Размножение Laburnum anagyroides Medik. в условиях in vivo и in vitro при интродукции в Нижнем Поволжье

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
В литературном обзоре изложены сведения о эколого-биологических
особенностях L. anagyroides, проанализированы проблемы и перспективы
микроразмножения древесных растений в условиях in vitro, рассмотрены
факторы, влияющие на его эффективность.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектамиисследованияслужилирастения L. anagyroides,
произрастающие в Ботаническом саду СГУ имени Н.Г. Чернышевского.
Изучение сезонного ритма развития растений проводили в 2017-
2019 гг. по методике И.Н. Бейдеман (1974). Успешность интродукции
оценивали по методике Н.А. Кохно (1980), модифицированной для
засушливых регионов (Арестова, Арестова, 2017). Акклиматизационное
число (А) рассчитывали по формуле:
А = 2Р + 4Гз + 7Зм + 7Зс, где:
Р – показатель роста; Гз – показатель генеративного развития; Зм – показатель
зимостойкости; Зс – показатель засухоустойчивости; перед показателями проставлены
коэффициенты весомости признаков по (Арестова, Арестова, 2017).
Степень акклиматизации определяли в соответствие со шкалой: полная
акклиматизация (А=100-81), успешная акклиматизация (А=80-61),
удовлетворительная акклиматизация (А=60-41), слабая акклиматизация
(А=40-21), отсутствие акклиматизации (А≤20).
Биологию цветения и опыления изучали по методике А.Н. Пономарева
(1975). Цитоэмбриологический анализ осуществляли на препаратах
просветленных пыльников и семязачатков (Herr, 1971), выделенных из
цветков, которые фиксировали каждые 2-3 сут от начала цветения до
увядания. Всего была изучена структура более 1000 семязачатков. Семенную
продуктивность оценивали по И.В. Вайнагий (1974), качество семян – по
М.К. Фирсовой (1959).
В биотехнологических исследованиях стерилизацию растительного
материала проводили 70% этанолом и 0,1% раствором сулемы (HgCl2). В
экспериментах использовали питательные среды Мурасиге-Скуга (MS)
(Murashige, Skoog, 1962) и Woody Plant Medium (WPM) (Lloyd, McCown,
1980). Для индукции морфогенеза в среды добавляли цитокинины (БАП,
кинетин, тидиазурон, зеатин) и ауксины (ИУК, ИМК и НУК) в разных
концентрациях и сочетаниях. Культивирование осуществляли при
температуре 26±2оС при 14 ч фотопериоде, используя Osram Fluora лампы
(3 klux). Гистологические особенности морфогенеза in vitro изучали на
препаратах, приготовленных с использованием техники просветления
растительных тканей (Юдакова и др., 2012).

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1 Оценка успешности интродукции
Фенологические наблюдения показали, что в условиях Нижнего
Поволжья (г. Саратов) L. anagyroides регулярно проходит полный цикл
сезонного развития. Установленный ритм развития вегетативных побегов
позволяет отнести его к поздно начинающим вегетацию, ритм цветения – к
ранне-летним, длительность цветения – к среднецветущим растениям (рис.1).
Месяц, декада
Годапрельмайиюньиюльавгустсентябрьоктябрьноябрь
IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII

2014

2016

2017

2018

2019

– вегетация– цветение
– рост побегов– плодоношение

Рис. 1. Сезонный феноспектр развития L. anagyroides в Нижнем Поволжье

При проведении комплексной оценки адаптивной способности вида
установлено: 1) рост – «относительно умеренный» (3 балла); 2) генеративное
развитие – «всхожих семян мало» (4 балла); 3) зимостойкость – «частично
обмерзают годичные побеги» (4 балла); 4) засухоустойчивость – «растение
вполне засухоустойчиво» (5 баллов). Общее акклиматизационное число – 84
балла, что свидетельствует о полной акклиматизации. Однако случаи
самосева у изученных растений были единичными, а развивающиеся
проростки, как правило, быстро погибали. Для выявления причин низкой
эффективности естественного семенного размножения был осуществлен
цитоэмбриологический анализ, изучены процессы прорастания семян в
лабораторных условиях и первые этапы онтогенеза.

