Получение, анализ свойств и иммунологической роли субпопуляции NK-клеток, экспрессирующих HLA-DR
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Краткая характеристика NK-клеток
1.1.1. Рецепторы натуральных киллеров
1.1.2. Субпопуляции NK-клеток
1.1.3. Адаптивные NK-клетки, экспрессирующие NKG2C
1.1.4. Энергетический метаболизм NK-клеток
1.1.5. Влияние цитокинов на функциональную активность
NK-клеток…………………………………………………………………………………………33
1.2. HLA-DR-позитивные NK-клетки
1.2.1. HLA-DR-позитивные NK-клетки в норме
1.2.2. HLA-DR-позитивные NK-клетки при патологии
1.2.2.1. HLA-DR-позитивные NK-клетки при инфицировании HIV
1.2.2.2. HLA-DR-позитивные NK-клетки при других вирусных
инфекциях…………………………………………………………………..43
1.2.2.3. HLA-DR-позитивные NK-клетки при туберкулезе
1.2.2.4. HLA-DR-позитивные NK-клетки при аутоиммунных
заболеваниях………………………………………………………………..45
1.2.2.5. HLA-DR-позитивные NK-клетки при раке
1.2.3. Индукция экспрессии HLA-DR на NK-клетках
1.2.4. Регуляция экспрессии HLA-DR на транскрипционном уровне
1.2.5. Функциональная значимость HLA-DR-экспрессирующей
субпопуляции NK-клеток
1.3. Роль NK клеток в защите от туберкулеза
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Клеточные линии
2.2. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови
2.3. Выделение NK-клеток человека методом магнитной сепарации
2.4. Получение CD4+ Т-клеток человека
2.5. Получение дендритных клеток человека
2.6. Проточная цитометрия
2.7. Внутриклеточное окрашивание IFNγ и TNFα
2.8. Анализ пролиферативной активности
2.9. Сортировка субпопуляций NK-клеток
2.10. Получение клонов NK-клеток
2.11. Активация NK-клеток IL-2 и мембраносвязанным/растворимым
IL-21……………………………………………………………………………72
2.12. Культивирование NK-клеток с блокатором IL-21 – растворимой
формой рекомбинантного IL-21R
2.13. Культивирование NK-клеток c блокатором IFNγR – специфичным
антителом к IFNγR1
2.14. Культивирование NK-клеток с ингибиторами транскрипционных
факторов семейства STAT и ERK1/2
2.15. Активация NK-клеток IL-2 и/или соникатом M. tuberculosis
2.16. Стимуляция NK-клеток для функциональных тестов
2.17. Анализ цитотоксической активности
2.17.1. Оценка цитотоксической активности клеток-эффекторов по их
дегрануляции
2.17.2. Оценка цитотоксической активности по уровню активации
каспазы-6 в клетках-мишенях.
2.18. Иммуноферментный анализ
2.19. Определение содержания АТФ в NK-клетках
2.20. Выделение тотальной мРНК
2.21. Обратная транскрипция
2.22. Полимеразная цепная реакция
2.23. Электрофорез ДНК в агарозном геле
2.24. РНК-секвенирование
2.25. Ко-культивация CD4+ Т-клеток с NK-клетками и дендритными
клетками..………………………………………………………………………87
2.26. Статистический анализ
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Экспрессия HLA-DR in vivo на NK-клетках различной степени
дифференцировки
3.2. Экспрессия HLA-DR на NK-клетках NKG2C+
3.3. Сравнительное РНК-секвенирование HLA-DR-позитивных и
негативных NK-клеток
3.4. Анализ функциональных свойств свежевыделенных HLA-DR-
экспрессирующих NK-клеток
3.5. Экспансия HLA-DR-экспрессирующих NK-клеток in vitro
3.6. Сравнение воздействия растворимой и мембраносвязанной форм IL-
21 на экспрессию HLA-DR NK-клетками
3.7. Выявление оптимальных условий для получения HLA-DR-
позитивных NK-клеток in vitro
3.8. Стимуляция IL-2 и/или mbIL-21 индуцирует как экспрессию
HLA-DR в HLA-DR-негативных NK-клетках, так и активную
пролиферацию HLA-DR-позитивной субпопуляции NK-клеток
3.8.1. NK-клетки экспрессируют HLA-DR de novo в процессе
активации
3.8.2. HLA-DR-позитивные NK-клетки интенсивнее пролиферируют в
ответ на стимуляцию
3.9. Анализ механизма индукции экспрессии HLA-DR в NK-клетках
3.9.1. Экспрессию HLA-DR в NK-клетках индуцирует как IL-21, так и
эндогенный IFN
3.9.2. STAT3- и ERK1/2-опосредованные внутриклеточные пути
передачи сигнала участвуют в запуске экспрессии HLA-DR в
NK-клетках
3.9.3. Экспрессию HLA-DR в NK-клетках регулирует изоформа 3
транскрипционного фактора CIITA
3.10. Анализ экспрессии поверхностных маркеров на HLA-DR-
позитивных NK-клетках, полученных в культуре
3.11. Функциональная активность HLA-DR-экспрессирующих NK-
клеток, полученных in vitro
3.12. Энергетический метаболизм HLA-DR-экспрессирующих NK-
клеток, свежевыделенных и полученных in vitro
3.13. HLA-DR-экспрессирующие NK-клетки в иммунном ответе против
M. tuberculosis
3.13.1. HLA-DR-позитивные NK-клетки в крови пациентов, больных
туберкулезом
3.13.2. HLA-DR+ NK-клетки интенсивнее продуцируют IFNγ в ответ
на М. tuberculosis
3.13.3. Субпопуляция менее зрелых, NCR-экспрессирующих
+
HLA-DR NK-клеток пролиферирует в ответ на М. tuberculosis
3.13.4. HLA-DR+ NK-клетки способны осуществлять презентацию
микобактериальных антигенов CD4+ Т-клеткам in vitro
Глава 4. Заключение
Список литературы
8
Литературный обзор
Обзор литературы представлен в первой главе диссертации и включает в
себя три раздела. Первый раздел посвящен описанию фенотипических и
функциональных особенностей NK-клеток. Во втором разделе представлена
имеющаяся информация по HLA-DR-экспрессирующим NK-клеткам в норме и
при патологии. Третий раздел посвящен роли NK-клеток в иммунном ответе на
микобактерию туберкулеза, и возможности участия HLA-DR-позитивной
субпопуляции в этом процессе.
2 Экспериментальная часть
2.1 Экспрессия HLA-DR in vivo на NK-клетках различной степени
дифференцировки
На первом этапе была проанализирована взаимосвязь между уровнем
поверхностной экспрессии HLA-DR в NK-клетках периферической крови и
стадиями дифференцировки NK-клеток, которые были определены в
соответствии с экспрессией маркеров CD56 и CD57 (рис. 1А): CD56bright,
CD56dimCD57–, CD56dimCD57+.
Доля HLA-DR-позитивных клеток была значительно выше среди NK-
клеток CD56bright, чем CD56dim, у всех обследованных добровольцев (рис. 1Б).
Однако у части доноров наблюдалась увеличенная доля HLA-DR-позитивных
NK-клеток также в субпопуляциях CD56dimCD57+ и CD56dimCD57– (группа 2),
по сравнению с другими донорами (группа 1, рис. 1Б). У доноров из группы 2 в
целом наблюдался повышенный уровень общего количества HLA-DR-
позитивных NK-клеток в периферической крови (рис. 1В), и большую часть
этих клеток составляли NK-клетки из субпопуляции CD56dimCD57+ (рис. 1Г).
