ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИДОВОГО СОСТАВА ПЛАНКТОННЫХ БАКТЕРИЙ БАССЕЙНА РЕКИ ЕНИСЕЙ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ БИОГЕОХИМИЧЕСКИХ ФУНКЦИЙ

По образному выражению В. И. Вернадского, каждый биологический вид в
природе выполняет уникальную, только ему присущую “геохимическую работу”,
т.е. потребляет определенные виды вещества и энергии и синтезирует из них дру-
гие специфические вещества, включая собственную биомассу (Вернадский, 1978).
В водных экосистемах определение видового состава и функциональной роли от-
дельных видов продуцентов и консументов – водорослей, беспозвоночных жи-
вотных и рыб – успешно осуществляется с момента зарождения гидробиологии.
Вместе с тем, изучение такого важнейшего звена водных экосистем как редуцен-
ты было до недавнего времени ограничено отсутствием адекватных методов ис-
следований.
В пелагических экосистемах звено редуцентов, как известно, представлено
бактериопланктоном. Основными методами определения видовой принадлежно-
сти бактерий в течение длительного периода были световая микроскопия и куль-
тивирование на твердых селективных средах. Однако под микроскопом удавалось
идентифицировать лишь виды с характерной морфологией, например, крупные
нитчатые бактерии и цианобактерии (Заварзин, 2003). Метод культивирования
тоже имеет значительные ограничения, поскольку на средах вырастает не более
1% водных бактерий, определяемых прямым счетом (Горленко и др., 1977; Cole,
1982; Amann et al., 1995). Чем ниже уровень трофности водоёма, тем больше раз-
рыв между результатами подсчёта численности водных бактерий методами мик-
роскопии и культивирования, который может достигать десятков тысяч раз для
олиготрофных водоёмов (Заварзин, 2003). Многие виды бактериопланктона не-
возможно культивировать на лабораторных средах (Cases, de Lorenzo, 2002). Та-
ким образом, до недавнего времени видовой состав подавляющего большинства
видов водных бактерий оставался практически неизвестным.
Очевидно, что если невозможно определить видовую принадлежность орга-
низма и отличить один вид от другого, то и не удастся и выявить видоспецифич-
ные функции каждого вида в экосистеме. В связи с проблематичностью иденти-
фикации отдельных видов первоначально выделялись целые группы бактерий,
предположительно объединённые общей биогеохимической функцией (Ouverney,
Fuhrman, 1999). Подробно изучалось участие агрегированных групп водных мик-
роорганизмов в процессах фотосинтеза, хемосинтеза и деструкции органических
веществ (углеводов, белков, аминокислот, аминосахаров, альгиновых кислот, уг-
леводородов, гуминовых веществ и др.) в круговороте азота и других элементов
(Горленко и др., 1977; Weiss, Simon, 1999; Grover, Chrzanowski, 2000; Rosenstock,
Simon, 2001; Perez et al., 2003; Zubkov et al., 2008). Однако роль отдельных видов в
деструкции органических веществ долго оставалась неизвестной в связи с трудно-
стями видовой идентификации бактериопланктона. В то же время многие авторы
указывали на необходимость определения филогенетической принадлежности
бактериопланктона, участвующего в тех или иных биогеохимических процессах
(Grover, Chrzanowski, 2000; Perez et al., 2003). Эти ограничения были преодолены
с появлением в последние два десятилетия молекулярно-генетических методов
определения видовой принадлежности бактерий.
Молекулярно-генетические методы, такие как анализ последовательности
гена 16S рибосомальной РНК, мультилокусное типирование последовательностей
(MLST) и анализ вариабельных по числу мультилокусных тандемных повторов
(MLVA), широко используются для идентификации некультивируемого бактери-
опланктона (Hofle et al., 2008). В базах данных накапливается большое число по-
следовательностей генов, принадлежащих водным бактериям, о которых помимо
их места обитания и филогенетической принадлежности ничего не известно (За-
варзин, 2003). Исследование физиологии бактериопланктона, и тем более его био-
геохимической функции в природном водоёме – сложная задача. Многие виды
бактерий являются некультивируемыми, поэтому невозможно исследовать по-
требляемые ими субстраты и выделяемые продукты в лабораторной культуре.
Бактерии не удаётся культивировать по нескольким причинам: 1) клетки
вступили в некультивируемую стадию (Nyström, 2001); либо 2) бактериопланктон
представлен неизвестными видами, для которых еще не подобраны условия куль-
тивирования (Amann et al., 1995; Suzuki et al., 1997). Таким образом, некультиви-
руемые виды бактериопланктона корректнее было бы назвать «пока ещё не куль-
тивируемыми» (Yokokawa, Nagata, 2010). По некоторым данным, часть видов бак-
терий невозможно выделить в чистую культуру, поскольку в природе они сущест-
вуют только в тесном сообществе с другими организмами (Connon, Giovannoni,
2002). В любом случае, по мнению В. И. Вернадского, разделение «живых ве-
ществ» на чистые виды неизбежно упрощает реальные явления и противоречит
естественному состоянию вещей, в то время как основное значение имеет так на-
зываемый “сложный вид”, представляющий собой симбиоз видов – геохимиче-
скую органическую смесь (Вернадский, 1978). Даже если удастся выяснить, что
изолированный и идентифицированный вид бактериопланктона в лабораторных
условиях потребляет конкретное вещество, это не означает, что в природном со-
обществе водоёма, из которого он был выделен, данный вид выполняет ту же
функцию. На одно и то же изменение внешней среды, например, увеличение кон-
центрации питательного вещества, вид может реагировать по-разному, в
зависимоcти от того, есть ли вокруг него другие биологические виды, и того, ка-
кие это виды (Lawrence et al., 2012). Исследуемый вид может начать утилизиро-
вать предложенное вещество ввиду недоступности иных субстратов, потребляе-
мых им в естественных условиях. Или вполне вероятно, что в естественных усло-
виях конкуренты потребляют данное вещество более успешно, чем исследуемый
вид, и ему приходится довольствоваться другими ресурсами. Таким образом, если
в лабораторных условиях не моделируются такие природные факторы, как гетеро-
генность среды, конкуренция за ресурсы, хищничество и другие взаимодействия,
то культивирование изолированного вида не позволяет определить особенности
физиологии и жизнедеятельности данных микроорганизмов в природных экоси-
стемах (Maron et al., 2007).
