ВВЕДЕНИЕ ………………………………………………………………………………………………………………..5
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ……………………………………………………………………………10
1.1 Общая характеристика флавивирусов …………………………………………………………………10
1.1.1 Систематическое положение флавивирусов ………………………………………………….10
1.1.2 Строение вириона представителей рода Flavivirus ………………………………………..12
1.1.3 Жизненный цикл флавивирусов и строение генома ……………………………………….13
1.1.4 Распространение флавивирусов на территории России и их переносчики ……..16
1.1.5 Принципы районирования ареала вируса клещевого энцефалита …………………..19
1.2 Общая характеристика флавиподобных вирусов …………………………………………………21
1.2.1 Систематическое положение флавиподобных вирусов ………………………………….22
1.2.2 Общая характеристика сегментированных флавиподобных вирусов ……………..22
1.2.3 Распространение флавиподобных вирусов в мире …………………………………………24
1.2.4 Медицинское значение сегментированных флавиподобных вирусов …………….26
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ …………………………………………………………………….27
2.1 Культуры клеток, животные и вирусы, использованные в работе ………………………..27
2.1.1 Культуры клеток ………………………………………………………………………………………….27
2.1.2 Лабораторные животные ………………………………………………………………………………28
2.1.3 Вирусы…………………………………………………………………………………………………………28
2.2 Сбор полевого материала и работа с клещами …………………………………………………….28
2.2.1 Сбор клещей ………………………………………………………………………………………………..28
2.2.2 Получение клещевых суспензий …………………………………………………………………..29
2.2.3 Заражение клещей из лабораторной культуры ………………………………………………29
2.3 Вирусологические, серологические и микробиологические методы ……………………30
2.3.1 Изоляция вирусов на культурах клеток и в сосунках белых мышей ……………….30
2.3.2 Концентрация вируса с помощью ультрацентрифугирования ………………………..31
2.3.3 Очистка вируса в градиенте плотности сахарозы…………………………………………..31
2.3.4 Просвечивающая электронная микроскопия …………………………………………………32
2.3.5 Выявление антигена ВКЭ методом ИФА ………………………………………………………32
2.3.6 Получение колоний микроорганизмов из клещевых суспензий на плотной
питательной среде ………………………………………………………………………………………………..33
2.3.7 Изучение перекрестных реакций между ВКЭ и бактериями методом ИФА ……34
2.4 Молекулярно-биологические методы, компьютерная обработка данных и
электронная микроскопия………………………………………………………………………………………..34
2.4.1 Выделение РНК ……………………………………………………………………………………………34
2.4.2 Обратная транскрипция ………………………………………………………………………………..34
2.4.3 Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (ПЦР-РВ) …………35
2.4.4 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) ……………………………………………………………35
2.4.5 Аналитический электрофорез в агарозном геле …………………………………………….36
2.4.6 Препаративный электрофорез и выделение ПЦР-фрагмента из агарозы ………..36
2.4.7 Секвенирование ДНК по Сэнгеру …………………………………………………………………36
2.4.8 Высокопроизводительное секвенирование ……………………………………………………39
2.4.9 Филогенетический анализ …………………………………………………………………………….39
2.4.10 Статистическая обработка ………………………………………………………………………….40
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ………………………………………………………….41
3.1 Сравнение методов выявления вируса клещевого энцефалита в биологических
материалах ………………………………………………………………………………………………………………41
3.1.1 Оценка специфичности ИФА и ПЦР-РВ для выявления ВКЭ по отношению к
другим представителям рода Flavivirus …………………………………………………………………42
3.1.2 Влияние отклонений в пробоподготовке на чувствительность коммерческой
тест-системы на основе ИФА при выявления ВКЭ в клещах …………………………………43
3.1.3 Оценка возможных неспецифических реакций в ИФА с микроорганизмами,
обитающими в клещах, при использовании коммерческой тест-системы ………………45
3.1.4 Обсуждение …………………………………………………………………………………………………47
3.2 Выявление и изоляция флави- и флавиподобных вирусов на границах ареала
вируса клещевого энцефалита в России ……………………………………………………………………49
3.2.1 Выбор регионов исследования ……………………………………………………………………..49
3.2.2 Республика Карелия ……………………………………………………………………………………..51
3.2.3 Калининградская область ……………………………………………………………………………..58
3.2.4 Ставропольский край ……………………………………………………………………………………61
3.2.5 Челябинская область …………………………………………………………………………………….64
3.2.6 Республика Татарстан …………………………………………………………………………………..69
3.2.7 Ульяновская область …………………………………………………………………………………….71
3.2.8 Республика Тыва ………………………………………………………………………………………….74
3.2.9 Обсуждение …………………………………………………………………………………………………84
3.3 Общая характеристика выявленных флавиподобных вирусов……………………………..90
3.3.1 Вирус Алонгшан ………………………………………………………………………………………….90
3.3.2 Вирус Янггоу ……………………………………………………………………………………………..100
3.3.3 Обсуждение ……………………………………………………………………………………………….100
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ………………………………………………………………………………………………………104
ВЫВОДЫ………………………………………………………………………………………………………………..109
ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ…………………………………..110
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ …………………………….111
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ………………………………………………………………………………………113