Повышенная экспрессия HLA-DR на менее зрелых NK-клетках CD56bright может
быть связана с прохождением определенного этапа дифференцировки, либо
являться результатом взаимодействия с микроокружением в тканях перед тем,
как клетки CD56bright попадают в кровоток. Для более зрелых NK-клеток
CD56dim появление экспрессии HLA-DR может входить в комплекс реакций при
распознавании измененных клеток, в том числе зараженных HCMV.
Рис. 1. Анализ экспрессии
HLA-DRвсвеже-
выделенных NK-клетках.
(А) Субпопуляции NK-
клеток на разных стадиях
дифференцировки,выб-
ранныедляанализа
экспрессии HLA-DR. (Б, В)
Доля HLA-DR+ NK-клеток
в субпопуляциях CD56bright,
CD56dimCD57–и
CD56dimCD57+ (Б) и в
цельной популяции NK-
клеток (В) у доноров из
групп 1 и 2. (Г) Доли NK-
клеток на разных стадиях
дифференцировкиво
фракцииHLA-DR+
у
доноров из групп 1 и 2.
2.2 Экспрессия HLA-DR на NK-клетках NKG2C+
Была проанализирована доля HLA-DR-позитивных клеток и уровень
экспрессии HLA-DR ex vivo в субпопуляциях NK-клеток, экспрессирующих
рецептор NKG2C, на разных стадиях дифференцировки, в частности, в
субпопуляциитерминальнодифференцированныхNK-клеток
CD56 CD57 NKG2C , проявляющих признаки клеток памяти: повышенный
dim++
пролиферативный и функциональный ответ при повторной встрече с
патогеном. Экспансию NKG2C-экспрессирующих NK-клеток связывают с
реакцией организма на инфицирование цитомегаловирусом Установлено, что в
субпопуляциях NK-клеток CD56dimCD57‒NKG2C+ и CD56dimCD57+NKG2C+
процентная доля HLA-DR-позитивных клеток значительно выше, чем в
соответствующих субпопуляциях NKG2C‒ (рис. 2). Кроме того, клетки
CD56dimCD57‒NKG2C+ и CD56dimCD57+NKG2C+ демонстрировали более
высокую интенсивность экспрессии данного маркера, независимо от HCMV-
статуса донора. Можно предположить, что реактивация вируса в организме и
развитие соответствующего иммунного ответа приводит к активации и
экспансии адаптивных NK-клеток и их менее дифференцированных
потенциальных предшественников, ко-экспрессирующих NKG2C и HLA-DR.
Рис. 8. Доля HLA-DR-позитивных клеток и интенсивность экспрессии HLA-DR в
субпопуляциях NK-клеток NKG2C+ и NKG2C‒ на разных стадиях дифференцировки.
2.3Сравнительное РНК-секвенированиеHLA-DR-позитивныхи
негативных NK-клеток
Для анализа сходств и различий между HLA-DR-экспрессирующими
NK-клетками из менее дифференцированной субпопуляции CD56bright и
терминальнодифференцированной«адаптивной»субпопуляции
dim+
CD56 CD57 NKG2C+
было проведено РНК-секвенирование образцов
предварительно отсортированных свежевыделенных NK-клеток HLA-DR‒ и
HLA-DR+ из соответствующих фракций.
В целом, NK-клетки CD56brightHLA-DR+ меньше отличались по
дифференциальной экспрессии генов от клеток CD56brightHLA-DR‒, чем клетки
CD56dimCD57+NKG2C+HLA-DR+ от клеток CD56dimCD57+NKG2C‒HLA-DR‒
(рис. 3). Тем не менее, HLA-DR+ NK-клетки из обеих субпопуляций
демонстрировали ряд сходных признаков: сниженную экспрессию некоторых
генов, связанных с цитотоксичностью, сниженную экспрессию KIR, но
увеличенную экспрессию IFNγ по сравнению с соответствующими клетками
HLA-DR‒. При этом, в NK-клетках CD56brightHLA-DR+ была увеличена
экспрессия ряда генов, указывающих на активную пролиферацию и хоуминг в
очаги воспаления (рис. 3). Судя по паттерну экспрессии генов NK-клеток
CD56dimCD57+NKG2C+HLA-DR+, данные клетки склонны к подвижности и
миграции, в том числе, в ткани и лимфоузлы, а также экспрессируют более
широкий спектр компонентов антиген-презентирующей системы и больше
ингибирующих рецепторов, по сравнению с клетками CD56brightHLA-DR+
(рис. 3). Возможно, именно более дифференцированные HLA-DR-позитивные
NK-клетки способны контактировать с Т-клетками и, вероятно, осуществлять
антиген-презентацию in vivo, и наличие широкого спектра ингибирующих
рецепторов в таком случае защищает их от аутореактивности при близком
контакте. Не исключено, что активно делящиеся и накапливающиеся в очагах
воспаленияNK-клеткиCD56brightHLA-DR+могутвпоследствии
дифференцироваться в клетки CD56 CD57 NKG2C HLA-DR и служить
dim+++
дополнительными активаторами Т-клеточного адаптивного звена.
Рис. 3. Сравнительная дифференциальная экспрессия генов между NK-клетками HLA-DR+ и
HLA-DR‒ из субпопуляций CD56bright и CD56dimCD57+. Черной линией отмечена граница
достоверности различий, выше которой располагаются точки со значением P adj ≤0,05.
2.4 Анализ функциональныхсвойствсвежевыделенныхHLA-DR-
экспрессирующих NK-клеток
Была проведена оценка способности свежевыделенных из крови
здоровых людей HLA-DR-позитивных и негативных NK-клеток продуцировать
IFN в ответ на стимуляцию IL-12 и IL-15, а также проведен анализ их
антитело-зависимой и естественной цитотоксичности после предварительной
стимуляции IL-2. NK-клетки CD56dimHLA-DR+, обогащенные с помощью
клеточной сортировки, демонстрировали более высокий уровень продукции
IFN (рис. 4А, Б), но менее эффективную антитело-зависимую дегрануляцию,
чем NK-клетки CD56dimHLA-DR– (рис. 4В). Естественная цитотоксическая
активность не различалась среди NK-клеток HLA-DR+ и HLA-DR‒ из
субпопуляций CD56bright и CD56dim.
Рис. 4. Функциональная активность предварительно отсортированных NK-клеток
HLA-DR+ и HLA-DR‒ из субпопуляций CD56bright и CD56dim. Продукцию IFNγ измеряли с
помощью внутриклеточного окрашивания (А) и ИФА (Б) после предварительной стимуляции
IL-12+IL-15. (В) Антитело-зависимая цитотоксическая активность субпопуляций
NK-клеток CD56brightHLA-DR–, CD56brightHLA-DR+, CD56dimHLA-DR–, CD56dimHLA-DR+ по
отношению к клеткам C1R после предварительной стимуляции IL-2.
