Прогнозирование развития резистентности Staphylococcus aureus в экспериментах с линезолидом и его комбинацией с даптомицином в динамической системе in vitro

Глава 1. Обзор литературы
Рассмотрена проблема устойчивости бактерий к антибиотикам, её текущее состояние
и пути решения, отмечена важность грамотного и оправданного подхода к применению
антибактериальных средств для лечения инфекционных заболеваний. Описан принцип
моделирования фармакокинетики антибиотика и одновременного моделирования
фармакокинетики нескольких антибиотиков в динамической системе in vitro. Проведён
анализ результатов фармакокинетико-фармакодинамических исследований в динамических
системах in vitro, посвященных изучению фармакодинамики антибиотиков, процессов
развития резистентности бактерий к антибиотикам, взаимодействия линезолида с
даптомицином. Приведена характеристика линезолида и даптомицина: активность,
фармакокинетика, фармакодинамика и эффективность в клинике.
Глава 2. Материалы и методы
Питательные среды, вспомогательное оборудование, расходные материалы и
антибиотики.
При проведении экспериментов использовали жидкую и плотную питательную среду
– бульон Мюллера-Хинтон (МХБ) и агар Мюллера-Хинтон II (МХА II), соответственно, а
также ряд вспомогательных материалов. Линезолид был предоставлен компанией Pfizer
Corporation (Гротон, США), даптомицин – компанией Cubist Pharmaceuticals, Inc.
(Лексингтон, США). В питательных средах, используемых во всех исследованиях с
даптомицином, создавали концентрацию ионов Са2+, соответствующую физиологическому
значению в крови человека – 50 мг/л (Hanberger et al., 1991; Carpenter, Chambers, 2004).
Бактериальные штаммы.
В работе использовали 4 штамма S. aureus: 479, 688, 2061 и ATCC 700699 (GISA Mu-
50). Все штаммы были устойчивыми к метициллину (MRSA). Штамм S. aureus ATCC 700699
характеризовался сниженной чувствительностью к ванкомицину, остальные штаммы были
к нему чувствительны. Для каждого штамма провели лабораторную селекцию резистентных
мутантов путём многократных пересевов на среде с линезолидом при постепенном
повышении его концентрации. Методология селекции РМ и их генетического анализа
описана в: Струкова, 2010, Firsov et al., 2015b.
Оценка чувствительности S. aureus к антибиотикам. Определение МПК и
МПКМ.
Значения МПК антибиотиков устанавливали методом серийных разведений в МХБ,
обогащённом ионами Ca2+ и Mg2+, согласно методике CLSI. Значения МПКМ антибиотиков
устанавливали методом разведений в МХА II. Методология описана в: Firsov et al., 2015b.
Значения МПК и МПКМ линезолида и даптомицина в присутствии друг друга в отношении
штаммов S. aureus 2061 и S. aureus ATCC 700699 МПК и МПКМ определяли при
соотношении их концентраций 1:2 в МХБ и МХА II, соответственно. Такое же соотношение
ПФК данных антибиотиков моделировали в экспериментах в динамической системе in vitro.
Моделируемые фармакокинетические профили антибиотиков.
В динамической системе in vitro моделировали моноэкспоненциальное снижение
концентрации антибиотика с установленным в клинических исследованиях периодом
полувыведения: 6 ч для линезолида (Moellering, 1999; Stalker, Jungbluth, 2003), 9 ч для
даптомицина (Dvorchik et al., 2003). Воспроизведенные фармакокинетические профили
соответствовали реализуемым у человека при 5-дневном введении линезолида с интервалом
в 12 ч (10 введений) и 5-дневном введении даптомицина с интервалом в 24 ч (5 введений).
Моделируемые значения ПФК составили: 15, 30, 60, 120, 240 и 480 мкг/мл×ч для линезолида
(режимы Л15, Л30, Л60, Л120, Л240 и Л480, соответственно), 240 и 480 мкг/мл×ч для
даптомицина (режимы Д240 и Д480, соответственно). Значения ПФК линезолида и
даптомицина, равные 240 и 480 мкг×ч/мл, соответственно, были близки к клинически
реализуемым: ПФК ≈ 228 мкг×ч/мл при введении линезолида в дозе 600 мг каждые 12 ч
(Meagher et al., 2003) и ПФК ≈ 494 мкг×ч/мл при введении даптомицина в дозе 4 мг/кг
каждые 24 ч (Dvorchik et al., 2003).