В настоящее время микробиологические исследования проводятся с исполь-
зованием двух групп методов. Во-первых, применяются классические методы
культивирования. Исторически непременным условием идентификации бактерий
является их выделение в чистые культуры по физиолого-биохимическим призна-
кам (Определитель бактерий Берджи, 1997). Во-вторых, всё чаще используются
молекулярно-генетические методы, благодаря которым в геометрической про-
грессии увеличивается объём данных о последовательностях бактериальных генов
и разнообразии природных бактериальных сообществ на основе выделения опе-
рационных таксономических единиц (Hofle et al., 2008). Наблюдается парадокс:
первоначально таксономическая идентификация бактерий основывалась на их
биогеохимической функции – культивировании на селективных средах, а те, что
культивировать и идентифицировать не удавалось, оставались без внимания ис-
следователей. В настоящее же время легко идентифицировать бактерию методами
молекулярной генетики, но трудно определить её функцию. Знания о функции
популяций и сообществ бактериопланктона необходимы для прогнозирования их
отклика на меняющиеся условия окружающей среды и понимания биогеохимиче-
ских процессов, происходящих в экосистеме (Zehr, 2010). Таким образом, необхо-
димы адекватные методы, позволяющие определять видоспецифичные экологиче-
ские (биогеохимические) функции в водных экосистемах некультивируемых бак-
терий, идентифицируемых средствами молекулярной генетики.
Перспективным методом для изучения потребления различных веществ от-
дельными видами бактериопланктона является метод экспериментальных микро-
экосистем (МЭС), содержащих пробы природного сообщества бактериопланкто-
на, в которые добавляются тестируемые питательные вещества. Ранее было уста-
новлено, что в МЭС в течение недели сохраняется и функционирует естественное
планктонное сообщество (Гладышев, 1999). Для мониторинга изменений состава
доминирующих видов внутри бактериальных сообществ в МЭС часто использу-
ется метод разделения амплифицированных фрагментов гена 16S рибосомальной
РНК с помощью денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ)
(Martin et al., 2012).
В качестве тестовых добавок для гетеротрофного бактериопланктона были
выбраны аминокислоты, поскольку эти вещества в больших количествах выделя-
ются из растущего и отмирающего фито- и зоопланктона и являются одним из
наиболее предпочитаемых бактериями органических компонентов.
Целью настоящей работы было определить видовой состав планктонных
бактерий бассейна реки Енисей молекулярно-генетическими методами, включая
секвенирование следующего поколения, и оценить их биогеохимические функции
с помощью экспериментального исследования потребления отдельными видами
бактериопланктона конкретных органических веществ.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1) Изучить биоразнообразие бактериопланктона р. Енисей методом секве-
нирования следующего поколения.
2) Молекулярно-генетическими методами идентифицировать бактерио-
планктон, потребляющий определённый спектр аминокислот, на примере водо-
хранилища Бугач.
3) Методом экспериментальных микроэкосистем, созданных на основе
проб из водохранилища, изучить сезонную динамику отклика видового состава
бактериопланктона на добавление различных аминокислот.
При решении поставленных задач были получены результаты, которые вы-
носятся на защиту:
1) В р. Енисей выделяются три сообщества бактериопланктона, достоверно
отличающиеся по видовому составу, и населяющие участки реки, расположенные
в горной тайге, равниной тайге и тундре (лесотундре).
2) В бактериопланктоне водохранилища существуют виды, имеющие уз-
кую специализацию в потреблении отдельных аминокислот.
3) Участие бактериопланктона водохранилища в утилизации отдельных
органических веществ существенно зависит от сезона, что необходимо учитывать
при оценке способности экосистемы водоёма к биологическому самоочищению от
отдельных органических веществ.
Апробация работы: материалы диссертации докладывались на V Междуна-
родной конференции по промышленной, прикладной микробиологии и микро-
биологии окружающей среды – BioMicroWorld2013 (Мадрид, Испания, 2013); XV
Школе-конференции молодых ученых «Биология внутренних вод» (пос. Борок
Ярославской обл., 2013); конкурсах-конференциях научных работ молодых учё-
ных Института биофизики СО РАН (Красноярск, 2012-2014) и Красноярского на-
учного центра (Красноярск, 2014); XV Международном симпозиуме по микроб-
ной экологии – ISME (Сеул, Республика Корея, 2014); XI съезде Гидробиологиче-
ского общества при РАН (Красноярск, 2014); Конкурсе на лучшую научную рабо-
ту студентов и молодых учёных федеральных университетов (Ростов-на-Дону,
2014); семинарах лаборатории экспериментальной гидроэкологии Института био-
физики СО РАН (Красноярск, 2011-2014).
ГЛАВА 1 СЕКВЕНИРОВАНИЕ СЛЕДУЮЩЕГО ПОКОЛЕНИЯ И
СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИДОСПЕЦИФИЧНЫХ