны результатам H.S. V atansever et. al (2005) свидетельствующие о том, что снижение количества апоптотических клеток и слабая иммунореактивность р53, а также сильная иммунореактивность Bcl– 2 в эндометрии бесплодных женщин, по сравнению с фертильными могут быть важным фактором дефектной имплантации. При оценке экспрессии Ki67 отмечалось его статистически значимое повышение в стромальных клетках эндометрия у женщин с миомами матки (рисунок 9b). Название оси Название оси Рисунок 9 – Экспрессия p53 (a), Ki67 (b) в железах и строме. Примечание *p<0,05 50 40 30 20 10 железы строма a Экспрессия p53 0 Группа Группа Группа Группа 1234 Экспрессия Ki67 20 15 10 5 0 * Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4 Предполагается, что PTEN, проапоптотический фактор и ген супрессор опухолевого роста, является одним из сигнальных белков, через которые эстроген и прогестерон действуют на клетки эндометрия, их пролиферацию и апоптоз. Фосфорилирование PTEN в C–терминальном домене, вызывает его инактивацию. В более ранних исследованиях сообщалось, о роли PTEN в матке млекопитающих и необходимости для правильной инвазии трофобласта и децидуальной регрессии (Laguë M.N. et al., 2010). В исследовании Анциферовой (2014) у женщин с эндометриозом и бесплодием, наблюдалась более низкая экспрессия мРНК PTEN по сравнению с таковой, в группе женщин с трубным бесплодием. Другие исследования были сосредоточены на роли PTEN в регуляции роста эпителия. Liang X et. al. (2018) показано, что потеря PTEN в эпителии в строме приводит к быстрому развитию карциномы эндометрия, а его потеря в эпителиальных клетках обуславливает гиперплазию эндометрия. Тем не менее, при анализе PTEN в исследуемых группах не было отмечено его снижение в железистом эпителии, как при ручном подсчете, так и при компьютерной морфометрии. Напротив, нами выявлено статистически значимое повышение этого индуктора апоптоза в железистых и стромальных клетках у женщин с эндометриозом и патологией эндометрия. В противоположность этому, у женщин с миомами матки регистрировалось значительное снижение экспрессии рецепторов к PTEN как в гландулоцитах, так и в клетках стромы, что может способствовать неконтролируемой клеточной пролиферации и являться фактором риска развития онкологического процесса (Шрамко С.В. с соавт., 2013) (рисунок 10) b 260 240 220 200 180 160 140 120 100 60 40 b 20 280 260 240 220 200 180 160 140 120 100 60 40 a 20 0 -20 1234 группа Медиана 25%-75% Мин.-Макс. 0 -20 1234 группа Медиана 25%-75% Мин.-Макс. Рисунок 10 – Экспрессия PTEN в железах (a), в строме (b). Примечание *p<0,05 В ряде исследований было отмечено, что более выраженная экспрессия LIF во время «окна имплантации», коррелирует с более высокой вероятностью беременности, в то время как снижение экспрессии LIF в течение этого интервала, связано с меньшей вероятностью зачатия в последующих циклах. Таким образом, максимизация LIF и, следовательно, уровней LIFR, имеет важное значение для имплантации эмбрионов ( Margioula–Siarkou C. et al., 2016, 2017). Согласно полученным нами данным, все образцы от женщин с бесплодием характеризовались уменьшением экспрессии LIF и уменьшением балла H–score как для клеток желез, так и для стромы. HSCORE PTEN железы -Комп HSCORE PTEN строма - комп Название оси Название оси Наибольшая экспрессия этого маркёра рецептивности наблюдалась в апикальных зонах эпителиальных клеток. Гораздо менее интенсивно накапливали LIF клетки стромы эндометрия (рисунок 11). 350 300 250 200 150 100 Диаграмма размаха по группам Перемен.: H-S LIF жел 50 a 0 -50 1234 группа Медиана 25%-75% Мин.-Макс. 350 300 250 200 150 100 Диаграмма размаха по группам Перемен.: H-S LIF стром 50 b 0 -50 1234 группа Медиана 25%-75% Мин.