Патоморфологическое исследование глиобластомы для оценки прогноза и выбора таргетной терапии

В качестве методологической и теоретической основы диссертационного исследования использовались труды отечественных и зарубежных ученых по патологической анатомии, посвященные факторам транскрипции, клеточным рецепторам клеток глиобластомы, обеспечивающих её онкогенность и резистентность к лечению. В проведенной работе в качестве основы было использовано морфологическое исследование, включающее: гистологический метод, иммуногистохимический метод, в том числе с двойной меткой, электронную микроскопию, конфокальную лазерную сканирующую микроскопию, фазово-контрастную микроскопию. Дополнительно использовались культивирование колоний клеток глиом, полимеразная цепная реакция на материале парафиновых блоков, флуоресцентные трекеры для окраски нативных препаратов опухоли, анализ клинической информации с оценкой продолжительности жизни пациентов. Объектом исследования стали пациенты с глиобластомой. Предмет исследования: ткань глиобластомы. Группой сравнения послужили
пациенты с диффузными астроцитомами Grade II, группой контроля – пациенты, умершие от сердечно-сосудистой патологии без опухолей головного мозга. На проведение диссертационной работы получено разрешение Комитета по вопросам этики при ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» (протокол No 224 от 10 декабря 2018 г).
Положения диссертации, выносимые на защиту
1. Степень и варианты экспрессии и коэкспрессии факторов транскрипции NeuroD1, Prox1, FoxM1, HIF-1, соматостатиновых и CXCR4 рецепторов, CD38 в норме и при глиобластоме отличаются, при этом экспрессия CD38 в опухолевых клетках свидетельствует о крайне неблагоприятном прогнозе течения заболевания и требует дополнительной таргетной терапии.
2. Химиорезистентность глиобластомы обусловлена особенностью морфологического строения периваскулярного микроокружения, в состав которого входят телоциты, перициты и клетки со смешанным иммунофенотипом телоцит/перицит, а также тесной связью этих клеток с опухолевыми.
3. Выявленные при биопсийном исследовании опухоли уровень пролиферативной активности по Ki-67, высокий уровень экспрессии FoxM1, NeuroD1, Prox1, CXCR4, а также синтез протопорфирина IX в митохондриях клеток перифокальной зоны глиобластомы, стимулируемый приемом АЛК-5 перед операцией, свидетельствуют об её онкогенном потенциале.
Степень достоверности результатов исследования и апробация работы
Результаты диссертационного исследования достоверны и
обоснованны, что обеспечивается репрезентативностью и
достаточным объемом изученного материала, использованием широкого спектра как традиционных так и новейших методов морфологического анализа, адекватной поставленным задачам статистической обработкой полученных данных с учётом принципов доказательной медицины. Основные результаты диссертационного исследования используются в практической работе патологоанатомического отделения ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова». Результаты работы докладывались и обсуждались на заседании Общества патологоанатомов Санкт-Петербурга (март 2019), конкурсе молодых ученых имени профессора М.М. Руднева
(октябрь 2020), XIX Всероссийской научно-практической конференции «Поленовские чтения», «Конференции молодых ученых» (ноябрь 2020), 32-ом интернациональном конгрессе
Европейского общества патологов совместно с 33-им
интернациональном конгрессом Международной академии патологии (ноябрь 2020).
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы исследования
В исследование были включены 71 глиобластома и 15 образцов нормального головного мозга. Количество глиом grade IV составило 61 наблюдение, диффузных астроцитом — 10 наблюдений. Из них 21 глиобластома вошла в группу морфологического исследования гетерогенности. Контрольная группа нормального головного мозга составила 10 аутопсийных наблюдений. Возраст пациентов в группе анализа гетерогенности глиобластом варьировал от 31 до 79 лет, медиана возраста составила 61 [55; 65] год, распределение по полу было примерно равным: 10 мужчин (47,6%) и 11 женщин (52,4%). Группа контроля при исследовании гетерогенности глиобластом состояла из 6 женщин и 4 мужчин (медиана возраста — 54 [43; 68] лет).
