Оптимизация лабораторной диагностики наследственного сфероцитоза

📅 2022 год
Бесплатно
Работа доступна по лицензии Creative Commons:«Attribution» 4.0
Асатрян Татевик Тиграновна
Бесплатно
Работа доступна по лицензии Creative Commons:«Attribution» 4.0

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ………………………………………………………………………………….. 4

ВВЕДЕНИЕ ……………………………………………………………………………………………………….. 5

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ДИАГНОСТИКЕ НАСЛЕДСТВЕННОГО
МИКРОСФЕРОЦИТОЗА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) …………………………………………….. 12

1.1 Эпидемиология наследственного сфероцитоза ……………………………………………. 12

1.2 Строение мембраны эритроцита. ……………………………………………………………….. 13

1.3 Клинические проявления. ………………………………………………………………………….. 17

1.4 Лабораторная диагностика наследственного сфероцитоза. …………………………… 19

1.5 Дифференциальная диагностика НС и других типов ГА………………………………. 28

1.6 Проблема выявления наследственного сфероцитоза в РФ ……………………………. 31

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ …………………………………. 33

2.1 Характеристика групп больных …………………………………………………………………. 33

2.2 Исследуемые параметры. …………………………………………………………………………… 37

2.2.1 Клинический анализ крови с подсчетом эритроцитарных параметров и
количества ретикулоцитов……………………………………………………………………………. 38

2.2.2 Микроскопия окрашенного мазка периферической крови и расчет
морфометрических параметров. ……………………………………………………………………. 39

2.2.3 Определение скорости лизиса эритроцитов с использованием
глицеринового теста. …………………………………………………………………………………… 43
2.2.4 Тест на связывание красителя эозин-5-малеимида. ………………………………… 45

2.3 Статистические методы …………………………………………………………………………….. 46

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ…………………… 48

3.1 Исследование клинического анализа крови с расчетом основных и
интегральных эритроцитарных параметров ……………………………………………………… 48

3.2 Результаты исследования морфометрических параметров эритроцитов………… 66

3.3 Исследования скорости лизиса эритроцитов с использованием глицеринового
теста ……………………………………………………………………………………………………………… 76

3.4 Исследование связывания красителя эозин – 5 – малеимида ………………………… 90

3.5. Лабораторный алгоритм диагностики наследственного сфероцитоза. ………….. 95

3.6 Клинические примеры. ……………………………………………………………………………… 99

ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. ……………………………………………………………………………… 107

ВЫВОДЫ ………………………………………………………………………………………………………. 110

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ……………………………………………………………… 111

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ …………………………………………………………………………….. 112
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АПК – аппаратно – программный комплекс
Г-6-ФД – глюкозо-6-фосфат дегидрогеназа
ГА – гемолитическая анемия
ГП – гемоглобинопатия
ГТ – глицериновый тест
КАК – клинический анализ крови
КДЛ – клинико – диагностическая лаборатория
ЛИС – лабораторная информационная система
МЦКДЛ – Межрайонная централизованная клинико-диагностическая лаборатория
НС – наследственный сфероцитоз
НЭ – наследственый эллиптоцитоз
ОП – оптическая плотность
ОРЭ – осмотическая резистентность эритроцитов
СИФ – средняя интенсивность флюоресценции
ФСБ, PBS – фосфатно – солевой буфер, Phosphate buffered saline
Э – 5 – м – эозин – 5 – малеимид
ЭМА-тест – тест на сязывание эозин – 5 – малеимида
ЭФ – электрофорез
Hb – гемоглобин
HCT − гематокрит
MCH − среднее содержание гемоглобина в эритроцитах
MCHC − средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах
MCV − средний объем эритроцитов
MSCV – средний объем сферической клетки
RBC − количество эритроцитов
RDW − ширина распределения эритроцитов по объему
Rt – ретикулоциты