3.2. Особенности семенного размножения L. anagiroides
в условиях Нижнего Поволжья
Цветки L. anagyroides мотылькового типа, зигоморфные, обоеполые.
Андроцей состоит из 10 тычинок, в пыльниках которых формируется по
705,6±10,5 пыльцевых зерен. Гинецей монокарпный. Завязь содержит 5,2±0,1
кампилотропных, крассинуцеллятных и битегмальных семязачатков.
Соотношение количества пыльцевых зерен к количеству семязачатков (P/O
ratio) – 1440, что характерно для факультативных аллогамов (Cruden, 1977).
Зрелые пыльцевые зерна округлой формы, трехпоровые, средний диаметр
24,1 мкм. Средняя степень дефектности пыльцы – 15,4%. В ходе
проведенного цитоэмбриологического исследования уточнен тип развития
женского гаметофита. Guignard (1881) впервые описал его как Polygonum-
тип, но позднее Rembert (1966) идентифицировал его как Allium-тип.
Характерной особенностью L. anagyroides является осуществление второго
деления мейоза только в халазальной клетке диады мегаспор, тогда как
микропилярная клетка не делится и постепенно дегенерирует. В результате
вместо тетрад мегапор образуются триады. Наличие таких триад указывает
на моноспорический тип развития зародышевого мешка, а биполярность и
восьмиядерность зрелых мегагаметофитов – на Polygonum-тип.
Анализ 800 зародышевых мешков показал, что зародыш и эндосперм
развиваются в результате оплодотворения. Гаметофитных аномалий,
нарушений эмбрио- и эндоспермогенеза, а также эмбриологических
признаков апомиксиса не зарегистрировано. Из-за того, что многие
зародышевые мешки остаются неоплодотворенными, в среднем только 30-
40% семязачатков развиваются в семена. При средней потенциальной
семенной продуктивности 5,2±0,1 семязачатков на завязь, реальная семенная
продуктивность составляет 1,4±0,1 семян на плод. Тем не менее, большое
количество соцветий и цветков в них позволяют изученным растениям
ежегодно производить более 3000 полноценных семян. Сформировавшиеся
зрелые семена практически не содержат эндосперм. V-образно изогнутый
зародыш занимает почти весь объем семени. Зародыш нормально развитый,
дифференцированный. Средний вес 1000 семян – 19,6±3,4 г.
При проращивании семян в лабораторных условиях на фильтровальной
бумаге наклёвывание единичных из них происходило в среднем на 9-е сут. В
области микропиле появлялся зародышевый корешок длиной 1-2 мм. Через
1-2-е сут от начала прорастания корешок удлинялся до 5-12 мм. В это же
время появлялся этиолированный гипокотиль длиной 3-4 мм, который на
4-5-е сут проращивания зеленел и удлинялся до 15-25 мм. Семядольные
листья проростков эллипсовидной формы, ярко-зеленые, гладкие,
цельнокрайние, длиной 5-7 мм, шириной 3-4 мм, разворачивались на 6-8-е
сут от начала прорастания. На 7-9-е сут у проростков развивался первый
настоящий лист.
Через 1 мес прорастало не более 10% интактных семян. Остальные,
несмотря на нормальное строение, даже не набухали, что свидетельствует о
водонепроницаемости семенной оболочки, характерной для многих бобовых.
Дляпреодолениятвердосемянностисеменабылиподвергнуты
стратификации: теплой (обработка горячей водой, +90°С, 15 мин), холодной
(промораживание сухих семян при –18°С, 1 мес); и переменному
температурному воздействию (–18°С, 1 мес / +90°С, 15 мин). Холодная
стратификация повысила частоту прорастания с 4,8% (в контроле) до 9,9%, а
воздействие высокими и переменными температурами – до 82,2% (Р ≤ 0,01).
Длительность высокотемпературной предобработки (5, 15 и 25 мин) не
влияла на частоту прорастания (75,5, 84,5, 80,0%, соответственно). Однако
после 5 мин предобработки у 71,4% семян кожура сохраняла свою жесткость,
что затрудняло разворачивание семядольных листьев и приводило к гибели
проростков. Проростки, развившиеся после высокотемпературной
предобработки, проходили все основные фазы своего развития, их
морфометрические параметры не отличались от контрольных показателей,
чтосвидетельствуетоботсутствиинегативноговлияния
высокотемпературной предобработки семян на рост и развитие зародыша.
Большинство проростков, развившихся на фильтровальной бумаге,
были гидратированы (рис. 2, а) и погибали после высадки в почву, поэтому
дополнительно были изучены другие субстраты для проращивания:
кокосовое волокно и питательная среда MS, дополненная 0,5 мг/л БАП
(табл. 1).
Таблица 1.
Частота прорастания семян L. anagyroides на различных субстратах
Количество проросших семян, %
Субстрат дляпосле температурной предобработкиСредние
без
проращивания(фактор В)значения
обработки
(фактор А)–18°С,+90°С,–18°С, 1 мес/(фактор A)
(контроль)
1 мес15 мин+90°С, 15 мин
Фильтровальная
4,8 a9,9 a 82,2 defg82,2 efg 44,8 b
бумага
Кокосовый
6,7 a13,3 a 51,8 b80,2 cdefg 38,0 a
субстрат
MS +
7,8 a11,9 a 82,3 fg86,1 g47,0 b
0,5 мг/л БАП
Средние значения
6,4 a11,7 a 71,1 b82,9 c-
(фактор B)
F(A) 5,4* , F (B) 290,1 ***, F (A×B) 4,8*
Примечание. В каждом варианте изучено три повторности по 15-20 семян. Данные,
обозначенные разными буквами в одном столбце, достоверно различаются по результатам
двухфакторного дисперсионного анализа, *Р ≤ 0,05, ***Р ≤ 0,01.
Во всех вариантах высокотемпературное воздействие оказалось
эффективнее низкотемпературного (табл. 1). На кокосовом субстрате
развивались нормальные проростки (рис. 2, б), но после пересадки в почву
приживалось не более 40-50% из них. Проростки, развившиеся на
питательной среде MS с 0,5 мг/л БАП, имели укороченный и утолщенный
гипокотиль и небольшой корешок (рис. 2, в), однако именно они после
высадки в почву приживались с высокой частотой (95-98%).