Штаммы S. aureus 479, S. aureus 688 и S. aureus ATCC 700699 подвергали воздействию
линезолида при моделировании его ПФК в 32-кратных пределах (режимы Л15-Л480).
Штаммы S. aureus 2061 и S. aureus ATCC 700699 подвергали воздействию линезолида и
даптомицина в отдельности (режимы Л240 и Л120, Д480 и Д240) и в комбинации (режимы
Л240+Д480 и Л120+Д240).
Динамическаясистемаinvitro ивоспроизводимостьзаданных
фармакокинетических профилей антибиотиков.
С целью моделирования фармакокинетических профилей антибиотиков и изучения
их фармакодинамики использовали динамическую систему in vitro. Она состоит из
герметичных сосудов (камер) различного назначения, насосов для создания потоков
жидкостей между всеми компонентами и системы отбора проб (Рисунок 1). Устройство
системы описано в: Firsov et al., 2015b. Принцип работы системы объяснён в: Фирсов и
соавт., 1989. Для одновременного моделирования профилей линезолида и даптомицина
использовался принцип суперпозиции потоков (Blaser, 1985).

Рисунок 1. Схема динамической системы in vitro.

Воспроизводимость заданных фармакокинетических профилей антибиотиков
проверяли методом ВЭЖХ. Фактические значения периода полувыведения линезолида и
даптомицина при применении в отдельности и в комбинации были близки к заданным.
Регламент эксперимента. Оценка противомикробного эффекта и развития
устойчивости.
Центральную камеру заполняли МХБ с 18-часовой бактериальной культурой S. aureus
и инкубировали при 370С в течение ~2 ч, затем начинали периодическое введение одного
или двух антибиотиков. Все эксперименты проводили: со смешанным инокулятом
(соотношение количества РМ к общей численности стафилококков 1:108 КОЕ), в течение
120 ч, не менее чем в двух повторностях. Из ЦК отбирали биопробы, которые высевали на
чашки с МХА II без антибиотика, с 2×, 4× и 8×МПК линезолида, с 2× и 4×МПК линезолида
или даптомицина (при работе с комбинацией антибиотиков). Чашки инкубировали при
температуре 37°С в течение 24-48 ч и подсчитывали число колоний. Нижний предел
определения составлял 103 КОЕ/мл (3 lg КОЕ/мл) и 10 КОЕ/мл (1 lg КОЕ/мл) для
чувствительных и резистентных клеток S. aureus, соответственно.
При интегральной оценке процессов изменения численности чувствительных и
устойчивых бактериальных клеток под воздействием антибиотика использовали параметры
ППК (площадь под кинетической кривой изменения общей численности клеток) (Фирсов и
соавт., 1985) и ППКM (площадь под кинетической кривой изменения численности
резистентных к антибиотику мутантов) (Firsov et al., 2008a), соответственно. Значения ППК
и ППКM оценивали в интервале времени от начала опыта до его окончания и
корректировали, вычитая произведение численности клеток на уровне предела определения
на 120 ч.
Анализ зависимости противомикробного эффекта и селекции устойчивых
мутантов S. aureus от фармакодинамических параметров.
Зависимость ППКM от ПФК/МПК и от ПФК/МПКМ описывали модифицированной
функцией Гаусса
Y = Y0 + a exp (0,5(|x – x0|/b)c), (1)
где Y – ППКM, x – lg (ПФК/МПК) или lg (ПФК/МПКМ), Y0 – минимальное значение Y,
x0 – значение lg (ПФК/МПК) или lg (ПФК/МПКМ), которое соответствует максимальному
значению Y, a, b и c – параметры уравнения.
