Оптимизация диагностики лейкоза, иммунный статус и его коррекция при лейкоз-ассоциированной инфекции крупного рогатого скота в условиях Северного Казахстана

2.1 Материалы и методы исследования. Экспериментальная часть
диссертационной работы выполнена в период с 2017 по 2020 гг в ФГБОУ ВО
Омский ГАУ на кафедре ветеринарной микробиологии, инфекционных и
инвазионных болезней, на базе ТОО «Северо-Казахстанского научно-
исследовательского института сельского хозяйства» в отделе комплексной
лаборатории, ФГБНУ «Омского аграрного научного центра» в отделе
ветеринарии.
Эпизоотологический материал собран по данным документации и
официальных ветеринарных отчетов отдела ветеринарии Управления сельского
хозяйстваСеверо-Казахстанскойобласти,протоколовсерологических
исследований сыворотки крови на лейкоз, а также сведений областной
ветеринарной инспекции Комитета ветеринарного контроля и надзора
Министерства сельского хозяйства Республики Казахстан.
Построение картограммы эпизоотической ситуации проводили с помощью
специальной компьютерной программы (Е.С. Борисов и др., 2020), используя
встроенные графические возможности языка программирования Delphi 2010.
Объектом исследования являлся крупный рогатый скот красной степной и
голштино-фризской породы в возрасте от 24-х месяцев и старше (около 1000
голов), принадлежащий различным сельскохозяйственным формированиям
Северо-Казахстанской и Костанайской областей Республики Казахстан,
периферическая кровь и сыворотка крови 920 голов крупного рогатого скота из
неблагополучных по лейкозу и бруцеллезу хозяйств.
Носительство ВЛКРС у коров определялось реакциями иммунодиффузии в
геле агара – РИД (производство ФКП «Курская биофабрика – фирма «Биок»,
Россия), иммуноферментный анализ – ИФА (производство компании ID Vet,
Франция) и непрямой иммунофлюоресценции – РНИФ; при диагностике
бруцеллеза использовались ИФА (производство компании AniGen, Корея), роз
бенгал проба (РБП), реакции агглютинации (РА) и связывания комплемента (РСК)
с единым антигеном (производство НПП «Антиген», Казахстан) и РНИФ. При
диагностике других бактериальных инфекций применяли ИФА (паратуберкулез,
хламидиоз) с использованием коммерческих наборов компании ID Vet, а также
РНИФ (хламидиоз, анаплазмоз, кампилобактериоз и Ку-лихорадка). Все реакции
выполнены в соответствии с инструкцией по применению диагностических
наборов для обнаружения специфических антител в сыворотке крови. Учет и
интерпретацию результатов иммуноферментного анализа осуществляли с
помощью ИФА анализатора Multiscan FX («Thermo Scientific»).
РНИФ проводили по общепринятой методике с использованием
люминесцирующей сыворотки против глобулинов быка (производство института
им. Н.Ф. Гамалеи). В качестве антигенов применяли вакцинные штаммы и
стандартные антигены, используемые для постановки РА, РСК и РИД.
Люминесценцию антител регистрировали по четырехкрестной системе с оценкой
не менее трех крестов на микроскопе AXIOSTAR PLUS (производство CARL
ZEIS, Германия).
Лейкограмму выводили по результатам дифференцированного подсчета 100
клеток в окрашенных мазках крови под микроскопом с иммерсионной системой.
Абсолютное количество лимфоидных элементов в 1 мкл крови определяли путем
умножения количества лейкоцитов на общий процент лимфоцитов в
лейкоцитарной формуле и деления полученного произведения на 100.
Показатель абсолютного количества лимфоцитов оценивали по «лейкозному
ключу» в соответствии с Методическими указаниями по диагностике лейкоза
крупного рогатого скота (2000).
В качестве иммунокорректора испытана изготовленная на основе Бетулина-
экстракта (производство ООО «След», РФ, г. Пермь) 0,25% суспензия в 1,2-
пропиленгликоле (Бетулин-ЭПГ).