-Макс. Рисунок 11 – Экспрессия LIF в железах (a), в строме (b). Примечание *p<0,05 Действия LIF в основном индуцируются, после связывания с рецептором на поверхности клеток (LIFR), который представляет собой гетеродимер, состоящий из двух субъединиц. Экспрессия LIFR была выражена крайне неравномерно: в 1,5 и 2 раза снижено количество позитивных клеток желез и стромы в эндометрии женщин 2–й группы относительно показателей группы сравнения. Однако при оценке итогового балла H–score достоверных различий между показателями женщин с эндометриозом и показателями группы сравнения не обнаружено. Статистически значимое повышение экспрессии, как в эпителиоцитах, так и в стромальных клетках в образцах женщин с гиперплазией эндометрия (рисунок 12). 350 300 250 200 150 100 Диаграмма размаха по группам Перемен.: H-S LIFR жел 0a -50 Медиана 1234 группа Мин.-Макс. 25%-75% 300 250 200 150 100 Диаграмма размаха по группам Перемен.: H-S LIFR стром 0b -50 1234 группа Мин.-Макс. Медиана 25%-75% Рисунок 12 – Экспрессия LIFR в железах (a), в строме (b). Примечание *p<0,05 Морфологическими детерминантами эндометриальной дисфункции при бесплодии, ассоциированном с пролиферативными заболеваниями матки, являются: расстройства кровообращения; прогрессирующий фиброз стромы; снижение уровня ангиогенеза как результат его дисрегуляции; нарушение созревания пиноподий к моменту «окна имплантации»; изменение уровня экспрессии ER и PR как в ядрах поверхностных эпителиоцитов и гландулоцитов желёз, так и в клетках стромы эндометрия; расстройства секреторных преобразований эндометрия. Выявленные морфологические признаки дисфункции эндометрия при пролиферативных заболеваниях матки представлены в таблице 3. H-S LIFR жел H-S LIF жел H-S LIFR стром H-S LIF стром заболеваниях матки Признак Миома матки Макроскопич ↑ еские Микроскопич ↑ еские Эндометриоз Плотность фрагментов Гиперплазия эндометрия Пролиферация эпителия желез Таблица 3 – Морфологические признаки дисфункции эндометрия при пролиферативных ↓ Предецидуальная реакция стромы Секреторная трансформация Высота пиноподий Площадь пиноподий Высота пиноподий Предецидуальная реакция стромы Секреторная трансформация Площадь пиноподий Высота пиноподий ИГХ ↑ Ki67 (строма) PR (строма и железы), VEGFr3 (строма), PTEN (строма и железы) PR (строма), СD34, LIF (строма и железы) СD34, LIF (строма и железы), СD3, bcl-2 (железы), p53 (строма) PR (строма), СD3, СD20, bcl-2 (строма), LIFR (строма и железы), PTEN (строма и железы) ↓ СD34, LIF (строма и железы), p53 (железы) Примечание: Стрелками ↑↓ обозначены снижение или повышение морфологических и иммуногистохимических признаков Эти факторы, обуславливающие эндометриальную дисфункцию, связаны, прежде всего, с гиперплазией эндометрия, поскольку именно у этих пациенток регистрируется большинство указанных клинико– анамнестических и морфологических детерминант эндометриальной дисфункции: более выраженная инфильтрация стромы CD20+ клетками и снижение экспрессии гландулоцитами проапоптотического белка p53. На основании многофакторного анализа с применением пошагового подхода, нами были определены наиболее информативные морфологические пoказатели и построена математическая модель, позволяющая прогнозировать наступления беременности у женщин с бесплодием, ассоциированным с пролиферативными заболеваниями матки с использованием программ компьютерной морфометрии. На основании измерения площади и высоты пиноподий, площади сосудов на микрофотографии гистологического препарата для всех женщин предлагается вычислять прогностический индекс (PI) по формуле: PI =10,63– Х1×0,082– Х2×0,202– Х3×0,776, где Х1 – площадь пиноподий, %; Х2 – средняя высота пиноподий, пиксели; Х3 – площадь сосудов, %; 10,63 – Const. При PI более 0, прогнозируют высокий риск репродуктивных неудач в программах ВРТ, а при PI менее 0, делают заключение о готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона, у женщин с бесплодием. Чувствительность предлагаемого способа, составляет 84,46%, специфичность – 87,2%, эффективность способа – 82,69%. Данные проверки эффективности работы, проводили на экзаменационной выборке, состоящей