абв

гд

Рис. 2. Проростки L. аnagyroides, развившиеся на разных субстратах:
а – через 3 нед на фильтровальной бумаге; б – через 3 нед на кокосовом субстрате;
в – через 3 нед на среде MS с 0,5 мг/л БАП; г – через 1 мес (слева) и 3 мес (справа)
выращивания в почве; д – через 6 мес выращивания в почве. Масштаб: 10 мм

Через 1 мес выращивания высота сеянцев достигала 30,50±1,56 мм,
размеры семядольных листьев – 11,12±0,29 мм в длину и 6,25±0,16 мм в
ширину, у растений появлялся и разворачивался первый настоящий лист
(рис. 2, г). Через 2-2,5 мес развивалось 2-3 небольших тройчатосложных
листа 14,65±0,74 мм длиной и 7,90±0,38 мм шириной (рис. 2, г). Через 3-
3,5 мес семядольные листья желтели и опадали, проростки переходили к
автотрофному питанию. Через 4 мес от начала выращивания в почве высота
сеянцев достигала 50,12±5,49 мм, размеры листьев – 18,98±0,64 мм в длину,
10,21±0,32 мм в ширину. Постепенно ростовая активность снижалась, листья
опадали, ткани побега одревесневали на ⅔ его высоты, растения уходили на
покой. Высота сеянцев 1-го года жизни достигала 50-55 мм, диаметр
стволика – 3-4 мм. Стержневая корневая система состояла из главного корня
длиной 50-60 мм и нескольких боковых корней длиной от 5 до 20 мм
(рис. 2, д). Проростки выдерживаили пересушивание субстрата до 4-5 сут, но
даже однократное переувлажнение субстрата приводило к их гибели.
Таким образом, наиболее эффективным способом массового получения
проростков L. anagyroides является культивирование высокотемпературно
предобработанных семян на питательной среде MS, дополненной 0,5 мг/л
БАП. Культивирование семян на питательной среде позволяет получать
стерильные проростки, которые в дальнейшем можно либо высаживать в
почву для получения сеянцев, либо, в случае ограниченности семенного
материала, клонировать в условиях in vitro для массового размножения.