Морфологическое исследование периваскулярной ниши глиом проводилось на 15 наблюдениях с глиобластомой. Группу сравнения составили вышеупомянутые 10 диффузных астроцитом, контролем стали 5 образцов головного мозга пациентов, умерших от сердечно-сосудистых заболеваний без опухолей. Фрагменты лобных долей забирались в течение 4 часов после смерти. Возраст пациентов с глиобластомой в группе исследования периваскулярной ниши варьировал от 48 до 76 лет (медиана — 61 [59; 64] год). Выборка состояла из 13 женщин (86,7%) и 2 мужчин (13,3%). В этой же группе возраст пациентов с диффузной астроцитомой варьировал от 35 до 71 года (медиана — 59 [40; 62] лет), данная группа наблюдений состояла из 6 женщин и 4 мужчин. В группе контроля были 2 женщины (возрастом 61 и 51 год) и 3 мужчин (68, 40, 53 года соответственно).
В группу исследования перифокальной зоны вошли 10 глиобластом. Медиана возраста составила 56 [47; 64] лет, распределение по полу — 6 мужчин и 4 женщины.
Оценка наличия метилирования промотора MGMT методом ПЦР в реальном времени и мутаций IDH 1/2 проводилась на 15 глиобластомах.
Методы исследования
Анализ клинических данных
размеры опухоли по данным магнитно-резонанасной томографии и нейронавигации после приёма пациентами 5-аминолевулиновой кислоты, продолжительность жизни пациентов после проведённого лечения.
Морфологическое исследование
Световое микроскопическое исследование осуществлялось на 71-ой глиоме (операционный материал). Материал фикcирoвaлcя в 10% рacтвoре зaбуфeрeннoгo нeйтральнoгo фoрмалинa в течение 24 часов для дальнейшего гистологического, иммунoгиcтoхимичecкoгo и молекулярно-биологического иccлeдoвaний.
Микрoфoтoгрaфии были получены при съемке на камеру Leica DFC 490 (Германия). Морфометрический анализ осуществлялся посредством оптической системы LeicaScopeM и программного обеспечения FIJI. Выполнялось определение уровня экспрессии транскрипционных факторов и рецепторов. Уровень экспрессии изучаемых маркеров вычислялся путём деления количества клеток с экспрессией антигенов на общее число клеток в одном поле зрения светового микроскопа х400 (в процентах). Усредненный уровень рассчитывался на 10 последовательных полей зрения. Высоким уровнем экспрессии считалась доля опухолевых клеток с экспрессией антигенов более 50% от общего их числа.
Иммуногистохимическое исследование
В качестве первичных антител использовались антитела к FOXM1 (разведение 1:1000; клон G-5:sc-376471; Santa Cruz Biotechnology; USA), CXCR4 (разведение 1:100; клон NB100-74396 Novus Biologicals; USA), SSTR2 (разведение 1:100; клон EP149; Epitomics; USA), SSTR5 (разведение 1:100; клон UMB4; Abcam; UK), CD38 (разведение 1:100; клон SPC32, Leica Biosystems; UK),
Анализировались пол, возраст больных, локализация и
HIF-1 alpha (разведение 1:50; клон H1alpha67; Novus Biologicals; USA), Prox1 (разведение 1:100; клон 5G10; Novus Biologicals; USA), NeuroD1 (разведение 1:1000; клон ab60704; Abcam; UK), Ki-67 (разведение 1:200; клон MIB-1; DAKO; Denmark), MGMT (разведение 1:400; клон MT 23.2; Novus Biologicals; USA), GFAP (разведение 1:100; клон 6F2; DAKO; Denmark), CD117 (разведение 1:100; клон 1657; Novus Biologicals; USA), CD34 (разведение 1:100; клон QBEnd-10; DAKO; Denmark), SMA (разведение 1:300; DAKO; клон OV-TL 12/30; Denmark). Двойная иммуногистохимическая метка производилась с вторичным коктейлем антител (MultiVision Polymer Cocktail, Thermo Scientific, UK).