Зависимость ППКM от TОСМ, от T>МПКм и от ПОМПКМ описывали сигмоидальной
функцией
Y = Y0 + a/{1 + exp (– (x – x0)/b)}, (2)
где Y – ППКM или ППК, x – TОСМ, или T>МПКм, или lg (ПФК/МПК), или ПОМПКМ, Y0
– минимальное значение ППКM или ППК, a –максимальное значение ППКM или ППК, x0 –
значение x, соответствующее a/2, и b – параметр уравнения, отражающий степень
сигмоидности.
За пороговое «антимутантное» значение фармакокинетико-фармакодинамического
параметра принимали значение, соответствующее значению ППКM, равному 30 (lg КОЕ/мл)
× ч (Strukova et al., 2016b).

Глава 3. Фармакодинамика линезолида в отношении устойчивых и чувствительных
к нему клеток Staphylococcus aureus
Лабораторная селекция устойчивых мутантов S. aureus.
Устойчивые к линезолиду мутанты каждого штамма с целевым значением МПК
линезолида (8 мкг/мл) (Firsov et al., 2015b) были отобраны после 7-го (S. aureus 479, РМ7),
9-го (S. aureus 2061, РМ9), 23-го (S. aureus ATCC 700699, РМ23) и 28-го (S. aureus 688, РМ28)
пассажа. По результатам анализа нуклеотидных последовательностей участка V домена гена
23S рРНК лабораторные мутанты S. aureus 479 (РМ7) и S. aureus ATCC 700699 (РМ23)
содержали нуклеотидную замену G2576T (нумерация по E. coli) в одной из копий гена 23S
рРНК. Данная хромосомная мутация часто встречается у выделенных в клинике устойчивых
к линезолиду стафилококков.
Определение МПК и МПКМ линезолида.
Значение МПК линезолида составило 2 мкг/мл в отношении всех штаммов S. aureus
(все штаммы – чувствительные). Значения МПКМ линезолида составляли 5 (S. aureus 479),
6 (S. aureus 688) и 10 мкг/мл (S. aureus 2061 и S. aureus ATCC 700699). Значения, полученные
при использовании инокулята без РМ и с РМ совпадали. Все последующие исследования в
динамической системе in vitro проводились со смешанным инокулятом.
Фармакодинамика линезолида в отношении устойчивых к нему клеток S. aureus.
С целью установления зависимости между численностью устойчивых к линезолиду
клеток и режимом дозирования антибиотика моделировали его фармакокинетику в 32-
кратном диапазоне значений ПФК (от 15 до 480 мкг×ч/мл, режимы Л15-Л480) в отношении
штаммов с различными значениями МПКМ: S. aureus 479, S. aureus 688 и S. aureus ATCC
700699. Накопление устойчивых стафилококков происходило, когда концентрации
антибиотика находились в пределах ОСМ в течение большей части интервала дозирования.
Это можно проследить на примере трёх из моделируемых фармакокинетических профилей
линезолида и соответствующих им кинетических кривых изменения численности клеток S.
aureus ATCC 700699, устойчивых к 2×МПК антибиотика (Рисунок 2). Резистентность к
линезолиду развивалась, когда его фармакокинетический профиль находился в пределах
ОСМ (режим Л15; TОСМ = 99%, Т>МПКм = 0%), и подавлялась, когда уровни концентрации
антибиотика были ниже МПК (режим Л120; TОСМ = 99%, Т>МПКм = 0%) или выше МПКМ (
режим Л480; TОСМ = 4%, Т>МПКм = 96%).
В условиях, способствующих селекции мутантов, устойчивых к 2×МПК линезолида,
в популяции каждого штамма также шло накопление мутантов, устойчивых к 4×МПК
линезолида (интенсивность их роста зависела от штамма), а в популяции S. aureus АТСС
700699 – также к 8×МПК линезолида.
При моделировании терапевтического режима Л240 наблюдали селекцию мутантов
каждого штамма, наиболее интенсивную – у S. aureus ATCC 700699, причём были выявлены
мутанты данного штамма с уровнем устойчивости выше 2×МПК линезолида.