2.5 Экспансия HLA-DR-экспрессирующих NK-клеток in vitro
С целью изучения изменений в экспрессии HLA-DR при длительном
культивировании NK-клеток, что актуально при экспансии и подготовке клеток
с определенными характеристиками для клинического применения, была
проанализирована поверхностная экспрессия HLA-DR на NK-клетках,
стимулированных в течение 6 дней следующими факторами: IL-2, фидерные
клетки K562, экспрессирующие мембраносвязанный IL-21 (K562-mbIL21),
немодифицированные фидерные клетки K562, растворимый IL-21 и различные
комбинации перечисленных стимулов. Было зарегистрировано увеличение доли
HLA-DR-позитивных NK-клеток во всех группах образцов на 3-й и 6-ой день
культивирования, а затем доля HLA-DR+ клеток оставалась примерно на том же
уровне до 9-го дня (рис. 5A, Б). Тем не менее, наиболее значительное
увеличение уровня HLA-DR-позитивных клеток вызывала комбинация IL-2 и
фидерных клеток K562-mbIL21 (рис. 5Б). Увеличение доли NK-клеток
HLA-DR+ в образцах с растворимыми цитокинами IL-2, IL-21 и
немодифицированными фидерными клетками K562 свидетельствует о том, что
появление HLA-DR-экспрессирующих клеток зависит как от взаимодействия с
фидерными клетками, так и от стимуляции IL-21; использование фидерных
клеток с мембраносвязанным IL-21, следовательно, позволяет максимально
усилить стимуляцию.
Рис. 5. Увеличение экспрессии HLA-DR на NK-клетках в условиях стимуляции. (А) Динамика
экспрессии HLA-DR во время инкубации с указанными стимулами. (Б) Сравнение влияния
растворимого и мембраносвязанного IL-21 на экспрессию HLA-DR в NK-клетках.
Представлена доля NK-клеток HLA-DR+ на 6-ой день инкубации с указанными стимулами.
2.6 Стимуляция IL-2 и/или mbIL-21 индуцирует как экспрессию HLA-DR в
HLA-DR-негативных NK-клетках, так и активную пролиферацию HLA-
DR-позитивной субпопуляции NK-клеток
С помощью полуколичественной ОТ-ПЦР гена α-субъединицы HLA-DR
до и после стимуляции IL-2 либо IL-2+K562-mbIL21, а также путем
культивирования предварительно отсортированной субпопуляции NK-клеток
HLA-DR– in vitro в течение 6 дней с различными стимулами (рис. 6А) было
зарегистрировано появление экспрессии HLA-DR на изначально негативных
NK-клетках и ее увеличение в процессе культивирования в условиях
стимуляции (рис. 6А, Б). Наблюдаемый эффект был подтвержден на
клональных популяциях NK-клеток (рис. 6В), полученных как из общей
культуры NK-клеток, так и из отсортированной субпопуляции CD56+HLA-DR‒.
В другой серии экспериментов было показано, что при всех
использованных способах стимуляции интенсивность пролиферации клеток
HLA-DR+ была либо достоверно выше, чем у клеток HLA-DR‒, либо, по
крайней мере, наблюдалась такая тенденция (рис. 6Г). Таким образом,
экспрессия HLA-DR тесно связана с пролиферацией NK-клеток, и особенно
интенсивная экспансия наблюдается в ответ на стимуляцию фидерными
клетками K562-mbIL21.
Рис. 6. Стимуляция NK-клеток IL-2 и/или K562-mbIL21 индуцирует экспрессию HLA-DR на
HLA-DR-негативных клетках. (А) Экспрессия HLA-DR в субпопуляциях NK-клеток HLA-DR+
и HLA-DR‒ после 6 дней инкубации с указанными стимулами. (Б) Уровень мРНК α-
субъединицы HLA-DR в NK-клетках, свежевыделенных и через 6 дней инкубации с
указанными стимулами (верхний ряд), а также в свежевыделенных субпопуляциях HLA-DR+
и HLA-DR‒ непосредственно после сортировки (нижний ряд). (В) Изменения экспрессии
HLA-DR в клонах, полученных из несортированных NK-клеток и отсортированной
субпопуляции HLA-DR‒ NK-клеток). (Г) Пролиферация NK-клеток при различных методах
стимуляции, измеренная по потере окрашивания CFSE после 7 дней инкубации с указанными
стимулами.
2.7 Анализ механизма индукции экспрессии HLA-DR в NK-клетках
Было выявлено, что при стимуляции NK-клеток IL-2 и растворимым
IL-21 в течение 6 дней в присутствии растворимой формы рекомбинантного
человеческого рецептора к IL-21 (rhIL-21R) блокируется IL-21-обусловленный
эффект повышения экспрессии HLA-DR, и процентная доля HLA-DR-
экспрессирующих клеток достигает уровня образца с IL-2 (рис. 6A). В
присутствии антител к рецептору IFNγ первого типа (anti-IFNγR1) также было
зарегистрировано достоверное снижение доли HLA-DR-экспрессирующих
NK-клеток и интенсивности экспрессии данной молекулы по сравнению с
образцами без блокатора (рис. 7A). Данный эффект указывает на то, что, по
крайней мере частично, индукция экспрессии HLA-DR в NK-клетках,
активированных IL-2 и IL-21, происходит за счет IL-21-зависимого запуска
синтеза IFNγ, который, в свою очередь, связывается с собственными
рецепторами IFNγ на поверхности NK-клеток (аутостимуляция) и запускает
повышение экспрессии HLA-DR.
Для анализа внутриклеточных сигнальных путей, участвующих в
индукции экспрессии HLA-DR, нами были выбраны селективные ингибиторы
транскрипционных факторов STAT1, STAT3 и ERK1/2 – флударабина фосфат,
криптотаншинон и FR180204, соответственно, которые добавлялись к
NK-клеткам при стимуляции IL-2 и растворимым IL-21 в течение 6 дней. Было
выявлено, что блокировка сигнального пути JAK1/3-STAT1, активирующегося
в том числе при взаимодействии IFNγ-IFNγR, не влияет на экспрессию HLA-DR
в NK-клетках (рис. 7Б). Возможно, при его блокировке активно задействуются
компенсаторные пути, например, Ras/Raf/Mek/ERK1/2. Добавление в систему
FR180204, блокатора ERK1/2, показало, что активация сигнального пути
Ras/Raf/Mek/ERK1/2, являющегося общим для IFNγR и IL-21R, необходима для
индукции экспрессии HLA-DR (рис. 7Б). Блокировка сигнального пути JAK1/3-
STAT3, который является основным при передачи сигнала от IL-21R, также
влияла на экспрессию HLA-DR, по крайней мере частично (рис. 7Б). Таким
образом, на внутриклеточном уровне запуск экспрессии HLA-DR в NK-клетках
при стимуляции IL-2+IL-21 опосредуется транскрипционными факторами
ERK1/2 и STAT3, которые, по всей видимости, запускают экспрессию или
регулируют активность основного транскрипционного фактора MHC класса II –
CIITA.
Рис. 7. Анализ механизма индукции экспрессии HLA-DR в NK-клетках. Влияние (А)
блокаторов rhIL-21R, anti-IFNγR1 и (Б) ингибиторов транскрипционных факторов STAT1,
ERK1/2 и STAT3 в указанных концентрациях на процентное содержание HLA-DR-
позитивных NK-клеток в культуре при стимуляции IL-2±IL-21. Представлены усредненные
данные пяти экспериментов, нормализованные на значения в контрольных образцах только
с IL-2. (В) Результат ОТ-ПЦР анализа, демонстрирующий экспрессию в NK-клетках
изоформы 3 белка CIITA. -акт – -актин (положительный контроль).
Подбор праймеров к месту контакта экзонов 1 и 2 изоформ I, III и IV гена
CIITA и последующее проведение ОТ-ПЦР анализа позволило определить, что
в NK-клетках экспрессируется изоформа III регулятора CIITA (рис. 7В) – та же
изоформа, что и в T-клетках при активации, что, по-видимому, является
следствием их происхождения из общих клеток-предшественников.