С помощью биохимических исследований определяли в крови показатели
минерального (железо, магний, кальций, неорганический фосфор), белкового
(общий белок, альбумины, мочевина), липидного (холестерин), углеводного
(глюкоза) и пуринового (мочевая кислота) обменов. Исследования сыворотки
крови проводили на полуавтоматическом биохимическом анализаторе Stat Fax
4500 (США) с помощью наборов реагентов производства ТОО «ДиАКиТ»
(Республика Казахстан) и АО «ДИАКОН-ДС» (Россия) в соответствии с
инструкциями по их применению.
Исследование клеточного звена иммунитета проводилось методами
спонтанного (Е-рок) для определения Т-лимфоцитов, комплементарного (ЕАС-
рок) для выявления В-лимфоцитов и глобулинового розеткообразования (ЕА-
рок) для идентификации цитотоксических Т-лимфоцитов, в соответствии с
методическими рекомендациями по оценке иммунного статуса у крупного
рогатого скота при лейкозе (В.С. Власенко и др., 2010).
Состояние параметров фагоцитоза определяли на основе изучения кислород
продуцирующей активности нейтрофильных гранулоцитов в реакции
восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) в спонтанном и
индуцированном вариантах фотометрическим способом с последующей
фиксацией результатов с помощью многоканального иммунохимического
анализатора «Fluorofot STD Less-486-М». Для дополнительной характеристики
НСТ-теста рассчитывали функциональный резерв нейтрофилов как отношение
стимулированного варианта НСТ к спонтанному (Л.В. Дегтяренко и др. 2017).
Также осуществляли оценку кислороднезависимой бактерицидной системы по
содержанию катионных белков цитохимическим методом по М.Г. Шубичу
(1974) с последующим подсчетом в соответствии со стандартной методикой
среднего цитохимического коэффициента (СЦК).
Для оценки гуморального звена определяли уровень ЦИК в сыворотке крови
по стандартной методике с использованием полиэтиленгликоля (Ю.А. Гриневич,
А.Н. Алферов, 1981).
Полученные данные были подвергнуты статистической обработке с
определением средних арифметических (M) и расчетом ошибок средних
арифметических (m). При оценке достоверности различий (р) между двумя
средними величинами Мх и Му использовали t-критерий Стьюдента. Различия
результатов считали статистически достоверными при уровне значимости
р≤0,05.

2.2. Эпизоотическая ситуация по лейкозу в Северо-Казахстанской
области Республики Казахстан. В соответствии с данными ветеринарной
отчетности на территории Северо-Казахстанской области наблюдалась
достаточно напряженная эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого
скота. В общей сложности за 5 лет (с 2014 по 2018 годы) было подвергнуто
исследованию на лейкоз (РИД) 19650 проб сыворотки крови, из которых 3667
оказались положительными, что составило 18,7 %. Уровень инфицированности
за анализируемый период не претерпевал существенных изменений и находился
приблизительно на одном уровне. Так, в 2014 году выявлено 19,2 % позитивных
проб, в 2015 – 19,4 %, в 2017 – 20,0 % и в 2018 – 18,6 %. Исключением являлся
2016 год, в котором зарегистрировано практически двукратное снижение
инфицируемости до 10,3 %, что, вероятно, было связано с неполным охватом
поголовья серологическими исследованиями в РИД.
На территории всех 13-и административно-территориальных единиц с 2014
по 2018 годы регистрировались случаи выявления животных-вирусоносителей,
носящих неравномерный характер. По результатам серологических исследований
в целом за 5 лет процент позитивных проб варьировал от 3,5 до 28,1 %. Самыми
неблагополучными являлись Кызылжарский (28,1 %), Аккайынский (27,9 %) и
Айыртауский (26,3 %) районы.
Для более наглядной оценки степени распространения инфицированности в
отдельно взятых территориальных единицах нами была разработана технология
компьютерной визуализации эпизоотологического районирования с выведением
на экран карты, нанесения на нее эпизоотических данных согласно алгоритму
обработки в виде кругов разной раскраски или штриховки в центре каждого
района.
Согласно серологическим исследованиям, проведенным за анализируемый
промежуток времени, территория Северо-Казахстанской области была разбита по
уровнюраспространениявируснойинфекцииследующимобразом:
административно-территориальные единицы со степенью инфицированности
скота до 10 %, от 10 до 30 % и свыше 30 %. Установлено, что суммарно за 5 лет в
Северо-Казахстанской области в 11 из 13 районов регистрировался средний
уровень (от 10 до 30 %) носительства ВЛКРС. Еще в двух районах
(УалихановскийиАкжарский)выявленаминимальнаястепень
распространенности инфекции (до 10 %).
