ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИДОВОГО СОСТАВА ПЛАНКТОННЫХ БАКТЕРИЙ БАССЕЙНА РЕКИ ЕНИСЕЙ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ БИОГЕОХИМИЧЕСКИХ ФУНКЦИЙ
Введение …………………………………………………………………………………………………………… 5
Глава 1 Секвенирование следующего поколения и современные методы опреде-
ления видоспецифичных биогеохимических функций бактериопланктона ………. 11
1.1 Секвенирование следующего поколения…………………………………………………. 11
1.2 Методы определения видоспецифичных биогеохимических функций бакте-
риопланктона ………………………………………………………………………………………………….. 13
1.2.1 Анализ функциональных генов, транскриптов и белков …………………… 13
1.2.1.1 Методы «-омика» ………………………………………………………………………. 13
1.2.1.1.1 Метагеномика ……………………………………………………………………… 14
1.2.1.1.2 Метатранскриптомика …………………………………………………………. 16
1.2.1.1.3 Метапротеомика ………………………………………………………………….. 17
1.2.1.1.4 Метаболомика …………………………………………………………………….. 18
1.2.1.2 Амплификация геномов единичных клеток ………………………………… 19
1.2.2 Методы с добавками питательных веществ ………………………………………. 19
1.2.2.1 Мечение стабильными изотопами ……………………………………………… 21
1.2.2.1.1 Анализ липидов …………………………………………………………………… 21
1.2.2.1.2 Анализ ДНК ………………………………………………………………………… 22
1.2.2.1.3 Анализ РНК ………………………………………………………………………… 23
1.2.2.2 Применение бромдезоксиуридина и йоднитротетразолия фиолето-
вого для определения биогеохимических функций бактериопланктона ……………. 25
1.2.2.3 Методы, основанные на флуоресцентной гибридизации in situ …… 26
1.2.2.3.1 Комбинация микроавторадиографии с флуоресцентной гибри-
дизацией in situ ……………………………………………………………………………………………….. 28
1.2.2.3.2 Комбинация спектроскопии комбинационного рассеяния света,
изотопных меток и флуоресцентной гибридизации in situ ………………………………… 29
1.2.2.3.3 Мультиизотопная визуализирующая масс-спектрометрия ……. 31
1.2.2.3.4 Комбинация бета-микроимиджинга с флуоресцентной гибриди-
зацией in situ …………………………………………………………………………………………………… 32
1.2.2.4 Изотопные чипы ………………………………………………………………………… 33
1.2.2.5 Метод фингерпринтов («отпечатков пальцев») …………………………… 34
1.3 Сравнение методов и выбор наиболее оптимального пути для решения по-
ставленных задач …………………………………………………………………………………………….. 36
Глава 2 Материал и методы исследований ……………………………………………………….. 39
2.1 Река Енисей ……………………………………………………………………………………………. 39
2.2 Водохранилище Бугач ……………………………………………………………………………. 42
2.3 Методы исследования …………………………………………………………………………….. 42
2.3.1 Отбор проб бактериопланктона Енисея ……………………………………………. 42
2.3.2 Постановка экспериментов в МЭС …………………………………………………… 44
2.3.3 Отбор проб в ходе экспериментов ……………………………………………………. 46
2.3.4 Выделение геномной ДНК ……………………………………………………………….. 47
2.3.4.1 Бактериопланктон Енисея ………………………………………………………….. 47
2.3.4.2 Бактериопланктон МЭС …………………………………………………………….. 47
2.3.5 Амплификация фрагмента гена 16S рРНК ………………………………………… 48
2.3.5.1 Бактериопланктон Енисея ………………………………………………………….. 48
2.3.5.2 Бактериопланктон МЭС …………………………………………………………….. 49
2.3.6 Получение библиотеки ампликонов участка гена 16S рРНК ……………… 50
2.3.7 Определение нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК бакте-
риоплактона Енисея методом секвенирования следующего поколения (NGS) ……. 50
2.3.8 Биоинформатический анализ данных NGS ………………………………………. 51
2.3.9 Определение численности бактериопланктона …………………………………. 52
2.3.10 Анализ изменений в составе бактериопланктона в МЭС методом дена-
турирующего градиентного гель-электрофореза ………………………………………………….. 53
2.3.11 Клонирование генов 16S рРНК бактериоплактона из экспериментов в
МЭС ……………………………………………………………………………………………………………………. 54
2.3.11.1 I эксперимент …………………………………………………………………………… 54
2.3.11.2 IV эксперимент ………………………………………………………………………… 55
2.3.12 Определение нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК бак-
териоплактона из экспериментов в МЭС …………………………………………………………… 56
2.3.12.1 I эксперимент …………………………………………………………………………… 56
2.3.12.2 IV эксперимент ………………………………………………………………………… 57
2.3.13 Филогенетический анализ ………………………………………………………………. 57
Глава 3 Биоразнообразие и численность бактериопланктона р. Енисей…………….. 58