Культивирование телоцитов из образцов глиобластомы
Фрагменты опухоли удалялись в стерильных условиях и помещались в широкие (50 мл) пробирки с натрий-фосфатным буфером (НФБ). После промывания свежим НФБ для удаления крови, образцы опухолей измельчали на фрагменты миллиметрового размера в стерильной культуральной чашке, содержащей раствор коллагеназы II типа (V900892; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) в НФБ, затем инкубировались при 37°С в течение 30 минут. Коллагеназу деактивировали синтетической средой для культивирования клеток в модификации Дульбекко (Dulbecco’s Modified Eagle Medium, DMEM; 12400-024, Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, США) с добавлением 1% раствора глютамина и 1% раствора пенициллина/стрептомицина. Фрагменты центрифугировали, осадки были посеяны на стерильные культуральные чашки после повторного суспендирования в свежей DMEM. Образцы культивировали при 37°С с CO2 и повышенной влажностью в течение 7 дней, с заменой среды каждые 2 дня. Культуры клеток ежедневно исследовали с использованием инвертированного микроскопа. Через 7 дней колонии клеток начали формироваться вокруг маленьких эксплантов. К 2 неделям они прикрыли более 70% площади чашечек со средами. Исследование культур телоцитов было выполнено с использованием рутинной фазовой контрастной микроскопии и конфокальной сканирующей лазерной микроскопии.
Конфокальная сканирующая лазерная микроскопия
Конфокальная сканирующая лазерная микроскопия (КСЛМ) культивируемых телоцитов проводилась с использованием одинарной и двойной иммунофлюоресценции. Для КСЛМ культивируемых телоцитов клетки первичных культур глиомы после достижения 80% смыкания монослоя отделяли и повторно наносили на стеклянные покровные стекла со свежей синтетической средой для культивирования клеток в модификации Дульбекко в течение 2 дней. Через 2 дня DMEM удаляли и клетки промывали 3 раза НФБ, фиксировали и снова промывали. Затем клетки содержали в 0,1% растворе Triton X-100 в течение 10 минут и блокировали 1% раствором бычьего сывороточного альбумина в течение 1 часа. Клетки метили мышиными моноклональными антителами (CD117, NeuroD1, CD34 или GFAP) на протяжении 60 минут при комнатной температуре. При подготовке двойной иммунофлюоресценции после дополнительной промывки клетки на покровных стеклах инкубировали с поликлональным кроличьим антителом connexin43 при таких же условиях. Для визуализации использовали вторичное козлиное анти-мышь антитело Alexa Fluor488 и вторичное козлиное противокролечье антитело Alexa Fluor568 (инкубация в течение 1 часа). После промывки ядра окрашивали DAPI (AppliChem). Dako Mounting Medium (DAKO, Дания) использовали для закрепления первичных препаратов клеточных культур. В результате сигналы NeuroD1 и CD34 были видны как зеленая флуоресценция; connexin43 (разведение 1:100; polyclonal; Cell Signaling; USA) — как красная; контрастированные ядра — как синяя.
Кроме того, КСЛМ образцов глиобластомы с использованием двух коктейлей первичных антител (CD34/NG2 и CD13/CD117) выполнялась на замороженных и парафиновых срезах. Замороженные срезы глиобластомы (толщиной 2-4 мкм) изготавливались на криостате Leica CM1510 S и укладывались на предметные стёкла, покрытые полилизином. Затeм зaмoрoжённые cрeзы oттaивaли, прoмывaлиcь НФБ. Далее образцы обрабатывались согласно протоколу иммуногистохимического исследования с использованием антитела к NG2 (разведение 1:700; polyclonal; Abcam; UK) или CD117.
В двух наблюдениях в группе исследования перифокальной зоны глиобластомы проводилось предоперационное назначение
пациентам 5-АЛК. Затем исследовались мазки-отпечатки, замороженные и парафиновые срезы, нативный материал глиобластомы и её перифокальной зоны методом КСЛМ с окрашиванием ядер клеток DAPI, а митохондрий — флуоресцентным трекером CellLightTM Mitochondria-GFP, BacMam 2.0 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA).