2.8 Анализ фенотипа, метаболической и функциональной активности
HLA-DR-позитивных NK-клеток, полученных в культуре in vitro
Был проведен сравнительный анализ экспрессии ряда фенотипических
маркеров на NK-клетках HLA-DR+ и HLA-DR– через 3 или 6 дней
культивирования со следующими комбинациями стимулов: IL-2+K562-mbIL21,
IL-2+K562 или IL-2+IL-21. Среди NK-клеток HLA-DR+ была зарегистрирована
более высокая доля CD107a-позитивных клеток и более высокий уровень
экспрессии рецептора NKG2D по сравнению с NK-клетками HLA-DR‒ во всех
образцах, которые содержали фидерные клетки (рис. 8А). CD107a является
маркером дегрануляции NK-клеток, а рецептор NKG2D участвует в активации
естественного цитотоксичского ответа; таким образом, HLA-DR-позитивные
NK-клетки, полученные при стимуляции IL-2+K562-mbIL21 или IL-2+K562,
проявляли интенсивную естественную цитотоксичность в отношении обоих
типов фидерных клеток в процессе культивирования. Помимо этого, среди
Рис. 8. Анализ фенотипа, метаболической и функциональной активности HLA-DR-
позитивных NK-клеток, полученных in vitro. (А) Процент NK-клеток, экспрессирующих
CD107a, CD86 и интенсивность экспрессии NKG2D, измеренные после 3- или 6-дневной
стимуляции IL-2+K562-mbIL-21, IL-2+K562 или IL-2+IL-21 в субпопуляциях HLA-DR+ и
HLA-DR–. (Б) Продукция IFNγ, измеренная методом внутриклеточного окрашивания и ИФА,
в HLA-DR-позитивных и HLA-DR-негативных NK-клетках, полученных после 4 дней
стимуляции IL-2 и K562-mbIL21 in vitro и ре-стимулированных указанными стимулами.
(В) Корреляционная зависимость между экспрессией HLA-DR и продукцией IFNγ в клонах
NK-клеток, полученных при стимуляции IL-2+K562-mbIL21.
HLA-DR-позитивных NK-клеток была значительно повышена доля клеток
CD86+ при всех используемых вариантах стимуляции (рис. 8А), что
свидетельствуют о приобретении HLA-DR+ NK-клетками, полученными при
стимуляции in vitro, дополнительных ко-стимулирующих молекул,
необходимых для потенциальной реализации антигенпрезентации.
Функциональные тесты показали, что HLA-DR-позитивные NK-клетки,
полученные после 4-х дней стимуляции IL-2 и фидерными клетками
K562-mbIL21, лучше продуцируют IFNγ, чем HLA-DR-негативные, у всех
обследованных доноров (рис. 8Б). При анализе IFNγ-продуцирующей
активности клонов NK-клеток, полученных в условиях стимуляции IL-2 и
фидерными клетками K562-mbIL21, было выявлено, что все клональные
популяции NK-клеток продуцировали данный цитокин. При этом, количество
синтезированного клоном IFNγ находилось в прямой корреляционной
зависимости от уровня экспрессии HLA-DR на клетках данного клона (рис. 8Б).
Рис. 9. Сравнение метаболической активности HLA-DR+ и HLA-DR– NK-клеток. (А)
Объем митохондриальной массы и (Б) содержание АТФ в HLA-DR+ и HLA-DR–
субпопуляциях непосредственно после выделения и через 6 дней культивирования с
указанными стимулами.
При анализе метаболических характеристик было выявлено, что объем
митохондриальной массы у HLA-DR-позитивных NK-клеток был выше, чем у
HLA-DR-негативных, как ex vivo, так и после стимуляции NK-клеток IL-2 и
фидерными клетками K562-mbIL21 в течение 6 дней (рис. 9А). Продукция АТФ
в NK-клетках HLA-DR+ также была достоверно выше, чем в клетках HLA-DR‒
как непосредственно после выделения, так и после 6 дней культивирования с
IL-2+IL-21 (рис. 9Б). Кроме того, продукция АТФ в обеих субпопуляциях
увеличивалась на 6-й день активации по сравнению с продукцией ex vivo.
Полученные данные свидетельствуют об увеличенной метаболической
активности HLA-DR-позитивной субпопуляции NK-клеток.
2.9 HLA-DR-позитивныеNK-клеткивкровипациентов,больных
туберкулезом
Выявлено, что доля HLA-DR-экспрессирующих клеток среди всех
NK-клеток (CD56+CD3‒, рис. 10А), а также NKT-подобных клеток (CD56+CD3+,
рис. 10Б) в среднем у больных туберкулезом достоверно выше, чем у здоровых
доноров. У больных туберкулезом также наблюдалось пониженное содержание
HLA-DR+ клеток во фракции CD3‒CD56‒ (у здоровых доноров данную фракцию
в основном представляют В-клетки) (рис. 10В) и сниженная доля T-клеток
CD3+CD56‒ (рис. 10Г), что в целом указывает на угнетенное состояние
адаптивной иммунной системы. Можно предположить, что в данных условиях
HLA-DR-позитивные NK-клетки будут играть важную роль при развитии
иммунного ответа против M. tuberculosis, в том числе, возможно, компенсируя
недостатки адаптивного звена.
Рис. 10. Анализ доли HLA-
DR+ клеток в популяциях
NK-клеток(А),NKT-
подобных клеток (Б) и во
фракцииCD3‒CD56‒
клеток (В) и сравнение
доли CD3+CD56‒ Т-клеток
(Г) в крови здоровых
доноров и пациентов с
первично
диагностированным
тубер-кулезом.
2.10 HLA-DR+ NK-клетки интенсивнее продуцируют IFNγ в ответ на М.
tuberculosis
Как у здоровых, так и у больных туберкулезом доноров, в культуре
PBMC HLA-DR-позитивные NK-клетки демонстрировали более интенсивную
продукцию IFNγ в ответ на 24-часовую стимуляцию разрушенными
ультразвуком клетками M. tuberculosis (соникатом), по сравнению с HLA-DR-
негативными NK-клетками (рис. 11А). В то же время, в культуре
изолированных NK-клеток наблюдалось ингибирование продукции IFNγ после
24 ч инкубации с IL-2 и микобактериальными антигенами, как в HLA-DR+, так
и в HLA-DR‒ субпопуляциях, в широком диапазоне концентраций сониката – от
0,25 до 10 мкг/мл. По-видимому, в отсутствие клеточного микроокружения
(РВМС) функционирование и жизнедеятельность как HLA-DR+, так и HLA-DR‒
NK-клеток существенно подавляется продуктами разрушенных микобактерий.
После предварительной активации IL-2+IL-21 в течение 7 дней HLA-DR-
экспрессирующие NK-клетки сохраняли высокий уровень продукции IFNγ даже
в присутствие сониката, и в субпопуляции HLA-DR+ вновь было
зарегистрировано значительно больше IFNγ-продуцирующих клеток, чем в
субпопуляции HLA-DR– (рис. 11Б). После длительного контакта с
разрушенными микобактериями (стимуляция IL-2 и соникатом в течение 7
дней) и последующей ре-стимуляции цитокинами было выявлено, что, во-
первых, HLA-DR-позитивные NK-клетки после культивирования с соникатом
интенсивнее отвечают на ре-стимуляцию путем продукции интерферона, чем
клетки, культивированные без сониката; во-вторых, среди HLA-DR+ NK-клеток
было больше IFNγ-продуцирующих, чем среди клеток HLA-DR‒ как в
экспериментальном, так и в контрольном образце (рис. 11В).