1. Сравнение методов выявления вируса клещевого энцефалита в биологических материалах
В 2010-х годах самым распространенным в России методом исследования клещей на наличие ВКЭ являлся ИФА. Доля исследований с использованием ПЦР составляла 40%. В последние годы в западной и юго-западной частях РФ, ранее считавшихся неэндемичными по КЭ, в которых не регистрировались случаи заболевания, участились случаи обнаружения антигена ВКЭ в клещах с помощью ИФА. Попытки выявления вируса в этих материалах с помощью вирусологических и молекулярных методов не были результативными. На основании выше сказанного можно было бы предположить, что метод ИФА является более чувствительным, по сравнению с ПЦР, и его применение более оправдано. С другой стороны,
работы, проведенные с использованием экспериментально зараженных ВКЭ клещей, и с 7
большим количеством клещей из природы показали, что метод ПЦР более чувствителен и специфичен, чем ИФА. Тем не менее, требовалось экспериментальное объяснение причин возникновения ложноположительных реакций.
Для оценки специфичности методов мы взяли 3 штамма ВКЭ, относящихся к различным подтипам (европейский, сибирский и дальневосточный), и 3 вируса из группы переносимых клещами флавивирусов млекопитающих, которые, как известно, характеризуются перекрестами в серологических реакциях. В работе были использованы коммерческие тест-системы на основе ИФА и ПЦР-РВ. Кроме того мы исследовали вирусы в ПЦР с использованием праймеров на фрагмент генома, кодирующий белок NS5 флавивирусов (панфлави).
Все вирусы, использованные в работе, показали положительный результат при использовании коммерческой тест-системы на основе ИФА, но в различных концентрациях (Таблица 1).
При исследовании вирусов с помощью коммерческой тест-системы на основе ПЦР-РВ три штамма ВКЭ выявлялись в концентрации 2,2 – 2,6 lgБОЕ/мл. Вирус ШЭО был выявлен в концентрации 2,3 lgБОЕ/мл. Производителем тест-системы, в инструкции по применению набора, указывается, что вирусы ОГЛ и Лангат не детектируются. В наших исследованиях это подтвердилось (Таблица 1). ПЦР-РВ является более специфичным методом, однако, и он давал положительную реакцию с филогенетически наиболее близким к ВКЭ вирусом ШЭО. ПЦР с использованием панфлави праймеров выявляла все используемые флавивирусы в концентрации меньшей, чем ИФА. В дальнейших исследованиях по выявлению флави- и флавиподобных вирусов мы использовали ПЦР с панфлави праймерами.
Таблица 1 – Оценка специфичности различных методов выявления ВКЭ с использованием
представителей рода Flavivirus Вирус
ВКЭ – штамм Абсеттаров, Европейский подтип
ВКЭ – штамм ЭК-328, Сибирский подтип
ВКЭ – штамм СофьинКГГ, Дальневосточный подтип вирус Омской геморрагической лихорадки – штамм Никитина (максимальная концентрация 8,7 lgБОЕ/мл) вирус Лангат – штамм ТР-21 (максимальная концентрация 8,7 lgБОЕ/мл)
вирус шотландского энцефаломиелита овец – штамм S1
Минимально выявляемые концентрации вируса, lgБОЕ/мл ИФА1 ПЦР-РВ ПЦР2
5,2 2,2 2,2 5,5 2,5 2,5 5,6 2,6 2,6
6,3
6,7
3,2
не выявили 2,3
не выявили 2,7
2,3 2,2
1 вирусные суспензии были приготовлены на среде 199 на растворе Эрла и разведены коммерческим раствором для разведения исследуемых образцов в соотношении 1:1;
2 полимеразная цепная реакция проводилась с использованием праймеров на участок генома, кодирующего фрагмент белка NS5 флавивирусов (панфлави) – cFD2-MAMD
8

Для оценки возможных ложноположительных реакций были исследованы 205 иксодид разных видов, собранных в Московской области и республике Татарстан и разделенных на пулы по 1-7 особи (всего 83 пробы). 64 пробы клещей гомогенизировали в среде 199 на растворе Эрла, а потом добавляли раствор для разведения исследуемых образцов в соотношении 1:1. Из оставшихся 19 пулов были приготовлены пробы тем же способом, но перед суспензированием клещей не промывали в 70% этиловом спирте. Как было показано в Таблице 1, ПЦР является более чувствительным методом, чем ИФА, при выявлении ВКЭ в клещах. Поэтому все пулы были проверены методом ПЦР на наличие РНК вирусов рода Flavivirus с использованием панфлави праймеров и 25 пулов на наличие ВКЭ с использованием праймеров Kgg19 и Kgg31, обеспечивающих более высокую чувствительность по сравнению с панфлави праймерами, с последующим электрофоретическим анализом. Ни одна из проб не содержала вирусной РНК. При исследовании пулов с помощью ИФА в 4 из 28 пулов, при подготовке которых клещей промывали в 70% этаноле перед суспензированием, и в 5 клещах из 36, приготовленных индивидуально, оказались положительными на наличие ВКЭ (14% положительных проб). В случае, когда клещей не промывали в спирте перед суспензированием, 13 пулов из 19 показали положительный результат (68% положительных проб).
Из положительных в ИФА пулов была получена чистая культура 12 видов бактерий, представленные 15 изолятами. Бактериальные суспензии были уравнены по концентрации белка, определенной по методу Бредфорда, до 3 и 6 мг/мл и исследованы с помощью коммерческой тест-системы на основе ИФА на наличие антигена ВКЭ.
Из 15 исследованных изолятов микроорганизмов 4 изолята, представлявшие виды Pseudomonas luteola, Stenotrophomonas maltophilia, Bacillus weihenstephanensis, оказались положительными в ИФА на наличие антигена ВКЭ. Один вид бактерий Stenotrophomonas maltophilia был выделен из клещей после стандартной пробоподготовки, два вида бактерий Pseudomonas luteola и Bacillus weihenstephanensis – из клещей, в пробоподготовке которых отсутствовала стадия обработки 70% спиртом перед суспензированием.
Таким образом, возможными причинами появления ложноположительных реакций в ИФА могут являться:
• перекрестные реакции с переносимых клещами флавивирусами млекопитающих;
• перекрестные реакции с обитающими в клещах микроорганизмами.
2. Выявление и изоляция флавивирусов и флавиподобных вирусов на различных территориях России
Наиболее значимые процессы эволюции арбовирусов можно ожидать на границах ареала
и в зонах совместного обитания различных видов клещей, где высока вероятность 9