Электронная микроскопия
Фиксация образцов для микроскопии проводилась в три этапа. На первом этапе осуществлялась фиксация фрагментов опухоли в 2,5% глютаровом альдегиде на 0,1М фосфатном буфере (PBS) в течение 60 минут. Далее кусочки снова погружались в PBS на 30 минут. Затем образцы помещались в 1% раствор OsO4 на 60 минут, а потом — в PBS на 30 минут. После этого материал последовательно погружался в возрастающую концентрацию этанола для дегидратации, пропитывался ацетоном и затем фиксировался в смоле. После чего ультратонкие срезы, изготовленные на ультратоме Leica UC7, помещались на медные сетки и контрастировались. Электронная микроскопия осуществлялась на микроскопе JEOLJEM 1011 (Япония). Электронные микрофотографии были получены с использованием камеры Morada (Digital Imaging Solutions Inc.).
Молекулярно-биологическое исследование
Выделение ДНК из парафиновых блоков производили на колонках с помощью набора реагентов для выделения ДНК из парафиновых блоков “QIAamp DNA FFPE Tissue Kit” (Qiagen, 56404). Для выявления мутаций в генах IDH1 и IDH2 методом ПЦР в реальном времени использовали набор реагентов “IDH1/2 RGQ PCR Kit” (Qiagen, 873001). Определение статуса метилирования промотора гена MGMT производили методом специфичной к метилированию ПЦР в реальном времени (MethyLight) по de Abreu F.B. et al., 2014, с собственными модификациями. Специфичную к метилированию ПЦР в реальном времени проводили с помощью набора “Epitect MethyLight PCR + ROX Vial Kit” (Qiagen, 59469), использовали праймеры и зонды, описанные в протоколе de Abreu F.B et al., 2014. В каждую постановку ПЦР включали неметелированный неконвертированный контроль, контроль без добавления матрицы, стандарты для построения калибровочной
кривой (метелированный неконвертированный контроль в исходной концентрации и разведенный в 5, 25, 125 и 625 раз), прошедшие бисульфитную конверсию, а также метилированный конвертированный контроль (EpiTect Control DNA, methylated (100), Qiagen, 59655). Все образцы, контроли и стандарты анализировали в двух технических повторах. Анализ и интерпретацию результатов производили в соответствии с вышеуказанным протоколом, с адаптацией к прибору Rotor-Gene Q и следующей модификацией: при PMR=2 результат интерпретировали как пограничный (PMR – Percentage of Methylated Reference).
Статистические методы исследования
Статистический анализ полученных данных проводился с помощью программы IBM SPSS Statistics 23, при уровне доверительности p=0,05. Оценка нормальности распределения осуществлялась с помощью критерия Шапиро-Уилка. Ни один признак не имел нормального распределения. В качестве описательных статистик средних значений использовалась медиана с указанием в скобках значений 25% и 75% квартиля. Оценка достоверности различий между выборками проводилась с помощью критерия Манна-Уитни, при корреляционном анализе использовался коэффициент Спирмена и точечный бисериальный корреляционный коэффициент. Теснота корреляционных связей оценивалась по шкале Чеддока (0,1 — 0,3 слабая; 0,3 — 0,5 умеренная; 0,5 — 0,7 заметная; 0,7 — 0,9 высокая; 0,9 — 0,99 очень высокая).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Морфологическое исследование гетерогенности
глиобластомы.