В соответствии с Ветеринарными правилами Республики Казахстан (п. 1199)
в случае выявления положительного результата в реакции иммунодиффузии
проводят уточнение диагноза с применением иммуноферментного анализа
(ИФА). И только при регистрации положительного результата по ИФА
осуществляют исследование с использованием гематологического метода. С
помощью ИФА за 5 лет было выявлено 2289 положительных проб, а также 110
животных в гематологической стадии заболевания лейкозом. Значительное
количество ИФА-позитивных проб зарегистрировано в 2015 и 2017 годах
(соответственно: 648 и 618). Случаи гематологического проявления лейкоза
превалировали в 2017 году.
Таким образом, несмотря на комплекс проводимых профилактических
мероприятий, лейкоз остается актуальной проблемой в животноводстве.
Эпизоотическая ситуация в Северо-Казахстанской области по лейкозу крупного
рогатогоскотахарактеризуетсяповсеместнымраспространением,
напряженностью и стойким вирусоносительством среди поголовья.
2.3. Оценка диагностической эффективности иммунофлюоресцентного
метода в сопоставлении с РИД и ИФА при лейкозе крупного рогатого скота
С целью испытания диагностической эффективности реакции непрямой
иммунофлюоресценции (РНИФ) в сравнении с нормативно утвержденными
методами было протестировано 783 пробы сывороток крови крупного рогатого
скота в возрасте от 24 месяцев и старше из различных сельскохозяйственных
формирований Северо-Казахстанской и Костанайской областей, обозначенные
условно – объекты А, Б, В и Г.
Количество положительных проб, выявленных с помощью РИД, в разных
объектах колебалось от 31 до 87 (17,7 – 35,65 %), при этом суммарно
идентифицировано 216 носителей ВЛКРС, что составило 27,6 %. В то же время
исследованием с помощью ИФА и РНИФ в 783-х образцах сыворотки крови было
установлено соответственно 231 (29,5 %) и 230 (29,4 %) проб, имеющих антитела
к вирусу лейкоза.
В объектах А, Б и Г обнаружено одинаковое количество положительных
проб, выявленных с помощью ИФА и РНИФ, которое к тому же было на 1,7-4,1 %
выше, чем при исследовании в РИД. Что касается объекта В, то в нем все
изучаемые методы диагностики показали практически равноценный результат.
В дальнейшем нами был проведен анализ случаев совпадений и расхождений
в РИД, ИФА и РНИФ, которой представлен в таблице 1.

Таблица 1 – Сравнительная оценка диагностической эффективности разных
методов
СтатусКоличествоИФАРНИФИФА(+)
животныхпроб(–)(+)(–)(+)РНИФ (+)
РИД (-)567549185491817
РИД (+)21632134212212
Всего783552231553230229

Из таблицы 1 видно, что с помощью ИФА и РНИФ из числа 567-и РИД-
отрицательных голов дополнительно идентифицировано 18 (3,2 %) носителей
ВЛКРС, в том числе в 17-и случаях одновременно двумя методами. В
подавляющем большинстве случаев (99 %) были установлены совпадения
положительных результатов ИФА с РНИФ, что свидетельствовало о
приблизительной равнозначности их диагностической эффективности. В то же
время идентичность РИД с ИФА и РНИФ составила свыше 98 %, отмечались
лишь единичные случаи расхождения результатов.
Высокая стоимость тест-систем, а также оборудования, предназначенного
для проведения ИФА, сдерживают широкое внедрение этого метода. По этой
причине, согласно нормативным документам, регламентированным на
территории Республики Казахстан, ИФА применяется только для уточнения
диагноза у животных, давших положительную РИД. Таким образом,
иммунофлюоресцентныйметод,имеющийдостаточновысокую
чувствительность, найдет успешное применение для диагностики лейкозной
инфекции в качестве альтернативного метода.
2.4. Изучение ассоциативных форм проявления лейкозной инфекции
С целью выявления одновременного течения с другими инфекционными
заболеваниями сыворотки крови от 50 голов крупного рогатого скота, имеющих
антитела к вирусу лейкоза, выявленных одновременно с помощью РИД, ИФА и
РНИФ, были подвергнуты диагностическому тестированию на ряд других
инфекционных заболеваний: бруцеллез, анаплазмоз, хламидиоз, паратуберкулез,
кампилобактериоз и Ку-лихорадку (табл. 2).

Таблица 2 – Комплексные диагностические исследования сыворотки крови
коров, инфицированных ВЛКРС
Выявлены антитела, проб (%)
Инфекции (n=50)
ИФАРНИФ ИФА+РНИФРБПРАРСК
Бруцеллез19 (38) 23 (46)19 (38)22 (44) 20 (40) 19 (38)
Хламидиоз5 (10) 9 (18)4 (8)н/ин/ин/и
Паратуберкулез6 (12)н/ин/ин/ин/ин/и
Анаплазмозн/и2 (4)н/ин/ин/ин/и
Ку-лихорадкан/и–н/ин/ин/ин/и
Кампилобактериозн/и4 (8)н/ин/ин/ин/и
Примечание: н/и – не исследовали; – отрицательные.
В 40 пробах из 50-ти (80 %) выявлено наличие антител к возбудителям
других инфекционных заболеваний. Наиболее часто носительство ВЛКРС
сочеталось с бруцеллезной инфекцией. Так, в общей сложности специфические
антитела были выявлены в 23-х пробах сывороток крови (46 %), из них 19 имели
положительную реакцию в РБП, РСК, РА, ИФА и РНИФ, 3 только в РБП и РНИФ
и 1 – в РА, ИФА и РНИФ. Следует отметить, что в 2 пробах, наряду с
бруцеллезными антителами, были обнаружены хламидиозные. Необходимо
отметить, что сельскохозяйственные формирования, в которых была отобрана
сыворотка крови, являются неблагополучными по бруцеллезу. При
диагностических исследованиях крупного рогатого скота выявляют до 9-10 %
реагирующих животных в стаде. Вакцинацию против этой инфекции в этих
хозяйствах не проводят. Лейкоз и бруцеллез, как показывают регулярно
проводимые в хозяйстве диагностические тестирования, протекают как
самостоятельно, так и в ассоциации, не оказывая существенного влияния на
особенности проявления эпизоотического процесса названных нозологий.
Помимо этого, с помощью ИФА и РНИФ установлено, что еще в 17
исследуемых сыворотках крови обнаруживались антитела к другим
бактериальным заболеваниям, из которых можно отметить хламидиоз.
Специфические антитела к этой бактериальной инфекции выявлены в 10 пробах
(20 %), из них в 5 положительную реакцию наблюдали в ИФА, в 9 – в РНИФ и в 4
– одновременно в ИФА и РНИФ. Иммунофлюоресцентным методом также
определены кампилобактериозные (4 пробы) и анаплазмозные антитела (2 пробы).
В то же время, с помощью ИФА установлено 6 случаев (12 %) инфицирования
животных паратуберкулёзом.
Необходимо отметить, что нами были также выявлены единичные случаи
лейкоза в гематологической стадии заболевания, осложненного бруцеллезной
инфекцией. При проведении гематологических исследований нами были
установлены ряд изменений. В частности, в периферической крови крупного
рогатого скота мы наблюдали плазматические клетки, в том числе с эксцентрично
расположенным ядром, атипичные формы лимфоцитов: с увеличенной
цитоплазмой; клетки Ридера, имеющие почкообразную форму ядер или
двудольчатые формы ядер; голое ядро лимфоцита.

2.5. Изучение иммунобиологических особенностей проявления лейкоз-
бруцеллезной инфекции
В связи с наибольшей распространенностью одновременного течения
бруцеллезной и лейкозной инфекцией по сравнению с другими нами была
поставлена задача изучения уровня обменных и иммунных механизмов при
данной ассоциации.

2.5.1. Анализ изменений биохимических показателей у крупного
рогатого скота при ассоциативном течении лейкоза и бруцеллеза
С целью изучения обменных процессов у крупного рогатого скота при
ассоциативном течении лейкоза и бруцеллеза было отобрано 30 коров, которых
разделили на 3 группы. Первую группу составили клинически здоровые
животные (n=10), при диагностических исследованиях на лейкоз и бактериальные
инфекции специфические антитела отсутствовали (контроль). Вторая группа
образована из 10 голов крупного рогатого скота, имевших по результатам
диагностических исследований на лейкоз в РИД, ИФА и РНИФ, положительную
реакцию (носители ВЛКРС). Третья группа была также сформирована из 10
инфицированных ВЛКРС животных, но в отличие от второй группы у них по
результатам тестирования на бруцеллез регистрировались положительные
реакции в РБП, РА, РСК, ИФА и РНИФ. У животных всех групп были
определены биохимические показатели крови (табл. 3).
Таблица 3 – Показатели обменных процессов в сыворотке крови крупного
рогатого скота при лейкоз-бруцеллезной инфекции, М±m
Группа животных
Лейкоз-
Биохимические показателиносители
здоровыебруцеллезная
ВЛКРС
инфекция
Общий белок, г/л71,80±1,7066,10±6,0082,10±5,20
Альбумины, г/л38,10±1,4023,90±1.50**63,30±3,50**
Мочевина, ммоль/л4,90±0,704,70±0,505,50±0,80
Холестерин, ммоль/л3,60±0,303,00±0,404,90±0,50*
Кальций, ммоль/л2,70±0,101,90±0,10**2,40±0,10*
Фосфор, ммоль/л1,50±0,102,30±0,20*1,50±0,10
Магний, ммоль/л5,10±0,704,00±0,704,90±0,70
Железо, ммоль/л34,80±1,8033,40±1,9032,50±1,60
Глюкоза, ммоль/л2,80±0,102,80±0,103,00±0,30
Мочевая кислота, мкмоль/л63,70±6,9073,80±5,9067,20±4,40
Примечание: *р<0,05; **р<0,01. При анализе показателей белкового обмена установлена неодинаковая траектория изменений параметров у крупного рогатого скота опытных групп относительно контроля. Так, если у носителей ВЛКРС наблюдалось снижение в сыворотке крови концентрации общего белка и альбуминов, то у животных, являющихся одновременно бруцелло- и вирусоносителями, напротив, отмечено увеличение их содержания. Наиболее выраженные различия были выявлены в количестве альбумина. В частности, этот показатель значительно возрастал при ассоциативном течении вирусной инфекции до 63,3±3,5 г/л против 38,1±1,4 г/л (р<0,01) у здоровых животных, тогда как у инфицированных ВЛКРС он с высокой степенью достоверности уменьшался до 23,9±1,5. Аналогичная траектория изменений отмечена у животных опытных групп по сравнению с контрольной в содержании мочевины и холестерина, однако только концентрация последнего показателя достигала достоверной разницы у коров с лейкоз-ассоциированной инфекцией и составила 4,90±0,50 ммоль/л против 3,60±0,30 ммоль/л (р<0,05) у здорового крупного рогатого скота. Анализ биохимических параметров также выявил отклонения в минеральном обмене, проявлявшиеся достоверным снижением уровня общего кальция до 1,9±0,1 ммоль/л у носителей ВЛКРС против 2,7±0,1 ммоль/л (р<0,01) в контрольной группе на фоне заметного увеличения концентрации неорганического фосфора (соответственно: 2,3±0,2, 1,5±0,1 ммоль/л; р<0,05). Тенденция к существенному уменьшению содержания общего кальция также прослеживалась при ассоциативном проявлении лейкозной инфекции, однако разница заключалась в том, что количество неорганического фосфора оставалось неизменным. Таким образом, биохимический статус инфицированных ВЛКРС животных характеризуется снижением интенсивности белкового, жирового и минерального обменов. Особенно можно выделить достоверные изменения, сопровождающиеся снижением концентрации альбуминов, а также кальция на фоне значительного увеличения содержания неорганического фосфора. Ассоциативное течение лейкозной инфекции с бруцеллезом, напротив, сопровождалось усилением интенсивности белкового и жирового обменов, о чем свидетельствовало достоверное повышение уровня альбуминов и холестерина. 2.5.2. Анализ изменений иммунного статуса у крупного рогатого скота при ассоциативном течении лейкоза и бруцеллеза С целью оценки иммунного статуса у крупного рогатого скота, инфицированного бруцеллезной и лейкозной инфекцией, было взято 15 коров, в том числе клинически здоровые животные (контроль, n=5), носители ВЛКРС (n=5), а также с ассоциированным течением лейкозной и бруцеллезной инфекций (n=5). У всех животных были отобраны пробы крови для исследования количестваиммунокомпетентныхклеток,атакжефункционально- метаболической активности нейтрофилов в НСТ-тесте. Установлено, что концентрация лейкоцитов находилась на одном уровне у клинически здоровых и инфицированных ВЛКРС животных, тогда как при лейкоз-бруцеллезной инфекции этот показатель достоверно увеличивался до 9,18±0,30 × 109/л против 6,90±0,76 × 109/л в контрольной группе. Общее количество лимфоцитов у носителей ВЛКРС относительно животных контрольной группы увеличилось на 25 % (р<0,01), а при сочетанном течении вирусной и бактериальной инфекции на 53 % (р<0,01). Увеличение числа лимфоидных клеток в обеих опытных группах происходило за счет В-лимфоцитов и цитотоксических Т-лимфоцитов. Так, содержание В-лимфоцитов у животных-вирусоносителей относительно контроля возросло с 0,94±0,16 до 1,81±0,20 × 109/л (р<0,05), у коров с сочетанным течением инфекции до 1,85±0,22 × 109/л (р<0,05); цитотоксических Т-лимфоцитов с 0,72±0,10 до 1,82±0,22 (р<0,01) и 1,93±0,15 (р<0,001) × 109/л соответственно. Концентрация Т-лимфоцитов у инфицированных ВЛКРС по сравнению с контрольной группой имела тенденцию к снижению, а при ассоциативном течении, напротив, увеличивалась. При постановке НСТ в спонтанном варианте отмечалась тенденция к увеличению в крови активных форм кислорода, усиливающаяся у животных, являющихся одновременно вирусо- и бактерионосителями, у которых интенсивность окислительно-восстановительного метаболизма увеличивалась в 2,3 раза (р<0,01) относительно значений контрольной группы (табл. 4). Таблица 4 – Показатели функционально-метаболической активности нейтрофилов у животных контрольной и опытных групп, М±m НСТ-тест Группа животныхСпонтанный, Индуцированный, Функциональный ед.оп.пл.ед.оп.пл.резерв Контрольная0,24±0,020,23±0,021,00±0,08 Носители ВЛКРС0,28±0,020,18±0,01*0,65±0,06** Ассоциированная 0,56±0,06**0,51±0,200,87±0,25 инфекция Примечание: *р<0,05; **р<0,01 У инфицированного ВЛКРС скота наблюдается снижение стимулированной окислительно-восстановительной метаболической активности нейтрофильных гранулоцитов на 28 % (р<0,05) по сравнению с контролем. Следует отметить, что у коров с лейкоз-бруцеллезной инфекцией индуцированная активность кислородзависимых механизмов возрастала в 2,2 раза, однако не достигала статистически значимой разницы из-за существенного колебания этого параметра у отдельных животных от 0,180 до 1,304 ед.оп.пл. Средние значения функционального резерва нейтрофилов у здоровых коров оказались равны 1,00±0,08, тогда как у вирусоносителей он уменьшался на 35 % (р<0,01). Что касается ассоциированного течения болезни, то следует обратить внимание на значительные колебания этого показателя: от очень высоких у одной коровы, до незначительных у других животных или же в пределах нормальных значений. Такимобразом,особенностьюокислительно-восстановительного метаболизма нейтрофильных гранулоцитов при лейкоз-ассоциированной инфекции является значительная активизация параметров спонтанной и стимулированной НСТ-активности, а также функционального резерва нейтрофилов у отдельных животных на фоне значительного снижения этого параметра у носителей ВЛКРС. 2.6. Изучение иммунокоррегирующего действия бетулина-ЭПГ при лейкозной инфекции крупного рогатого скота, осложненной инфекционно- воспалительными процессами С целью испытания иммунокоррегирующего действия препарата было отобрано 20 коров, у 10 из которых в сыворотке крови выявлены антитела к ВЛКРС, а также отмечались послеродовые осложнения (эндометриты, вульвовагиниты). Остальных 10 клинически здоровых коров использовали в качестве контроля. Животным опытной группы осуществляли трехкратную с интервалом 7 суток подкожную инъекцию бетулина-ЭПГ из расчета 10 мг/ кг. До введения, на 7-, 14- и 21-е сутки после инокуляции препарата у особей опытной и контрольной группы производили отбор проб крови для оценки иммунного статуса. При исследовании иммунного статуса перед введением препарата установлено, что у коров опытной группы наблюдалось увеличение количества лейкоцитов на 39 % и лимфоцитов на 61 % (р<0,05) по сравнению со значениями в контрольной группе животных. Вследствие этих изменений концентрация Т-, В- и цитотоксических Т-лимфоцитов также повышена однако не достигает достоверной разницы. Изменения функционально-метаболической активности лейкоцитов у серопозитивных гинекологически больных коров сопровождались сильными колебаниями: от незначительных у одних индивидуумов к существенно повышенным параметрам у других. Именно по этой причине среднегрупповые значения, несмотря на их увеличение, не имели достоверных различий с аналогичными показателями контрольной группы. Анализ параметров иммунной системы после однократного введения препарата также показал наличие достоверных различий в количестве лейкоцитов и лимфоцитов, но в отличие от предыдущего исследования концентрация лимфоцитов, напротив, снижалась до 3,23±0,12 против 4,27±0,38 × 109/л (р<0,05) в контрольной группе. Вследствие наблюдаемой нами трансформации лимфоцитов происходило также снижение числа В-лимфоцитов и особенно Т- лимфоцитов, концентрация которых в опытной группе составила 0,36±0,06 против 0,65±0,06 × 109/л у контрольных животных. Также установлено достоверное снижение спонтанной тетразолиевой активности с 0,30±0,02 до 0,24±0,01 ед. оп. пл. относительно контрольной группы. Такая перестройка способствовалаувеличениюфункциональногорезерванейтрофилов (соответственно: 0,90±0,08, 1,11±0,01; р<0,05). После двукратного введения препарата нами не было обнаружено достоверных различий между показателями опытной и контрольной групп. Последующее исследование, проведенное через 7 суток после трехкратного введения бетулина-ЭПГ, выявило тенденцию к увеличению числа лейкоцитов в пределах физиологической нормы у животных опытной группы относительно контроля (соответственно: 6,66±0,79, 8,30±0,35× 109/л; р>0,05). Отличительной
особенностью иммунного статуса в этот срок исследования стало достоверное
увеличение индуцированной тетразолиевой активности до 0,33±0,02 против
0,21±0,02 ед. оп. пл. в контроле и, как следствие, функционального резерва
нейтрофилов в 1,55 раза (р<0,01), что свидетельствовало о более высокой кислородзависимой микробицидной активности нейтрофилов у животных опытной группы. При этом следует отметить, что уровень катионных белков, ответственных за кислороднезависимые механизмы бактерицидности лейкоцитов, существенно не изменился. Помимо отмеченных изменений, наблюдается снижение в сыворотке крови опытных животных концентрации ЦИК до 63,2±11,62 у.е. против 85,2±11,13 у.е. однако не достигает достоверной разницы. Таким образом, применение бетулина-ЭПГ при осложненном течении лейкозной инфекции крупного рогатого скота обеспечивает оптимизацию параметров иммунной системы, характеризующуюся восстановлением количества лимфоидных клеток до уровня клинически здоровых животных. Полученные результаты позволяют рекомендовать препарат как эффективное средство для сдерживания лейкозного процесса, осложненного ассоциированной инфекцией, а также для использования серонегативным животным с целью повышения неспецифической резистентности к заражению ВЛКРС. 3.ЗАКЛЮЧЕНИЕ На основании результатов проведенных исследований нами сделаны следующие выводы: 1. Уровень инфицированности крупного рогатого скота, выявленный в серологических исследованиях (РИД), на территории Северо-Казахстанской области, составил: в 2014 г. – 19,2 %, в 2015 г. – 19,4 %, в 2016 г. – 10,3 %, в 2017 г. – 20,0 %, в 2018 г. – 18,6 %, что свидетельствует о стойком вирусоносительстве. Разработана технология компьютерной визуализации, позволяющая на основании проведенных диагностических исследований, ранжировать территорию области на зоны с высоким (от 30 % и выше), средним (от 10 до 30 %) и низким (менее 10 %) уровнем распространения инфекции. 