возникновения новых вариантов вируса в связи со сменой переносчиков и основных прокормителей. Мы создали карту распространения КЭ на основе данных Роспотребнадзора об эндемичных по КЭ территориях (Рисунок 1), в основе которой лежат случаи регистрации заболевания КЭ, поскольку мы не могли опираться на данные о распространения вируса, полученные с помощью ИФА.
Случаи КЭ регистрируются на территориях 65 из 85 субъектов РФ, и только 48 субъектов России являются эндемичными по КЭ, т.е. на их территории регистрируются незавозные случаи этого заболевания. Районы значительно различаются по уровню заболеваемости. Очевидно, что границы распространения ВКЭ будут шире.
В последние десятилетия наблюдается расширение ареала ВКЭ на север. Северная граница распространения ВКЭ простирается от Норвегии, Швеции и Финляндии в Европе до Хабаровского края на Дальнем Востоке России. Основными причинами наблюдаемых явлений считается изменение климата и антропогенный фактор.
По направлению с севера на юг лесные зоны переходят в лесостепные (место совместного обитания клещей родов Dermacentor и Ixodes) и степные зоны, где доминируют клещи рода Dermacentor. В связи с этим определение южной границы распространения ВКЭ осложнено, т.к. не ясна роль клещей рода Dermacentor в поддержании стойких самостоятельных очагов КЭ.
Рисунок 1 – Эндемичные по клещевому энцефалиту территории России (синий цвет). Регионы исследования (красный цвет). Карта была подготовлена на основе официальных данных Роспотребнадзора России об эндемичных по клещевому энцефалиту территориях.
Для исследования были выбраны регионы на границе ареала ВКЭ в различных зонах (Рисунок 1). На северо-западной границе распространения ВКЭ была выбрана Калининградская область, как место обитания основного клеща-переносчика ВКЭ I.ricinus, и Республика Карелия, которая является зоной симпатрии клещей I. persulcatus и I. ricinus. На южной границе – республики Тыва и Татарстан, Ульяновская и Челябинская области, где имеются зоны совместного обитания клещей родов Ixodes и Dermacentor и зоны обитания только клещей рода Dermacentor, а также Ставропольский край, где никогда не регистрировали заболеваемость КЭ, но при этом отмечено выявление антигена ВКЭ в ИФА.
В период с 2008 года по 2019 год в различных регионах Российской Федерации нами было проанализировано на наличие флавивирусов 7122 клещей 12 видов: I. ricinus (n=724), I. persulcatus (n=2756), D. reticulatus (n=922), D. marginatus (n=1175), D. silvarum (n=85), D. nuttalli (n=1027), Hyalomma marginatum (n=254), H. scupense (n=1), Haemaphysalis concinna (n=8), Haem. punctata (n=79), Rhipicephalus rossicus (n=84) и R. sanguineus (n=7) (Рисунок 2).
Рисунок 2 – Места сбора клещей и выявления ВКЭ, вирусов Алонгшан (ВАЛ) и Янггоу (ВЯГ).
ВКЭ был выявлен в республиках Карелия и Тыва (Рисунок 2). В республике Карелия мы не обнаружили ВКЭ в клещах I. ricinus. По-видимому, вирусофорность клещей I. ricinus составляет менее 1%. Для клещей I. persulcatus вирусофорность составила 0,3 – 1,7%. Все
выделенные нами штаммы ВКЭ относились к балтийской группе сибирского подтипа. Мы не обнаружили штаммы дальневосточного и европейского подтипов ВКЭ, которые встречаются в близких с Карелией районах – в республике Коми и Финляндии, соответственно. Штаммы ВКЭ из республики Карелия образовывали три монофилетические группы в рамках балтийской группы сибирского подтипа ВКЭ (Рисунок 3). В одну группу вошли штаммы только из республики Карелия (дер. Гомсельга и пригород Петрозаводска). Эта группа показала высокую генетическую стабильность и фактически представляет локальный очаг (расстояние между точками сбора клещей менее 30 км). Штаммы, изолированные с интервалом в 12 лет (2006 г., 2014 г. и 2018 г.), на участке генома, кодирующем фрагмент белка Е (1225 нт), показали уровень дивергенции менее 0,7%. С другой стороны, в том же месте были изолированы штаммы, входящие в другие монофилетические группы, которые помимо карельских штаммов включали штаммы, изолированные из клещей с более отдаленных территорий (расстояние между точками сбора клещей более 700 км). В одну группу входили штаммы из Эстонии и Вологодской области, а в другую – штаммы из Эстонии и штамм Volkhov-2-43 из Ленинградской области. Очевидно, что требуется больше информации о вирусах из соседних регионов, но этот срез данных показывает, что помимо стабильного локального очага КЭ, на территорию республики Карелия происходит занос ВКЭ птицами из Эстонии и Вологодской области.
Куршская коса также является местом перелета птиц, и отсутствие постоянного очага КЭ связано, по-видимому, с низкой зараженность клещей I. ricinus. Тем не менее, этот очаг требует пристального внимания из-за высокой численности клещей и возможности заноса различных вариантов вируса с других территорий.
Сбор клещей в южных регионах проводили в степных и лесостепных районах, где основным обитателем являются клещи рода Dermacentor, роль которых в поддержании очагов КЭ до конца не ясна, и отмечается спорадическая заболеваемость. Мы не нашли ВКЭ в клещах из Челябинской области, республики Татарстан и Ульяновской области. А также в клещах из Ставропольского края, положительных на наличие антигена ВКЭ в ИФА.
В республике Тыва зараженность клещей I. persulcatus колебалась от 0,9% до 4,76%. Зараженность клещей D.silvarum составила 8,6% и статистически не отличалась от зараженности I.persulcatus, как внутри одного округа, так и в общем, по республике. Зараженность клещей D. nuttalli составила от 5,2% до 8,3% и статистически не отличалась от таковой для I. persulcatus и D. silvarum. ВКЭ встречался на всех высотах. Корреляции между зараженностью клещей и высотой места сбора не наблюдалась. Самая высокая точка, где был найден ВКЭ в клещах рода Dermacentor, – 1566 м н.у.м., а в клещах I. persulcatus – 1506 м н.у.м. Для изоляции вируса было использовано 14 ампликон содержащих суспензий клещей
Рисунок 3 – Филогенетическое дерево вируса клещевого энцефалита построено методом максимального правдоподобия (Maximum Likelihood) по фрагменту генома, кодирующему белок Е. Штаммы, описанные в данной работе, отмечены красными кругами (Тыва) и оранжевым кругами (Карелия). Штаммы, выделенные другими авторами – зелеными треугольниками (Тыва) и фиолетовыми треугольниками (Карелия).
I. persulcatus, и было изолировано 9 штаммов (64% изоляции). Для изоляции вирусов из клещей D. nuttalli было использовано 33 ампликон содержащих суспензии, и был изолирован только 1штамм ВКЭ (3% изоляции). Все штаммы, описанные в работе, отнесены к группе Васильченко сибирского подтипа ВКЭ и совместно с 4 штаммами, выделенными в Тыве в 2011г. сибирскими учеными, образовывали одну монофилетическую группу (Рисунок 3). Другие 3 штамма, выделенные на территории республики Тыва теми же авторами, образовывали общую группу со штаммами, выделенными в Кемеровской области и Китае, что может быть следствием заноса вируса птицами или при перевозке скота на территорию Тывы.
Таким образом, одним из наиболее важных факторов, определяющих разнообразие вариантов ВКЭ, циркулирующих на границах ареала, является занос вирусов/клещей из других регионов. Локальные очаги ВКЭ могут значительно различаться по значению этого фактора.
При исследовании тех же клещей было обнаружено 39 ампликонов вируса Алонгшан (Таблица 2, Рисунок 4). Двенадцать ампликонов были детектированы с помощью праймеров на род Flavivirus (панфлави) и тридцать два ампликона были детектированы с помощью специфических праймеров на сегмент 2. Вирусы были найдены практически во всех исследуемых регионах, но их распространение было неравномерным (Рисунок 2). Наибольшее количество ампликонов в одном месте сбора было детектировано в Калининградской области (3 ампликона) и в Челябинской области (9 ампликонов). Малое количество ампликонов в одном сборе было детектировано в Ульяновской области (1 ампликон), республике Карелия (2 ампликона), республике Татарстан (1 ампликон) и республике Тыва (1 ампликон). В клещах из Ставропольского края вирус Алонгшан детектирован не был. Вирус Алонгшан был детектирован в клещах I. persulcatus (республики Тыва и Карелия, Челябинская область), I. ricinus (Калининградская и Ульяновская области, республика Татарстан), D. reticulatus (Ульяновская область) (Таблица 2).
Наименьшая вирусофорность клещей была в республиках Тыва, Карелия и Татарстан, и составляла 0,6%, 0,8% и 1,4%, соответственно. В остальных регионах вирусофорность клещей составляла от 1,8% (Калининградская область) до 5,1% (Калининградская область).
Вирус Янггоу был выявлен только в клещах D.nuttalli из республики Тыва, и их зараженность составила 0,5% (Таблица 2, Рисунок 4). Штамм Erzin14-T20074 вируса Янггоу был изолирован из напитавшихся клещей D. nuttalli, собранных с крупного рогатого скота. Мы не можем исключить возможность того, что вирус Янггоу был получен во время питания клеща на зараженном животном, так как ранее была показана вирусемия у млекопитающих, инфицированных другими представителями группы Джингмен.
Рисунок 4 – Филогенетическое дерево вирусов Алонгшан и Янггоу. Филогенетическое дерево было построено по фрагменту сегмента 2 в 233 нт с использованием метода ближайшего соседа в MEGA X. Оранжевые кружки – ампликоны/штаммы вируса Алонгшан, описанные в данном исследовании. Синий кружок –штамм вируса Янггоу, описанный в данном исследовании. YGTV = вирус Янггоу, JMTV = вирус Джингмен, ALSV = вирус Алонгшан.
Таблица 2 – Штаммы («ш») или ампликоны («а») вирусов Алонгшан и Янггоу выделенных или
детектированных в клещах Штамм («ш»)/
ампликон («а»)
a. Miass501 ш. Miass502 ш. Miass506
Вид клеща Год, регион (GPS) вирус Алонгшан
Номер GenBank
MT210222 MW525314 – MW525317 MW525318 –
I. persulcatus I. persulcatus I. persulcatus
2014, Челябинская область (55.02145°, 60.168283°)
15