При микроскопическом исследовании 15 из 21 глиобластом были мультиформными, 2 имели мелкоклеточный тип строения, 2 — были с экстремальным полиморфизмом и гигантскими клетками и 2 — с выраженным саркоматозным компонентом. Медиана уровня пролиферативной активности по Ki-67 составила 23,5 [17,7; 37,3]%. Медиана продолжительности жизни пациентов составила 5 [3; 6] месяцев. Экспрессия HIF1 в глиобластомах отсутствовала. Высокая ядерная экспрессия (>50% опухолевых клеток) MGMT была определена во всех случаях. Высокая экспрессия FoxM1 была
обнаружена в ядрах клеток глиобластомы в 18 наблюдениях из 21 (85,7%), экспрессия в стенках сосудов глиобластомы обнаружена в 17 случаях из 21 (81,0%). Среди всех наблюдений медиана уровня экспрессии FoxM1 составила 93,8 [85,6; 96,0]%. Высокий уровень экспрессии NeuroD1 в ядрах опухолевых клеток и клеток стенок сосудов отмечался во всех наблюдениях. Медиана уровня экспрессии NeuroD1 составила 96,3 [93,6; 97,6]%. Транскрипционный фактор Prox1 высоко экспрессировался в ядрах клеток глиобластомы примерно в половине случаев (57,1%, 12 наблюдений из 21), а в сосудах — в 85,7% (18 наблюдений из 21). Медиана уровня экспрессии Prox1 составила 71,1 [25,7; 87,6]%. Экспрессия SSTR 2-ого и 5-ого типов была обнаружена преимущественно на клетках стенок сосудов во всех исследованных глиобластомах, медиана уровня экспрессии составила 0,9 [0,7; 1,5]% и 5,8 [2,1; 10,5]% соответственно. Заметная экспрессия CXCR4 была обнаружена в 16 случаях (76,2%). Во всех этих наблюдениях CXCR4 экспрессировался на клетках опухоли, эндотелии и в стенке сосудов. Медиана экспрессии CXCR4 составила 84,9 [72,3; 93,4]%. Впервые была обнаружена иммуногистохимическая экспрессия CD38 в глиобластоме. При этом высокий уровень экспрессии CD38 на опухолевых клетках наблюдался всего в 2-ух случаях из 21 (9,5%). Медиана уровня экспрессии CD38 составила 1,0 [0; 14,0]%. При корреляционном анализе была обнаружена статистически достоверная заметная обратно пропорциональная корреляционная связь между уровнем экспрессии CD38 и продолжительностью жизни (r(S)= – 0,629; при p=0,01).
При изучении вариантов коэкспрессии маркеров самыми редкими являлись сочетания FoxM1-/NeuroD1+/Prox1+/CXCR4+/CD38- (2 наблюдения из 21, 9,5%), FoxM1-/NeuroD1+/Prox1-/CXCR4+/CD38+ и FoxM1+/NeuroD1+/Prox1+/CXCR4+/CD38+ (по 1-ому наблюдению соответственно, по 4,8%). Наиболее часто встречалась комбинация маркеров FoxM1+/NeuroD1+/Prox1-/CXCR4+/CD38- (8 наблюдений из 21, 38,1%). Иммунофенотипы FoxM1+/NeuroD1+/Prox1+/CXCR4+/CD38- (4 опухоли) и FoxM1+/NeuroD1+/Prox1+/CXCR4-/CD38- (5 опухолей) составили 19,1% и 23,8% соответственно (рисунок 1).
Метелирование промотора гена MGMT, отвечающего за восстановление ДНК при воздействии алкилирующих агентов —
основных общепринятых химиотерапевтических препаратов, было обнаружено нами всего в 3 случаях из 15 (20%). В аналогичных исследованиях метилирование промотора гена MGMT обнаружено не более чем в 55% изученных глиобластом [Табаков Д.В. и др., 2013; Smrdel U. et al., 2016]. Наличие мутации IDH в глиомах подтвердилось только в 2-ух случаях из 15 (13,3%). Эти данные говорят о том, что успех терапии первой линии возможен только для половины пациентов.
Рисунок 1. Варианты коэкспресcии маркеров в глиобластоме.
Таким образом, впервые в клетках глиобластомы была обнаружена экспрессия CD38, показана его роль как неблагоприятного фактора прогноза течения глиобластомы. Высокие уровни экспрессии SSTR2, SSTR5, Neurod1, FoxM1, Prox1 были зарегистрированы не только в клетках опухоли, но и в стенках её сосудов. Была определена иммунофенотипическая неоднородность глиобластомы в российской популяции, выявлен самый частый вариант сочетания белков в одной опухоли. Согласно полученным данным, требуется новый персонифицированный подход к лечению с определением мишеней для воздействия и соответствующего спектра препаратов в каждом индивидуальном случае. Обнаруженные факторы транскрипции и рецепторы являются мишенями для разработки и применения таргетных препаратов. Существуют низкомолекулярные таргетные препараты, направленные на FoxM1, — Siomycin A [172], MG115, MG132, bortozomib, thiostrepton [Gartel A.L., 2010; Gartel A.L., 2011; Nakano