из 41 пациентки, данные приведены в таблице 4. Таблица 4 – Эффективность наступления беременности использования морфологических показателей для прогнозирования Исход Абс. Кол–во % Средняя площадь пиноподий в % Средняя высота пиноподий в пикселях Средняя площадь сосудов в %; Среднее значение прогности– ческого индекса Береме– Спон– нность танная ЭКО Неэффективное ЭКО На данный момент в протоколе ЭКО Нет данных об ЭКО и беременности 3 7,0 4 9,3 16 37,2 7 16,3 8 18,6 51±6,03 34,5±4,36 17,25±4,10 39,43±4,60 36,25±5,21 20,29±1,3 20,34±2,31 21,77±2,34 19,21±2,45 20,23±1,82 5,86±0,7 5,38±0,81 1,92±1,07 1,50±0,83 1,73±0,75 –2,2±1,7 –0,48±1,11 3,3±1,24 2,35±1,44 2,23±1,66 Роды (после хирургического лечения) 3 7,0 12±3,29 17,98±2,10 2,09±1,35 4,39±1,33 При анализе результатов исследования было выявлено, что у женщин, с наступившей беременностью, PI был менее 0, при этом у женщин со спонтанно наступившей беременностью, он был в 4,5 раза меньше, чем у женщин, проходивших процедуру ЭКО. Женщины с неэффективным ЭКО, имели PI = 3,3±1,24, который в основном обусловлен небольшой площадью сосудистого русла (таблица 34). Женщины, которые на данный момент находятся в протоколе ЭКО, также имеют PI более 0, что предполагает неудачную попытку, более того, 42,8% женщин, уже имели неудачные попытки ЭКО в анамнезе. Далее проводилось расширенное иммуногистохимическое исследование для всех групп женщин. У женщин с первичным бесплодием и миомой матки прогностический индекс определялся по формуле: PI = (–0,045)× Х1+(–0,06)× Х2+0,27× Х3+3,38, где Х1 – балл H–score экспрессии VEGFr3 в строме; Х2 – балл H–score экспрессии PTEN в строме; Х3 – балл H–score экспрессии PTEN в железах при компьютерной морфометрии; 3,38– Const. При PI более 0, делают заключение о готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона и возможности направления женщины с первичным бесплодием и миомой матки, в программу ВРТ. При PI менее 0, прогнозируют низкую рецептивность эндометрия и высокий риск репродуктивных неудач в программах ВРТ. Чувствительность предлагаемого способа составляет 91,67%, специфичность – 100%, эффективность способа – 95,84%. У женщин с эндометриозом прогностический индекс определялся по формуле: PI = Х1×–0,54+0,233× Х2–0,165× Х3+29,2, где Х1 – количество p53+ клеток в строме; Х2 – количество p53+ клеток в железах; Х3 – балл H–score экспрессии PTEN в строме; 29,2– Const. При PI более 0, делают заключение о готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона и возможности направления женщины в программу ВРТ. При PI менее 0, прогнозируют высокий риск репродуктивных неудач в программах ВРТ, чувствительность метода составляет – 100%, специфичность – 83%, диагностическая эффективность = 90%. У женщин с гиперплазией эндометрия прогностический индекс определялся по формуле: PI = Х1×–0,48+ Х2×–1,5+ Х3×–23,07+0,87× Х4+ Х5×–1,21+592, где Х1 – балл H–score экспрессии прогестерона в железах; Х2 – балл H–score экспрессии прогестерона в строме; Х3 – количество CD20+ клеток в строме; Х4 – балл H–score экспрессии PTEN в железах; Х5 – балл H–score экспрессии PTEN в строме; 592– Const. При PI более 0, делают заключение о готовности эндометрия, к успешной имплантации эмбриона и возможности направления женщины в программу ВРТ. При PI менее 0, прогнозируют высокий риск репродуктивных неудач в программах ВРТ. Чувствительность метода составляет 91,66%, специфичность – 100%, эффективность – 95,83%. Разработанные нами способы прогнозирования готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона у женщин с первичным бесплодием при пролиферативных заболеваниях матки позволили вывести алгоритм обследования данной категорией пациенток (рисунок 13). Рисунок 13 – Алгоритм иммуногистохимического обследования пациенток с первичным бесплодием ВЫВОДЫ 1. Клинико-анамнестической особенностью течения первичного бесплодия у женщин более чем в половине случаев является бессимптомное течение гиперпластических процессов в матке: обильные или скудные короткие менструации, болевой синдром регистрируются у каждой пятой пациентки с миомой матки. 