a. Miass508 a. Miass510 a. Miass515
ш. Miass519
a. Miass523
ш. Miass527
ш. Miass15-T22516 ш. Miass15-T22517
a. Goms12-T16338
a. Goms13-T17158 a. Goms13-T17160/2 a. Goms13-T17182/2 a. Goms13-T17190/2
ш. Galozero14-T20426
a. Goms14-T20532
a. Goms18-T27349 a. Goms18-T27350
a. Goms18-T27366
a. Erjey17-T25134
a. Sizim17-T25125
a. Kursh17-T25178 a. Kursh17-T25208
a. Kursh17-T25456
a. Kursh17-T25652
a. Kursh18-T30280
a. Kursh18-T30274
a. Kursh18-T27123
a. Kursh18-T30281
a. Kursh18-T30284 a. Kursh18-T30285 a. Kursh18-T30286 a. Kursh18-T30278 a. Kursh18-T30290
a. Ulya14-T20695
I. persulcatus I. persulcatus I. persulcatus
I. persulcatus
I. persulcatus
I. persulcatus
I. persulcatus I. persulcatus
I. persulcatus
I. persulcatus I. persulcatus I. persulcatus I. persulcatus
I. persulcatus
I. persulcatus
I. persulcatus I. persulcatus
I. persulcatus
I. persulcatus
I. persulcatus
I. ricinus I. ricinus
I. ricinus I. ricinus I. ricinus I. ricinus I. ricinus I. ricinus
I. ricinus
I. ricinus D. reticulatus
2015, Челябинская область (55.021583°, 60.169783°) 2012, республика Карелия (62,0690667°, 33,96141667°) 2013, республика Карелия (62.069381°, 33.964528°) 2013, республика Карелия (62.068557°, 33.962730°) 2014, республика Карелия (62.075051°, 33.951404°) 2014, республика Карелия (62.063838°, 33.943815°) 2018, республика Карелия (62.075230°, 33.946687°) 2018, республика Карелия (62.067203°, 33.933651°) 2017, республика Тыва (51.32646°, 95.98224°) 2017, республика Тыва (51.33110°, 95.94315°) 2017, Калининградская область (54.972030°, 20.508669°) 2017, Калининградская область (55.18242°, 20.85957°) 2017, Калининградская область (54.97020°, 20.50458°) 2018, Калининградская область (55.146110°, 20.824530°) 2018, Калининградская область (55.15465°, 20.82790°) 2018, Калининградская область (55.183363°, 20.857993°) 2018, Калининградская область (55.175897°, 20.846458°)
2018, Калининградская область (55.1591837°, 20.8432753°)
2018, Калининградская область (55.222354°, 20.891556°) 2014, Ульяновская область (54.446204°, 48.379524°)
MW525321 MT210221 MT210225 MT210223 MN648774 – MN648777 MT210224 MN648770 – MN648773 MW525284 MW525285
MW525286
MW525287 MW525288 MW525289 MW525290
MN604229
MW525291
MW525292 MW525293
MW525294 MW525295
MW525296
MW525297 MW525298
MW525299
MW525300
MW525304
MW525302
MW525301
MW525305
MW525306 MW525307 MW525308 MW525303 MW525309
MW525311
16