I. et al., 2011]. Перспективным препаратом против CD38 можно считать зарегистрированный в России даратамумаб.
Исследование периваскулярного микроокружения сосудов глиобластомы
Экспрессия CD117 и NG2 наблюдалась в сосудистых стенках, в глиальном рубце, реже — по периферии опухолевых клеток подобно оплетке, уровень экспрессии CD117 в глиобластоме составил 8,8 [3; 13,6]%. Среднее количество клеток с экспрессией CD117 в группе астроцитом было достоверно меньше (U= 13,5; p= 0,001), чем в глиобластомах, и составило 1,3 [1; 2,1]%. Экспрессия NeuroD1 наблюдалась не только в подавляющем большинстве клеток опухоли, но и в ядрах клеток сосудов. Корреляционный анализ выявил значимую связь между Ki-67 и количеством CD117+ клеток. Иммуногистохимическое окрашивание глиобластомы с коктейлем NG2/SMA продемонстрировало коэкспрессию антител на клетках сосудистых стенок, в тех же зонах, где экспрессировался CD117.
В первичных культурах глиобластом и астроцитом были обнаружены типичные телоциты с характерными морфологическими чертами: небольшое тело овальной формы с чрезвычайно длинными и тонкими телоподиями. Телоциты часто сопровождали опухолевые клетки, контактируя с ними с помощью телоподий.
КЛСМ изолированных из глиобластом и астроцитом клеточных культур выявила клетки с характеристиками телоцитов, с зеленой флюоресценцией CD117. Наблюдалась коэкспрессия CD34 с connexin43 в культуре диффузной астроцитомы и NeuroD1 с connexin43 в культуре глиобластомы в описанных выше клетках с длинными и тонкими телоподиями, соответствующих иммунофенотипу телоцитов. При использовании коктейля NeuroD1/connexin43 была обнаружена зеленая флуоресценция NeuroD1 в ядре, красная флуоресценция connexin43 в цитоплазме одних и тех же телоцитов культур (рисунок 2). КЛСМ парафиновых и замороженных срезов глиобластомы выявила в сосудах клетки с иммунофенотипом CD34+ и NG2+, которые были расценены как CD34+эндотелиоциты, CD34+телоциты и NG2+перициты, а также клетки с коэкспрессией CD34/NG2 и CD117/CD13, которые были
расценены как клетки со смешанным иммунофенотипом телоцита/перицита (рисунок 3).
Рисунок 2. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия культуры глиобластомы. A: голубая флуоресценция клеточных ядер (DAPI); B: зеленая флуоресценция NeuroD1 в ядрах телоцитов; С: красная флуоресценция connexin43 на телоподиях телоцитов; D: зеленовато-голубая/бирюзовая флуоресценция NeuroD1/DAPI ядер и красная флуоресценция connexin43; увеличение 200
При помощи электронной микроскопии было подтверждено присутствие в капиллярах глиобластомы перицитов и телоцитов.
Некоторые авторы описывают перициты в стенках сосудов опухоли и в глиальных рубцах, но не телоциты [Cheng J. et al., 2018, Svensson A. et al., 2015]. Последние также могут служить мишенью
для таргетной терапии, например иматинибом или его аналогами, а
также препаратами, мишенью которых является NeuroD1.
Рисунок 3. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия глиобластомы (замороженные срезы). A: синяя флуоресценция ядер (DAPI); B: зеленая флуоресценция NG2; C: красная — CD34; D: коэкспрессия CD34 и NG2 в одних и тех же клетках (оранжевая флуоресценция; указана стрелками) сосудов глиобластомы; увеличение 200.
Исследование перифокальной зоны глиобластомы
Гистологическое строение перифокальной зоны роста глиобластомы варьировало от практически нормального головного мозга до морфологической картины диффузной астроцитомы,
представленной полями полиморфных отростчатых клеток с
умеренной атипией гиперхромных ядер с неровной ядерной мембраной, без митотической активности, некрозов и сосудистой пролиферации.
