Производные хромофоров флуоресцентных белков как флуорогенные красители для белка FAST

Генетически кодируемые флуороген-активирующие белки имеют некоторые
преимущества в сравнении с прочими методами флуоресцентного маркирования.
Малый размер вводимой метки снижает вероятность нарушения функций
исследуемого белка после мечения. Благодаря тому, что флуоресцирует метка
исключительно после образования комплекса белок-флуороген, снижается
уровень фоновой флуоресценции и исключается необходимость отмывки
избыточного количества флуорогена. Кроме того исследователь может
инициировать флуоресцентный сигнал в любой момент простым добавлением
флуорогена или убрать его, с помощью замены среды. Также использование
синтетического флуорогена значительно упрощает задачу по увеличению
цветового разнообразия такого типа меток.
Производные хромофоров флуоресцентных белков высокоперспективны в
качестве флуорогенов. Они имеют малый размер и высокую гидрофильность.
Разработано большое количество удобных синтетических подходов, позволяющих
получать бензилиденимидазолоны различной окраски. Кроме того известно, что
эти соединения имеют крайне слабую флуоресценцию в растворе из-за
подвижности бензилиденового фрагмента, которая приводит к безызлучательному
высвобождению энергии возбужденного состояния. Однако внешняя или
внутренняя фиксация этого подвижного фрагмента приводит к многократному
росту интенсивности флуоресценции.
Настоящая работа посвящена расширению возможностей использования 4-
бензилиден-1Н-имидазол-5(4Н)-онов в роли флуорогенных красителей. Первая
часть работы посвящена разработке новых подходов к синтезу и модификации
этих соединений, в частности, предложены подходы, позволяющие создавать
бензилиден-1Н-имидазол-5(4Н)-оны,которыехарактеризуютсяболее
длинноволновым положением спектров поглощения и эмиссии. Вторая часть
работы посвящена созданию новых флуорогенов для известного флуороген-
активирующего белка FAST.
1.Новые методы синтеза и модификации бензилиден-1Н-имидазол-
5(4Н)-онов
Одной из важных задач при разработке флуоресцентных маркеров является
создание более красных меток. Поглощение и флуоресценция таких соединений
должны лежать в длинноволновой области примерно в диапазоне 700-900 нм. Свет
с такой длиной волны в наименьшей степени поглощается биологическими
объектами. Поэтому первая часть работы посвящена разработке новых
химических модификаций, позволяющих в значительной степени сместить
максимумы абсорбции и эмиссии 4-бензилиден-1Н-имидазол-5(4Н)-онов в
красную область спектра.
1.1Синтез 4-арилиден-1Н-имидазол-5(4Н)-онов с помощью реакции
О-алкилирования амидоацетатов
4-Бензилиден-1Н-имидазол-5(4Н)-оны, имеющие во втором положении
имидазолона акцепторные заместители, например кетогруппы, характеризуются
более длинноволновыми поглощением и испусканием. Благодаря высокой
реакционной способности алкильного остатка во втором положении, имидазолоны
под воздействием диоксида селена легко могут быть окислены до альдегидов или
кетонов. Однако синтез исходных имидазолонов, особенно тех, что содержат
бензильный заместитель во втором положении, зачастую затруднен.
Один из самых популярных подходов к синтезу бензилиденимидазолонов
заключается в использовании реакции циклоприсоединения оснований Шиффа к
иминоэфирам. Иминоэфиры в свою очередь в основном получают из
соответствующих нитрилов в две стадии:

Схема 1. Синтез имидазолонов из имидатов.
Однако у этого подхода есть один существенный недостаток – ограниченный
круг нитрилов, подходящих для данной реакции, а следовательно и ограниченный
круг заместителей, которые можно ввести во второе положение имидазолона.
В настоящей работе была предложена модификация этого метода,
позволяющая получить имидазолоны, содержащие разные заместители во втором
положении, включая бензильные. В качестве альтернативного способа получения
иминоэфиров мы использовали реакцию О-алкилирования амидоацетатов 1 с
помощью тетрафторбората триэтилоксония:

Схема 2. Синтез имидатов из амидоацетатов.
Тетрафторборат триэтилоксония взаимодействует с амидами при комнатной
температуре в присутствии карбоната калия в хлористом метилене с образованием
иминоэфиров. В препаративном плане можно обойтись без выделения полученных
соединений. Так, реакционную смесь промывают насыщенным раствором хлорида
натрия, упаривают и без дополнительной очистки вводят в реакцию
циклоприсоединения с основанием Шиффа.
С помощью предложенной методики были получены производные 4-(4-
гидроксибензилиден)-1Н-имидазол-5(4Н)-она 2a-m, содержащие во втором
положении имидазолона различные заместители, в том числе искомые бензильные
группы. Универсальность данного метода была продемонстрирована синтезом
соединений с этильным, трет-бутильным, фенильным и фенилэтильным
остатками:
Схема 3. Ряд производных 4-(4-гидроксибензилиден)-1Н-имидазол-5(4Н)-она, полученных
по разработанному в данной работе методу.
В ходе синтеза было замечено, что строение вводимого в положение С2
заместителя существенно влияет на ход реакции. Выход реакции варьировался от
25 до 90% (схема 3). С минимальным выходом 25% было получено производное
2b, содержащее трет-бутильный заместитель. Впрочем, стоит отметить, что и
ранее синтез этого вещества удавалось проводить лишь с крайне низкими
выходами.
Далее было изучено влияние заместителя на атоме азота. Было показано, что
заместитель в первом положении имидазолона имеет минимальное влияние –
выходы во всех случаях составили 80-85%:

Схема 4. 4-(4-Гидроксибензилиден)-2-(4-метоксибензил)-1Н-имидазол-5(4Н)-оны с
разными заместителями в первом положении.
Применимость этого метода также была исследована в синтезе имидазолонов
с разными арилиденовыми заместителями (схема 5). В зависимости от
использованного основания Шиффа выход реакции составлял от 30 до 85%.
Схема 5. Варьирование арилиденового заместителя в четвертом положении 2-
бензилимидазолона.
На следующем этапе некоторые производные 4-(4-гидроксибензилиден)-1Н-
имидазол-5(4Н)-она с бензильным заместителем в положении С2 были окислены
до соответствующих 2-ароилпроизводных. Реакция осуществлялась под действием
небольшого избытка диоксида селена в диоксане при кипячении:

Схема 6. Синтез кетонов 5.
Изучение оптических свойств исходных имидазолонов 2 и их окисленных
производных 5 показало, что введение кетогруппы приводит к батохромному
сдвигу спектральных максимумов в среднем на 50 нм (таблица 1).
Синтезированные кетоны 5 и их предшественники 2 имеют в четвертом
положении бензилидена гидроксигруппу и могут существовать в виде анионов.
Было установлено, что для депротонированной формы кетонов характерно
поглощение около 600 нм (таблица 1). Также стоит обратить внимание, что
природа ароматического заместителя при кето-группе практически не влияет на
оптические свойства производных 5. По всей видимости данный фрагмент не в
полной мере входит в общую сопряженную систему молекулы.
Таблица 1. Максимумы абсорбции (в нм) имидазолонов 2 и кетонов 5 в ацетонитриле.
СоединениеНейтральная формаАнионная форма
2e370481
5a418592
2g370481
5b414591
2i370483
5c423602
2j371483
5d423596
2k373490
5e440616
2l372484
5f427602
Таким образом, в настоящей работе был разработан удобный подход к
синтезу 4-арилиденимидазолонов, содержащих во втором положении имидазолона
разные заместители. Окисление 4-гидроксибензиледеновых производных
позволило получить ряд кетонов с абсорбцией в области 600 нм, что делает их
хорошими кандидатами на роль флуорогенных красителей.
1.2Реакция окисления диоксидом селена
Ранее в нашем коллективе было показано, что окисление заместителя в 2-ом
положении4-арилиден-1Н-имидазол-5(4Н)-оновможетприводитьк
формированию циклических амидов, что приводит к батохромному сдвигу на ~50
нм. Нами было предположено, что введение дополнительной С=О группы может
привести к более сильному сдвигу в длинноволновую область. Для получения
таких соединений на первой стадии при взаимодействии ароматических
альдегидов с имидатом были синтезированы имидазолоны 6a-f, содержащие
эфирную группу в боковой цепи. Затем при реакции с аминами из этих эфиров
были получены соответствующие амиды 7a-f:

Схема 7. Синтез амидов 7 для изучения реакции окисления SeO2.
На заключительном нами было изучено окисление соединений 7a-f до
циклических имидов 8a-f под воздействием избытка диоксида селена при
кипячении в смеси вода-диоксан:
Схема 8. Получение циклических имидов 8a-f.
Механизм этого превращения, по всей видимости, включает формирование
альдегида, который затем подвергается нуклеофильной атаке и избыточному
окислению (схема 9). Однако подтвердить предложенный механизм, и
зафиксировать образование альдегида с помощью масс-спектрометрии не удалось.

Схема 9. Возможный механизм окисления.
Изучение оптических свойств исходных амидов 7 и имидов 8 показало, что
подобное окисление приводит к батохромному смещению положений максимумов
поглощения и эмиссии в среднем на 70 нм (таблица 2). Также заметно возрастание
величины стоксового сдвига в ряде случаев почти до 100 нм:
Таблица 2. Оптические свойства амидов 7a-f и имидов 8a-f в ацетонитриле.
СоединениеНейтральная формаАнионная формаСтоксов сдвиг
7a34540863
8a40949889
7b35541560
8b42050787
7c43049464
8c51260593
7d36340845
8d40950697
7e36140746
8e41251098

Заметное влияние на положение спектральных максимумов также оказывает
электронный характер заместителей R1 и R2 в бензилиденовом фрагменте (Схема
8). Так с увеличением донорного характера введенного заместителя максимумы
поглощения и испускания в большей степени смещаются в длинноволновую
область, что хорошо коррелирует с данными, полученными ранее в нашей
лаборатории для других 4-арилиден-1Н-имидазол-5(4Н)-онов1.
Сравнение оптических свойств новых циклических имидов 8b и 8c с ранее
полученными циклическими амидами показало, что введение дополнительной
С=О группы действительно приводит к большему батохромному сдвигу на 30 нм.
В заключении также можно отметить, что все полученные новые циклические
имиды 8a-f имеют квантовый выход флуоресценции около 0.1-0.2%. Такие
оптические свойства – эмиссия в области 500-600 нм и слабая флуоресценция в
свободном виде, говорят о перспективности использования подобных соединений
в качестве флуорогенных красителей.
2.Новые флуорогены белка FAST
Производные хромофоров флуоресцентных белков имеют высокий
флуорогенный потенциал. В частности, в нашей лаборатории уже было показано,
что некоторые производные этой группы могут быть использованы в роли
флуорогенных красителей для отдельных клеточных органелл, в то время как
другие могут быть использованы в роли флуорогенов для флуороген-
активирующих белков, сконструированных нашими коллегами из ИБХ на базе
белка семейства липокалинов.
Флуороген-активирующий белок FAST (от англ. Fluorescence-activating and
Absorption-Shifting Tag) также является перспективным объектом для связывания
производных хромофоров. Этот белок образует флуоресцентные комплексы при
взаимодействии с производными 4-гидроксибензилиденроданина (рисунок 1А).
Помимо многократного усиления флуоресцентного сигнала при формировании
комплекса также происходит батохромное смещение спектральных максимумов
флуорогена, обусловленное депротонированием гидроксигруппы.