Материалы и методы исследования
Исследование было выполнено на базе центральной клинико-
диагностической лаборатории федерального государственного бюджетного
образовательного учреждения высшего образования «Северо-Западный
государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова»
Министерства здравоохранения Российской Федерации.
В исследование были включены 76 пациентов (39 мужчин, 37 женщин)
различных возрастных групп (от 2 лет до 61 года, среднее 25,8 ± 14,5 года,
медиана 25,0), находившихся на обследовании и лечении в СПб ГБУЗ
«Консультативно-диагностический центр для детей», ФГБУ «Российский НИИ
гематологии и трансфузиологии ФМБА России» и ФГБОУ ВО СЗГМУ им. И.И.
Мечникова Минздрава России в период с октября 2015 г. по ноябрь 2018 г.
На момент исследования пациенты проживали в г. Санкт-Петербурге,
обследованную группу составили пациенты с подозрением на наличие или с
подтвержденным ранее диагнозом «наследственный сфероцитоз», другого типа
ГА, а также «здоровые» лица (с отсутствием гематологических заболеваний,
которые были определены в I или II группу здоровья).
Из исследования были исключены дети младше 6 месяцев, поскольку в
этот период наличие микросфероцитов считается вариантом нормы [Румянцев
А.Г., 2015].
По результатам проведенного лабораторного обследования пациенты
были разделены на 3 группы: основную, группу сравнения и контрольную.
Основную группу составили 18 пациентов с наследственным
сфероцитозом (по МКБ-10: D58.0: ахолурическая (семейная) желтуха,
врожденная (сфероцитарная) гемолитическая желтуха, синдром Минковского-
Шоффара). Пяти пациентам в связи с тяжелым течением заболевания ранее
была проведена спленэктомия.
Группа сравнения (n=32) – это гетерогенная группа, включающая
пациентов с различными типами несфероцитарных ГА.
Контрольную группу составили 25 человек с отсутствием
гематологических заболеваний.
Характеристика групп пациентов, вошедших в исследование,
представлена в таблице 1.
Таблица 1. Демографическая характеристика групп больных
Основная
Контрольная
группаГруппа сравнения
Демографическийгруппа
(наследственный (гемолитические
показатель(«здоровые»
сфероцитоз,анемии, n=32)
лица, n=25)
n=18)
медиана25,527,020,0
возраст
мин-макс6 – 618 – 562 – 61
мужской91613
пол
женский91612
Всем пациентам однократно были проведены гематологические и
биохимические исследования. Гематологические исследования включали
клинический анализ крови (КАК); расчет интегральных эритроцитарных
параметров (Hb/RDW, MCHC/RDW); микроскопия мазка периферической
крови с описанием морфологии эритроцитов; расчет морфометрических
параметров эритроцитов; биохимические – определение скорости лизиса
эритроцитов с использованием глицеринового теста; тест на связывание
красителя эозин-5-малеимида (ЭМА-тест).
Клинический анализ крови выполняли не позднее 6 часов от момента
забора крови на 3 DIFF гематологическом анализаторе Sysmex KX- 21N
(Sysmex, Япония).
Оценивали концентрацию гемоглобина (Нb, г/л), количество эритроцитов
(RBC, ×1012/л), средний объем эритроцита (MCV, фл), среднее содержание
гемоглобина в отдельном эритроците (MCH, пг), среднюю концентрацию
гемоглобина в эритроците (MCHC, г/л), ширину распределения эритроцитов по
объему (RDW, %), гематокрит (HCT, %). Для оценки результатов использовали
возрастные референтные значения. Также в рамках КАК рассчитывали
интегральные эритроцитарные индексы Hb/RDW и MCHC/RDW, так как по
данным Rocha et.al. (2012) они имеют большую специфичность и
чувствительность для скрининга НС, чем эритроцитарные параметры,
полученные при помощи гематологического анализатора.
Мазки периферической крови фиксировали в течение 2-3 минут в
фиксаторе Май-Грюнвальд, затем красили методом погружения в 10% раствор
красителя Романовского-Гимзы в течение 10 минут.
Расчет морфометрических параметров эритроцитов проводился методом
микроскопии окрашенных мазков периферической крови при помощи АПК
ВидеоТесТ-Морфология. АПК состоит из микроскопа с встроенной системой
ввода изображений, компьютера и соответствующего программного
обеспечения (рисунок 1). Расчет морфометрических параметров производился
по формулам, приведенным в таблице 2.

абв
Рисунок 1. Этапы анализа изображений мазков периферической крови с
использованием АПК «ВидеоТесТ-Морфология». а) загрузка изображения в
программу, выделение эритроцитов, б) распределение эритроцитов на классы в
зависимости от диаметра (микроциты (4,0 – 6,9 мкм), нормоциты (6,9 – 8,0
мкм), макроциты (8,0 – 9,5 мкм), мегалоциты (9,5 – 11,0 мкм)), в) результат.
Таблица 2. Параметры и формулы, используемые для расчета
эритроцитарных параметров аппаратно-программным комплексом.
ПоказательФормулы для Размерность Референтные
расчетазначения
Измеряемые параметры
Средняя площадь эритроцитовS эр.   2 мкм2-
Средний диаметр эритроцитовDэр.  2мкм7,2 – 7,5
Расчетные параметры
Толщина эритроцитовT 
MCV мкм1,7 – 2,3
эр.
S

Индекс сферичностиRсф =
D-3,4  3,9
T

Определение скорости лизиса эритроцитов. Лизис эритроцитов
оценивали с помощью глицеринового теста. Регистрацию скорости разрушения
эритроцитов проводили на автоматическом биохимическом анализаторе
Sapphire-400 (США). Изменение оптической плотности (ОП) регистрировали в
течение 10 минут при 37°С (длина волны 625 нм).
Приготовление реактива: 11 мл (13,81 г) глицерина растворяли в 400 мл
фосфатно-солевого буфера (ФСБ) с pH=6,85 и доводили объем до 1 л
дистиллированной водой. Реактив хранили при температуре 2 – 8 ˚С.
Ход определения: анализатором автоматически в кювету дозировалось
297 мкл реактива, нагревалось до температуры реакции, затем в ту же кювету
вносилось 3 мкл цельной крови. После перемешивания пробы незамедлительно
начиналась непрерывная регистрация снижения ОП в течение 10 минут.
Результат выражали в виде разницы между начальной и конечной ОП,
умноженной на 1000. Кроме того, скорость лизиса эритроцитов оценивали
визуально по форме графика изменения ОП со временем.
Тест на связывание красителя эозин-5-малеимида (ЭМА-тест) дает
возможность оценить целостность цитоскелета эритроцита путем связывания
флуоресцентного красителя эозин-5-малеимида с белком полосы 3 цитоскелета
эритроцита.
Исследование проводили в 5 этапов: отмывание эритроцитов, инкубация
с красителем эозин-5-малеимидом, отмывка эритроцитов от несвязавшегося
красителя, проявление красителя в ФСБ, измерение средней интенсивности
флюоресценции в процентах (СИФ). Эритроциты отмывали 3 раза в
физиологическом растворе: к 100 мкл цельной крови добавляли 1,5 мл
физиологического раствора, аккуратно перемешивали при помощи
лабораторного встряхивателя «Вортекс персональный V-1» (Biosan, Латвия, РУ
№ ФСЗ 2011/09797) и центрифугировали 5 минут при скорости центрифуги
1500 об/мин, повторяли 3 раза. Далее 10 мкл отмытых эритроцитов
инкубировали с 25 мкл красителя эозин-5-малеимида (флюоресцентный
краситель N-(5-Флуоресценил) малеимид (производство компании «Сигма»,
США) при комнатной температуре в темноте в течение часа. После инкубации
отмывку эритроцитов повторяли 2 раза для удаления несвязавшегося красителя.
После этого полученные эритроциты инкубировали 15 минут при комнатной
температуре в темноте с добавлением 600 мкл ФСБ (pH=7,0). Под воздействием
ФСБ флуоресценция связавшегося с белком эозин-5-малеимида проявляется.
Далее проводили измерение интенсивности флуоресценции с расчетом СИФ на
проточном цитометре FC500 (Beckman Coulter) с использованием программы
CXPanalysis по данным 50000 эритроцитов, гейтированных по параметрам
светорассеяния.
В каждой аналитической серии СИФ пациента с подозрением на наличие
НС сопоставляли с СИФ 3-х пациентов с отсутствием гематологических
заболеваний, при условии, что забор крови всех пациентов производился в один
день, пробы хранились в одинаковых условиях, анализ выполнялся
одномоментно.
В связи с нестабильностью красителя эозин-5-малеимид в разведенном
состоянии и отсутствием контрольных материалов, результат представляли, как
отношение СИФ пациента к сумме СИФ «здоровых» лиц в 1 аналитической
группе, выраженный в процентах.

Статистическую обработку полученных результатов производили с
использованием параметрических и непараметрических методов статистики.
Методы описательной статистики включали в себя оценку среднего
арифметического (M), стандартного отклонения (SD), медианы (Me), нижний
(25) и верхний (75) квартили. Для оценки нормальности распределения
применяли критерий Колмогорова-Смирнова (d). Для оценки межгрупповых
различий значений признаков, имеющих непрерывное распределение,
применяли t-критерий Стьюдента, ранговый U-критерий Манна – Уитни.
Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы
принимали равным 0,05.
Диагностическую ценность исследуемых маркеров оценивали с помощью
построения характеристической кривой (ROC-кривая, Receiver Operating
Characteristic, ROC-curve), которая показывает отношение доли истинно
положительных результатов (чувствительность) к доле истинно отрицательных
случаев (специфичность). Точки наиболее оптимального расположения
пересечения на ROC-кривой положительных и отрицательных примеров
определяются как пороговые значения, или Сut-off. Для получения численного
значения клинической значимости теста, а также для сравнения двух тестов,
использовали показатель AUC (Area Under Curve), или значение площади под
характеристической ROC-кривой. Этот показатель оценивали по общепринятой
экспертной шкале, при которой интервал AUC 0,9 – 1,0 характеризует качество
модели как «отлично», 0,8 – 0,9 – как «очень хорошо», 0,7 – 0,8 – «хорошо», 0,6
– 0,7 «удовлетворительно» и 0,5 – 0,6 «неудовлетворительно». Статистическую
обработку материала выполняли с использованием программ прикладного
статистического анализа (Statistica for Windows, v. 6.0).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Результаты исследования клинического анализа крови с расчетом
основных и интегральных эритроцитарных параметров
Использование гематологических анализаторов, основанных на принципе
Култера, обеспечивает расчет основных эритроцитарных параметров и
интегральных эритроцитарных индексов.
Результаты исследования основных эритроцитарных параметров в
группах представлены в таблице 3.

Таблица 3. Основные эритроцитарные параметры в группах. Приведены
медиана (Ме), нижний (25) и верхний (75) квартили
ПоказательГруппы

НС (наследственныйГА (гемолитические«Здоровые»
сфероцитоз)анемии)лица
RBC, ×1012/л4,4(3,6; 5,1)4,6 (3,1; 5,1)4,6(4,3;4,7)
Hb, г/л133 (115; 149)**121,5(110;136,5)***137 (127;145)
MCV, фл83,3 (80,1; 87,7)79,7(71,2;88,7)83(82; 85,6)
MCH, пг30,7(29,40; 32,40)28,9(24,8;32,2)30(29,4; 31)
MCHC, г/л366,5(356; 373)**350,5(336,5; 363,5)364 (353; 367)
RDW, %16(14; 19,2)*15,2(13,8; 17,4)***13,3(13; 13,7)
Непараметрический ранговый U-критерий Манна Уитни
*достоверные различия (р<0,05) между группами НС и «здоровые» **достоверные различия (р<0,05) между группами НС и ГА ***достоверные различия (р<0,05) между группами ГА и «здоровые» Данные, полученные с помощью гематологического анализатора Sysmex KX-21N, не выявили достоверных различий по большинству из приведенных в таблице параметров между группами пациентов, за исключением RDW, свидетельствующим о наличии анизоцитиоза. Далее нами изучались интегральные эритроцитарные индексы Hb/RDW и MCHC/RDW в группах (таблица 4). Также были проанализированы аналитические характеристики основных эритроцитарных параметров (рисунок 2а) и интегральных эритроцитарных индексов (рисунок 2б) с использованием ROC-анализа. Оценивали чувствительность и специфичность тестов (таблица 5). Значение AUC (площади под кривой) у эритроцитарных параметров, полученных с помощью гематологического анализатора, находилось в диапазоне 0,31 – 0,51, что позволило охарактеризовать качество тестов как «неудовлетворительно». Значение AUC (площади под кривой) у расчетных эритроцитарных индексов составило 0,808 для Hb/RDW и 0,800 для MCHC/RDW. Значение AUC позволило оценить клиническую значимость тестов: для индекса Hb/RDW как «хорошо» и для MCHC/RDW - «удовлетворительно». Чувствительность исследуемых расчетных эритроцитарных параметров составила 83,3% для Hb/RDW и 88,8% для MCHC/RDW, специфичность – 65,2% для Hb/RDW и 52,17% для MCHC/RDW. Таблица 4. Результаты анализа интегральных эритроцитарных параметров в группах. Приведены медиана (Ме), нижний (25) и верхний (75) квартили ПоказательГруппы НСГА (гемолитические «Здоровые» (наследственныйанемии)лица сфероцитоз) Hb/MCHC0,37 (0,32;0,41)0,36 (0,31;0,39)0,38 (0,36;0,40) Hb/RDW7,84 (7,07;9,66)*8,02 (6,09; 9,75)**10,33 (9,38;10,89) MCHC/RDW22,55 (18,43;26,36)*22,9026,89 (19,56;25,09)**(25,75;27,95) Непараметрический ранговый U-критерий Манна Уитни *достоверные различия (р<0,05) между группами НС и «здоровые» **достоверные различия (р<0,05) между группами ГА и «здоровые» аб Рисунок 2. ROC-кривая для основных (а) и расчетных (б) эритроцитарных параметров. Таблица 5. Пороговые значения, чувствительность и специфичность расчетных эритроцитарных индексов, полученные в ходе исследования ПороговоеЧувствительностьСпецифичность значение MCHC/RDW≤ 24,388,8%52,17% Hb/RDW≤ 8,783,3%65,2% По данным литературы, параметры Hb/RDW, MCHC/RDW могут использоваться для выявления пациентов с НС при выполнении КАК. В нашем исследовании при сравнении основных и расчетных эритроцитарных параметров в основной группе (НС, n=18) и группе сравнения (ГА, n=32) ни один из параметров не оказался эффективным для скрининга НС. Это указывает на то, что описанные изменения связаны с изменением показателей Hb и RDW в КАК и могут быть при любом из типов ГА. Таким образом, использование данных, полученных при помощи гематологического анализатора и расчетных параметров Hb/RDW и MCHC/RDW дает возможность только предположить у пациента наличие одного из типов ГА, но не указывает на наличие именно НС. Морфометрические параметры эритроцитов. Анализ мазка крови с применением аппаратно-программного комплекса (АПК) позволяет с большей степенью установить различия в форме эритроцитов в количественной форме, что позволяет уточнить характер анемии (таблица 6). Как следует из представленных данных, анализ морфометрических параметров позволяет выявить достоверные различия в группах по всем изученнымпараметрам.Срединих наиболеезначимымидля дифференциальной диагностики микросфероцитарной анемии являются: толщина эритроцитов (Тэр), индекс сферичности эритроцитов (Rэр) и средний диаметр эритроцитов (Dэр) (таблица 7). Как видно из приведенных данных специфичность и чувствительность морфометрических параметров эритроцитов составили 100%. Это свидетельствует о том, что предложенный метод подходит для дифференцировки микросфероцитов от нормоцитов. Описанная методика не дает возможности автоматического описания изменения формы эритроцитов (пойкилоцитоза эритроцитов). Полученные нами результаты указывают на то, что измерение объема эритроцитов с помощью автоматизированного гематологического анализатора не должно и не может заменить собой полностью исследования их диаметра и толщины. Если исходить из фактов, свидетельствующих о том, что развитие анемии чаще всего сопровождается изменением формы эритроцитов – диаметра, толщины и объема, то следует признать целесообразным изучение всех трех показателей [Зенина М.Н., 2015]. Таким образом, использование в лабораториях систем анализа изображения позволяет при микроскопическом анализе выявлять параметры эритроцитов, необходимые для дифференциальной диагностики анемий. Таблица 6. Значения эритроцитарных показателей, полученных с помощью аппаратно-программного комплекса. Приведены среднее значение (М) и стандартное отклонение (SD) Исследуемые параметрыНС«Здоровые» Значения (наследственлицар -ный сфероцитоз) Толщина эритроцитов микроцитов2,9±0,22,3±0,20,001 (Tмэр), мкм Толщина эритроцитов (Тэр)2,6 ± 0,32,1± 0,20,005 Индекс сферичности эритроцитов2,2± 0,22,8± 0,20,003 микроцитов (Rмэр) Индекс сферичности эритроцитов2,3 ± 0,13,7±0,30,005 (Rэр) Средний диаметр эритроцитов (Dэр)6,6 ± 0,27,5±0,20,005 Содержание микроцитов (% микр)68,7 ± 16,912,6± 6,7<0,001 Содержание нормоцитов (% норм)30,4 ± 16,572,9± 7,3<0,001 Содержание макроцитов (% макр)1,9± 1,214,5± 11,8<0,001 Таблица 7. Пороговые значения, чувствительность и специфичность морфометрических эритроцитарных параметров. ИндексыПороговое Чувствительность Специфичность значение Толщинаэритроцитов≥ 2,1100%100% (Тэр) Индекс сферичности (Rэр)≤ 2,3100%100% Диаметр эритроцитов (Dэр)≤ 6,2100%100% Изучение скорости лизиса эритроцитов с использованием глицеринового теста. Результаты глицеринового теста на определение скорости лизиса эритроцитов c кровью сразу после взятия в группах приведены в таблице 8. Чувствительность и специфичность теста составили 77% и 96% соответственно (рисунок 3). Таблица 8. Разность начальной и конечной ОП при проведении глицеринового теста c кровью сразу после взятия в группах. Приведены медиана (Ме), нижний (25) и верхний (75) квартили ПоказательГруппы НС (наследственныйГА (гемолитические«здоровые» сфероцитоз)анемии)лица ГТ-0 (у.е.)949,5 (894,0; 1256,0)*952,5 (888,0;987,0)**573,0 (517,0;732,0) Непараметрический ранговый U-критерий Манна Уитни *достоверные различия (р<0,05) между группами НС и «здоровые» **достоверные различия (р<0,05) между группами ГА и «здоровые» Пороговое значение≥864 у.е. Чувствительность77,78% Специфичность96,00% Рисунок 3. ROC-кривая глицеринового теста, проводимого на крови сразу после взятия для выявления пациентов с НС. Глицериновый тест, проводимый с кровью сразу после взятия, не обладает достаточной чувствительностью для надежной диагностики НС. В связи с этим, тест повторили после 24 часовой инкубации при комнатной температуре. Полученные результаты приведены в таблице 9 и на рисунке 4. Чувствительность и специфичность теста составили 94% и 98,7% соответственно. Пороговое значение составило ≥ 968 у.е. Как видно из представленных данных инкубирование крови 24 часа при комнатной температуре позволило увеличить диагностическую значимость теста. Таблица 9. Разность начальной и конечной ОП при проведении глицеринового теста c инкубированной кровью в группах. Приведены медиана (Ме), нижний (25) и верхний (75) квартили ПоказательГруппы НС (наследственныйГА (гемолитические«здоровые» сфероцитоз)анемии)лица ГТ_инк1843 (1094;1957) */**/***965 (901;1000)586 (530;745) Непараметрический ранговый U-критерий Манна Уитни *достоверные различия (р<0,05) между группами НС и «здоровые» **достоверные различия (р<0,05) между группами НС и ГА ***достоверные различия (р<0,05) между группами ГА и «здоровые» Пороговое значение≥968 Чувствительность94,44 Специфичность98,7 Рисунок 4. ROC-кривая для глицеринового теста, проводимого с инкубированной кровью для основной группы (НС). Помимо количественной оценки скорости лизиса эритроцитов (в у.е.), возможна визуальная оценка графиков кинетики лизиса эритроцитов. Это позволяет оценить скорость лизиса при пограничных значениях ГТ, а также это важно для контроля протекающей в кювете реакции, поскольку такой график отображает изменение ОП в любую секунду теста. Примеры графиков, полученных с автоматического биохимического анализатора Sapphire-400 представлены на рисунках 5 А, Б, В. Изучение кинетики гемолиза эритроцитов у пациентов основной группы (НС) отчетливо показало наличие двух фаз: в начальный период, который у всех пациентов составлял от 50 до 100 с, снижение оптической плотности происходило быстрее, чем во второй. Лизис эритроцитов при выполнении глицеринового теста протекает быстрее у пациентов с НС по сравнению с иными видами ГА или здоровыми лицами. Данный феномен может быть обусловлен нестойкостью мембраны микросфероцитов, которые составляют значительную долю клеток эритроидного ростка в периферической крови больных НС. абв Рисунок 5. Графическое представление скорости лизиса эритроцитов у пациентов: А - основной группы (НС), Б – группы сравнения (ГА), В – контрольной группы («здоровые» лица) Следовательно, проведение глицеринового теста на определение скорости лизиса эритроцитов может использоваться для подтверждения наличия у пациента микросфероцитарной анемии. Тест на связывание красителя эозин – 5 – малеимида. Полученные значения СИФ (%) с использованием метода проточной цитометрии и красителя эозин-5-малеимида образцов крови пациентов всех групп и «здоровых лиц» представлены в таблице 10. Таблица 10. Средняя интенсивность флюоресценции для пациентов основной (НС), группы сравнения (ГА) и контрольной группы («здоровые» лица). параметрНСГА«здоровые» (наследственный(гемолитическиелица сфероцитоз)анемии) */** СИФ, %799697 Непараметрический ранговый U-критерий Манна Уитни *достоверные различия (р<0,05) между группами НС и «здоровые» **достоверные различия (р<0,05) между группами НС и ГА Чувствительность и специфичность теста составили 94,44% и 100% соответственно, что соответствует литературным данным [Stoya B., 2006] (рисунок 6). Пороговое значение≤ 86% Чувствительность94,44% Специфичность100,00% Рисунок 6. ROC-кривая для показателя СИФ. Полученные данные легли в основу лабораторного алгоритма диагностики наследственного сфероцитоза, который предполагает 3 этапа (рисунок 7). 1 этап: скрининг 2 этап: подтверждение наличия микросфероци тов 3 этап: подтверждение наследственного сфероцитоза Рисунок 7. Алгоритм лабораторной диагностики наследственного сфероцитоза. Первый этап - это клинический анализ крови, в результате которого на основании двух расчетных индексов (Hb/RDW и/или MCHC/RDW) при первичном обследовании групп клинически бессимптомных лиц можно выделить группу пациентов с высокой вероятностью наличия наследственного сфероцитоза. На втором этапе у пациентов с подозрением на НС проводится морфометрия эритроцитов в окрашенных мазках периферической крови с использованием АПК и/или определение скорости лизиса эритроцитов с инкубированной кровью в глицериновом тесте для подтверждения наличия сфероцитов. Третий этап – это подтверждение наследственного характера заболевания (сфероцитоза) по оценке мембраны эритроцитов с помощью теста на связывание красителя эозин-5-малеимида. Предложенная схема позволит выявить латентные формы НС и провести дифференциальный диагноз гемолитических анемий, протекающих с появлением микросфероцитов в крови. По нашему мнению, предложенный лабораторный алгоритм выявления пациентов с НС может использоваться для выявления пациентов с НС при проведении клинического анализа крови в централизованных клинико- диагностических лабораториях (ЦКДЛ). Он не требует дополнительных финансовых вложений, поскольку эритроцитарные индексы MCHC/RDW и Hb/RDW рассчитываются с использованием эритроцитарных параметров, полученных с помощью гематологического анализатора. При этом алгоритм позволит провести как скрининг наиболее распространенного типа гемолитической анемии, так и подтверждение диагноза наследственного сфероцитоза при наличии проточного цитометра при помощи теста на связывание красителя эозин-5-малеимида. Внедрение предложенных интегральных эритроцитарных индексов в ЛИС и данного алгоритма в лабораторную практику медицинских организаций позволит проводить направленный поиск пациентов с НС и обеспечить создание реестра таких пациентов. Ранняя диагностика НС позволит снизить риск ошибок при дифференциальной диагностике различных видов гемолитических анемий и необоснованную лекарственную терапию. Кроме того, своевременная постановка диагноза НС освободит пациента и медицинскую организацию от ненужных дополнительных обследований. Таким образом, разработанный лабораторный алгоритм диагностики позволит у пациентов с высокой вероятностью НС провести дифференциальную диагностику с другими видами гемолитических анемий и установить наличие наследственного сфероцитоза, своевременно назначить соответствующую терапию, тем самым решить важную социально-значимую задачу по улучшению качества медицинской помощи данной категории пациентов. ВЫВОДЫ 1.Данные клинического анализа крови, в результате которого на основании эритроцитарных и двух расчетных индексов (MCHC/RDW и Hb/RDW), а также наличия микросфероцитов в окрашенных мазках крови можно выделить группу пациентов, требующих дальнейшего проведения дифференциального диагноза. 2.Использование в клинико-диагностических лабораториях систем анализа изображения позволяет при микроскопическом анализе выявлять параметры эритроцитов, необходимые для дифференциальной диагностики анемий. 3.Проведение глицеринового теста для определения скорости лизиса эритроцитов с использованием инкубированной крови может использоваться для подтверждения наличия у пациента микросфероцитарной анемии. 4.Высокотехнологичный метод проточной цитометрии позволяет выявлять сохранность структуры цитоскелета эритроцитов в 100% случаев наследственного сфероцитоза. 5.Разработанный лабораторный алгоритм диагностики у пациентов с высокой вероятностью наследственного сфероцитоза позволяет провести дифференциальную диагностику с другими видами гемолитических анемий и установить наличие наследственного сфероцитоза. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Для врачей клинической лабораторной диагностики, гематологов, педиатров, терапевтов: 1.Одновременно с оценкой эритроцитарных параметров, полученных при помощи гематологического анализатора, рекомендуется рассчитывать интегральные эритроцитарные индексы Hb/RDW, MCHC/RDW (с использованием значения Hb в г/л). 2.Пациентам с микросфероцитарной анемией следует оценивать морфометрические показатели эритроцитов и скорость лизиса эритроцитов. 3.Если у пациента выявлена высокая скорость лизиса эритроцитов, то следует проводить исследование связывания красителя эозин – 5 – малеимида. 4.Диагноз НС подтверждается тестом на связывание эозин – 5 - малеимида. 5.Для целенаправленного автоматического поиска пациентов с высокой вероятностью наследственного сфероцитоза рекомендуется внедрение интегральных эритроцитарных индексов в лабораторные информационные системы (ЛИС). ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Разработанные методические подходы позволяют осуществлять изучение особенностей выявления других вариантов ГА, а также разработку лабораторных подходов для подтверждения диагноза НС. В качестве перспектив разработки темы можно рассматривать внедрение предложенного алгоритма, как возможность выявления пациентов с НС на базе клинико- диагностических лабораторий.

Актуальность темы исследования
Мембранопатии представляют собой важную группу наследственных
гемолитических анемий, которые обусловленны аномалией белкового и/или
липидного компонента биологической мембраны эритроцита [45]. Они
классифицируются по отличительным морфологическим признакам эритроцитов в
мазке периферической крови и характеризуются гетерогенностью клинических
проявлений, лабораторных и генетических исследований [45].
Наследственный сфероцитоз (НС) – это наследственное заболевание, связанное
с дефектом белков мембраны эритроцита, сопровождающееся развитием
гемолитической анемии (ГА) различной степени тяжести [54].
Впервые НС был описан в 1871 г. бельгийскими врачами С. Vanlair и J. Masius,
как случай ГА, при котором у пациента наблюдались желтуха, выраженная
спленомегалия, острые боли в верхней части живота, анемия с наличием мелких
красных сферичных глобул, которые они назвали «микросфероциты» [109].
В 75% случаев наследование НС происходит аутосомно-доминантно: это
мутации в генах, кодирующих такие мембранные белки как анкирин, спектрин и
белок полосы 3. 25% случаев включают в себя аутосомно – рецессивно наследуемые
мутации в гене, кодирующем альфа-спектрин, либо белок полосы 4.2 и мутации,
возникшие de novo. Больные с не доминантным НС представляют собой большую
нерешенную проблему при генетическом консультировании [28].
Тяжесть заболевания определяется генетически унаследованным типом
повреждения мембраны эритроцитов и количеством микросфероцитов в крови.
Микросфероциты селективно захватываются макрофагами селезенки, что приводит к
сокращению продолжительности их жизни до 70-80 дней. Степень тяжести гемолиза
у различных пациентов варьирует и может осложниться инфекцией [54].
НС встречается во всех этнических и расовых группах [15]. В Северной части
Европы НС является самой распространенной причиной наследственной ГА и
встречается с частотой 1:2500, в США – 1:5000 [33]. Частота встречаемости НС среди
африканцев и жителей Юго-Восточной Азии особенно низкая [54].
Распространенность НС в других популяциях изучена недостаточно [15].
Заболеваемость НС в России растет, тем самым формируя необходимость
создания лабораторного алгоритма, направленного на поиск пациентов с НС. В
настоящее время существуют федеральные рекомендации по диагностике и лечению
НС, однако единого подхода к выявлению НС не разработано. Врачи гематологи,
терапевты и педиатры нередко сталкиваются с проблемой неправильной
интерпретации результатов лабораторных исследований. Это особенно актуально
при атипичных вариантах НС или при сочетании НС с другими патологиями.
Расширение панели биохимических тестов, автоматический расчет интегральных
эритроцитарных параметров и их введение в лабораторную информационную
систему (ЛИС) для диагностики НС является первым шагом к повышению
эффективности дифференциальной диагностики врожденных гемолитических
анемий.
Таким образом, разработка алгоритма лабораторной диагностики НС упростит
этап проведения дифференциальной диагностики и поможет в создании реестра
пациентов с НС. Все эти вопросы послужили основанием для проведения
диссертационной работы.

Заказать новую

Лучшие эксперты сервиса ждут твоего задания

от 5 000 ₽

Не подошла эта работа?
Закажи новую работу, сделанную по твоим требованиям

    Нажимая на кнопку, я соглашаюсь на обработку персональных данных и с правилами пользования Платформой

    Читать

    Читать «Оптимизация лабораторной диагностики наследственного сфероцитоза»

    Публикации автора в научных журналах

    Современные подходы к лабораторной диагностике микросфероцитарных анемий
    Т.Т. Асатрян, М.Н. Зенина, Л.Б. Гайковая //Медицинский алфавит. – 2019; 3 (22). Современная лаборатория. – С. 22
    Значимость глицеринового теста с графическим определением скорости лизиса эритроцитов для скрининга наследственного сфероцитоза
    Т.Т. Асатрян, Л.Б. Гайковая, В.В. Слепышева // Трансляционная медицина.2019;6(6) – С. 26
    Использование лабораторного алгоритма диагностики наследственного сфероцитоза. Разбор клинического случая
    Т.Т. Асатрян,Л.Б. Гайковая, М.Н. Зенина // Профилактическая и клиническая медицина.2021; 3(80) – С. 71-DOI: 47843/2074-9120_2021_3_
    Разработка алгоритма лабораторной диагностики наследственного сфероцитоза
    Т.Т. Асатрян, М.Н. Зенина, Н.Ю. Черныш,Л.Б. Гайковая // Лабораторная служба. - 2- 3 (2). - С. 21
    Использование глицеринового теста на определение скорости лизиса эритроцитов в диагностике наследственного сфероцитоза
    Т.Т.Асатрян, М.Н. Зенина, Н.Ю. Черныш // «Трансляционная медицина: оттеории к практике»: Сборник материалов 4-й научно-практическойконференции молодых ученых и специалистов/ под ред. д.м.н. А.В. Силина. –СПб.: Изд-во СЗГМУ им. И.И. Мечникова. - 2– с.
    Особенности лабораторной диагностики анемий у пациентов старшей возрастной группы
    Н.Ю. Черныш, М.Н. Зенина, Ю.И. Жиленкова,Т.Т. Асатрян // Клиническая лабораторная диагностика. – 2- 61(9). – с.
    Использование глицеринового теста для оценки скорости лизиса эритроцитов при наследственном сфероцитозе
    Т.Т. Асатрян //«Трансляционная медицина: от теории к практике»: Материалы 5-й научно-практической конференции молодых ученых и специалистов / под ред. д.м.н.А.В. Силина. - СПб.: Изд-во СЗГМУ им. И.И. Мечникова. - 2– С. 15
    Случай сочетания наследственного сфероцитоза и синдрома Жильбера у одного больного
    Т.Т. Асатрян, М.Н. Зенина, С. С. Бессмельцев// Гематология и трансфузиология. - 2- 63(1). - с.
    Диагностика врожденных состояний патологии эритроидного ростка
    Т.Т. Асатрян, Ю.И. Жиленкова, М.Н. Зенина, В.А. Зимина, Л.Б.Гайковая // Современные достижения химико-биологических наук впрофилактической и клинической медицине: сборник научных трудовВсероссийской научно-практической конференции с международнымучастием. 3 декабря 2020 года / Под ред. А.В. Силина, Л.Б. Гайковой. Ч. –СПб.: Изд-во СЗГМУ им. И.И. Мечникова, 2– С. 198-205

    Помогаем с подготовкой сопроводительных документов

    Совместно разработаем индивидуальный план и выберем тему работы Подробнее
    Помощь в подготовке к кандидатскому экзамену и допуске к нему Подробнее
    Поможем в написании научных статей для публикации в журналах ВАК Подробнее
    Структурируем работу и напишем автореферат Подробнее

    Хочешь уникальную работу?

    Больше 3 000 экспертов уже готовы начать работу над твоим проектом!