Рисунок 2. Моделируемые профили линезолида и кинетические кривые изменения
численности мутантов S. aureus ATCC 700699, устойчивых к 2×МПК линезолида. Моменты
введения линезолида обозначены стрелками. ОСМ обозначены закрашенными областями.

Поиск оптимального предиктора развития устойчивости S. aureus к линезолиду.
С целью установления зависимости «антимутантного» эффекта линезолида от
фармакокинетико-фармакодинамических параметров были рассчитаны значения
интегрального параметра ППКM для каждой кинетической кривой, отражающей изменения
численности устойчивых стафилококков во времени.
Минимальное расслоение индивидуальных кривых каждого штамма в системах
координат ППКM-ПФК/МПК и ППКM-ПФК/МПКМ позволяет объединить данные и описать
их уравнением Гаусса (Уравнение 1) с высокими коэффициентами корреляции (r2 = 0,89 и
0,81, соответственно) (Рисунок 3).
Пороговые значения параметров ПФК/МПК и ПФК/МПКМ составили 200 и 80 ч,
соответственно. Зависимость «ППКM – ПФК/МПК» была построена на основании данных,
полученных для штаммов с одинаковым значением МПК (2 мкг/мл), и вопрос о её
применимости для прогнозирования «антимутантного» эффекта линезолида в отношении
штаммов стафилококка с другими значениями МПК линезолида остаётся открытым. В этой
связи параметр ПФК/МПКМ следует считать предпочтительным для использования в
качестве предиктора развития резистентности S. aureus к линезолиду.
При анализе зависимостей ППКM-ПФК/МПК для индивидуальных штаммов S. aureus,
нисходящей половине каждой кривой соответствовали значения T>МПКм > 0. Использование
такого разделения при построении соответствующих графиков зависимости ППК M от TОСМ
позволяет увидеть петлю гистерезиса: для верхней части кривой выполняется условие
T>МПКм = 0, а для нижней – T>МПКм > 0. Гистерезис показан на примере штамма S. aureus
ATCC 700699 на Рисунке 4.

Рисунок 3. Зависимости ППКM для мутантов S. aureus, устойчивых к 2×МПК
линезолида (объединённые данные по трём штаммам), от ПФК/МПК и ПФК/МПКМ.

Рисунок 4. Зависимости ППКM для мутантов S. aureus ATCC 700699, устойчивых к
2×МПК линезолида, от ПФК24/МПК и TОСМ. Значения T>МПКм указаны в выносках.

Зависимость величин ППКM, относящихся к нижней кривой гистерезиса (T>МПКм > 0),
от TОСМ и зависимость ППКM от T>МПКм была описана сигмоидной функцией c r2 = 0,91
(Уравнение 2) (Рисунок 5).
Поскольку одному и тому же значению TОСМ могут соответствовать принципиально
разные уровни устойчивости, предпочтительным для прогноза развития резистентности S.
aureus к линезолиду представляется параметр T>МПКм.
Прогнозируемые пороговые «антимутантные» значения ПФК/МПКМ и T>МПКм
составили 80 ч и 100 % от интервала дозирования, соответственно. Такие значения могут
быть достигнуты при применении линезолида в терапевтической дозе в том случае, если
значение его МПКМ в отношении бактериального штамма не превышает 4 мкг/мл.

Рисунок 5. Зависимости ППКM для мутантов S. aureus, устойчивых к 2×МПК
линезолида (объединённые данные по трём штаммам), от TОСМ и T>МПКм.

Результаты анализа связи между фармакокинетико-фармакодинамическими
параметрами и резистентностью для мутантов S. aureus, резистентных к 4×МПК линезолида,
соответствовали вышеописанным.
Фармакодинамика линезолида в отношении общей популяции клеток S. aureus.
Антистафилококковый эффект линезолида зависел от режима его дозирования и был
качественно схожим в отношении всех изученных штаммов. Эффект отсутствовал при
режимах Л15-Л60 и был умеренным при режимах Л120-Л480, усиливаясь по мере
увеличения моделируемого значения ПФК. Между значениями ППК (объединённые данные
по трём штаммам) и ПФК/МПК была установлена зависимость, описываемая сигмоидной
функцией (Уравнение 2) с r2 = 0,82.