Рисунок 1. Роданиновые флуорогены белка FAST2 и хромофор белка GFP.
Высокое структурное подобие хромофоров флуоресцентных белков с
роданиновым флуорогеном (рисунок 1Б), позволяет предположить, что белок
FAST будет также эффективно образовывать флуоресцентные комплексы и с
производными 4-гидроксибензилиденимидазолона.
Baranov M.S., Solntsev K.M., Baleeva N.S., Mishin A.S., Lukyanov S.A., Lukyanov K.A., Yampolsky I. V. Red-Shifted
Fluorescent Aminated Derivatives of a Conformationally Locked GFP Chromophore // Chem. – A Eur. J. 2014. Т. 20. № 41.
С. 13234–13241
Plamont M.A. и др. Small fluorescence-activating and absorption-shifting tag for tunable protein imaging in vivo // Proc.
Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2016. Т. 113. № 3. С. 497–502.
В связи с этим вторая часть настоящей работы посвящена созданию
флуорогеновдлябелкаFASTнаосновепроизводных4-
гидроксибензилиденимидазолона с разным цветовым окрашиванием, и выявлению
самых перспективных кандидатов.
2.1Поиск новых флуорогенов для белка FAST среди различных 4-
гидроксибензилиденимидазолонов
Существенным отличием роданиновых лигандов белка FAST от хромофоров
флуоресцентных белков является присутствие более крупных атомов серы в
роданиновом фрагменте (рисунок 1А, Б). Поэтому для выявления перспективных
кандидатов на роль флуорогенов белка FAST были протестированы разные
производные хромофоров флуоресцентных белков, содержащие гидроксигруппы в
четвертом положении бензилидена.
В это исследование были включены кетоны 5a-f и циклические имиды 8d-f,
синтез которых был описан выше. Также из библиотеки соединений, ранее
полученных в нашей лаборатории, была использована серия производных
хромофора белка GFP GA02-06, содержащая разные алкильные остатки во втором
положении имидазолона. Кроме того был синтезирован ряд аналогов хромофора
белка Kaede 10a-e и 11a-i (схема 10). Синтез этой группы соединений проводился
с помощью конденсации различных альдегидов по метильной группе,
находящейся во втором положении имидазолонового цикла.

Схема 10. Структуры потенциальных флуорогенов белка FAST.
Сотрудниками лаборатории генетически кодируемых молекулярных
инструментов ИБХ РАН был подготовлен образец белка FAST,
иммобилизованного на металл-аффинной смоле TALON. Выявление эффективных
флуорогенов проводилось с помощью масштабного скрининга. Небольшие
количества смолы смешивали с растворами потенциальных флуорогенов в
многолучночных плашках и осматривали на флуоресцентном микроскопе в
различных каналах. В результате было установлено, что для двух соединений 11a
и 11d (схема 10), после взаимодействия с белком FAST наблюдается заметное
усиление флуоресценции.
Эксперименты с очищенным белком в растворе показали, что при
образовании комплексов происходит примерно десятикратное возрастание
интенсивности флуоресценции. Также было установлено, что флуорогены сильно
отличаются по степени связывания с белком. Для производного 11a наблюдается
очень слабое связывание с KD около 50 мкМ, что существенно затрудняет
дальнейшее исследование этого комплекса. В то время как KD соединения 11d
намного меньше (таблица 3). Однако дальнейшее изучение оптических свойств
комплекса белка FAST с производным 11d показало, что квантовый выход этой
пары крайне мал:
Таблица 3. Оптические свойства соединений 11a и 11d в виде комплекса с белком FAST в
фосфатном буфере.
Абсорбция,КоэффициентЭмиссия,Квантовый выходKD,
Соед.
нмэкстинкции, М-1см-1нмфлуоресценции, %μM
11a537-604-~50
11d480210006001.20.54

Полученные результаты подтверждают изначальную гипотезу, что
производные хромофоров GFP, такие как вещества 11a и 11d, будут проявлять
флуорогенные свойства при смешивании с белком FAST. Однако из-за
незначительного усиления флуоресцентного сигнала, а также слабого связывания
(производное 11a) и низкого квантового выхода (производное 11d) они не могут
быть использованы для мечения. Однако эти соединения являются отличной
основой для создания новых производных, среди которых могут быть выявлены
более перспективные флуорогены.
Оптические свойства свободных форм флуорогенов 11a и 11d также были
изучены. Соединения 11a и 11d, как и все 4-гидроксибензилиденимидазолоны,
могут переходить в анионную форму. Было установлено, что процесс
депротонирования сопровождается батохромным сдвигом максимумов на 50-80
нм (таблица 4), рКа соединения 11a составляет 7.55, а соединения 11d – 8.15.
Таблица 4. Оптические свойства соединений 11a и 11d в составе комплекса с белком FAST
и в свободном виде.
11a11d
Абсорбция, нм Эмиссия, нмАбсорбция, нм Эмиссия, нм
нейтр./анион. нейтр./анион.нейтр./анион. нейтр./анион.
В свободном виде (вода)430/511545/600480/512560/600
Комплекс (PBS)537604480600
Стоит отметить, что оптические свойства комплексов в большей степени
схожи со свойствами свободных флуорогенов в анионной форме (таблица 4).
Вероятно, что при формировании комплексов с белком FAST производные
имидазолонов, как и роданиновые флуорогены, депротонируются, и происходит
батохромное смещение спектральных максимумов.
На следующем этапе этого исследования на флуорогенную активность был
протестирован расширенный ряд производных флуорогенов 11a и 11d. Для всех
новых соединений было решено сохранить структурный фрагмент 4-(4-
гидроксибензилидена), который очевидно имеет важное значение в процессе
связывания с белком. Чтобы сместить положения спектральных максимумов в
длинноволновую область в бензилиденовый фрагмент были введены
дополнительные электронодонорные группы, а в стирольный остаток –
акцепторные (схема 11).