    Логик Ф. кандидат наук, доцент
    4.9 (826 отзывов)
    Я - кандидат философских наук, доцент кафедры философии СГЮА. Занимаюсь написанием различного рода работ (научные статьи, курсовые, дипломные работы, магистерские дисс... Читать все
    Я - кандидат философских наук, доцент кафедры философии СГЮА. Занимаюсь написанием различного рода работ (научные статьи, курсовые, дипломные работы, магистерские диссертации, рефераты, контрольные) уже много лет. Качество работ гарантирую.
    #Кандидатские #Магистерские
    1486 Выполненных работ
    Юлия К. ЮУрГУ (НИУ), г. Челябинск 2017, Институт естественных и т...
    5 (49 отзывов)
    Образование: ЮУрГУ (НИУ), Лингвистический центр, 2016 г. - диплом переводчика с английского языка (дополнительное образование); ЮУрГУ (НИУ), г. Челябинск, 2017 г. - ин... Читать все
    Образование: ЮУрГУ (НИУ), Лингвистический центр, 2016 г. - диплом переводчика с английского языка (дополнительное образование); ЮУрГУ (НИУ), г. Челябинск, 2017 г. - институт естественных и точных наук, защита диплома бакалавра по направлению элементоорганической химии; СПХФУ (СПХФА), 2020 г. - кафедра химической технологии, регулирование обращения лекарственных средств на фармацевтическом рынке, защита магистерской диссертации. При выполнении заказов на связи, отвечаю на все вопросы. Индивидуальный подход к каждому. Напишите - и мы договоримся!
    #Кандидатские #Магистерские
    55 Выполненных работ
    Мария М. УГНТУ 2017, ТФ, преподаватель
    5 (14 отзывов)
    Имею 3 высших образования в сфере Экологии и техносферной безопасности (бакалавриат, магистратура, аспирантура), работаю на кафедре экологии одного из опорных ВУЗов РФ... Читать все
    Имею 3 высших образования в сфере Экологии и техносферной безопасности (бакалавриат, магистратура, аспирантура), работаю на кафедре экологии одного из опорных ВУЗов РФ. Большой опыт в написании курсовых, дипломов, диссертаций.
    #Кандидатские #Магистерские
    27 Выполненных работ
    Оксана М. Восточноукраинский национальный университет, студент 4 - ...
    4.9 (37 отзывов)
    Возможно выполнение работ по правоведению и политологии. Имею высшее образование менеджера ВЭД и правоведа, защитила кандидатскую и докторскую диссертации по политоло... Читать все
    Возможно выполнение работ по правоведению и политологии. Имею высшее образование менеджера ВЭД и правоведа, защитила кандидатскую и докторскую диссертации по политологии.
    #Кандидатские #Магистерские
    68 Выполненных работ
    Екатерина С. кандидат наук, доцент
    4.6 (522 отзыва)
    Практически всегда онлайн, доработки делаю бесплатно. Дипломные работы и Магистерские диссертации сопровождаю до защиты.
    Практически всегда онлайн, доработки делаю бесплатно. Дипломные работы и Магистерские диссертации сопровождаю до защиты.
    #Кандидатские #Магистерские
    1077 Выполненных работ
    Татьяна Б.
    4.6 (92 отзыва)
    Добрый день, работаю в сфере написания студенческих работ более 7 лет. Всегда довожу своих студентов до защиты с хорошими и отличными баллами (дипломы, магистерские ди... Читать все
    Добрый день, работаю в сфере написания студенческих работ более 7 лет. Всегда довожу своих студентов до защиты с хорошими и отличными баллами (дипломы, магистерские диссертации, курсовые работы средний балл - 4,5). Всегда на связи!
    #Кандидатские #Магистерские
    138 Выполненных работ
    Петр П. кандидат наук
    4.2 (25 отзывов)
    Выполняю различные работы на заказ с 2014 года. В основном, курсовые проекты, дипломные и выпускные квалификационные работы бакалавриата, специалитета. Имею опыт напис... Читать все
    Выполняю различные работы на заказ с 2014 года. В основном, курсовые проекты, дипломные и выпускные квалификационные работы бакалавриата, специалитета. Имею опыт написания магистерских диссертаций. Направление - связь, телекоммуникации, информационная безопасность, информационные технологии, экономика. Пишу научные статьи уровня ВАК и РИНЦ. Работаю техническим директором интернет-провайдера, имею опыт работы ведущим сотрудником отдела информационной безопасности филиала одного из крупнейших банков. Образование - высшее профессиональное (в 2006 году окончил военную Академию связи в г. Санкт-Петербурге), послевузовское профессиональное (в 2018 году окончил аспирантуру Уральского федерального университета). Защитил диссертацию на соискание степени "кандидат технических наук" в 2020 году. В качестве хобби преподаю. Дисциплины - сети ЭВМ и телекоммуникации, информационная безопасность объектов критической информационной инфраструктуры.
    #Кандидатские #Магистерские
    33 Выполненных работы
    Ольга Р. доктор, профессор
    4.2 (13 отзывов)
    Преподаватель ВУЗа, опыт выполнения студенческих работ на заказ (от рефератов до диссертаций): 20 лет. Образование высшее . Все заказы выполняются в заранее согласован... Читать все
    Преподаватель ВУЗа, опыт выполнения студенческих работ на заказ (от рефератов до диссертаций): 20 лет. Образование высшее . Все заказы выполняются в заранее согласованные сроки и при необходимости дорабатываются по рекомендациям научного руководителя (преподавателя). Буду рада плодотворному и взаимовыгодному сотрудничеству!!! К каждой работе подхожу индивидуально! Всегда готова по любому вопросу договориться с заказчиком! Все работы проверяю на антиплагиат.ру по умолчанию, если в заказе не стоит иное и если это заранее не обговорено!!!
    #Кандидатские #Магистерские
    21 Выполненная работа
    Анна Н. Государственный университет управления 2021, Экономика и ...
    0 (13 отзывов)
    Закончила ГУУ с отличием "Бухгалтерский учет, анализ и аудит". Выполнить разные работы: от рефератов до диссертаций. Также пишу доклады, делаю презентации, повышаю уни... Читать все
    Закончила ГУУ с отличием "Бухгалтерский учет, анализ и аудит". Выполнить разные работы: от рефератов до диссертаций. Также пишу доклады, делаю презентации, повышаю уникальности с нуля. Все работы оформляю в соответствии с ГОСТ.
    #Кандидатские #Магистерские
    0 Выполненных работ

    Последние выполненные заказы

    Другие учебные работы по предмету

    Диагностические маркеры и предикторы неонатальной иммунной тромбоцитопении
    📅 2021 год
    🏢 ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии имени академика Е.И. Чазова» Министерства здравоохранения Российской Федерации