a. Ulya15-T22688 a. Tat14-T21924
ш. Erzin14-T20074
I. ricinus I. ricinus
D. nuttalli
2015, Ульяновская область (54.588423°, 48.416590°) 2014, республика Татарстан (55.85397°, 48.7577°)
вирус Янггоу
2014, республика Тыва
(50.13304°, 95.4722°)
MW525312 MW525313
MW525322 – MW525325
3. Общая характеристика выявленных флавиподобных вирусов
Семь случайно выбранных проб (Miass502, Miass506, Miass519, Miass527, Miass15- T22516, Miass15-T22517, Galozero14-T20426), положительных на вирус Алонгшан, были использованы для заражения культуры клеток клещей I. ricinus (IRE/CTVM19). Ни один из семи штаммов не оказывал ЦПД на клетки. Также, мы проверили возможность вируса Алонгшан (штамм Miass527) размножаться в культуре клеток клещей Hyalomma anatolicum anatolicum (HAE/CTVM8). Штамм Miass527 успешно размножался в культуре клеток HAE/CTVM8 более 13 месяцев без ЦПД. Штамм Erzin14-T20074 вируса Янггоу длительно персистировал в культурах клеток IRE/CTVM19 и HAE/CTVM8 в течение 11 и 7 месяцев, соответственно, и не оказывал ЦПД.
Сконцентрированный и очищенный в градиенте плотности сахарозы вирус был использован для электронной микроскопии, которая показала, что большинство вирионов штамма Miass527 вируса Алонгшан представляли собой сферические частицы диаметром 40,5 ± 3,7 нм (Рисунок 5, A, Б). У них были либо электроннопрозрачные, либо электронно-плотные ядра. Вирусные частицы с электронно-плотным ядром выглядели как пустые формы, не содержащие гРНК (Рисунок 25, Б). В той же фракции градиента мы обнаружили маленькие сферические частицы диаметром 13,1 ± 2,1 нм, которые имели электроннопрозрачные или электронно-плотные ядра (Рисунок 5, В, Г). Можно предположить, что эти маленькие частицы являются вирионами вируса Алонгшан с неполным набором сегментов, белковыми структурами или каким-либо другим неидентифицированным компонентом клеток IRE/CTVM19. Осадок, полученный после УЦФ КЖ неинфицированной культуры IRE/CTVM19, разделяли УЦФ в градиенте плотности сахарозы. Для просвечивающей электронной микроскопии мы использовали ту же фракцию градиента, что и для инфицированных вирусом Алонгшан клеток IRE/CTVM19. В этой фракции мы обнаружили мелкие сферические частицы диаметром 15,7 ± 1,8 нм, которые были несколько больше, чем во фракции градиента с вирусом Алонгшан и имели электронно-плотные ядра.
Рисунок 5 – Просвечивающая электронная микроскопия. Электронные микрофотографии очищенных вирусных частиц штамма Miass527 вируса Алонгшан, размноженного в клетках IRE/CTVM19 (A, Б). Видны мелкие частицы с электронно-полупрозрачным (В) или электронно-плотным (Г) ядром. Образцы окрашивали 2% уранилацетатом. Масштабные полосы, 100 нм.
Сегмент 2 кодирует белки VP1a, VP1b и nuORF. Так как, по-видимому, белки VP1a и VP1b являются поверхностными структурными белками, мы предположили, что эти белки могут определять круг хозяев. При филогенетическом анализе последовательности белка VP1a штаммы разделились на группы, соответствующие ареалу клещей I. ricinus и I. persulcatus, в свою очередь, группа «I. persulcatus» разделилась на азиатскую и европейскую подгруппы (Рисунок 6, A). Штаммы Galozero14-T20426 и Coms13-T17158, изолированные в республике Карелия, и штаммы Miass519 и Miass506 из Челябинской области образовывали европейскую подгруппу, а штаммы Erjey17-T25134 (республика Тыва), H3 (Китай) и два штамма Miass527 и Miass502 из Челябинской области, образовывали азиатскую подгруппу группы «I. persulcatus».
При филогенетическом анализе последовательности белка VP1b сначала происходит разделение вирусов по географическому признаку на азиатскую подгруппу, все представители которой были изолированы из клещей с территории ареала I. persulcatus, и европейскую группу, которая в свою очередь разделилась согласно ареалу клещей на группы «I. persulcatus» и «I. ricinus» (Рисунок 6, Б).
Рисунок 6 – Филогенетический анализ аминокислотных последовательностей белков сегмента 2 вируса Алонгшан был выполнен с использованием метода объединения соседей в MEGA X. Красный кружок – группа «Ixodes persulcatus», зеленый кружок – группа «Ixodes ricinus». A. Полная аминокислотная последовательность белка VP1a. Б. Полная аминокислотная последовательность белка VP1b. В. Полная аминокислотная последовательность белка nuORF. YGTV = вирус Янггоу, JMTV = вирус Джингмен, ALSV = вирус Алонгшан.
Филогенетический анализ по полной аминокислотной последовательности белка nuORF показал наличие только азиатской подгруппы группы «I. persulcatus», поддержки других группы не было (Рисунок 6, В). Это может быть связано с тем, что аминокислотная последовательность белка nuORF короткая и высоко консервативна.
Были изучены различия в аминокислотных последовательностях белков VP1a, VP1b и nuORF между группами «I. ricinus» и «I. persulcatus». В белке VP1a было найдено 7 замен, которые были специфичны для групп «I. ricinus» и «I. persulcatus». Эти замены были в позиции 72, 115, 135, 138, 153, 216 и 472 (Таблица 3). В белке VP1b была найдена только одна замена в позиции 276 (Таблица 3). В белке nuORF специфических замен, характерных для групп «I. ricinus» и «I. persulcatus», не обнаружено.
Также были обнаружены аминокислотные различия в последовательностях белков VP1a, VP1b и nuORF между европейской и азиатской подгруппами группы «I. persulcatus». В белке nuORF было найдено 3 аминокислотных отличий в позициях 4, 15 и 32, в белке VP1a – 6 специфических замен в позициях 8, 210, 321, 460, 476 и 479, в белке VP1b – 4 специфические замены в 118, 172, 187 и 195 позициях (Таблица 3).
Эти наблюдения, а также тот факт, что изоляты от различных видов клещей принадлежат либо к группам «I. ricinus», либо к «I. persulcatus», дополнительно подтверждают идею о том, что распространение вируса Алонгшан зависит от вида основного вектора, а не только от территории.
Таблица 3 – Специфические аминокислотные замены в белках VP1a, VP1b и nuORF вируса
Алонгшан
Позиция аминокислоты в белке
Группа «Ixodes ricinus»
Группа «Ixodes persulcatus» Европейская подгруппа Азиатская подгруппа
белок VP1a
8
Ala
Ala
Thr
72
Val
Ala
Ala
Ala
Val
Val
135
Val
Lys
Lys
138
Pro
Ser
Ser
153
Lys
Arg
Arg
210
Gly
Gly
Ser
216
Thr
Ala
Ala
Val
Val
Thr
460
Thr
Met
Thr
472
Arg
His
His
476
Arg
Arg
Gln
479
Arg/His
Arg
His
20