Глава 4. Фармакодинамика линезолида в комбинации с даптомицином в отношении
устойчивых и чувствительных клеток Staphylococcus aureus
С целью оценки возможности преодоления устойчивости S. aureus к линезолиду под
воздействием его комбинации с даптомицином проведены фармакодинамические
исследования cо штаммами S. aureus АТСС 700699 и S. aureus 2061, которые
характеризовались значением МПКМ линезолида, равным 10 мкг/мл.
Определение МПКМ и МПК линезолида и даптомицина.
Значение МПКМ линезолида составило 10 мкг/мл в отношении обоих штаммов,
даптомицина – 10 и 14 мкг/мл в отношении S. aureus 2061 и S. aureus ATCC 700699,
соответственно. Под действием даптомицина значения МПКМ линезолида в отношении
штаммов S. aureus АТСС 700699 и S. aureus 2061 снизились в 3,3 и 2,5 раза (с 10 до 3 и 4
мкг/мл, соответственно). Под влиянием линезолида произошло 2,3- и 1,25-кратное снижение
МПКМ даптомицина в отношении штаммов S. aureus АТСС 700699 и S. aureus 2061 (с 14 и
10 до 6 и 8 мкг/мл, соответственно).
Под влиянием даптомицина значения МПК линезолида в отношении штаммов S.
aureus 2061 и ATCC 700699 снижались в 16 раз (с 2 до 0,125 мкг/мл), а под влиянием
линезолида величина МПК даптомицина в отношении штамма S. aureus ATCC 700699
снизилась в 2 раза (с 0,5 до 0,25 мкг/мл) и не изменилась в отношении штамма S. aureus 2061
(0,25 мкг/мл).
Фармакодинамика комбинации линезолида с даптомицином в отношении
устойчивой субпопуляции S. aureus.
Для оценки «антимутантного» эффекта в отношении обоих штаммов S. aureus
моделировали фармакокинетические профили линезолида и даптомицина отдельно и в
комбинации при их соотношении 1:2. Моделировали режимы дозирования линезолида,
даптомицина и их комбинации при соответствующих терапевтическим (Л240, Д480 и
Л240+Д480, соответственно) и субтерапевтическим значениях ПФК (Л120, Д240 и
Л120+Д240, соответственно). Линезолид вводили каждые 12 ч, даптомицин – каждые 24 ч
на протяжении 5 дней. Сочетанное применение антибиотиков подавляло рост мутантов,
устойчивых к каждому их них, что можно увидеть на примере штамма S. aureus ATCC
700699 при режимах Л240, Д480 и Л240+Д480, (Рисунок 6). Подавление развитие
резистентности было связано с увеличением продолжительности пребывания профиля
антибиотика выше уровня МПКМ, что стало следствием снижения значений МПКМ
препаратов в отношении S. aureus под влиянием друг друга.
Сопоставление значений параметра ППКМ для линезолида (ППКМ(Л)) и даптомицина
(ППКМ(Д)) с соответствующими значениями Т>МПКм подтвердило наличие зависимости:
меньшим значениям площадей (менее выраженное развитие резистентности)
преимущественно соответствовали бόльшие значения Т>МПКм. Также значения ППКМ(Л) и
ППКМ(Д) сопоставляли с новым интегральным параметром ПОМПКМ: их снижение
согласовывалось с увеличением соответствующих значений ПОМПКМ.
С целью оценки надёжности параметров T>МПКм и ПОМПКМ как штаммонезависимых
предикторов «антимутантного» эффекта их значения были сопоставлены с величиной
ППКM(Л) или ППКM(Д) для S. aureus ATCC 700699 и S. aureus 2061 при использовании
антибиотиков отдельно и в комбинации. Расположение точек на графике зависимости
ППКM(Л) или ППКM(Д) от T>МПКм позволяет описать ее сигмоидной функцией (Уравнение 2) с
r2 0,97 или 0,78, соответственно. Та же функция описывает зависимость ППКM(Л) или
ППКM(Д) от ПОМПКМ (r2 0,95 или 0,73, соответственно). На основании зависимости ППКM(Л)
или ППКM(Д) от T>МПКм и ПОМПКМ можно прогнозировать «антимутантные» значения
T>МПКм и ПОМПКМ. Они составили, соответственно, 60% от интервала дозирования
линезолида и даптомицина и 80 мкг×ч/мл.