Рис. 11. Функциональный ответ NK-клеток на стимуляцию соникатом M.
tuberculosis. (А) Продукция IFNγ NK-клетками HLA-DR+ и HLA-DR– в культуре РВМС
пациентов с туберкулезом и здоровых доноров в ответ на 24-часовую стимуляцию
соникатом. (Б) Продукция IFNγ NK-клетками HLA-DR+ и HLA-DR– после 6 дней инкубации с
IL-2+IL-21 и ре-стимуляции IL-12+IL-15 и соникатом. (В) Продукция IFNγ NK-клетками
HLA-DR+ и HLA-DR– после 6 дней инкубации с IL-2±соникат и ре-стимуляции IL-12+IL-15 в
течение 20 ч.
Согласно полученным данным, как выделенные ex vivo, так и полученные
in vitro HLA-DR-экспрессирующие NK-клетки представляют собой
субпопуляцию, которая активно реагирует на распознавание M. tuberculosis
продукцией IFNγ. Однако, ввиду ингибирующего воздействия сониката
микобактерий (предположительно, за счет высвобождающихся при разрушении
клеток факторов вирулентности), для проявления своих функций HLA-DR+ NK-
клеткам был необходим либо контакт с микроокружением (РВМС), либо
предварительная активация цитокинами, либо ре-стимуляция после первичного
контакта с разрушенными бактериями.
2.11 Субпопуляция менее зрелых, NCR-экспрессирующих HLA-DR+ NK-
клеток пролиферирует в ответ на М. tuberculosis
Рис. 12. Фенотипические изменения при культивировании NK-клеток с соникатом
M. tuberculosis. (А) Изменение процентного содержания HLA-DR-позитивных NK-клеток
через 3 и 6 дней инкубации с IL-2 и соникатом в указанных концентрациях. (Б) Анализ
пролиферативной активности NK-клеток HLA-DR+ и HLА-DR– при стимуляции IL-2 и
соникатом. (В) Экспрессия указанных поверхностных маркеров на NK-клетках HLA-DR+ и
HLA-DR– после 6 дней стимуляции IL-2 и соникатом.
Было зарегистрировано увеличение доли HLA-DR-позитивных NK-
клеток после 7 дней культивирования с IL-2 и соникатом M. tuberculosis, по
сравнению с образцом только с IL-2, в соответствии с увеличением
концентрации сониката от 0,25 до 2 мкг/мл (рис. 12А). Анализ снижения
флуоресценции ядерного красителя CFSE показал, что в ответ на соникат
интенсивнее пролиферировали именно клетки HLA-DR+ (рис. 12Б). При этом, в
субпопуляции HLA-DR-позитивных NK-клеток после 7 дней стимуляции
соникатом M. tuberculosis была зарегистрирована более высокая, чем в
субпопуляции HLA-DR–, доля клеток NKp44+, NKG2A+ и интенсивность
экспрессии рецепторов NKp46, NKp30, но сниженная доля клеток CD57 + и KIR+
(рис. 12В). Изменения в доле NKp44+ и NKG2A+ клеток были сходны с
изменениями в образцах только с IL-2 и, таким образом, характерны для
активированных NK-клеток в целом. Таким образом, большинство ответивших
на соникат HLA-DR+ NK-клеток демонстрировали фенотип относительно менее
зрелых (NKG2А+CD57‒KIR‒), но при этом экспрессировали на поверхности
больше активирующих рецепторов NKp46, NKp30.
2.12 HLA-DR+ NK-клетки способны индуцировать активацию CD4+ Т-
клеток в ответ на микобактериальные антигены in vitro
NK-клетки, предварительно активированные in vitro в течение 10 дней в
присутствие IL-2, IL-21 и IL-18 для повышения экспрессии HLA-DR,
инкубировали 24 ч с соникатом M. tuberculosis и затем культивировали
совместно с аллогенными CD4+ Т-клетками. В качестве контрольных образцов
к Т-клеткам добавляли пред-инкубированные с соникатом аллогенные
дендритные клетки (DC) и NK-клетки, не контактировавшие с микобактериями
(NK); также в часть образцов добавляли блокирующее антитело к HLA-DR.
Рис. 13. Продукция IFNγ и TNFα Т-клетками, измеренная после 20 ч инкубации с
антителом против HLA-DR (-HLA-DR), NK-клетками, пред-инкубированными и не пред-
инкубированными с соникатом M. tuberculosis(NK и NKmtb), и дендритными клетками, пред-
инкубированными с соникатом M. tuberculosis (DCmtb) в указанных комбинациях.
Выявлено, что NK-клетки, контактировавшие с разрушенными
микобактериями (NKmtb), но не контрольные NK-клетки индуцировали
статистически значимое увеличение продукции цитокинов в CD4 + Т-клетках
(рис. 13). Однако, наблюдаемый эффект был значительно ниже, чем в образцах
с дендритными клетками. Важно отметить, что после инкубации с NKmtb среди
Т-клеток появлялась субпопуляция TNF+IFNγ+, продуцирующая оба цитокина,
отчетливо регистрируемая также в образцах с DC и характерная для антиген-
зависимого функционального ответа. При этом, как в образцах T+DC, так и в
образцах T+NKmtb добавление блокирующего антитела к HLA-DR приводило к
снижению продукции обоих цитокинов в Т-клетках. Приведенные данные
свидетельствуют о том, что NK-клетки, предварительно проинкубированные с
M. tuberculosis, вступают в HLA-DR-опосредованное взаимодействие с CD4+ Т-
клетками, активируя антиген-зависимый цитокиновый ответ, то есть, вероятно,
реализуют антиген-презентацию.
Полученные в данной работе результаты позволяют заключить, что
HLA-DR-экспрессирующие NK-клетки могут обладать различающимися
характеристиками в зависимости от того, когда возникла экспрессия HLA-DR:
еx vivo, на клетках CD56bright экспрессия HLA-DR может быть частью
программы дифференцировки и ассоциирована с пролиферативной
активностью, тогда как на клетках CD56dim это действительно маркер активных
цитокин-продуцирующих клеток. Показано, что in vitro при различных методах
стимуляции экспрессия HLA-DR на NK-клетках значительно возрастает, и
сопровождается увеличением пролиферативной активности, продукции IFNγ,
дегрануляции и экспрессии ряда активирующих рецепторов и ко-
стимуляторных молекул. За счет этих свойств, а также поскольку HLA-DR-
позитивные NK-клетки можно эффективно нарастить in vitro с помощью
протестированной нами комбинации IL-2 и фидерных клеток K562-mbIL21, у
данной субпопуляции имеется значительный потенциал для использования в
иммунотерапевтических подходах. Выявлено, что индукция экспрессии
HLA-DR в NK-клетках обеспечивается в том числе эндогенным IFNγ,
создающим петлю положительной обратной связи, что, по-видимому,
необходимо для поддержания активированного состояния NK-клеток
длительное время.
Проведенные исследования подтверждают существенную роль HLA-DR+
NK-клеток в иммунном ответе. На примере инфекции M. tuberculosis было
продемонстрировано, что HLA-DR-экспрессирующие NK-клетки могут
являться важным источником IFNγ. Помимо продукции цитокинов, NK-клетки
из данной субпопуляции обладают повышенной экспрессией рецепторов,
которые могут быть необходимы для распознавания непосредственно
микобактерий туберкулеза и зараженных клеток (моноцитов), а также способны
к антиген-зависимой активации CD4+ Т-клеток после предварительной
инкубации с антигенами M. tuberculosis.