3.3 Разработка технологии
клонального микроразмножения L. аnagyroides
Для микроразмножения L. anagyroides был выбран метод активации
пазушных пресформированных меристем побегов при культивировании
ювенильного (семена) и зрелого растительного материала (вегетативные
почки и узловые сегменты побегов). В первом случае у стерильных
проростков, развившихся из высокотемпературно предобработанных семян
на среде MS с 0,5 мг/л БАП (рис. 3, а) отсекали корень, а оставшуюся часть
переносили на среды для собственно размножения различного состава
(табл. 2). Во всех вариантах экспланты дали 100%-ный морфогенный ответ,
но максимальные показатели микроразмножения (4,1-4,7 микропобегов от
одного экспланта) были получены на среде MS с добавлением БАП или ТДЗ
в концентрации 0,5 мг/л и на WPM с 0,5 мг/л БАП. Однако в последнем
случае развивались укороченные побеги (рис. 3, б), а при использовании ТДЗ
наблюдались морфозы побегов и листьев (рис. 3, г). Наиболее оптимальной
как для инициации стерильных культур, так и для собственно размножения
микроклонов оказалась среда MS с 0,5 мг/л БАП. Развившиеся побеги
переносили далее на среду для укоренения или вновь на среду для
размножения. Стабильно пролифирирующие культуры, не теряющие
потенциала размножения, удавалось поддерживать на протяжении 2-2,5 лет.
Таблица 2.
Регенерация микропобегов L. anagyroides на средах различного состава
Состав питательной средыКоличествоДлина
минеральнаяфитогормон, мг/лмикропобегов,микропобегов,
основаБАПТДЗштмм
MS0,5–4,7 d21,5 d
2,0–3,1 ab29,7 e
4,0–3,4 ab14,5 bc
–0,54,4 cd16,7 c
–2,03,1 ab15,8 bc
–4,03,2 ab15,5 bc
0,250,254,0 abc13,3 a
0,50,54,2 abc13,3 a
½MS0,5–3,5 abc16,8 c
2,0–3,2 ab16,9 c
WPM0,5–4,1 bcd11,0 a
2,0–3,0 a13,0 ab
F4,5*28,1*
Примечание: В каждом варианте изучены две повторности по 10 эксплантов. Данные,
обозначенные разными буквами в одном столбце, достоверно различаются по результатам
однофакторного дисперсионного анализа, * Р ≤ 0,05.
аб

вг

Рис. 3. Инициация и собственно размножение в культуре проростков:
а – проростки, развившиеся на среде MS с 0,5 мг/л БАП после
высокотемпературной предобработки семян (слева) и контроль (справа) (3 нед); б –
культура побегов, полученная на среде MS (слева), ½MS (в центре), WPM (справа),
каждая среда дополнена 0,5 мг/л БАП (6 нед); в – пучок микропобегов, развившийся на
среде MS с 0,5 мг/л (слева) и 4,0 мг/л БАП (справа) (8 нед); г – пучок микропобегов,
развившийся на среде MS с 0,5 мг/л БАП (слева) и 2,0 мг/л ТДЗ (справа) (8 нед). Масштаб:
10 мм