2. Изучена сравнительная диагностическая эффективность РИД, ИФА и иммунофлюоресцентного метода в 4-х стадах крупного рогатого скота неблагополучных по лейкозу. Установлена высокая чувствительность РНИФ сопоставимая с ИФА. Схематично результативность лабораторных методов можно представить в виде цепочки ИФА≥РИД≤РНИФ, ИФА≥РНИФ. Испытана эффективность иммунофлюоресцентного метода, РИД, ИФА в 4-х стадах крупного рогатого скота неблагополучных по лейкозу. 3. Инфицирование вирусом лейкоза в животноводческих хозяйствах Северо- Казахстанской области в 80 % случаев сопровождается ассоциативным течением. Наиболее часто лейкозная инфекция протекает в сочетании с возбудителями следующих бактериальных инфекций: бруцеллезом (46 %), хламидиозом (20 %), паратуберкулезом (12 %) и кампилобактериозом (8 %). 4. Ассоциативное течение лейкоза и бруцеллеза характеризуется достоверным увеличением концентрации альбуминов в 1,66 раза и холестерина в 1,36 раза относительно идентичных параметров у клинически здоровых коров. Отличительной особенностью животных, инфицированных ВЛКРС, является снижение этих показателей белкового и липидного обменов соответственно в 1,59 (р˂0,01) и 1,2 раза. 5. Иммунный статус у крупного рогатого скота при лейкоз-бруцеллезной инфекции характеризуется увеличением в крови абсолютного содержания всех иммунокомпетентных клеток в 1,21 – 2,68 раза и усилением спонтанной и стимулированной тетразолиевой активности нейтрофилов соответственно в 2,33 (р˂0,01) и 2,21 раза. Специфические изменения при инфицировании только вирусом лейкоза сопровождались уменьшением концентрации Т-клеток в 1,2 раза, а также достоверным снижением индуцированной НСТ активности и функционального резерва нейтрофилов в 1,23 и 1,35 раза соответственно. 6. Применение на крупном рогатом скоте при лейкозе, имеющем признаки инфекционно-воспалительных осложнений, иммунокорректора бетулин-ЭПГ из расчета 10 мг/кг подкожно, трехкратно с интервалом 7 суток способствует восстановлению количества лимфоидных клеток до уровня клинически здоровых животных, достоверному усилению бактерицидной функции нейтрофилов по результатам постановки НСТ-теста и снижению концентрации циркулирующих иммунных комплексов. На основании полученных результатов рекомендовать следующие практические предложения: 1. Разработанную программу для ЭВМ «Эпизоотическое районирование» целесообразно использовать для оптимизации планирования и проведения профилактических противолейкозных мероприятий. 2. Методические рекомендации «Применение реакции непрямой иммунофлюоресенции для диагностики лейкоза крупного рогатого скота», рассмотрены и утверждены Ученым советом факультета ветеринарной медицины Омского государственного аграрного университета (протокол № 9 от 2 июня 2020 года). Предназначено для специалистов ветеринарных научно-исследовательских институтов, ВУЗов и лабораторий, проводящих исследования в области разработки новых методов и средств иммунодиагностики животных. 3.Материалыисследованийпоизучениюособенностей иммунобиологического статуса крупного рогатого скота при лейкоз- ассоциированной инфекции целесообразно использовать при выполнении научно- исследовательских работ аналогичной направленности, при написании справочных пособий и монографий, а также в учебном процессе ВУЗов ветеринарного профиля. Перспективы дальнейшей разработки темы. Полученные результаты открывают перспективу дальнейших исследований, направленных на разработку новых методов и средств иммунодиагностики, прогнозирования эпизоотической ситуации, а также повышения иммунобиологических и защитных свойств организма животных, направленных на снижение риска инфицирования ВЛКРС. Использование полученных значений иммунологических и биохимических параметров при ассоциированном проявлении лейкоза у крупного рогатого скота возможно при прогнозировании течения инфекции.