ВЫВОДЫ
1. В периферической крови человека встречаются два пула HLA-DR-
позитивныхNK-клеток:менеедифференцированныеклетки
+
HLA-DR CD56 bright
, и более зрелые клетки HLA-DR CD56 CD57 , в том
+dim +
числе адаптивные – экспрессирующие NKG2C. Циркулирующие
NK-клетки HLA-DR+ характеризуются увеличенной продукцией IFNγ, но
сниженной антитело-зависимой цитотоксичностью.
2. Стимуляция IL-2 и фидерными клетками K562-mbIL21 приводит к
увеличению доли HLA-DR-позитивных NK-клеток в культуре до 90%.
3. При стимуляции in vitro увеличение экспрессии HLA-DR на NK-клетках
положительно коррелирует с продукцией IFNγ. Кроме того, приобретение
экспрессии HLA-DR связано с более интенсивной дегрануляцией по
отношению к фидерным клеткам, высокой пролиферативной
активностью, более высокой экспрессией рецепторов NKG2D, CD86 на
NK-клетках.
4. Экспрессия HLA-DR in vitro может запускаться экзогенным IL-21, а также
индуцированным им эндогенным IFNγ, по STAT3- и ERK1/2-зависимому
пути через активацию изоформы 3 транскрипционного фактора CIITA.
5. Доля HLA-DR+ NK-клеток повышена в крови пациентов, больных
туберкулезом, по сравнению со здоровыми добровольцами.
6. В ответ на разрушенные бактерии M. tuberculosis HLA-DR-позитивные
NK-клетки интенсивнее продуцируют IFNγ, чем клетки HLA-DR‒, в
смешанной культуре РВМС ex vivo и в изолированной культуре после
стимуляции. При длительном контакте с антигенами микобактерий
происходит экспансия NKG2A+CD57‒KIR‒HLA-DR+ NK-клеток с
увеличенной экспрессией рецепторов NKp30, NKp46.
7. HLA-DR-позитивные NK-клетки способны запускать активацию CD4+ Т-
клеток после предварительной инкубации с антигенами M. tuberculosis,
однако с меньшей эффективностью, чем профессиональные антиген-
презентирующие клетки.
Натуральные киллеры (natural killer cells, NK-клетки) являются одним из
важнейших компонентов врожденной иммунной системы за счет своей
способности проявлять цитотоксическую активность по отношению к
перерожденным и вирус-инфицированным клеткам, а также
антибактериальную и антимикотическую активность. Кроме того,
натуральные киллеры являются регуляторами как врожденного, так и
адаптивного иммунного ответа за счет гуморальных и контактных
взаимодействий с другими клетками иммунной системы.
Функциональная активность и репертуар поверхностных рецепторов
NK-клеток регулируется множеством факторов. Переход NK-клеток из
состояния покоя в состояние активации может сопровождаться запуском
пролиферации NK-клеток, увеличением их цитотоксического ответа и
продукции цитокинов, повышением экспрессии активирующих рецепторов и
других поверхностных маркеров. Кроме того, независимыми группами
исследователей было отмечено, что при длительном культивировании под
воздействием определенных стимулов увеличивается доля NK-клеток,
экспрессирующих HLA-DR – подтип MHC (molecular histocompatibility
complex, главный комплекс гистосовместимости) класса II (MHC II) [Delso-
Vallejo и др., 2017; Evans и др., 2011; Loyon и др., 2016; Nakayama и др., 2011;
Rabinowich и др., 1994; Senju и др., 2018].
Впервые появление экспрессии HLA-DR на NK-клетках под действием
стимулирующих агентов было зарегистрировано более 30-ти лет назад в
общих лейкоцитарных культурах, и с того времени данная молекула часто
использовалась как маркер для регистрации активированных NK-клеток
[Phillips, Le, Lanier, 1984]. Однако, большинство исследований данного
феномена были исключительно описательными, и лишь в немногих работах
были предприняты попытки оценить функциональную значимость молекулы
HLA-DR для NK-клеток. Основная функция этой молекулы на других клетках
связана со способностью презентировать антиген (у макрофагов, В-клеток,
дендритных клеток). Опубликовано несколько исследований,
демонстрирующих способность NK-клеток, подобно профессиональным
антиген-презентирующим клеткам (АПК), стимулировать специфичный
Т-клеточный ответ на определенные антигены: столбнячный токсин и
аллерген домашнего пылевого клеща Der pI [Roncarolo и др., 1991], частицы
HSV (herpes simplex virus, вирус простого герпеса) и выделенные из них
пептиды [Kim и др., 2012], комплекс частиц HCMV (human cytomegalovirus,
цитомегаловирус человека) с антителом [Costa-García и др., 2019]. Кроме того,
повышение уровня HLA-DR-позитивных NK-клеток в тканях и
периферической крови зарегистрировано при некоторых патологических
состояниях, таких как иммунодефицит на фоне HIV (human immunodeficiency
virus, вирус иммунодефицита человека) [Lichtfuss и др., 2012a; Marras и др.,
2013], инфицирование HCMV [Rölle и др., 2016], рассеянный склероз
[Aranami, Miyake, Yamamura, 2006], системная красная волчанка [Cruz-
Gonzales и др., 2018], что указывает на физиологическую значимость этой
субпопуляции in vivo. Во многих из перечисленных работ данные о высокой
экспрессии HLA-DR сопровождались сообщениями об увеличенной
функциональной активности NK-клеток, однако лишь в единичных случаях
рассматривалась взаимосвязь этих двух фактов. В связи с этим, более
углубленное исследование HLA-DR-экспрессирующих NK-клеток
представляется актуальной задачей. Изучение их фенотипических и
функциональных особенностей, экспрессии HLA-DR на разных стадиях
дифференцировки NK-клеток, сравнение HLA-DR-экспрессирующих NK-
клеток, выделенных из периферической крови ex vivo и полученных после
наращивания в стимулирующих условиях in vitro, выявление механизма
индукции экспрессии данной молекулы в NK-клетках поможет оценить вклад
HLA-DR-позитивных NK-клеток в иммунный ответ. Все вышеперечисленные
аспекты крайне мало описаны либо вовсе отсутствуют в литературе в
настоящее время.
NK-клетки играют важную роль в иммунном ответе против
микобактерий туберкулеза, взаимодействуя с зараженными
моноцитами/макрофагами, дендритными клетками и различными
субпопуляциями Т-клеток [Esin, Batoni, 2015]. При этом, в тканях легких
пациентов с туберкулезом отмечено высокое процентное содержание
HLA-DR-экспрессирующих NK-клеток [Pokkali, Das, Selvaraj, 2009; Schierloh
и др., 2005]. В другой работе показана экспансия данной субпопуляции и
увеличение продукции IFNγ в ответ на стимуляцию BCG (Bacillus Calmette–
Guérin, бацилла Кальметта-Герена) in vitro [Evans и др., 2011]. За счет
увеличенной продукции IFNγ [Loyon и др., 2016; Yano и др., 1996] HLA-DR-
экспрессирующая субпопуляция NK-клеток, накапливающаяся в легких,
может участвовать в локальном ответе на инфекцию. Помимо этого,
способность NK-клеток напрямую взаимодействовать с элементами
клеточных стенок микобактерий [Esin и др., 2013; Marcenaro и др., 2011] ставит
вопрос о возможности распознавания HLA-DR-экспрессирующими
NK-клетками микобактериальных антигенов и их последующей презентации
наивным Т-клеткам.
Цели и задачи
Целью работы являлось изучение механизмов появления,
фенотипических и функциональных особенности HLA-DR-экспрессирующих
NK-клеток человека и их иммунологического ответа на антигены
микобактерий.