белок VP1b
Met
Met
Leu
172
Ile
Ile
Val
187
Lys
Lys
Arg
Ser
Ser
Gly
276
Val
Ile
Ile
белок nuORF
Красный цвет – специфические аминокислотные замены, различающие группы «I. ricinus» и «I.persulcatus». Зеленый цвет – специфические аминокислотные замены, различающие Европейскую и Азиатскую подгруппы группы «I. persulcatus».
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Флавивирусы показали способность к стремительному расширению своего ареала, которое может сопровождаться более тяжелым течением болезни, изменением клинических проявлений и даже появлением дополнительных способов распространения. Особое внимание ученых привлекают границы ареала арбовирусов, т.к. здесь можно ожидать появление эпидемически значимых вариантов вирусов, обусловленное сменой переносчиков и/или основных прокормителей. В связи с этим целью данной работы было поиск и характеристика флави- и флавиподобных вирусов, циркулирующих на границе ареала ВКЭ, как наиболее распространенного переносимого клещами флавивируса в России.
К началу нашей работы были известны обзоры, посвященные этому вопросу, и карты распространения КЭ на территории РФ, тем не менее, такая информация требует периодического обновления в связи с изменением границ этой инфекции, значительным улучшением диагностики и системы контроля.
В начале работы была проведена оценка эффективности и чувствительности коммерческих тест-систем по выявлению ВКЭ на основе ИФА и ПЦР-РВ, а также ПЦР с праймерами на род Flavivirus (лабораторная методика). Коммерческая тест-система по выявлению ВКЭ на основе ИФА давала ложноположительные реакции с микроорганизмами присутствующими в клещах, и с другими представителями рода Flavivirus, в отличие от коммерческой тест-системы на основе ПЦР-РВ.
Поскольку мы не могли использовать данные на основе ИФА для оценки распространения ВКЭ, мы составили карту на основе данных Роспотребнадзора о заболеваемости КЭ и литературных источников. Очевидно, что ареал ВКЭ шире, чем показано на карте.
Lys
Lys
Gln
15
Asp
Asp
Asn
132
Thr
Ala
Thr
В соответствии с картой, сборы клещей проводили на северо-западной границе распространения КЭ, где зона обитания клещей I.ricinus, как основного переносчика, переходит в зону симпатрии и зону, где обитает только клещи I. persulcatus, и на южной границе, где лесные зоны переходят в лесостепные (место совместного обитания клещей родов Dermacentor и Ixodes) и степные зоны, где доминируют клещи рода Dermacentor.
Нами было проанализировано более 7 тыс. клещей относящихся к 12 видам с использованием панфлави праймеров, специфичных для ВКЭ праймеров и праймеров на вирус Алонгшан.
Мы не выявили вирус ОГЛ, вирус Повассан и вирус ШЭО. Это связано с тем, что районы исследования не являются эндемичными по этим инфекциям.
Нами был выявлен ВКЭ в клещах в районах существования активных очагов на северо- западной границе распространения в республике Карелия и на южной границе – в республике Тыва. Всего было детектировано 54 положительные на ВКЭ пробы (21 – I. persulcatus, 33 – род Dermacentor) и изолировано 18 штаммов, из которых 16 штаммов из I. persulcatus, 1 штамм из D.nuttalli и 1 штамм из D.silvarum. Все выделенные штаммы относились к сибирскому подтипу, карельские штаммы к балтийской подгруппе, а тывинские штаммы к подгруппе Васильченко. Штаммы ВКЭ из республики Карелия образовали три независимые монофилетические группы. Одна группа состоит только из штаммов из республики Карелия, две другие группируются со штаммами, выделенными как с близлежащих областей, так и удаленных на несколько сотен километров. Штаммы ВКЭ из республики Тыва образовали две монофилетические группы. В одну группу вошли только штаммы из республики Тыва, в другой штаммы из Тывы кластеризовались со штаммами, выделенными с близлежащих территорий. Филогенетическая близость штаммов, изолированных в отдельных биотопах в разные годы, свидетельствует о существовании на территории республик стабильных локальных очагов ВКЭ. Наряду с этим наблюдаемое разнообразие штаммов ВКЭ, по-видимому, определяется заносом ВКЭ из соседних регионов. Популяции ВКЭ на территориях республик различаются по уровню заноса вируса. Таким образом, для предсказания эпидемиологической и эпизоотологической ситуаций на границах ареала необходимо учитывать микроэволюционные процессы в локальных очагах и интенсивность, и направление заноса вируса извне. Наиболее информативным является филогенетический анализ геномов циркулирующих в очагах вариантов ВКЭ.
В других областях исследования республике Татарстан, Ульяновской и Челябинской областях на южной границе распространения клещевого энцефалита ВКЭ или другие флавивирусы обнаружены не были. Это может быть связано с тем, что в местах сбора клещей доминирующим родом являлся род Dermacentor, роль которого в поддержании очага КЭ до сих
пор не ясна. Заболеваемость КЭ на этих территориях спорадическая, без жесткого доказательства, что инфицирование произошло после присасывания клеща рода Dermacentor. Хотя по нашим данным и данным других авторов вирусофорность клещей рода Dermacentor на уровне, а то и выше, вирусофорности клещей рода Ixodes, заболеваемость КЭ в районах преобладания клещей рода Dermacentor ниже. Причинами это может быть неспособность клещей рода Dermacentor длительно поддерживать циркуляцию ВКЭ в отсутствие клещей рода Ixodes или то, что в клещах рода Dermacentor отбирается менее вирулентный вирус, хуже реплицирующийся в клетках млекопитающих. Нельзя также исключить, что на распространение ВКЭ могут влиять и другие флави- или флавиподобные вирусы. Требуются дальнейшие паразитологические, вирусологические и молекулярно-генетические исследования этого вопроса.
Нами были изолированы несколько штаммов вируса Алонгшан и получена их первичная характеристика. С помощью просвечивающей электронной микроскопии нами была изучена морфология вирионов и показано, что вирионы штамма Miass527 вируса Алонгшан имеют сферическую форму размером 40,5 ± 3,7 нм. Нами впервые в мире было показано, что вирусы Алонгшан и Янггоу могут длительно поддерживать персистентную инфекцию (от 1 года до 3 лет) не оказывая ЦПД на клетки клещей I. ricinus (IRE/CTVM19) и Hyalomma anatolicum (HAE/CTVM8). С помощью ВПС была получена полная нуклеотидная последовательность генома четырех штаммов вируса Алонгшан, что позволило выбрать праймеры, которые позволили более эффективно выявлять эти вирусы.
Нами впервые была показана широкая распространенность на территории России сегментированных флавиподобных вирусов Алонгшан и Янггоу, относящихся к группе Джингмен. Вирусы этой группы нами были обнаружены от Калининградской области на западе до республики Тыва на востоке в клещах I. ricinus, I. persulcatus, D. reticulatus, D. nuttalli.
Филогенетический анализ аминокислотных последовательностей белков сегмента 2 VP1a, VP1b, которые, по-видимому, являются поверхностными структурными белками, показал, что штаммы вируса Алонгшан, выделенные из разных видов клещей и человека, разделяются на группы соответственно месту обитания клещей I. persulcatus и I. ricinus, в дальнейшем группа «I.persulcatus» разделяется на европейскую и азиатскую подгруппы. Подобное деление наблюдается и для ВКЭ, у которого европейский подтип ассоциирован с клещами I. ricinus, а сибирский и дальневосточный подтипы с клещами I. persulcatus. Поскольку филогенетический анализ дает информацию об основных факторах, определяющих эволюцию вируса, то аналогия между циркулирующими на одной и той же территории в популяции одних и тех же клещей вируса КЭ и Алонгшан позволяет сделать предположение, что определяющим фактором для этих вирусов является вид основного переносчика: клещи
I.ricinus и I.persulcatus. Китайскими учеными получены данные указывающие, что вирус Алонгшан может быть связан с заболеваниями человека. Для ВКЭ известно, что европейский подтип с основным переносчиком I.ricinus по эпидемиологическим характеристикам отличается от сибирского и дальневосточного подтипов с основным переносчиком I.persulcatus. Выявленная нами схожесть деления штаммов/ампликонов вируса Алонгшан позволяет высказать предположение, что разные подгруппы этого вируса могут иметь свою эпидемиологическую специфику. Это предположение требует дальнейшего всестороннего изучения.
На территории России существуют сочетанные очаги флавивирусов и флавиподобных вирусов. На территории республик Тыва и Карелия нами были выделены вирусы Алонгшан, Янггоу и ВКЭ из клещей, собранных на одном маршруте. Дальнейшее изучение сочетанных очагов флави- и флавиподобных вирусов даст ответ о возможном влиянии вирусов друг на друга и на течение вызываемых ими заболеваний.
ВЫВОДЫ
1. Ложноположительные реакции при выявлении ВКЭ в биологических материалах с помощью ИФА могут быть следствием перекрестных реакций с переносимыми клещами флавивирусами млекопитающих и перекрестных реакций с микроорганизмами, обитающими в клещах.
2. Одним из наиболее важных факторов, определяющих разнообразие вариантов ВКЭ, циркулирующего на границах ареала, является занос вирусов/клещей из других регионов. Локальные очаги ВКЭ могут значительно различаться по значимости этого фактора.
3. Показано широкое распространение сегментированных флавиподобных вирусов (вирус Алонгшан и вирус Янггоу) на территории РФ от Калининградской области на западе до республики Тыва на востоке.
4. На территории России существуют сочетанные очаги ВКЭ и флавиподобных вирусов, циркулирующих в клещах. В сборах клещей из одной точки выявлен ВКЭ и вирус Алонгшан (республики Карелия и Тыва) и ВКЭ и вирус Янггоу (республика Тыва).
5. Получена первичная вирусологическая и молекулярно-генетическая характеристика флавиподобных вирусов Алонгшан и Янггоу. Получены полные нуклеотидные последовательности 4 геномов вируса Алонгшан и 1 генома вируса Янггоу, показана длительная персистентная инфекция в культурах клеток клещей Ixodes ricinus (IRE/CTVM19) и Hyalomma anatolicum (HAE/CTVM8), описана морфология вирионов вируса Алонгшан.
6. По данным филогенетического анализа сегмента 2, кодирующего поверхностные структурные вирусные белки, показано, что основными факторами эволюции вируса являются вид основного переносчика, а также место изоляции вируса. Штаммы/ампликоны вируса Алонгшан при филогенетическом анализе разделяются в соответствии с основным видом переносчика на группы «I. ricinus» и «I. persulcatus». В свою очередь, группа «I. persulcatus» разделяется на европейскую и азиатскую подгруппы.
ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ
Описанные в диссертационной работе исследования по изучению циркулирующих флави- и флавиподобных вирусов на территории России требуют дальнейшего продолжения. Необходим постоянный мониторинг за изменением ареала, как переносчиков, так и вирусов. Дальнейшее изучение вирусных популяций на границах ареала позволит установить пути заноса вирусов на данные территории, спрогнозировать варианты распространения инфекции. Дальнейшее изучение роли клещей рода Dermacentor в поддержании очагов клещевого энцефалита позволит установить более четкие южные границы его распространения. Дальнейшее изучение циркуляции флавиподобных вирусов, потенциально опасных для человека, и существование сочетанных очагов флави- и флавиподобных вирусных инфекций послужит основой для коррекции профилактических и противоэпидемических мероприятий, и важно при оценке эффективности существующих и создании новых профилактических и лечебных препаратов. Необходимо изучение флавиподобных вирусов, их эволюции, патогенности и влияния на циркуляцию уже известных флавивирусов, которые являются причиной возникновения тяжелых заболеваний у человека. Полученные флавиподобные вирусы будут использованы для изучения биологических свойств, структуры их генома и способов реализации генома.