3.1 Численность …………………………………………………………………………………………… 58
3.2 Альфа-разнообразие……………………………………………………………………………….. 58
3.3 Бета-разнообразие ………………………………………………………………………………….. 64
3.4 Сравнение с другими реками ………………………………………………………………….. 71
Резюме ………………………………………………………………………………………………………… 72
Глава 4 Экспериментальное изучение потребления аминокислот бактериопланк-
тоном эвтрофного водохранилища …………………………………………………………………… 74
4.1 Июль 2004 (I эксперимент) …………………………………………………………………….. 74
4.2 Август 2005 (II эксперимент) …………………………………………………………………. 83
4.3 Май 2006 (III эксперимент) ……………………………………………………………………. 84
4.4 Август 2009 (IV эксперимент) ………………………………………………………………… 86
4.5 Май 2013 (V эксперимент) …………………………………………………………………….. 93
Обсуждение…………………………………………………………………………………………………. 93
Резюме ………………………………………………………………………………………………………… 96
Заключение …………………………………………………………………………………………………….. 97
Выводы …………………………………………………………………………………………………………. 100
Список литературы ……………………………………………………………………………………….. 101
По образному выражению В. И. Вернадского, каждый биологический вид в
природе выполняет уникальную, только ему присущую “геохимическую работу”,
т.е. потребляет определенные виды вещества и энергии и синтезирует из них дру-
гие специфические вещества, включая собственную биомассу (Вернадский, 1978).
В водных экосистемах определение видового состава и функциональной роли от-
дельных видов продуцентов и консументов – водорослей, беспозвоночных жи-
вотных и рыб – успешно осуществляется с момента зарождения гидробиологии.
Вместе с тем, изучение такого важнейшего звена водных экосистем как редуцен-
ты было до недавнего времени ограничено отсутствием адекватных методов ис-
следований.
В пелагических экосистемах звено редуцентов, как известно, представлено
бактериопланктоном. Основными методами определения видовой принадлежно-
сти бактерий в течение длительного периода были световая микроскопия и куль-
тивирование на твердых селективных средах. Однако под микроскопом удавалось
идентифицировать лишь виды с характерной морфологией, например, крупные
нитчатые бактерии и цианобактерии (Заварзин, 2003). Метод культивирования
тоже имеет значительные ограничения, поскольку на средах вырастает не более
1% водных бактерий, определяемых прямым счетом (Горленко и др., 1977; Cole,
1982; Amann et al., 1995). Чем ниже уровень трофности водоёма, тем больше раз-
рыв между результатами подсчёта численности водных бактерий методами мик-
роскопии и культивирования, который может достигать десятков тысяч раз для
олиготрофных водоёмов (Заварзин, 2003). Многие виды бактериопланктона не-
возможно культивировать на лабораторных средах (Cases, de Lorenzo, 2002). Та-
ким образом, до недавнего времени видовой состав подавляющего большинства
видов водных бактерий оставался практически неизвестным.
Очевидно, что если невозможно определить видовую принадлежность орга-
низма и отличить один вид от другого, то и не удастся и выявить видоспецифич-
ные функции каждого вида в экосистеме. В связи с проблематичностью иденти-
фикации отдельных видов первоначально выделялись целые группы бактерий,
предположительно объединённые общей биогеохимической функцией (Ouverney,
Fuhrman, 1999). Подробно изучалось участие агрегированных групп водных мик-
роорганизмов в процессах фотосинтеза, хемосинтеза и деструкции органических
веществ (углеводов, белков, аминокислот, аминосахаров, альгиновых кислот, уг-
леводородов, гуминовых веществ и др.) в круговороте азота и других элементов
(Горленко и др., 1977; Weiss, Simon, 1999; Grover, Chrzanowski, 2000; Rosenstock,
Simon, 2001; Perez et al., 2003; Zubkov et al., 2008). Однако роль отдельных видов в
деструкции органических веществ долго оставалась неизвестной в связи с трудно-
стями видовой идентификации бактериопланктона. В то же время многие авторы
указывали на необходимость определения филогенетической принадлежности
бактериопланктона, участвующего в тех или иных биогеохимических процессах
(Grover, Chrzanowski, 2000; Perez et al., 2003). Эти ограничения были преодолены
с появлением в последние два десятилетия молекулярно-генетических методов
определения видовой принадлежности бактерий.