В рамках данной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Определить фенотип и функциональную активность HLA-DR-
позитивных NK-клеток человека, выделенных из периферической
крови.
2. Оценить пролиферативную способность, а также изменения
фенотипа, функциональной и метаболической активности HLA-DR-
экспрессирующей субпопуляции при наращивании NK-клеток in vitro
в общей популяции и в виде клональных культур.
3. Исследовать механизм индукции экспрессии HLA-DR на
поверхности NK-клеток в условиях активации in vitro.
4. Провести сравнительный анализ содержания HLA-DR-позитивных
NK-клеток в периферической крови пациентов с диагностированным
туберкулезом и здоровых людей.
5. Изучить влияние микобактериальных антигенов на экспрессию
NK-клетками молекулы HLA-DR, а также на функциональную
активность и фенотип HLA-DR-позитивной субпопуляции in vitro.
6. Изучить возможность антиген-презентации HLA-DR-позитивными
NK-клетками микобактериальных антигенов CD4+ T-клеткам.
Научная новизна работы
В данной работе описано два пула циркулирующих в периферической
крови HLA-DR-позитивных NK-клеток, различающихся по функциональной
активности: менее дифференцированные клетки HLA-DR+CD56bright, и более
зрелые клетки HLA-DR+CD56dimCD57+. Выявлено, что in vitro наибольшее
увеличение доли HLA-DR-позитивных NK-клеток происходит при
использовании разработанной нами схемы стимуляция на основе IL-2 и
фидерных клеток K562-mbIL21. Показана связь между экспрессией HLA-DR
на NK-клетках и продукцией ими IFNγ ex vivo и in vitro, в том числе прямая
корреляционная зависимость между этими двумя параметрами в клональных
культурах NK-клеток. Помимо этого, выявлено, что при экспансии NK-клеток
in vitro экспрессия HLA-DR ассоциирована с более интенсивной
дегрануляцией по отношению к фидерным клеткам, высокой
пролиферативной активностью, более высокой экспрессией рецепторов
NKG2D, CD86. Показано, что in vitro экспрессия HLA-DR может запускаться
не только экзогенным IL-21, но и индуцированным им эндогенным IFNγ.
Индукция экспрессии происходит по STAT3- и ERK1/2-зависимому пути через
активацию изоформы 3 транскрипционного фактора CIITA.
Выявлено, что в крови пациентов, больных туберкулезом, доля HLA-DR+
NK-клеток повышена по сравнению со здоровыми донорами. По результатам
работы in vitro показано, что в ответ на стимуляцию разрушенными
бактериями M. tuberculosis происходит экспансия NKG2A+CD57‒KIR‒
HLA-DR+ NK-клеток. Кроме того, HLA-DR-позитивные NK-клетки
интенсивнее продуцировали IFNγ в ответ на микобактериальные антигены,
чем HLA-DR-негативные, как в смешанной культуре РВМС (peripheral blood
mononuclear cells, мононуклеарные клетки периферической крови) ex vivo, так
и в изолированной культуре NK-клеток после длительной стимуляции.
Наконец, впервые продемонстрировано, что HLA-DR-позитивные NK-клетки
способны запускать специфическую активацию CD4+ Т-клеток после
предварительной инкубации с разрушенными микобактериями, однако с
меньшей эффективностью, чем профессиональные антиген-презентирующие
клетки.
Теоретическая и практическая значимость работы
Теоретическая значимость данной работы заключается в расширении
знаний о мало описанной в литературе, однако часто встречающейся in vivo и
in vitro субпопуляции NK-клеток, экспрессирующих на своей поверхности
молекулу HLA-DR. На протяжении многих лет данная молекула в контексте
изучения NK-клеток использовалась исключительно как маркер их активации,
и единичные работы были посвящены изучению различных биологических
особенностей HLA-DR-позитивной субпопуляции. Полученные данные о
фенотипе, стадиях дифференцировки, функциональной, пролиферативной и
метаболической активности HLA-DR-экспрессирующих NK-клеток человека
дополнят имеющиеся представления об иммунологической роли NK-клеток.
Практическая значимость данной работы связана с возрастающей
заинтересованностью в применении NK-клеток в адоптивной иммунотерапии
[Fang, Xiao, Tian, 2017]. Наиболее перспективные в данной области
методические подходы предполагают использование NK-клеток,
предварительно стимулированных in vitro с целью повысить их
функциональную активность и нарастить в нужных количествах [Ostaijen-ten
Dam van и др., 2016]. Опираясь на уже опубликованные в литературе и
полученные нами данные о появлении экспрессии HLA-DR на NK-клетках при
разнообразных условиях стимуляции [Delso-Vallejo и др., 2017; Loyon и др.,
2016; Rabinowich и др., 1994; Senju и др., 2018], можно утверждать, что
существующие на данный момент способы наращивания NK-клеток будут
приводить к значительному увеличению доли HLA-DR-экспрессирующих
клеток в культуре, наряду с изменениями других фенотипических и
функциональных свойств. Это необходимо учитывать при разработке методов
получения NK-клеточного терапевтического продукта, и понимание спектра
изменений, сопутствующих экспрессии HLA-DR в NK-клетках, может в этом
помочь. Помимо этого, HLA-DR-экспрессирующие NK-клетки сами по себе
могут стать перспективным агентом для использования в иммунотерапии за
счет возможности комбинированного использования киллерной и антиген-
презентирующей активности. В данной работе предлагается эффективный
метод экспансии субпопуляции NK-клеток HLA-DR+ с использованием IL-2 и
фидерной клеточной линии K562-mbIL21.
Апробация результатов
Основные результаты работы были представлены на международных и
российских конференциях: XXVII, XXVIII, XIX, XXX и XXXI Зимняя
молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической
биологии и биотехнологии» (2015, 2016, 2017, 2018, 2019, Москва, Россия);
всероссийский научный форум с международным участием «Дни иммунологи
в Санкт-Петербурге» (2015, 2017, Санкт-Петербург, Россия); международный
конгресс International Congress of Immunology (2016, Мельбурн, Австралия);
международный симпозиум Natural Killer Cell Symposium (2017,
Дюссельдорф, Германия; 2018, Гамбург, Германия); международный конгресс
The 5th European Congress of Immunology (2018, Амстердам, Нидерланды);
международная конференция 18thMeeting of the Society for Natural Immunity
(2019, Люксембург, Люксембург).
По материалам работы опубликовано 8 статей в рецензируемых
журналах и 13 тезисов.
Статьи в рецензируемых журналах:
1. Стрельцова М.А., Ерохина С.А., Каневский Л.М., Коваленко Е.И.
Сравнительный анализ поверхностных маркеров клонов NK-клеток
человека. Российский иммунологический журнал, 2015, 9(18), 3(1): 218-
220.
2. Kovalenko, E.I., Streltsova, M.A., Kanevskiy, L.M., Erokhina, S.A., Telford,
W.G. Identification of human memory-like NK cells. Curr. Protoc. Cytom.,
2017, 79: 9.50.1-9.50.11. doi: 10.1002/cpcy.13
3. Erokhina, S.A., Streltsova, M.A., Kanevskiy, L.M., Telford, W.G.,
Sapozhnikov, A.M. and Kovalenko, E.I. HLA-DR+ NK cells are mostly
characterized by less mature phenotype and high functional activity. Immunol
Cell Biol, 2018, 96(2): 212–228. doi:10.1111/imcb.1032
4. Streltsova M.A., Erokhina S.A., Kanevskiy L.M., Grechikhina M.V.,
Kobyzeva P.A., Lee D.A., Telford W.G., Sapozhnikov A.M., Kovalenko E.I.
Recurrent stimulation of NK cell clones with K562 expressing membrane-
bound IL-21 affects their phenotype, IFN-γ production and lifespan. Int J Mol
Sci., 2019, 20(2): E443. doi: 10.3390/ijms20020443.
5. Kanevskiy, L.M., Erokhina, S.A., Streltsova, M.A., et al. The Role of O-
Antigen in LPS-Induced Activation of Human NK Cells. J Immunol Res.,
2019, 2019: 3062754. doi: 10.1155/2019/3062754.
6. Erokhina, S.A., Streltsova, M.A., Kanevskiy, L.M., Grechikhina, M.V.,
Sapozhnikov, A.M., Kovalenko, E.I. HLA-DR-expressing NK cells: effective
killers suspected for antigen presentation. J Leukoc Biol., 2020, 109(2): 1-11.
doi: 10.1002/JLB.3RU0420-668RR.
7. Kobyzeva, P.A., Streltsova, M.A., Erokhina, S.A., Kanevskiy L.M., Telford
W.G., Sapozhnikov A.M., Kovalenko E.I. CD56dimCD57−NKG2C+ NK cells
retaining proliferative potential are possible precursors of
CD57+NKG2C+ memory-like NK cells. J Leukoc Biol., 2020, 108(4): 1379–
1395. doi: 10.1002/JLB.1MA0720-654RR.
8. Kust, S.A., Streltsova, M.A., Panteleev, A.V., Karpina, N.L., Lyadova, I.V.,
Sapozhnikov, A.M., Kovalenko, E.I. HLA-DR-Positive NK Cells Expand in
Response to Mycobacterium Tuberculosis Antigens and Mediate
Mycobacteria-Induced T Cell Activation. Front. immunol., 2021, 12: 1531.
doi: 10.3389/fimmu.2021.662128.
Тезисы докладов на конференциях:
1. Ерохина С.А., Коваленко Е.И. Характеристика HLA-DR-
экспрессирующих NK-клеток человека, полученных в условиях
стимуляции IL-2 и мембраносвязанным IL-21 // Зимняя молодёжная
научная школа «Перспективные направления в физико-химической
биологии и биотехнологии», 9-12 февраля, 2015, Москва. Сборник
тезисов, с. 93-94.
2. Streltsova, M., Erokhina, S, Kanevskiy, L., Kovalenko, E. Phenotypic
characteristic of NK cell clones obtained with soluble IL-2 and membrane-
bound IL-21 stimulation // Cell Symposium “Cancer. Inflammation and
Immunity”, 14-16 июня, 2015, Сиджес, Испания. Abstract book, с.
Р1.063.
3. Ерохина С.А., Стрельцова М.А., Каневский Л.М., Коваленко Е.И.
Применение фидерных клеток, экспрессирующих мембраносвязанный
IL-21, для активации и пролиферации NK-клеток человека // «Дни
Иммунологии в Санкт-Петербурге XXVIII», 1-4 июня, 2015, Санкт-
Петербург. Медицинская иммунология, 2015, том 17 (спецвыпуск), с.
20.
4. Ерохина С.А., Коваленко Е.И. Изучение возможной роли HLA-DR-
экспрессирующих NK-клеток человека в иммунном ответе на M.
tuberculosis // Зимняя молодёжная научная школа «Перспективные
направления в физико-химической биологии и биотехнологии», 8-11
февраля, 2016, Москва. Сборник тезисов, с. 43.
5. Erokhina, S., Streltsova, M., Kanevskiy, L., Kovalenko, E. Generation,
characterization and functional analysis of HLA-DR-positive NK cells //
International Congress of Immunology, 21-26 августа, 2016, Мельбурн,
Австралия. European Journal of Immunology, Special Issue: Abstracts of
ICI 2016, том 46(s1), с. 119-120.
6. Ерохина С.А., Стрельцова М.А., Каневский Л.М., Коваленко Е.И.
HLA-DR как маркер особого функционального состояния NK-клеток
человека // Зимняя молодёжная научная школа «Перспективные
направления в физико-химической биологии и биотехнологии», 7-10
февраля, 2017, Москва. Тезисы докладов и стендовых сообщений, с. 15.
7. Ерохина С.А., Стрельцова М.А., Каневский Л.М., Коваленко Е.И.
Экспрессия HLA-DR на NK-клетках ассоциирована преимущественно с
менее дифференцированными клетками с повышенной
функциональной активностью // «Дни Иммунологии в Санкт-
Петербурге XXIX», 5-8 июня, 2017, Санкт-Петербург. Медицинская
иммунология, 2017, том 19, спецвыпуск, с. 29.
8. Стрельцова М.А., Ерохина С.А., Муравьева А.В., Коваленко 2017. Е.И.
IL-2 и мембраносвязанный IL-21 приводит к индукции пролиферации,
изменению фенотипа и функций NK-клеток // VIII Российский
Симпозиум «Белки И Пептиды», 18-22 сентября, 2017, Москва. Acta
Naturae, 2017, спецвыпуск, стр. 57.
9. Ерохина С.А., Стрельцова М.А., Каневский Л.М., Коваленко Е.И.
Экспрессия HLA-DR периферическими NK-клетками человека
ассоциирована с высокой способностью к пролиферации и продукции
IFNγ, но низкой антитело-зависимой цитотоксичностью // Зимняя
молодёжная научная школа «Перспективные направления в физико-
химической биологии и биотехнологии», 12-15 февраля, 2018, Москва.
Тезисы докладов и стендовых сообщений, с. 11.
10.Erokhina S., Kobyzeva P., Streltsova M., Kovalenko E. Mature NKG2C+
NK cells demonstrate increased HLA-DR expression // The 5th European
Congress of Immunology, 2-5 сентября, 2018, Амстердам, Нидерланды.
Abstract book, с. 450.
11.Erokhina S., Streltsova M., Kanevskiy L., Kovalenko E. A subset of HLA-
DR-positive NK cells expands in response to Mycobacterium tuberculosis //
NK Cell Symposium, 10-12 сентября, 2018, Гамбург, Германия. Abstract
book, с. 41.
12.Ерохина С.А., Негреева А.В., Пантелеев А.В., Лядова И.В., Коваленко
Е.И. Анализ ответа HLA-DR-экспрессирующих NK-клеток человека на
стимуляцию антигенами M. tuberculosis // Зимняя молодёжная научная
школа «Перспективные направления в физико-химической биологии и
биотехнологии», 11-14 февраля, 2019, Москва. Тезисы докладов и
стендовых сообщений, с. 15.
13.Erokhina S., Negreeva A., Lutsenko G., Streltsova M., Kanevskiy L.,
Kovalenko E. HLA-DR expression in NK cells is induced by both
extracellular cytokines and self-produced IFNγ and associated with high
metabolic activity // 18th Meeting of the Society for Natural Immunity, 29
сентября – 3 октября, 2019, Люксембург, Люксембург. Abstract book, с.
39.
Помогаем с подготовкой сопроводительных документов
Хочешь уникальную работу?
Больше 3 000 экспертов уже готовы начать работу над твоим проектом!
5 (188 отзывов)
4.7 (18 отзывов)
4.6 (71 отзыв)
4 (15 отзывов)
4.8 (30 отзывов)
5 (44 отзыва)
4.2 (13 отзывов)
4.8 (40 отзывов)
5 (49 отзывов)