Перифокальная зона опухоли визуализировалась при помощи МРТ в режиме FLAIR, а также интраоперационной розовой флюоресценции протопорфирина IX – продукта метаболизма 5- аминолевулиновой кислоты. Медиана уровня пролиферативной активности по Ki-67 в перифокальной зоне составила 5,6 [1,8; 18,0]%, что было заметно ниже (U= 3,0; значимость 0,0001) уровня пролиферативной активности клеток опухоли — 33,1 [22,9; 37,7]%. Однако, уровень экспрессии FoxM1 оказался высоким как в
перифокальной зоне (U= 43,5; значимость 0,631), так и в зоне опухоли: медианы составили 96,5 [73,3; 100]% и 100 [75,3; 100]% соответственно.
При изучении образцов перифокальной зоны методом КЛСМ была обнаружена флуоресценция протопорфирина IX с колокализацией его сигнала и митохондрий, что точно показывало внутриклеточное расположение продукта метаболизма 5- аминолевулиновой кислоты.
Высокий уровень экспрессии FoxM1 и Ki-67, накопление протопорфирина IX в клетках перифокальной зоны свидетельствуют о её туморогенном потенциале и инвазии опухолевых клеток в нормальную структуру головного мозга. Соответственно удаление глиобластомы только в пределах самой опухоли не может гарантировать радикальность резекции.
ВЫВОДЫ
1) Глиобластома в российской популяции морфологически неоднородна, что диктует необходимость персонифицированного подхода к таргетной терапии. Самый частый вариант сочетания
белков в одной FoxM1+/NeuroD1+/Prox1-/CXCR4+/CD38-. иммунофенотипами FoxM1-/NeuroD1+/Prox1-/CXCR4+/CD38+, FoxM1-/NeuroD1+/Prox1+/CXCR4+/CD38- FoxM1+/NeuroD1+/Prox1+/CXCR4+/CD38+.
опухоли — Самыми редкими являются
и
2) Клетки некоторых глиобластом экспрессируют CD38. CD38 является первоочередной потенциальной мишенью таргетной терапии препаратом даратумумаб, зарегистрированным в России. Продолжительность жизни пациентов с глиобластомой, экспрессирующей CD38, в среднем составляет 4 месяца, что значительно ниже, чем при отсутствии таковой.
3) Факторы транскрипции NeuroD1, FoxM1, Prox1, рецептор CXCR4 экспрессируются не только в клетках глиобластомы, но и на стенках её сосудов, причем количество экспрессирующих клеток в большинстве случаев составляет более 50%. Эти белки являются перспективными мишенями для таргетной терапии злокачественных глиом.
4) Комплексное морфологическое исследование фрагментов и культур глиобластомы с иммуногистохимическим анализом,
конфокальной лазерной сканирующей и электронной микроскопии показало, что периваскулярная ниша опухоли включает в свой клеточный состав эндотелиоциты, перициты, телоциты и смешанный иммунофенотип перицитов/телоцитов, обеспечивая химиорезистентность.
5) Перифокальная зона глиобластомы имеет повышенный индекс пролиферативной активности по Ki-67 и содержит клетки, экспрессирующие FoxM1, что свидетельствует о ее ростовом злокачественном потенциале.
6) В российской популяции частота встречаемости метилирования промотора гена MGMT всего 20%, что значительно ухудшает потенциал использования в качестве терапии алкилирующих агентов.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1) Для определения прогноза и мишеней для потенциальной таргетной терапии глиобластом необходимо выполнять иммуногистохимическое исследование опухоли с антителами к FoxM1, CD38, Prox1, CXCR4.
2) Для оценки радикальности резекции глиобластомы рекомендуется выполнять иммуногистохимическое исследование образцов перифокальной зоны опухоли с антителами к FoxM1 и Ki- 67.
3) Молекулярно-биологические исследования наличия метелирования промотора MGMT, IDH мутаций являются экономически затратными и неэффективными с точки зрения персонифицированного подхода к лечению пациентов с глиобластомами, поскольку позволяют оценить только чуть более лучший прогноз, а не возможности для таргетной терапии.