Предикторы рака молочной железы у кошек

В главе собраны данные научной литературы о современных представлениях о раке молочной железы у кошек. Описаны перспективы использования генетических онкомаркеров и молекулярной диагностики в ветеринарной онкологии, референс- ные гены, активность ферментов обмена аденозина в крови онкологических боль- ных и метаболизм полиаминов при раке молочной железы.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материал и методы исследований
Биологическим материалом для изучения предикторов РМЖ у кошек послу- жили кровь и фрагменты тканей РМЖ. В качестве контроля использовали кровь и фрагменты тканей молочной железы клинически здоровых животных, владельцы которых обратились в клинику по поводу стерилизации, и были подобраны по принципу пар аналогов. Всего было исследовано 30 кошек с новообразованиями молочной железы и 10 здоровых животных. Гистологические исследования прово- дились на базе учебной лаборатории кафедры «Биология и общая патология» ДГТУ (г. Ростов-на-Дону). Биохимические исследования осуществлялись на базе биохи- мической лаборатории кафедры биохимии в РостГМУ (г. Ростов-на-Дону). Генети- ческие исследования проводились на базе лаборатории Академии биологии и био- технологии им. Д.И. Ивановского ЮФУ (г. Ростов-на-Дону).
Животные подбирались для исследования среди пациентов, поступивших в ве- теринарные клиники по поводу спонтанно возникших опухолей в области молоч- ных пакетов.
Анализ частоты встречаемости новообразований молочной железы в популяции домашних кошек Ростовской области
Для установления частоты встречаемости новообразований молочной железы у кошек в Ростовской области были проанализированы 73247 историй болезни ко-
шек, предоставленных ветеринарными клиниками г. Ростова-на-Дону и области. Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программы Clopper-Pearson (Расчет точного доверительного интервала в MS Exsel).
Анализ клинико-морфологических форм новообразований молочной железы кошек Ростовской области
Диагнозы, установленные с помощью цитологических методов исследования, были заимствованы из историй болезней. Для гистологического анализа операци- онный материал, полученный от 30 животных, поступивших в ветеринарные кли- ники по поводу спонтанно возникших опухолей в области молочных пакетов, фо- тографировали, производили его морфометрию, описание и фиксацию в 10% забу- ференном формалине. Проводку осуществляли на аппарате Tero scientific в автома- тическом режиме. После фиксации производили вырезку и изготовление гистоло- гических препаратов (парафиновых блоков и стекол) по стандартной методике (Семченко В. В. и др., 2006).
Диагноз инвазивная неспецифическая карцинома молочной железы и гипер- пластические изменения ставили согласно номенклатуре и критериям гистологиче- ской классификации опухолей молочной железы ВОЗ 2012 г. (Франк Г.А., 2013; Marx A. еt al., 2015; Overly-Adamson B., 2016), с указанием степени дифференци- ровки.
Выделение РНК, проведение реакции обратной транскрипции и анализ уровня транскрипции генов
Отбор тканевого материала для анализа РНК проводился под морфологиче- ским контролем объёма опухолевого материала. Выделение РНК проводили по стандартной методике ExtractRNA (Евроген, Россия).
Уровни мРНК генов B2M, GAPDH и ADA определяли с помощью ПЦР в режи- ме реального времени в присутствии красителя SYBRGreen I. Работу проводили на термоциклере CFX96 (Bio-Rаd, США). Для подбора праймеров и зондов к мРНК генов использовали программу Primer 3 (http://hebi.praimerblast/primer3/). Синтез праймеров осуществлен фирмой «Евроген» (Россия). Последовательность исполь- зованных праймеров приведена в таблице 1.
Таблица 1 – Праймеры для проведения ПЦР в режиме реального времени
Название B2M forward
B2M reverse GAPDH forward GAPDH reverse ADA forward ADA reverse
Последовательность 5’-3’ TTTGTGGTCTTGGTCCTGCTCG
TTCTCTGCTGGGTGACGGGA AGTATGATTCCACCCACGGCA GATCTCGCTCCTGGAAGATGGT
TTCGACAAGCCCAAAGTGGAG
AACGCACCTCCACATACACC
Образцы кДНК нормировали по контрольному гену В2М, являющемуся «ге- ном домашнего хозяйства», так как В2М экспрессируется практически во всех тка- нях и клетках на относительно постоянном уровне на всех стадиях жизненного цикла организма. Кроме того, в предварительных экспериментах установлено, что разброс уровней транскрипции для гена «домашнего хозяйства» В2М наименьший по сравнению с другим контрольным геном – GAPDH.
Статистический анализ данных по уровню экспрессии генов проводили мето- дом 2-∆∆Ct. Данный метод показывает кратность изменений уровня экспрессии ге- на в сравниваемых образцах. ∆∆Ct и ∆Ct рассчитывали согласно Livаk и Schmittgen (Livak K.J. et. al, 2001). Все значения экспрессии генов (∆Ct) в группах образцов сравнивали между собой как две выборки. Для подтверждения статистически зна-
чимых отличий между выборками образцов применяли критерий Манна–Уитни. Для определения взаимосвязи изучаемых показателей при их нормальном распре- делении в совокупности использовали линейную корреляцию Пирсона (r).
Определение активности аденозиндезаминазы в плазме крови кошек
Активность фермента определяли по методу Kalear (Березин И.В., 1976) на спектрофотометре NanoProtometr Implen.
Измерение содержания полиаминов в крови животных с новообразованиями молочной железы
Содержание полиаминов определяли в эритроцитах венозной крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке Lichrospher RP18.
Статистическую обработку данных проводили с использованием программы «Statistica 6.0». Для оценки достоверности обнаруженных изменений применяли следующие статистические критерии: тест Уилкоксона (сравнение параметров, из- меренных у контрольной группы и у животных с новообразованиями молочной же- лезы) и тест Стьюдента (сопоставление двух независимых групп данных).
2.2. Результаты исследования и их обсуждение
В разделе изложены результаты научных исследований, опубликованные в научных статьях самостоятельно и в соавторстве, которые содержат уточненные, расширенные и новые сведения.
2.2.1. Частота встречаемости новообразований молочной железы в популяции домашних кошек Ростовской области
и их клиникоморфологические формы
Таблица 2 – Анализ историй болезни кошек, поступивших на прием в клиники Ростовской области в 2018 году
73247 321 61 5
Анализ 73247 историй болезни кошек, предоставленных ветеринарными кли- никами г. Ростова – на – Дону и области, показал, что 321 животному была прове- дена операция по удалению новообразований (НО) молочной железы, что составля- ет 0,44 % от всех обратившихся пациентов (таблица 2). Соответственно, животные с новообразованиями молочной железы составили примерно 400 особей на каждые 100 000 кошек. Далее был проведен анализ распределения клинико-морфологи- ческих форм новообразований на основании цитологических исследований, имею- щихся в предоставленных нам историях болезни. Только в 61 истории болезни из 321 имелись данные о проведении цитологических исследований вырезанных ново- образований, и из них только 5 животным был поставлен диагноз на основании ги- стологического исследования. В соответствии с классификацией опухолей молоч- ной железы (ВОЗ, 2012) карцинома и саркома были отнесены к злокачественным новообразованиям молочной железы, а к доброкачественным и опухолеподобным образованиям – фиброаденома и фиброэпителиальная гиперплазия. У 32 животных из 61 было диагностировано злокачественное новообразование, что составило 53 % (Вакуленко М.Ю., 2019; Vakulenko M.Y. 2019) (рисунок 1).
На момент исследования в ветеринарных клиниках отмечалось отсутствие стандартизации осмотра, диагностики и лечения РМЖ у кошек, что затрудняет ре-
Кол-во проанализированных историй болезни
Кол-во кошек прооперированных по поводу Н.О. молочной железы
Кол-во Н.О. подвергшихся цитологическому исследованию
Кол-во Н.О. подвергшихся гистологическому исследованию
8

альную оценку проблемы РМЖ. Большинство НО было прооперировано без со- блюдения правил абластики и антибластики, и вырезанные НО не подвергались дальнейшему исследованию.
Рисунок 1 – Распределение различных форм новообразований по данным цитологических исследований
В основную группу исследования были включены 30 домашних кошек, посту- пивших в ветеринарную клинику по поводу спонтанно возникших опухолей в обла- сти молочных пакетов. После оперативного удаления новообразований были со- браны и проанализированы данные анамнеза, операционный материал и кровь жи- вотных.
В результате патоморфологического исследования тканей опухоли установле- но, что у 3-х животных опухоль представляла собой фиброэпителиальную гипер- плазию. Это были молодые животные, в возрасте от 8 месяцев до 2-х лет, в анамне- зе у всех был отмечен приём гормональных препаратов на основе экзогенных про- гестинов. Хозяева животных отмечали резкий интенсивный рост одновременно не- скольких опухолей, симметрично расположенных вдоль гряды молочных желёз. Макроскопически большинство опухолей представляли собой новообразования бо- бовидной формы, от 2 до 4 см в диаметре, эластичной консистенции. Границы определялись чётко, от близлежащих тканей опухоли отделялись самопроизвольно и имели собственную капсулу. На разрезе тела опухоли некрозов и кровоподтеков не наблюдалось, отмечалась гладкая блестящая ткань розового цвета. Микроскопи- чески установлено разрастание плотной соединительной ткани, в которой наблюда- лись чётко оформленные, разветвлённые протоки, сформированные эпителиальной железистой тканью. Обычно пролиферирующие протоки были выстланными двумя- тремя слоями мономорфных призматических эпителиальных клеток с гиперхром- ными округлыми ядрами. Митозы наблюдались в единичных клетках. При этом просветы ацинусов были сохранены, глубоких структурных изменений ядра и ци- топлазмы не наблюдалось.
У одного животного была диагностирована периканаликулярная фиброадено- ма. У данного животного уже проводилась операция по удалению НО молочной железы, которая представляла собой фиброаденоматозную гиперплазию, но хозяин вместо рекомендованной стерилизации продолжил применение прогестиновых препаратов. Удаленный макропрепарат представлял собой конгломерат узлов бобо- видной формы, диаметром от 2 до 8 мм. Узлы были четко отграниченными, в кап- суле, подвижными, не связанными с окружающими тканями, плотноэластической консистенции, с гладкой поверхностью. На разрезе они были представлены светло- розовой однородной мелкозернистой тканью. Участков некроза и кровоизлияний не выявлено. Ткань опухоли состояла из множества пролиферирующих мелких тубул, выстланных одним-двумя слоями мономорфных призматических и вытянутых (миоэпителий) клеток со слабоэозинофильной цитоплазмой, округлыми гиперх- ромными ядрами. Ядерный полиморфизм не выражен. Митозы единичные в препа- рате. Тубулы окружены фибробластической стромой.
У 26 животных был диагностирован РМЖ различной степени злокачественно- сти. Возраст животных варьировал от 8 до 19 лет. Макроскопически опухоли не имели общих закономерностей. Они отличались размерами и локализацией. Обыч- но на срезе ткани опухолей были значительно светлее прилежащих тканей, цвет ва- рьировал от бледно-розового до серо-желтого. Микроскопически карцинома мо- лочной железы у кошек характеризовалась признаками злокачественности: инва- зивный рост, клеточный и ядерный полиморфизм, высокий митотический индекс. Эпителиальные клетки располагались преимущественно в скоплениях, похожих на просветы каналов. Обычно опухоль была представлена нечетко оформленными протоками, выстланными одним или несколькими слоями полиморфных округлых и призматических клеток с округлыми гиперхромными ядрами. Строма опухоли была представлена рыхлой и плотной соединительной тканью. Соотношение между эпителиальной и соединительной тканью варьировало в разных опухолях, иногда встречались разрозненно лежащие клетки рака. При низкодифференцированных формах рака, соответствующих высокой степени злокачественности, наблюдались: неправильная форма ядра, неровные и нечёткие контуры ядерной мембраны, глыб- чатый хроматин, крупные чётко выраженные ядрышки, высокий митотический ин- декс. В подавляющем большинстве случаев мы регистрировали протоковый рак (Вакуленко М.Ю., 2019; Vakulenko M. Y., 2019).
Таким образом, злокачественные новообразования составили 87 % от всех про- оперированных нами животных, что существенно превышало процент злокачествен- ных новообразований, диагностированных с помощью цитологических исследова- ний, но соответствовало литературным данным (Якунина М.Н., 2011) (рисунок 2).
Рисунок 2 – Распределение различных форм новообразований, диагностированных гистологически
В проведенном исследовании наблюдалась чёткая зависимость злокачествен- ности опухоли от возраста животного. Случаи фиброэпителиальной гиперплазии наблюдались у животных не старше 2 лет, средний возраст животных с протоковым раком составил 12,9 лет. Таким образом, в группу риска можно отнести кошек в возрасте от 8 лет, средний возраст животного, в котором у них развивается злокаче- ственный рак молочной железы, находится в диапазоне 9-15 лет. Самое большое количество животных с диагнозом рака молочной железы наблюдалось в возраст- ной группе 10, 13 и 15 лет. 90% животных в исследуемой группе были не стерили- зованы, у 3 животных стерилизация была проведена во взрослом возрасте за не- сколько лет до развития опухоли. У 80% процентов животных в анамнезе хозяева указывали применение гормональных препаратов в виде капель или уколов проли- геснона и т.д.
Выживаемость после операции по удалению опухоли молочной железы среди животных с диагностированной фиброэпителиальной гиперплазией составила 100 %. Животные хорошо себя чувствовали на протяжении 3 лет проведения исследования. У двух кошек появилось потомство, после чего животным была проведена стерили-
зация. В группе животных со злокачественными новообразованиями 11 % погибло в течение 3 недель из-за послеоперационных осложнений или было усыплено по просьбе владельцев; 14 % прожило после операции более 2 лет и погибло по есте- ственным причинам. У 18 % животных наблюдался рецидив, и они погибли в тече- ние 3-8 месяцев после операции.
Исследуемые животные были разбиты на группы по признаку злокачественно- сти опухоли и степени дифференциации. В группу контроля вошли клинически здоровые животные, попавшие в клинику по поводу стерилизации. Группу живот- ных с доброкачественными и опухолеподобными новообразованиями составили животные с фиброэпителиальной гиперплазией и фиброаденомой молочной желе- зы. Группы животных со злокачественными новообразованиями составили живот- ные с инвазивной неспецифической карциномой низкой, умеренной и высокой сте- пени дифференциации.
2.2.2. Уровень экспрессии гена АДА
Нами были разработаны ДНК-праймеры на ген АДА кодирующий фермент аденозиндезаминазу. Смоделированные мРНК специфичные ДНК-праймеры были опробованы в трех различных концентрациях в режиме real-time PCR (125, 250 и 500 Нм) прямого и обратного праймеров. Все образцы содержали конечную кон- центрацию ДНК 0,2 НГ/мкл. Анализ кривой плавления проводили при температуре от 60 до 99 °С. Реакции ПЦР были линейными в диапазоне восьми log10 синтетиче- ского шаблона и давали один пик в анализе кривой плавления. Амплификация мРНК, выделенной из биологических образцов, дала такие же кривые амплифика- ции, что и для синтетических шаблонов. Анализ кривой плавления показал наличие только одного ампликона. Кроме того, при использовании биологических образцов наблюдалась хорошая корреляция между Ct и концентрацией шаблона в четырех разведениях, что подтвердило высокую специфичность и чувствительность разра- ботанных праймеров. При выборе референсных генов, ген В2М показал высокую экспрессию во всех образцах тканей и имел низкий коэффициент вариации в отли- чии от гена GAPDH. Кроме того, по данным литературы (Penning L.C., 2007), обычно при изучении экспрессии генов, связанных с развитием рака молочной же- лезы, в качестве референсного используют ген В2М. Поэтому экспрессию генов АДА рассчитывали по отношению к экспрессии гена В2М. Уровень экспрессии гена АДА значительно увеличивался в тканях новообразований молочной железы по сравнению со здоровой молочной железой. Результаты исследования представлены в таблицах 3-4.
Таблица 3 – Показатели ΔCt для гена АДА в группах животных с новообразованиями и в контрольной группе
Исследуемые группы АДА ΔCt (M±m)
Контрольная группа n =10 0,4±0,07
Инвазивная неспецифиче- ская карцинома n =26 5,57±0,31
Фиброэпительальная гиперплазия и фиброаденома 7,44±0,59
Таблица 4 – Показатели уровня экспрессии АДА в тканях опухолей по отношению к показателям в здоровых тканях молочной железы
Исследуемые группы Группа инвазивная неспецифическая карцинома Группа фиброэпителиальная гиперплазия и фиброаденома
Δ ΔCt 5,17
7,04
2 – Δ ΔCt 36
131 11
U-критерий Манна–Уитни(p) p˂0,001
p˂0,001

По данным литературы, аденозиндезаминаза осуществляет гидролитическое дезаминирование аденозина до инозина, и в быстро пролиферирующих тканях, например в лимфоцитах и в клетках кишечника, активность данного фермента обычно изменяется (Vy Hong-Diep, 2017; Abbed K.M., 2018). Перерождение здоро- вых клеток молочной железы в опухолевые всегда сопровождается неконтролируе- мым ростом ткани, следовательно экспрессия гена АДА должна изменяться. Для подтверждения правильности сделанных выводов было проведено попарное срав- нение средних показателей ΔCt исследуемых мРНК контрольной группы с группа- ми инвазивной неспецифической карциномы и фиброэпителиальной гиперплазии с помощью U-критерия Манна–Уитни, данные которого также приведены в таблицах 6-7. Получены результаты, которые подтверждают, что уровень экспрессии гена АДА в ткани опухолей инвазивной неспецифической карциномы и в ткани фибро- эпителиальной гиперплазии статистически значимо отличаются от соответствую- щего показателя в контрольной группе (p<0,001). Уровень экспрессии гена АДА в тканях опухолей инвазивной неспецифической карциномы и в тканях фиброэпите- лиальной гиперплазии резко повышается по сравнению с тканью здоровой молоч- ной железы (в 36 раз в тканях инвазивных карцином и в 131 раз в тканях фиброэпи- телиальных гиперплазий). Результаты проведённого исследования подтверждают участие гена АДА в патогенезе онкологических заболеваний. Учитывая вышеска- занное, выявление изменения количества определённых мРНК можно использовать для понимания как патофизиологических основ канцерогенеза, так и для поиска молекулярно-генетических подходов к его ранней диагностике (Вакуленко М.Ю., 2019). Учитывая увеличение экспрессии гена, кодирующего фермент аденозиндез- аминазу, мы ожидали увидеть увеличение активности данного фермента в перифе- рической крови животных с РМЖ. 2.2.3. Определение активности аденозиндезаминазы Согласно полученным результатам, между активностью АДА в плазме крови здоровых животных и в плазме крови животных со злокачественными новообразо- ваниями молочной железы достоверных отличий не наблюдалось (таблица 5). Таблица 5 – Активность АДА в плазме крови здоровых кошек и кошек с новообразованиями (М±m, нмоль / с/ мл плазмы крови) Группы Контроль n=10 Все новообразования n=30 Фиброэпителиальная гиперплазия и фиброаденома n=4 Высокодифференцированная инвазив- ная неспецифическая карцинома n=10 Умеренно дифференцированная инва- зивная неспецифическая карцинома n=9 Низкодифференцированная инвазивная неспецифическая карцинома n=7 Активность фермента АДА 67±5 54±15 (t =1,00, p = 0,212) 45±2 (t = 5,00, p = 0,007) 50±10 (t =1,271, p = 0,261) 47±2 (t =1,33, p = 0,22) 68±2 (t =0,278, p = 0,79) В зависимости от степени дифференциации опухоли достоверных различий активности фермента также не обнаружено. По всей видимости, этот факт связан с тем, что обследованные животные были прооперированы на 1-2 стадии рака молоч- ной железы и патологические процессы были недостаточно существенными, чтобы повлиять на метаболизм организма в целом. Другим возможным объяснением от- сутствия увеличения активности АДА в крови больных животных может являться тот факт, что в основном АДА в крови содержится в лимфоцитах. При иммуноде- фицитных состояниях обычно наблюдается недостаточность АДА, следовательно падение выработки АДА лимфоцитами может компенсировать рост активности АДА синтезируемой тканью опухоли (Вакуленко М.Ю., 2019; Vakulenko M. Y., 2019). Поскольку анализ активности АДА показал, что измерение активности этого фермента в крови животных с РМЖ не может быть использовано в качестве пре- диктора РМЖ, нами было принято решение проанализировать содержание полиа- минов в крови этих же животных. 2.2.4. Содержание полиаминов в крови кошек с новообразованиями молочной железы Впервые были получены показатели уровня полиаминов в крови здоровых ко- шек: путресцина – 0,04 мкг/мл, спермидина – 5,94 мкг/мл и спермина – 1,63 мкг/мл. При доброкачественных и опухолеподобных новообразованиях молочной же- лезы содержание путресцина в крови кошек статистически значимо увеличивалось в 5 раз (р<0,0001) по сравнению с показателями контрольной группы. При злокаче- ственных новообразованиях молочной железы (инвазивной неспецифической кар- циноме) содержание путресцина и спермина в крови значительно превышало кон- трольные значения в 6 (р<0,0001) и в 10 раз (р<0,02) соответственно. При этом со- держание спермидина в крови кошек, наоборот, снижалось в 8 раз (р <0,02) по сравнению с контролем. Снижение содержания спермидина, по-видимому, связано с образованием различных ацетильных производных (Вакуленко М.Ю., 2019; Аки- нина Н.И., 2019; Vakulenko M. Y., 2019) (таблица 6). Таблица 6 – Содержание полиаминов в крови кошек с новообразованиями молочной железы (М±m, мкг/мл крови) Группы Клиническая норма Фиброэпителиальная гиперплазия и фиброаденома Инвазивная неспецифическая карцинома Путресцин 0,4±0,01 2,15±0,22 ** 2,45±0,67* Полиамины мкг/мл Спермидин 5,94±1,13 4,00±0,40 0,76±0,14* Спермин 1,63±0,30 2,68±1,00 15,56 ±3,76* Примечание: * - р1<0,02 – достоверность различий величин у больных по сравнению с нормой. ** - р1<0,0001 – достоверность различий величин у больных по сравнению с нормой. 2.2.5. Сопоставление экспрессии гена АДА с основными клинико-морфологическими параметрами В заключение объединили все параметрические значения с клинико- морфологическими параметрами и провели корреляционный анализ всех призна- ков. Перед проведением корреляционного анализа полученных показателей была проведена проверка нормальности выборки для соответствующего выбора метода статистической обработки. Нормальность выборки была оценена с помощью крите- риев Шапиро–Уилка, Андерсона–Дарлинга и Лиллифорса. По всем критериям вы- борка отличалась от нормального распределения (p<0,05). Далее была оценена нор- мальность группы с неспецифической инвазивной карциномой. В группе с неспе- цифической инвазивной карциномой, за исключением показателя активности АДА, все переменные в плазме имели нормальное распределение (p>0,05). В контрольной группе все переменные, за исключением путресицина, имели нормальное распреде-
ление (p>0,05). Для межгруппового сравнения использовали непараметрический критерий Манна–Уитни. Корреляционный анализ проводили в программе стати- стической обработки Past 4.2. Когда данные не соответствовали нормальному рас- пределению, использовали коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Для оценки величины коэффициента корреляции использовали шкалу Чеддока.
В результате анализа установлено, что экспрессия гена АДА умеренно корре- лирует с основными клинико-морфологическими параметрами. Обратная взаимо- связь между экспрессией гена АДА в тканях новообразований и АДА в плазме крови (rs=-0,73) может быть объяснена тем фактом, что основным источником АДА в кро- ви являются лимфоциты. Существует множество работ, доказывающих взаимосвязь активности АДА в крови и уровнем иммунитета. АДА является ферментом пурино- вого метаболизма, а пуриновые нуклеотиды непосредственно участвуют в процес- сах гуморального иммунитета и антивирусной защите (Милашенко В.А., 2001). Кроме того, доказана роль АДА в модуляции процесса репликативного старения Т-лимфоцитов (Stanley et al., 2013). По данным литературы, при онкопатологии нарушается гомеостаз аденозина, что проявляется различной степенью иммуносу- прессирующего действия. Снижение активности аденозиндезаминазы в лимфоци- тах у онкобольных коррелирует с увеличением содержания малоактивных клеток иммунной системы, что обусловлено накоплением внеклеточного аденозина и спо- собствует иммуносупрессорному эффекту (Барсукова М.А., 2017). Полученные нами данные показали уменьшение содержания АДА в плазме крови, что указывает на ослабление иммунитета у животных, больных раком молочной железы. Увели- чение экспрессии гена АДА в тканях опухоли говорит о процессах пролиферации, характерных для роста любого новообразования. В то же время увеличение синтеза АДА в тканях опухоли не влияет на содержание АДА в крови животных. Это можно объяснить тем, что фермент работает в клетках опухолей и в кровь попадает только в случае повреждения целостности мембраны. Также надо учитывать тот факт, что в нашем эксперименте участвовали животные на 1 и 2 стадии рака, следовательно раз- мер опухоли по отношению ко всему организму был относительно несущественен.
Как повышение экспрессии гена АДА в процессе опухолевого роста, так и снижение активности АДА в плазме с возрастом (rs=-0,77) можно объяснить высо- ким уровнем пролиферации. Во-первых, у молодых животных до 2-3 лет идет рост организма, и пуриновый обмен более активен. Во-вторых, у молодых животных бо- лее высокий уровень иммунитета, в процессах формирования которого АДА прини- мает непосредственное участие. Поэтому уровень АДА в плазме крови с возрастом должен уменьшаться, что и было показано в данном исследовании.
Важно отметить, что установлена сильная прямая взаимосвязь между содер- жанием путресцина в эритроцитах и размером опухолей (rs=0.78). Полиамины (пу- тресцин, спермидин и спермин) имеют важное значение для роста эукариотических клеток, так как эти молекулы участвуют во многих ключевых процессах, в том чис- ле генной транскрипции, регуляции функции белка и стабильности клеточной мем- браны (Igarashi K. et al., 2018). Высокий уровень полиаминов способствует проли- ферации, инвазии и миграции опухолевых клеток (Bachrach U., 2004). При злокаче- ственных новообразованиях молочной железы (инвазивной неспецифической кар- циноме) содержание путресцина и спермина в крови значительно превышало кон- трольные значения в 6 (р <0,0001) и в 10 раз (р <0,02) соответственно. Тот факт, что уровень спермина в эритроцитах не коррелировал с размером опухоли, указывает на начальные этапы развития онкологического процесса. Сильная прямая взаимо- связь между спермидином и возрастом животных (rs=0,72) может быть объяснена тем фактом, что спермидин является индуктором аутофагии, и снижение его содер- 14 жания при старении может способствовать накоплению дефектных молекул и раз- витию онкологического процесса (Zhang H, 2020). Рисунок 3 – Отношение активности АДА в плазме крови к содержанию спермина (1–4 – доброкачественные; 5–30 – злокачественные; 31–40 – контроль) Поскольку при использовании метода главных компонент ни один из парамет- ров не показал однозначных результатов, нами были просчитаны и онкомаркеры (рисунок 3). ндексы- ЗАКЛЮЧЕНИЕ Подводя итог проделанной работы, следует указать на то, что впервые была выявлена частота встречаемости рака молочной железы, которая составила 0,4 % популяции домашних кошек в Ростовской области. Соответственно, животные с новообразованиями молочной железы составили примерно 400 особей на каждые 100 000 кошек. Был проведен анализ клинико-морфологических форм новообразо- ваний, в результате которого установлено, что в 87 % случаев новообразования мо- лочной железы у кошек являлись неспецифической инвазивной карциномой. Было проанализировано 73247 истории болезни кошек, предоставленных ветеринарными клиниками г. Ростова-на-Дону и Ростовской области, а также прооперировано 30 домашних кошек, обратившихся в ветеринарную клинику по поводу спонтанно возникших опухолей в области молочных пакетов. В результате анализа диагнозов, взятых из историй болезни и поставленных на основании цитологических исследо- ваний и диагнозов, полученных в результате гистологического анализа, выявлено, что в 30 % случаев злокачественные новообразования не диагностируются и жи- вотное остается без соответствующего лечения. Также был собран и проанализиро- ван анамнез животных с новообразованиями молочной железы и установлено, что в группу риска по развитию рака молочной железы следует отнести кошек в возрасте от 8 лет. Средний возраст животных, в котором у них развивается рак молочной железы, составляет 12,9 лет. 90 % животных в исследуемой группе были не стери- лизованы. У 80 % животных в анамнезе хозяева указывали применение гормональ- ных препаратов в виде капель или уколов пролигеснона. Выживаемость после опе- рации по удалению опухоли молочной железы среди животных с диагностирован- ной фиброаденоматозной гиперплазией составила 100 %, животные хорошо себя чувствовали на протяжении 3 лет проведения исследования. У двух кошек появи- лось потомство, после чего животным была проведена стерилизация. В группе животных со злокачественными новообразованиями 11 % погибло в течение 3 недель из-за послеоперационных осложнений или было усыплено по просьбе вла- дельцев. 14 % прожило после операции более 2 лет и погибло по естественным причинам. У 18 % животных наблюдался рецидив, и они погибли в течение 3-8 ме- сяцев после операции. С целью выявления предикторов РМЖ был проведен поиск его молекулярных предикторов у кошек. В том числе была изучена экспрессия гена АДА в тканях опу- холей молочной железы и активность данного фермента в плазме, а также было проанализировано содержание полиаминов в крови кошек с раком молочной желе- зы. Результаты исследований показали, что уровень экспрессии гена АДА в тканях опухолей инвазивной неспецифической карциномы и в тканях фиброэпителиальной гиперплазии резко повышается по сравнению с тканью здоровой молочной железы (в 36 раз в тканях инвазивных карцином и в 131 раз в тканях фиброэпителиальных гиперплазий). При этом достоверных отличий между активностью АДА в плазме крови здоровых животных и в плазме крови животных со злокачественными ново- образованиями молочной железы выявлено не было. Измерение уровня полиаминов в крови животных показало, что содержание путресцина в эритроцитах крови ко- шек с доброкачественными и опухолеподобными новообразованиями молочной железы (фиброэпителиальная гиперплазия) значимо увеличивалось (в 5 раз) по сравнению с показателями контрольной группы. При злокачественных новообразо- ваниях молочной железы (инвазивной неспецифической карциноме) содержание путресцина и спермина в крови значительно превышало контрольные значения в 6 и в 10 раз соответственно. Далее был проведен корреляционный анализ данных показателей и клинико- морфологических параметров (размер опухоли, возраст животного) и выявлены следующие закономерности: выявлена сильная прямая взаимосвязь между сперми- ном и путресцином и прямая взаимосвязь между спермином и возрастом. В группе с РМЖ наблюдалась прямая взаимосвязь между путресцином и размером опухоли. В группе контрольных животных была выявлена сильная обратная взаимосвязь между экспрессией АДА и активностью АДА в плазме, обратная взаимосвязь между АДА в плазме и возрастом животного, прямая взаимосвязь между спермидином и возрастом кошек. Также был разработан индекс-онкомаркер, представляющий со- бой отношение уровня активности АДА к содержанию спермина в крови; по этому индексу можно разделять между собой группы с фиброэпителиальной гиперплази- ей, инвазивной неспецифической карциномой и здоровых животных. Таким обра- зом, данный индекс-онкомаркер может быть внедрен в реальную клиническую ве- теринарную практику для постановки дифференциальных диагнозов рака молочной железы и мониторинга рецидивов данного заболевания. В данной работе впервые были исследованы показатели активности фермента аденозиндезаминазы и содержание полиаминов в крови кошек с новообразования- ми молочной железы. Также нами были впервые разработаны ДНК праймеры на ген АДА, кодирующий фермент аденозиндезаминазу, и получены рекомендации оценки экспрессии данного гена в тканях опухолей молочной железы у кошек. Результаты данной работы вносят вклад в понимание патофизиологических ос- нов развития канцерогенеза и в развитие молекулярно-генетических подходов ран- ней диагностики рака молочной железы у млекопитающих. ВЫВОДЫ 1. Встречаемость новообразований молочной железы у кошек Ростовской обла- сти составляет 400 особей на каждые 100 000 кошек. На 2018 год 0.44% популяции кошек Ростовской области имели новообразования молочной железы, из них злока- чественные новообразования составили 87 %. 2. Уровень экспрессии гена АДА в тканях злокачественных и доброкачествен- ных опухолей статистически значимо выше, чем в тканях здоровой молочной железы (в 36 раз в тканях инвазивных карцином и в 131 раз в тканях фиброэпителиальных ги- перплазий). Уровень активности аденозиндезаминазы в крови при этом не меняется. Активность АДА в группе здоровых животных составляет 67±5 нмоль / с/мл плазмы крови, в группе животных, больных раком молочной железы ,54±15 нмоль / с/ мл плазмы крови. 3. В крови кошек, больных раком молочной железы, достоверно увеличивается уровень полиаминов. Содержание полиаминов в крови здоровых животных состав- ляет: путресцина 0,04±0,01 мкг/мл, спермидина 5,94±1,13 мкг/мл, спермина 15,56 ±3,76 мкг/мл. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Данные о частоте встречаемости новообразований молочной железы у ко- шек в Ростовской области могут быть использованы при планировании ветеринар- ных санитарно-эпидемиологических мероприятий в Ростове-на-Дону и области. 2. Методики определения предикторов РМЖ могут быть использованы для диагностики и мониторинга лечения инвазивной неспецифической карциномы мо- лочной железы у кошек в рутинной клинической диагностике в условиях ветери- нарной клиники и в научно-исследовательской работе. 3. Всем кошкам после 10 лет рекомендовано проходить скрининговое обсле- дование по поводу новообразований молочной железы. 4. При назначении противоопухолевой терапии (химиотерапии, гормонотера- пии, хирургическом удалении опухоли) рекомендовано проводить биопсию опухо- левой ткани с дальнейшим гистологическим исследованием для дифференцирования опухоли. В случаях проведения оперативного вмешательства на пораженной молоч- ной железе следует учитывать микроскопический характер роста. 5. Рекомендовано разъяснять владельцам кошек преимущества ранней стери- лизации кошек, до наступления полной половозрелости, что способствует снижению риска развития рака молочной железы. ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ – Обобщение теоретического материала, результаты экспериментальных иссле- дований определили направление дальнейшей разработки темы исследования; – изучение патофизиологических основ канцерогенеза при возникновении рака молочной железы у кошек; – изучение встречаемости новообразований молочной железы у кошек на территории г. Ростова-на-Дону и близлежащих поселений; – разработка молекулярно-генетических методов ранней диагностики.