Схема 11. Аналоги хромофора белка Kaede как потенциальные флуорогены белка
FAST (в скобках приведены выходы реакции).
Скрининг проводился путем смешивания каждого вещества с белком FAST,
иммобилизованного на металл-аффинной смоле TALON. В результате было
замечено, что для соединений 12c и 12e добавление белка не приводит к усилению
флуоресцентного сигнала. Увеличение интенсивности сигнала в 10-30 раз
наблюдалось для соединений 12d и 13c-e. Такие же результаты были получены
для ряда соединений 14a-g, содержащие разные заместителей в стирольном
фрагменте. Более сильное разгорание, в 50-80 раз, было зафиксировано для
производных, содержащих атомы хлора в бензилиденовом фрагменте (12b и 13b).
Но к наибольшему росту флуоресценции привело введение метоксигруппы во
второе положение бензилиденового фрагмента. Для соединений 12a и 13a
флуоресцентный сигнал усиливался при смешивании с белком FAST почти в 200
раз.
Важно отметить, что помимо способности образовывать флуоресцентные
комплексы флуорогены должны соответствовать и другим требованиям. Для
красителей, используемых во флуоресцентной микроскопии, также необходимыми
характеристиками являются способность проникать через клеточные мембраны и
отсутствие неспецифического окрашивания. Поэтому в продолжение этого
исследования вещества, проявившие флуорогенные свойства, были использованы
для окрашивания в живых клетках.
Сотрудниками лаборатории генетически кодируемых молекулярных
инструментов ИБХ РАН был создан ряд конструкций, белков слияния гистона
Н2В или белков цитоскелета с белком FAST, которые были использованы для
временной трансфекции клеток линии HeLa Kyoto. Исследуемые флуорогены
добавляли в клеточную среду до конечной концентрации 5-10 µМ.
Большинство исследуемых веществ не окрашивали ядра клеток,
трансфицированных конструкцией Н2В-FAST. Добавление лишь некоторых
соединений (11a, 12b и 14a) приводило к появлению слабой флуоресценции.
Наиболее яркий сигнал был получен при использовании производного 12a (рис.
2А). Значимое усиление флуоресцентного сигнала соединения 12a также
наблюдалось на более сложной модели цитоскелета (рис. 2Б, В). Стоит также
отметить, что при использовании этого флуорогена не наблюдалось
неспецифического окрашивания.

Рисунок 2. Флуоресцентная широкопольная микроскопия конструкций белка FAST с
флуорогеном 12a в клетках HeLa Kyoto; масштабная линейка 20 µm.
Исследованиеоптическихсвойствпоказало,чтоспектральные
характеристики комплекса 12a-FAST схожи со свойствами комплекса,
образующегося с ранее предложенным флуорогеном HBR-DOM3 (схема 12).
Положение максимумов абсорбции и эмиссии этих комплексов практически
совпадают (таблица 5). Однако, стоит отметить, что спектр флуоресценции пары
12a-FAST имеет заметно более широкую форму (рис. 3). Применение такой метки
позволит детектировать флуоресцентный сигнал в большем диапазоне, до 700 нм.