Молекулярно-генетические методы, такие как анализ последовательности
гена 16S рибосомальной РНК, мультилокусное типирование последовательностей
(MLST) и анализ вариабельных по числу мультилокусных тандемных повторов
(MLVA), широко используются для идентификации некультивируемого бактери-
опланктона (Hofle et al., 2008). В базах данных накапливается большое число по-
следовательностей генов, принадлежащих водным бактериям, о которых помимо
их места обитания и филогенетической принадлежности ничего не известно (За-
варзин, 2003). Исследование физиологии бактериопланктона, и тем более его био-
геохимической функции в природном водоёме – сложная задача. Многие виды
бактерий являются некультивируемыми, поэтому невозможно исследовать по-
требляемые ими субстраты и выделяемые продукты в лабораторной культуре.
Бактерии не удаётся культивировать по нескольким причинам: 1) клетки
вступили в некультивируемую стадию (Nyström, 2001); либо 2) бактериопланктон
представлен неизвестными видами, для которых еще не подобраны условия куль-
тивирования (Amann et al., 1995; Suzuki et al., 1997). Таким образом, некультиви-
руемые виды бактериопланктона корректнее было бы назвать «пока ещё не куль-
тивируемыми» (Yokokawa, Nagata, 2010). По некоторым данным, часть видов бак-
терий невозможно выделить в чистую культуру, поскольку в природе они сущест-
вуют только в тесном сообществе с другими организмами (Connon, Giovannoni,
2002). В любом случае, по мнению В. И. Вернадского, разделение «живых ве-
ществ» на чистые виды неизбежно упрощает реальные явления и противоречит
естественному состоянию вещей, в то время как основное значение имеет так на-
зываемый “сложный вид”, представляющий собой симбиоз видов – геохимиче-
скую органическую смесь (Вернадский, 1978). Даже если удастся выяснить, что
изолированный и идентифицированный вид бактериопланктона в лабораторных
условиях потребляет конкретное вещество, это не означает, что в природном со-
обществе водоёма, из которого он был выделен, данный вид выполняет ту же
функцию. На одно и то же изменение внешней среды, например, увеличение кон-
центрации питательного вещества, вид может реагировать по-разному, в
зависимоcти от того, есть ли вокруг него другие биологические виды, и того, ка-
кие это виды (Lawrence et al., 2012). Исследуемый вид может начать утилизиро-
вать предложенное вещество ввиду недоступности иных субстратов, потребляе-
мых им в естественных условиях. Или вполне вероятно, что в естественных усло-
виях конкуренты потребляют данное вещество более успешно, чем исследуемый
вид, и ему приходится довольствоваться другими ресурсами. Таким образом, если
в лабораторных условиях не моделируются такие природные факторы, как гетеро-
генность среды, конкуренция за ресурсы, хищничество и другие взаимодействия,
то культивирование изолированного вида не позволяет определить особенности
физиологии и жизнедеятельности данных микроорганизмов в природных экоси-
стемах (Maron et al., 2007).
В настоящее время микробиологические исследования проводятся с исполь-
зованием двух групп методов. Во-первых, применяются классические методы
культивирования. Исторически непременным условием идентификации бактерий
является их выделение в чистые культуры по физиолого-биохимическим призна-
кам (Определитель бактерий Берджи, 1997). Во-вторых, всё чаще используются
молекулярно-генетические методы, благодаря которым в геометрической про-
грессии увеличивается объём данных о последовательностях бактериальных генов
и разнообразии природных бактериальных сообществ на основе выделения опе-
рационных таксономических единиц (Hofle et al., 2008). Наблюдается парадокс:
первоначально таксономическая идентификация бактерий основывалась на их
биогеохимической функции – культивировании на селективных средах, а те, что
культивировать и идентифицировать не удавалось, оставались без внимания ис-
следователей. В настоящее же время легко идентифицировать бактерию методами
молекулярной генетики, но трудно определить её функцию. Знания о функции
популяций и сообществ бактериопланктона необходимы для прогнозирования их
отклика на меняющиеся условия окружающей среды и понимания биогеохимиче-
ских процессов, происходящих в экосистеме (Zehr, 2010). Таким образом, необхо-
димы адекватные методы, позволяющие определять видоспецифичные экологиче-
ские (биогеохимические) функции в водных экосистемах некультивируемых бак-
терий, идентифицируемых средствами молекулярной генетики.