Актуальность темы исследования

Информация о распространении известных природно-очаговых инфекций, а также
выявление и характеристика новых потенциально опасных для человека инфекционных
агентов является научной основой для обеспечения биологической безопасности, в том
числе для составления краткосрочных и долгосрочных прогнозов, выработки мер по
контролю заболеваемости, включая выбор стратегии и тактики профилактики.
Представители рода Flavivirus вызывают тяжелые заболевания у человека с
поражением центральной нервной системы и геморрагическими лихорадками.
Флавивирусы показали способность быстро распространяться на огромные территории
[108], изменять вирулентность для человека [108, 243] и использовать альтернативные
пути передачи [197].
В настоящее время на территории России отмечена циркуляция флавивирусов
переносимых как комарами (вирус Западного Нила [25, 26, 58, 59], вирус японского
энцефалита [13, 38] и вирус Ламми [55]), так и клещами (вирус клещевого энцефалита
(ВКЭ) [212], вирус омской геморрагической лихорадки (ОГЛ) [82, 214], вирус Повассан
[35, 36, 37, 174], вирус шотландского энцефаломиелита овец (ШЭО) [173]).
Наиболее значимые процессы эволюции арбовирусов можно ожидать на границах
ареала и в зонах совместного обитания клещей разных родов и видов, где высока
вероятность возникновения новых вариантов вируса в связи со сменой переносчиков и
основных прокормителей. В связи с глобальным потеплением изменяется ареал
переносчиков, что позволяет вирусам появляться на территориях, где их никогда не
детектировали и не регистрировали вызываемую ими заболеваемость [86, 148, 221].
ВКЭ детектируют в более 20 видах клещей, но основными переносчиками
считаются клещи Ixodes persulcatus и Ixodes ricinus, чей ареал в последнее время
существенно расширяется. Так клещи I. persulcatus были найдены около Полярного
круга [158], а клещи I. ricinus – за Полярным кругом [221]. Вместе с расширением
ареала основных векторов произошло и расширение ареала ВКЭ. Вирус был обнаружен
в Скандинавских странах [86, 221], где его до недавнего времени не детектировали.
Определение южной границы ВКЭ осложняется тем, что в степных районах основными
обитателями являются клещи рода Dermacentor, способность которых в
самостоятельном поддержании очагов клещевого энцефалита (КЭ) не до конца изучена.
В тоже время на распространение флавивирусов могут оказывать влияние и другие
вирусы или микроорганизмы, циркулирующие в клещах. В Китае были выделены
флавиподобные вирусы, которые отличаются от классических флавивирусов
принципиально другим строением генома и представляют обособленную группу в
семействе Flaviviridae [205]. Имеются данные о возможной патогенности этих вирусов
для человека [151, 205]. Информация о распространении этих вирусов на территории
России к началу данной работы полностью отсутствовала.

Заказать новую

Лучшие эксперты сервиса ждут твоего задания

от 5 000 ₽

Не подошла эта работа?

Закажи новую работу, сделанную по твоим требованиям

Читать

Публикации автора в научных журналах

Оценка зараженности клещей вирусом клещевого энцефалита с использованием различных методов исследования. Неоднозначность трактовки результатов

И.С. Холодилов, О.А. Белова, О.В. Мотузова, А.П. Гмыль, Л.Ю.Романова, В.А. Бойко, Р.А. Крючков, О.Е. Орлова, Н.Д. Пакскина, А.Ф. Шамсутдинов, Г.Г. Карганова // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. – 2– Т. – No – С. 29-РИНЦ (ВАК)Ružek, D. Tick-borne encephalitis in Europe and Russia: Review of pathogenesis, clinical features, therapy, and vaccines / D. Ružek, T.A. Županc, J. Borde, A. Chrdle, L. Eyer, G.Karganova, I. Kholodilov, N. Knap, L. Kozlovskaya, A. Matveev, A.D. Miller,25D.I. Osolodkin, A.K. Överby, N. Tikunova, S. Tkachev, J. Zajkowska // Antiviral Research. –2– Vol. – P. 23-DOI: 1016/j.antiviral.2014, IF 5,9 WoS.