Схема 12. Структуры флуорогенов HBR-DOM и 12a.
Таблица 5. Оптические свойства соединений 12a и HBR-DOM в виде комплекса с белком
FAST в фосфатном буфере.
Абсорбция,КоэффициентЭмиссия,Квантовый выходKD,
Соединение
нмэкстинкции, М-1см-1нмфлуоресценции, %μM
HBR-DOM52039000600310.97
12a56223000606250.25

Рисунок 3. Спектры абсорбции и эмиссии комплексов 12a-FAST и HBR-DOM-FAST в
фосфатном буфере.
Взаимодействие белка FAST с производным 12a приводит к смещению
спектральных максимумов. Очевидно, что формирование флуоресцентного
комплекса 12a-FAST, как и в случае вышеописанных флуорогенов,
сопровождается депротонированием гидроксигруппы. Положения максимумов
абсорбции и эмиссии комплекса близки соответствующим анионной формы
свободного соединения 12a (таблица 6).
Li C., Plamont M.A., Sladitschek H.L., Rodrigues V., Aujard I., Neveu P., Le Saux T., Jullien L., Gautier A. Dynamic
multicolor protein labeling in living cells // Chem. Sci. 2017. Т. 8. № 8. С. 5598–5605.
Таблица 6. Оптические свойства производного 12a в составе комплекса с белком FAST и в
свободном виде.
Абсорбция, нмЭмиссия, нм
нейтр./анион.нейтр./анион.
В свободном виде (вода)455/528570/630
Комплекс (PBS)558610
Изучение спектров поглощения производного 12a при разном значении рН в
воде показало, что депротонирование происходит в диапазоне рН 6-8.5 и
характеризуется рКа 7.40. Эти данные позволяют предположить, что при
флуоресцентном мечении живых клеток свободный флуороген 12a, который не
связан белком FAST, будет существовать в двух формах и потенциально может
создавать фоновую флуоресценцию.
Было установлено, что в растворах соединения 12a в фосфатном буфере
действительно присутствуют и нейтральная и депротонированная форма. При
сравнении спектров поглощения и флуоресценции комплекса 12a-FAST и
свободного флуорогена 12a в фосфатном буфере можно увидеть сильное
перекрывание сигналов, особенно хорошо это заметно в спектрах эмиссии:

Рисунок 4. Спектры абсорбции (пунктирная линия) и эмиссии (сплошная линия)
соединения 12a в свободном виде (серый) и в виде комплекса с белком FAST (черный) в
фосфатном буфере.
Однако, квантовый выход флуоресценции нейтральной и анионной формы
соединения 12a в водных растворах не превышает 0.2 %, что на два порядка
меньше квантового выхода комплекса 12a-FAST (квантовый выход равен 25 %).
Таким образом, незначительная фоновая флуоресценция несвязанного флуорогена
будет обеспечивать хорошую контрастность флуоресцентного сигнала метки.
Константа диссоциации комплекса 12a-FAST составила 0.25 µМ, что близко к
аналогичным показателям некоторых из ранее предложенных флуорогенов:
Схема 13. Флуорогены HMBR, HBR-DOM и 12a.
Окрашивание живых клеток линии HEK293NT, трансфицированных H2B-
FAST, показало, что флуороген 12a имеет аналогичную флуорогену HMBR
скорость связывания с белком и вымывания:

Рисунок 5. Флуоресцентная микроскопия клеток линии HEK293NT, трансфицированных
вектором H2B-FAST, при попеременном добавлении и отмывании флуорогенов HMBR и
12a; масштабная линейка 10µm.
Также наши коллеги из лаборатории генетически кодируемых молекулярных
инструментов показали, что этот комплекс, в сравнении с ранее предложенными
роданиновыми, имеет заметно большую устойчивость в условиях флуоресцентной
микроскопии. При интенсивном облучении зеленым и синим светом комплекс
соединения 12a оказался более фотостабильным:

Рисунок 6. Кривые фотообесцвечивания флуоресцентного сигнала комплексов флуороген-
белок в ядрах клеток линии HeLa Kyoto, полученные при облучении лазером 488 нм (А) и
543 нм (Б).
В заключении можно сказать, что соединение 12a может быть использовано в
качестве флуорогена белка FAST для визуализации структур и процессов в живых
системах во флуоресцентной микроскопии. Флуоресцентный комплекс,
образующийся при взаимодействии белка с новым флуорогеном, по своим
характеристикам сопоставим ранее предложенным. Соединение 12a не уступает
роданиновым производным по эффективности связывания с белком. Более того,
новый лиганд формирует комплекс с более широким спектром флуоресценции и
заметно большей фотостабильностью.
2.2Расширение палитры флуорогенов для белка FAST
Широкий спектр задач, решаемых с помощью флуоресцентной микроскопии,
довольно часто требует разработки меток разной окраски. Такие метки позволяют
одновременно следить за разными биологическими объектами в разных каналах
микроскопа. Расширить цветовую палитру меток на основе флуороген-
активирующих белков значительно проще в сравнении с другими
флуоресцентными маркерами. Так как окраска такой метки зависит от флуорогена,
то для изменения цвета необходимо модифицировать лишь молекулу флуорогена
с помощью химических методов.
Флуорогены белка FAST, созданные на основе производных хромофоров
флуоресцентных белков, более доступны для химической модификации, чем
роданиновые флуорогены. Молекула 4-гидроксибензилиденроданина имеет
только одно направление для модификации – бензилиденовый фрагмент. В то
время как ряд производных 12a может быть легко расширен варьированием
стирольных заместителей (схема 14). Кроме того, на сегодняшний день
разработано много удобных подходов к созданию и модификации разных
имидазолонов.

Схема 14. Направление для модификации флуорогенов белка FAST.
Благодаря высокой реакционной способности алкильного заместителя во
втором положении имидазолона на следующем этапе данной работы был получен
ряд аналогов соединения 12a, содержащих различные заместители при двойной
связи (схема 15).
Схема 15. Синтез аналогов соединения 12a.
Введение заместителей разного характера позволило получить библиотеку
соединений, характеризующихся и гипсохромным и батохромным смещением
спектральных максимумов относительно производного 12a.
С использованием реакции окисления были синтезированы кетонные
производные 21a-b и альдегидный аналог 23 (схема 16). При взаимодействии
последнего с различными ароматическими нитрилами были получены аналоги
24a-b, содержащие нитрильный заместитель при двойной связи:
Схема 16. Использование диоксида селена в синтезе флуорогенов белка FAST.
Ряд производных соединения 12a также был расширен имидазо[1,2-
a]пиридин-3(2H)-онами–аналогами, содержащими дополнительное
конденсированное ароматическое кольцо:

Схема 17. Синтез циклических аналогов 12a.
Из литературных данных известно, что введение кето- и нитрильных групп, а
также удлинение π-системы сопряженных связей позволяет значительно сместить
поглощение и флуоресценцию в длинноволновую область.
Образец белка FAST был подготовлен сотрудниками лаборатории
генетически кодируемых молекулярных инструментов ИБХ РАН. Скрининг этой
библиотеки проводился уже не на иммобилизованном белке, а в растворе с
использованием плашечного ридера. Было установлено, что все полученные
соединения проявляют флуорогенные свойства. Однако в некоторых случаях
интенсивность сигнала увеличивалась не более чем в 50 раз. Такие результаты
были получены для енаминных 19a-b, кетонных 21a-b и циклического 26a
производных, а также аналогов 18 и 24a-b, содержащих дополнительные
заместители при двойной связи. Поэтому эти соединения были исключены из
дальнего исследования.
Изучение оптических свойств новых комплексов с белком FAST показало,
что все они имеют квантовый выход флуоресценции от 5 до 30 %, за исключением
циклического производного 26b (таблица 7). Также было отмечено, что введение
различных арильных заместителей незначительно влияет на константу связывания
– величина KD изменяется в диапазоне от 0.15 до 0.95 μM:
Таблица 7. Оптические свойства соединений 12a, 15a-i, 16a-b, 26b и 27a-b в виде комплекса
с белком FAST в фосфатном буфере (вещества расположены в порядке увеличения
батохромного сдвига максимума флуоресценции).
Абсорбция,Эмиссия,Яркость
ε, М-1см-1КВФ, %KD, μM
нмнм(КВФ •ε)
16a53933000570260.448600
15d54934000579280.589500
15h54736000582150.445400
26b570655005840.70.21450
15f52522500588~50.86~5400
15c51921000590~150.93~3000
15g55247000593320.4415000
15i55247000595140.166600
16b54941500605200.408300
12a56223000606250.255800
27b61740000634140.175600
27a61956000636180.1410100
15e533210006415,50.271200
15a54216500644290.165000
15b54215500645320.294800
КВФ – квантовый выход флуоресценции, Ɛ – коэффициент молярного поглощения