Перспективным методом для изучения потребления различных веществ от-
дельными видами бактериопланктона является метод экспериментальных микро-
экосистем (МЭС), содержащих пробы природного сообщества бактериопланкто-
на, в которые добавляются тестируемые питательные вещества. Ранее было уста-
новлено, что в МЭС в течение недели сохраняется и функционирует естественное
планктонное сообщество (Гладышев, 1999). Для мониторинга изменений состава
доминирующих видов внутри бактериальных сообществ в МЭС часто использу-
ется метод разделения амплифицированных фрагментов гена 16S рибосомальной
РНК с помощью денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ)
(Martin et al., 2012).
В качестве тестовых добавок для гетеротрофного бактериопланктона были
выбраны аминокислоты, поскольку эти вещества в больших количествах выделя-
ются из растущего и отмирающего фито- и зоопланктона и являются одним из
наиболее предпочитаемых бактериями органических компонентов.
Целью настоящей работы было определить видовой состав планктонных
бактерий бассейна реки Енисей молекулярно-генетическими методами, включая
секвенирование следующего поколения, и оценить их биогеохимические функции
с помощью экспериментального исследования потребления отдельными видами
бактериопланктона конкретных органических веществ.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1) Изучить биоразнообразие бактериопланктона р. Енисей методом секве-
нирования следующего поколения.
2) Молекулярно-генетическими методами идентифицировать бактерио-
планктон, потребляющий определённый спектр аминокислот, на примере водо-
хранилища Бугач.
3) Методом экспериментальных микроэкосистем, созданных на основе
проб из водохранилища, изучить сезонную динамику отклика видового состава
бактериопланктона на добавление различных аминокислот.
При решении поставленных задач были получены результаты, которые вы-
носятся на защиту:
1) В р. Енисей выделяются три сообщества бактериопланктона, достоверно
отличающиеся по видовому составу, и населяющие участки реки, расположенные
в горной тайге, равниной тайге и тундре (лесотундре).
2) В бактериопланктоне водохранилища существуют виды, имеющие уз-
кую специализацию в потреблении отдельных аминокислот.
3) Участие бактериопланктона водохранилища в утилизации отдельных
органических веществ существенно зависит от сезона, что необходимо учитывать
при оценке способности экосистемы водоёма к биологическому самоочищению от
отдельных органических веществ.
Апробация работы: материалы диссертации докладывались на V Междуна-
родной конференции по промышленной, прикладной микробиологии и микро-
биологии окружающей среды – BioMicroWorld2013 (Мадрид, Испания, 2013); XV
Школе-конференции молодых ученых «Биология внутренних вод» (пос. Борок
Ярославской обл., 2013); конкурсах-конференциях научных работ молодых учё-
ных Института биофизики СО РАН (Красноярск, 2012-2014) и Красноярского на-
учного центра (Красноярск, 2014); XV Международном симпозиуме по микроб-
ной экологии – ISME (Сеул, Республика Корея, 2014); XI съезде Гидробиологиче-
ского общества при РАН (Красноярск, 2014); Конкурсе на лучшую научную рабо-
ту студентов и молодых учёных федеральных университетов (Ростов-на-Дону,
2014); семинарах лаборатории экспериментальной гидроэкологии Института био-
физики СО РАН (Красноярск, 2011-2014).
ГЛАВА 1 СЕКВЕНИРОВАНИЕ СЛЕДУЮЩЕГО ПОКОЛЕНИЯ И
СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИДОСПЕЦИФИЧНЫХ
Впервые в данной работе было исследовано биоразнообразие речного
бактериопланктона методом секвенирования следующего поколения (NGS)
на участке длиной около 1800 км. Установлено, что альфа-разнообразие бак-
териопланктона не возрастает постепенно с движением вниз по течению, а
достигает наибольших показателей на среднем участке р. Енисей ниже места
впадения Нижней Тунгуски. Также не подтверждается гипотеза об увеличе-
нии относительной доли цианобактерий при движении от истока к устью по
концепции речного континуума.
Установлено, что структура бактериального сообщества в р. Енисей
существенно зависит от типа берегового ландшафта (биома). На трех участ-
ках Енисея, расположенных в районе Енисейского кряжа (горная тайга), в
Западно-Сибирской равнине (равнинная тайга), а также ниже места впадения
р. Нижняя Тунгуска (лесотундра и тундра в области вечной мерзлоты), обна-
ружено три бактериальных комплекса, достоверно различающихся по видо-
вому составу и структуре.