✍️ Журнал

ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКА

Isolation and characterisation of Alongshan virus in Russia

I.S.Kholodilov, A.G.Litov, A.S.Klimentov, O.A.Belova, A.E.Polienko, N.A.Nikitin, A.M. Shchetinin, A.Y. Ivannikova, L. Bell-Sakyi, A.S. Yakovlev, S.V. Bugmyrin, L.A. Bespyatova, L.V. Gmyl, S.V. Luchinina, A.P. Gmyl, V.A. Gushchin, G.G. Karganova // Viruses. – 2– Vol. – No – P. DOI: 3390/v12040362, IF 5,0 WoS.

Baltic group tick-borne encephalitis virus phylogeography: Systemic inconsistency pattern between genetic and geographic distances

A.A.Deviatkin, I.S. Kholodilov, O.A. Belova, S.V. Bugmyrin, L.A. Bespyatova, A.Y. Ivannikova, Y.A. Vakulenko, A.N. Lukashev, G.G. Karganova // Microorganisms. – 2– Vol. – No – P. 1DOI: 3390/microorganisms8101589, IF 4,1 WoS.Rubel, F. Vectors of disease at the northern distribution limit of the genus Dermacentor in Eurasia: D. reticulatus and D. silvarum / F. Rubel, K. Brugger, O.A. Belova, I.S. Kholodilov, Y.M. Didyk, L. Kurzrock, A.L. García ‐OP.éKreazh, l // Experimental and Applied Acarology. – 2– Vol. – No – P. 95-DOI: 1007/s10493-020-00533-y, IF 2,19 WoS

Geographical and tick-dependent distribution of flavi-like Alongshan and Yanggou tick viruses in Russia

I.S. Kholodilov, O.A Belova., E.S. Morozkin, A.G. Litov, A.Y. Ivannikova, M.T. Makenov, A.M. Shchetinin, S.V. Aibulatov, G.K. Bazarova, L. Bell- Sakyi, L.A. Bespyatova, S.V. Bugmyrin, N. Chernetsov, L.L. Chernokhaeva, L.V Gmyl., A.N. Khaisarova, A.V. Khalin, A.S. Klimentov, I.V. Kovalchuk, S.V. Luchinina, S.G. Medvedev, A.A. Nafeev, N.D. Oorzhak, E.V. Panjukova, A.E. Polienko, K.A. Purmak, E.N. Romanenko, E.N. Rozhdestvenskiy, A.A. Saryglar, A.F. Shamsutdinov, N.I. Solomashchenko, V.A. Trifonov, E.G. Volchev, P.G. Vovkotech, A.S. Yakovlev, O.B Zhurenkova, V.A. Gushchin, L.S. Karan, G.G. Karganova // Viruses. – 2– Vol. – No – P. DOI: 3390/v13030458, IF 5,0 WoS.

Помогаем с подготовкой сопроводительных документов

Совместно разработаем индивидуальный план и выберем тему работы Подробнее

Помощь в подготовке к кандидатскому экзамену и допуске к нему Подробнее

Поможем в написании научных статей для публикации в журналах ВАК Подробнее

Структурируем работу и напишем автореферат Подробнее

Хочешь уникальную работу?

Больше 3 000 экспертов уже готовы начать работу над твоим проектом!

Помогаю студентам с решением задач по ТОЭ и физике на протяжении 9 лет. Пишу диссертацию на соискание степени кандидата технических наук, имею опыт годовой стажировки ... Читать все

Помогаю студентам с решением задач по ТОЭ и физике на протяжении 9 лет. Пишу диссертацию на соискание степени кандидата технических наук, имею опыт годовой стажировки в одном из крупнейших университетов Германии.

#Кандидатские #Магистерские

9 Выполненных работ

Мне нравится изучать все новое, постоянно развиваюсь. Могу написать и диссертацию и кандидатскую. Есть опыт в различных сфера деятельности (туризм, экономика, бухучет... Читать все

Мне нравится изучать все новое, постоянно развиваюсь. Могу написать и диссертацию и кандидатскую. Есть опыт в различных сфера деятельности (туризм, экономика, бухучет, реклама, журналистика, педагогика, право)

#Кандидатские #Магистерские

39 Выполненных работ

Кандидат технических наук. Специализируюсь на выполнении работ по метрологии и стандартизации

#Кандидатские #Магистерские

836 Выполненных работ

Работаю на сайте четвертый год. Действующий преподаватель вуза. Основные направления: микробиология, биология и медицина. Написано несколько кандидатских, магистерских... Читать все

#Кандидатские #Магистерские

566 Выполненных работ

Практикую гражданское, семейное право. Преподаю указанные дисциплины в ВУЗе. Выполняла работы на заказ в течение двух лет. Обучалась в аспирантуре, подготовила диссерт... Читать все

Практикую гражданское, семейное право. Преподаю указанные дисциплины в ВУЗе. Выполняла работы на заказ в течение двух лет. Обучалась в аспирантуре, подготовила диссертационное исследование, которое сейчас находится на рассмотрении в совете.

#Кандидатские #Магистерские

18 Выполненных работ

Практически всегда онлайн, доработки делаю бесплатно. Дипломные работы и Магистерские диссертации сопровождаю до защиты.

#Кандидатские #Магистерские

1077 Выполненных работ

Читаю лекции и веду занятия со студентами по матанализу, линейной алгебре и теории вероятностей. Защитил кандидатскую диссертацию по качественной теории дифференциальн... Читать все

Читаю лекции и веду занятия со студентами по матанализу, линейной алгебре и теории вероятностей. Защитил кандидатскую диссертацию по качественной теории дифференциальных уравнений. Умею быстро и четко выполнять сложные вычислительные работ

#Кандидатские #Магистерские

117 Выполненных работ

Специализация: диссертации; дипломные и курсовые работы; научные статьи.

#Кандидатские #Магистерские

335 Выполненных работ

Высшее юридическое образование, красный диплом. Более 5 лет стажа работы в суде общей юрисдикции, большой стаж в написании студенческих работ. Специализируюсь на напис... Читать все

Высшее юридическое образование, красный диплом. Более 5 лет стажа работы в суде общей юрисдикции, большой стаж в написании студенческих работ. Специализируюсь на написании курсовых и дипломных работ, а также диссертационных исследований.

#Кандидатские #Магистерские

158 Выполненных работ