Рисунок 6. Моделируемые профили линезолида и даптомицина и кинетические
кривые изменения численности мутантов S. aureus ATCC 700699, устойчивых 2×МПК
соответствующего антибиотика, при применении их в отдельности и в комбинации при
терапевтически реализуемых значениях ПФК. ОСМ обозначены закрашенными областями.

Фармакодинамика линезолида, даптомицина и их комбинации в отношении
общей популяции S. aureus.
Эффект комбинации в отношении S. aureus АТСС 700699 и S. aureus 2061 при обоих
моделируемых режимах дозирования был выше эффекта линезолида. Эффект комбинации
линезолида с даптомицином в отношении обоих штаммов S. aureus при режимах Л240+Д480
и Л120+Д240 на протяжении всего периода наблюдения был схожим с эффектом
липопептида в отдельности при режимах Д240 и Д480, соответственно. По-видимому, эти
различия обусловлены значительно бóльшим снижением МПК линезолида под влиянием
даптомицина (16-кратные различия) по сравнению с минимальным снижением МПК
даптомицина под влиянием линезолида (2-кратное различие для S. aureus ATCC 700699 при
отсутствии различий в МПК для S. aureus 2061).
Глава 5. Обсуждение результатов
Антимикробный эффект линезолида в отношении общей популяции трёх изученных
штаммов S. aureus был качественно схожим и зависел от режима дозирования препарата.
Между ППК (объединённые данные по всем штаммам) и ПФК/МПК была установлена
зависимость, описываемая сигмоидной функцией (r2 = 0,82). Сигмоидные зависимости
между параметром, отражающим антибактериальный эффект, и ПФК/МПК прежде были
установлены для многих пар антибиотик-бактерия (Firsov et al., 1997, 2000a, 2001, 2002a,
2002b, 2003, 2006, 2013; MacGowan et al., 2000, 2001; Klepser et al., 2001; Lubenko et al., 2008;
Strukova et al., 2009; 2016a, 2016b).
Настоящая работа стала логическим продолжением исследования, посвящённого
изучению закономерностей развития резистентности S. aureus к линезолиду (Струкова,
2010; Firsov et al., 2015b). В предыдущем исследовании был разработан метод
искусственного обогащения бактериальной популяции стафилококка устойчивыми
клетками, который позволил изучить развитие резистентности к линезолиду у штаммов S.
aureus (Firsov et al., 2015b, 2017; Zinner et al., 2018), в том числе при его сочетанном
применении с рифампицином (Firsov et al., 2017) и гентамицином (Zinner et al., 2018).
Данный метод успешно применили и в настоящем исследовании.
По сравнению с упомянутой работой (Струкова, 2010; Firsov et al., 2015b), в
настоящем исследовании моделировали значительно более широкий диапазон значений
ПФК линезолида. В результате нам удалось установить куполообразные зависимости между
развитием резистентности S. aureus и параметрами ПФК/МПК или ПФК/МПКМ с высокими
коэффициентами корреляции. Подобные куполообразные кривые зависимости
«резистентность – концентрация», подтверждающие справедливость гипотезы ОСМ, ранее
были получены для антибиотиков других классов: фторхинолонов (Firsov et al., 2003, 2013,
2014, 2015a; Zinner et al., 2003, 2013; Croisier et al., 2004; Tam et al., 2007; Gebru et al., 2011;
Strukova et al., 2015, 2016b), гликопептидов (Firsov et al., 2006; Zhu et al., 2012), липопептидов
(Firsov et al., 2006) и бета-лактамов (Stearne et al., 2007). Примечательно, что диапазон
значений ПФК/МПК для S. aureus и линезолида, который соответствовал наиболее
интенсивному обогащению популяции бактерий мутантами (30-60 ч), оказался схожим с
таковыми для S. aureus в случае ванкомицина, даптомицина (20-60 ч) (Firsov et al., 2006) и
фторхинолонов (24-62 ч) (Firsov et al., 2003).