Введение разных электронодонорных и акцепторных групп позволило
получить комплексы с флуоресценцией в диапазоне 550-650 нм (таблица 7).
Наиболее красные производные были получены при увеличении системы
сопряженных двойных связей (циклические производные 27a-b или соединение
15e) и введении в пиридиновое кольцо галогенов (соединения 15a и 15b).
На следующем этапе этого исследования нашими коллегами из лаборатории
генетически кодируемых молекулярных инструментов ИБХ РАН новые
флуорогены были протестированы в окрашивании живых клеток HeLa,
трансфицированных конструкцией H2B-TagBFP2-FAST. Флуоресцентный белок
TagBFP2 был использован в качестве стандарта для оценки яркости и уровня
фоновой флуоресценции по отношению к флуоресцентному сигналу комплекса.
Для проведения этого эксперимента из всех соединений, представленных в
таблице 7 были отобраны те, которые при формировании комплекса с белком
FAST демонстрируют большую яркость или имеют более красную
флуоресценцию чем соединение 12a. В результате было установлено, что для трех
соединений 15d, 15g и 27a наблюдается эффективное окрашивание ядер клеток в
отсутствии нецелевой флуоресценции.
Флуорогены 15d и 15g характеризуются гипсохромным сдвигом
спектральных максимумов относительно производного 12a, а соединение 27a –
батохромным:

Рисунок 7. Спектры абсорбции и эмиссии соединений 15d, 15g, 12a и 27a в виде комплекса
с белком FAST в фосфатном буфере.
Сотрудниками лаборатории генетически кодируемых молекулярных
инструментов ИБХ РАН было показано, что такая разница позволяет отслеживать
меченые объекты с использованием разных флуоресцентных фильтров. Фильтр
TRITC использовался для детектирования флуоресцентного сигнала комплекса
15d-FAST, фильтр mCherry для 15g-FAST и фильтр Cy5 для 27a-FAST:

Рисунок 8. Флуоресцентная микроскопия клеток линии HeLa, трансфицированных
конструкцией H2B-FAST (A, B, C), виментин-FAST (D, E, F) и цитокератин-FAST (G, H, I)
с флуорогенами 15d, 15g и 27a; масштабная линейка 10µm.
В результате было продемонстрировано, что бензилиденимидазолоны
являются отличной основой для создания флуорогенов белка FAST различной
окраски. Современные удобные и доступные химические методы позволяют
синтезировать библиотеки производных имидазолонов с различными
заместителями и разными оптическими свойствами.
ВЫВОДЫ
1.На основе реакции О-алкилирования амидоацетатов тетрафторборатом
триэтиоксония разработан новый метод синтеза бензилиденимидазолонов,
позволяющий получать производные с разными вариантами заместителя во
втором положении имидазолонового цикла.
2.Показано, что окисление при помощи диоксида селена может быть
использованодлясозданияширокогонаборазамещенных
бензилиденимидазолонов, отличающихся заметным батохромным смещением
максимумов абсорбции и эмиссии по сравнению с исходными соединениями.
3.С помощью скрининга библиотеки веществ показано, что некоторые
производные хромофоров флуоресцентных белков демонстрируют
эффективное связывание с флуороген-активирующим белком FAST,
сопровождающеесямногократнымвозрастаниеминтенсивности
флуоресценции.
4.Определены взаимосвязи между строением производных хромофоров
флуоресцентных белков, способностью связываться с белком FAST и
свойствами образующихся комплексов. Предложены направления для
структурной модификации флуорогенов.
5.Получена группа веществ, различающихся по своей окраске, которые могут
быть использованы в роли флуорогенов белка FAST. Показано что они могут
применяться во флуоресцентной микроскопии для окрашивания живых
систем.