2. У пациенток с гиперплазией эндометрия статистически значимо чаще регистрируются повторные неудачи имплантации в программе экстракорпорального оплодотворения, чем у женщин с эндометриозом и с миомами матки. 3. Морфологическими особенностями эндометриальной дисфункции к моменту «окна имплантации» у женщин с бесплодием, обусловленным миомами матки, являются отсутствие или слабая выраженность предецидуальной реакции стромы, у женщин с эндометриозом – отсутствие или слабая выраженность предецидуальной реакции стромы и расстройства кровообращения в виде неравномерного кровенаполнения сосудов и обширных кровоизлияний в строме, у женщин с гиперплазий – нарушения секреторной трансформации эндометрия. 4. Морфометрическими детерминантами нарушения рецептивности у женщин с первичным бесплодием при пролиферативных заболеваниях матки являются: уменьшение количества желез, (в 1,5 раза), снижение количества сосудов (более, чем в 2 раза), уменьшение площади пиноподий (в 3 раза) и снижение их высоты более чем в 60 % случаев. 5. Иммуногистохимическими критериями нарушения рецептивности в эндометрии у всех женщин с первичным бесплодием при пролиферативных заболеваниях матки являются изменение соотношения уровней экспрессии эстрогена и прогестерона, экспрессии лейкемия-ингибирующего фактора в ядрах эпителиоцитов и стромальных клеток, повышение экспрессии рецептора LIF стромальными и железистыми клетками. 6. При первичном бесплодии, связанном с пролиферативными процессами в эндометрии, в образцах отмечается нарушение регуляции клеточного цикла в виде двухкратного повышения экспрессии PTEN в железах и строме, нарушение апоптоза с уменьшением экспрессии рецепторов р53 железистыми клетками и нарушение иммунологической толерантности с увеличением количества Т и В-клеток в строме. При эндометриозе – уменьшение экспрессии рецепторов р53 стромальными клетками, при миоме матки – повышение экспрессии маркера пролиферации Ki67 в 1,5 раза и двукратное снижение экспрессии PTEN железистыми и стромальными клетками. 7. Наиболее значимыми предикторами репродуктивных исходов у женщин с первичным бесплодием при пролиферативных заболеваниях матки являются площадь, высота пиноподий, площадь сосудистого русла, экспрессия регулятора клеточного цикла PTEN, р53, прогестерон и CD20, VEGFr3. 8. Включение в алгоритм обследования женщин с бесплодием при пролиферативных заболеваниях матки расчетных интегральных показателей на основании определения уровня экспрессии PTEN, р53, прогестерона в железах и строме, VEGFr3 и CD20 в строме эндометрия позволяет вероятностью до 95 % прогнозировать готовность эндометрия к успешной имплантации эмбриона с учетом характера заболевания и снизить количество неудачных попыток ЭКО. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. У пациенток с первичным бесплодием при пролиферативных заболеваниях матки для оценки структурных и функциональных изменений, проявляющихся расстройством рецептивности эндометрия, необходимо проводить Пайпель-биопсию эндометрия в предполагаемый период «окна имплантации» с среднюю стадию фазы секреции. 2. В комплекс обследования наряду с гистологическим исследованием целесообразно включать морфометрическое измерение площади и высоты пиноподий и площади сосудов с учетом экспрессии CD34 с последующим вычислением прогностического индекса и определением дальнейшей тактики лечения. 3. Для женщин с первичным бесплодием и миомой матки в алгоритм обследования необходимо включать определение рецепторов к PTEN, VEGFr3, для женщин с эндометриозом – рецепторов к PTEN и экспрессии p53, при неатипической гиперплазии эндометрия – определение количества СD20+ клеток, исследование экспрессии p53, PTEN с определением прогностических индексов для каждой нозологической формы.