При анализе зависимости ППКМ от TОСМ отмечался гистерезис, связанный и
гетерогенностью ОСМ (Firsov et al., 2008a). Между ППКМ и параметром TОСМ при Т>МПКм =
0 или Т>МПКм были установлены сигмоидные зависимости с высокими коэффициентами
корреляции.
Параметры ПФК/МПКМ и T>МПКм были признаны наиболее надёжными для
прогнозирования селекции устойчивых к линезолиду мутантов S. aureus. Прогнозируемое
пороговое «антимутантное» значение ПФК/МПКМ и T>МПКм в отношении стафилококка
составило, соответственно, 80 мкг×ч/мл и 100% от интервала дозирования линезолида.
Спрогнозированное на основе каждого из параметров пороговое значение МПКМ
линезолида (для терапевтической дозы 600 мг каждые 12 ч) составило 4 мкг/мл.
Если штамм стафилококка, вызвавший заболевание, характеризуется значением
МПКМ линезолида выше порогового, то вероятно развитие резистентности этого штамма к
линезолиду в процессе терапии. Значения МПКМ изученных в фармакодинамических
экспериментах штаммов S. aureus 479, 688 и АТСС 700699, равные 5, 6 и 10 мкг/мл,
соответственно, оказались выше данного критического значения. Наибольшую «опасность»
с точки зрения развития резистентности представляет штамм S. aureus АТСС 700699
характеризующийся значением МПКМ в 2 раза выше порогового. В отношении данного
штамма, а также изолята S. aureus 2061 с таким же значением МПКМ линезолида, была
изучена перспективность применения линезолида в комбинации с даптомицином.
В настоящей работе применяли фармакокинетически-обоснованный подход к
прогнозированиюразвития резистентности бактерийнафонеприменения
комбинированной антибиотикотерапии: оценку значений МПКМ антибиотиков,
применяемых в комбинации, проводили при соотношении концентраций препаратов,
соответствующем соотношению значений ПФК антибиотиков, моделируемых в
фармакодинамических экспериментах (Firsov et al., 2017; Zinner et al., 2018; Golikova et al.,
2019). Под действием линезолида или даптомицина в отдельности при моделировании как
субтерапевтических, так и терапевтических значений ПФК, популяция каждого штамма S.
aureus обогащалась мутантами, устойчивыми к соответствующему антибиотику. При
применении антибиотиков в комбинации, рост клеток стафилококка, устойчивых к
линезолиду или даптомицину, подавлялся полностью или частично, соответственно.
Усиление «антимутантного» эффекта антибиотиков, используемых в комбинации, было
связано со снижением значений их МПКМ в присутствии друг друга.
В настоящей работе было показано соответствие между снижением значений МПК М
антибиотиков под влиянием друг друга, повышением значений T>МПКм или ПОМПКМ
препаратов при их применении в комбинации и возрастанием «антимутантного» эффекта в
отношении S. aureus. Как показал регрессионный анализ, параметры T>МПКм и ПОМПКМ
являются надёжными предикторами «антимутантного» эффекта комбинации линезолида с
даптомицином в отношении S. aureus: была установлена сигмоидная зависимость между
параметрами T>МПКм или ПОМПКМ и ППКM(Л). Ранее возможность использования T>МПКм для
прогнозирования развития резистентности золотистого стафилококка была установлена для
комбинаций линезолид-рифампицин (Firsov et al., 2017) и линезолид-гентамицин (Zinner et
al., 2018), ПОМПКМ – для комбинации даптомицин-рифампицин (Golikova et al., 2019).