В данной работе также были идентифицированы виды бактерий, по-
требляющие различные аминокислоты в эвтрофном водохранилище. В кон-
трольных МЭС не наблюдалось существенных изменений в составе бактери-
опланктона по сравнению с исходной пробой на протяжении всего экспери-
мента. Данный результат означает, что в контрольных МЭС в течение всех
экспериментов функционировало естественное сообщество бактериопланк-
тона водохранилища. Виды бактериопланктона, которые увеличивали свою
численность при добавлении аминокислот лизин и глицин в эксперименталь-
ные микроэкосистемы в середине лета, принадлежали к различным семейст-
вам. Отклик одних и тех же видов бактерий на добавку лизина наблюдался
летом в разные годы. В это же время не наблюдалось значительного отклика
бактериального сообщества на добавление лизина, глицина и аргинина вес-
ной и поздним летом, хотя в составе бактериального сообщества присутство-
вали виды, потреблявшие аминокислоты летом. Вероятно, отсутствие по-
требления аминокислот было обусловлено низкими температурами воды или
иными неблагоприятными факторами среды в мае и конце августа. Получен-
ные результаты свидетельствуют в пользу гипотезы об узкой специализации
видов бактериопланктона в потреблении отдельных органических веществ и
дают основание предполагать, что способность экосистемы водоёма к само-
очищению от тех или иных органических веществ может существенно зави-
сеть от сезонной сукцессии бактериального сообщества.
Идентификация видов бактериопланктона, потребляющих различные
органические вещества, важна не только для филогении, но и для экологии.
Знания о конкретных видах и потребляемых ими субстратах в настоящее
время могут быть формализованы в математических моделях водных экоси-
стем, предназначенных для прогноза и управления качеством природных вод.
В эколого-математических моделях управления качеством природных вод
функциональная (биогеохимическая) роль видов в экосистеме формализуется
в виде численных значений кинетических ростовых характеристик, которые
количественно выражают интегральную скорость биохимических реакций,
заложенных в генотипе организмов (Гладышев, 1999). Продолжением иссле-
дований, проведённых в этой работе, может стать определение этих кинети-
ческих характеристик различных видов водных бактерий. В настоящее время
во многих моделях качества природных вод гетеротрофный бактериопланк-
тон описывается как агрегированная компонента, что не позволяет адекватно
отображать функциональную роль доминирующих видов. Точность прогноза
и успешность управления состоянием водных экосистем, несомненно, повы-
сятся в случае замены в моделях агрегированного бактериопланктона и агре-
гированного «органического вещества» на сведения о конкретных видах бак-
терий при использовании точных экспериментальных данных об утилизи-
руемых этими бактериями органических веществах.
ВЫВОДЫ
1) В составе бактериопланктона р. Енисей обнаружено 3022 опера-
ционных таксономических единицы («генетических вида»). Альфа-
разнообразие сообществ бактериопланктона и относительная доля цианобак-
терий в р. Енисей достигают максимальных значений в среднем течении ре-
ки.
2) В бактериопланктоне р. Енисей выявлены три комплекса (сооб-
щества), достоверно отличающиеся по видовому составу и структуре, кото-
рые, вероятно, формируются, в частности, в результате биогеохимического
влияния окружающего ландшафта (биома): горной тайги (верхний участок
реки), равнинной тайги (средний участок) и лесотундры и тундры (нижний
участок). Согласно имеющимся данным, доминирующие таксоны каждого из
комплексов специализируются в потреблении разных групп органических
веществ.
3) С использованием нестерильного культивирования в эксперимен-
тальных микроэкосистемах выявлены виды летнего бактериопланктона мо-
дельного водохранилища Бугач, питающиеся лизином и глицином. Получен-
ные данные свидетельствуют о том, что исследованные виды свободножи-
вущих бактерий специализированы к потреблению узкого спектра аминокис-
лот.
4) Отклик летнего сообщества бактериопланктона водохранилища
Бугач на добавку лизина устойчив и повторяется в разные годы. В отличие от
летних экспериментов, добавление лизина в весеннее и позднелетнее пелаги-
ческое сообщество водохранилища не вызвало значительных изменений ко-
личественного и качественного состава бактериопланктона. Полученные
данные свидетельствуют о том, что способность водных экосистем к само-
очищению от отдельных органических веществ может существенно меняться
в течение вегетационного сезона.
Помогаем с подготовкой сопроводительных документов
Хочешь уникальную работу?
Больше 3 000 экспертов уже готовы начать работу над твоим проектом!
4.5 (9 отзывов)
4.6 (71 отзыв)
4.8 (13 отзывов)
5 (18 отзывов)
4.9 (35 отзывов)
4.8 (211 отзывов)
4.8 (373 отзыва)
5 (9 отзывов)
4 (15 отзывов)