Было отмечено усиление антистафилококкового эффекта комбинации по сравнению
с линезолидом, но не с даптомицином. Схожие результаты были получены в нескольких
работах, посвященных изучению эффекта данной комбинации в динамических системах in
vitro (Luther, LaPlante, 2015; Jørgensen et al., 2016). Предположительно, различия между
эффектом каждого из препаратов в отдельности и в комбинации связаны со снижением
значений МПК антибиотиков в присутствии друг друга. Похожая связь прослеживается для
других комбинаций с линезолидом или даптомицином и S. aureus (Firsov et al., 2017; Zinner
et al., 2018; Golikova et al., 2019, 2020). Комбинация линезолид-даптомицин может
представлятьинтересдлятерапиистафилококковыхинфекцийблагодаряеё
потенциальному «антимутантному» действию: возможность предотвратить или, по крайней
мере, отсрочить развитие резистентности бактерий при проведении антимикробной терапии
двумя препаратами повышает шанс успешного лечения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Настоящая работа стала продолжением серии исследований, проводимых ранее в
динамических системах in vitro с антибиотиками разных групп. По результатам настоящего
исследования была подтверждена применимость гипотезы ОСМ к линезолиду при его
действии на штаммы Staphylococcus aureus. Между резистентностью S. aureus к линезолиду
ифармакокинетико-фармакодинамическимипараметрами,отражающимиего
концентрацию, были установлены зависимости, описываемые функцией Гаусса или
сигмоидной функцией.
До сих пор установить применимость гипотезы ОСМ и получить аналогичные
зависимости удалось применительно к антибиотикам групп фторхинолонов, липо- и
гликопептидов, цефалоспоринов. Результаты настоящего исследования позволяют
предполагать, что развитие резистентности бактерий к антибиотикам разных классов
происходит по одним и тем же законам. Установленные зависимости между
резистентностью S. aureus к линезолиду и фармакокинетико-фармакодинамическими
параметрамисталиоснованиемдля выбораоптимальныхпредикторов
антибиотикорезистентности.
Согласно полученным результатам, режим дозирования линезолида, применяемый
для терапии инфекционных заболеваний, не гарантирует предотвращения развития к нему
резистентности S. aureus. Мы установили, что сочетанное применение линезолида и
даптомицина позволяет предотвратить развитие резистентности S. aureus как к линезолиду,
так и к даптомицину, и обеспечивает антистафилококковый эффект, сравнимый с эффектом
даптомицина в отдельности. На основании полученных результатов можно сделать
заключение о перспективности применения данной комбинации антибиотиков в клинике
для терапии стафилококковых инфекций с целью снизить риск развития устойчивости
данного возбудителя к линезолиду и даптомицину.
ВЫВОДЫ
1. Подтверждена применимость гипотезы существования «окна селекции мутантов» к паре
«линезолид – S. aureus»: интенсивность селекции устойчивых к линезолиду мутантов
золотистого стафилококка зависит от положения фармакокинетического профиля
антибиотика относительно «окна селекции мутантов».
2. Установлены зависимости между развитием резистентности S. aureus к линезолиду и его
концентрацией, выраженной при помощи фармакокинетико-фармакодинамических
параметров. Согласно полученным результатам, наиболее надёжными для прогнозирования
эффекта линезолида в отношении резистентных мутантов S. aureus признаны параметры
ПФК/МПКМ и T>МПКм. Рассчитанное на основе этих параметров пороговое значение МПКМ
может быть использовано для оценки риска развития резистентности золотистого
стафилококка к линезолиду.
3. Показано, что линезолид при его применении в дозе, соответствующей терапевтической,
не гарантирует полного подавления селекции устойчивых мутантов S. aureus, что позволяет
сделать вывод о целесообразности применения линезолида в комбинации с другими
антибиотиками.
4. Показано, что сочетанное применение линезолида и даптомицина при моделировании
режимовихдозирования,соответствующихклиническим,характеризуется
«антимутантным» эффектом в отношении золотистого стафилококка. Отмечен сходный
антистафилококковый эффект комбинации линезолида и даптомицина и более
эффективного антибиотика из сочетаемых – даптомицина.
5. Показана применимость параметров T>МПКм и ПОМПКМ для прогнозирования
вероятности развития резистентности S. aureus к линезолиду и даптомицину при их
использовании в комбинации.