При разработке технологии клонирования растений с использованием
зрелого материала в качестве первичных эксплантов использовали
одиночные пазушные почки и узловые сегменты (пазушная почка + часть
побега длиной 5-7 мм). На питательной среде узловые сегменты массово
дегенерировали (рис. 4, а), тогда как изолированные почки зеленели и росли.
Через 4 нед количество успешно инициированных почек (72,5%) было
достоверно (Р ≤ 0,05) выше количества инициированных узловых сегментов
(9,1%). На этапе инициации изолированных почек было апробировано 8
вариантов питательных сред различного минерального и гормонального
состава. Наилучший рост и развитие эксплантов наблюдали на среде MS с
добавлением 0,5 мг/л БАП (рис. 4, б).
Установлена сезонная зависимость приживаемости изолированных
почек in vitro. Среднее количество почек, инициированных весной и осенью
(75,3 и 70,7%, соответственно), было достоверно выше, чем летом (14,3%,
Р ≤ 0,01). При последующем размножении различий между культурами,
инициированными весной и осенью, не наблюдалось. Это позволяет
равнозначно эффективно инициировать стерильные культуры от почек, как
весной, так и осенью.
абв

гд
Рис. 4. Инициация и собственно размножение в культуре пазушных почек:
а – первичные экспланты через 2 нед культивирования на среде MS с 0,5 мг/л БАП
(слева – почки, справа – узловые сегменты); б – прорастающие почки через 6 нед
культивирования на среде MS с 0,5 мг/л БАП; в – пучок микропобегов через 3 мес
культивирования на MS с 0,5 мг/л БАП; г – побеги, развившееся через 8 нед
культивирования на ½ MS (слева), MS (в центре) и WPM (справа), каждая среда
дополнена 0,5 мг/л БАП; д – побеги, развившиеся через 6 нед культивирования на ½ MS с
0,5 мг/л (слева) и на ½ MS с 2,0 мг/л БАП (справа). Масштаб: 10 мм
При субкультивировании на среде MS с 0,5 мг/л БАП на главном
побеге развивались пазушные побеги. Через 3-4 мес формировался пучок из
микропобегов длиной от 3 до 10 мм (рис. 4, в). Пазушные побеги размером
≥5 мм отделяли и переносили на среды различного минерального состава
(табл. 3). Максимальное количество вторичных эксплантов (85,9%) было
инициировано на среде ½ MS. Каждый эксплант при этом продуцировал
наибольшее количество пазушных побегов (3,0). Данную среду использовали
далее для выявления эффективного индуктора пролиферации побегов.
Таблица 3.
Регенерация микропобегов L. anagyroides на средах различного минерального состава,
дополненных 0,5 мг/л БАП (8 нед культивирования)
КоличествоКоличествоДлина
Питательная
инициированныхразвившихся побегов,микропобегов,
среда
эксплантов, %шт.мм
MS45,0 b1,1 a9,7 a
½ MS85,9 c3,0 b9,5 a
WPM26,9 a1,1 a8,3 a
F93,54**10,60*1,95 ns
Примечание: В каждом варианте изучены две повторности по 10 эксплантов. Данные,
обозначенные разными буквами, достоверно различаются по результатам одно-
факторного дисперсионного анализа; *Р < 0,05; **Р ≤ 0,01; ns – нет достоверной разницы. Развитие максимального количества пазушных микропобегов стимулировал БАП в концентрации 0,5 и 2,0 мг/л (табл. 4). Однако длительное культивирование на среде с 2,0 мг/л БАП вызывало витрификацию тканей и появление аномальных побегов и листьев, тогда как на среде с 0,5 мг/л БАП развивались стабильно пролиферирующие культуры, которыесохранялиспособностькформированиюнормальных жизнеспособных микропобегов на протяжении 3 лет. Таблица 4. Регенерация микропобегов L. anagyroides под влиянием различных фитогормонов (8 нед культивирования на ½ MS) КоличествоКоличество Длина микропобегов, Фитогормоны, мг/линициированныхразвившихся мм эксплантов, % микропобегов, шт. БАП, 0,585,9 b3,0 d9,5 d БАП, 1,081,8 b1,7 abc9,1 cd БАП, 2,085,8 b3,0 d9,2 cd БАП, 4,080,3 b2,0 bc11,5 a БАП, 0,5 + Кин, 0,554,4 ab2,5 cd7,8 bc Кин, 0,5 + НУК, 0,565,9 ab1,2 ab6,0 a ТДЗ, 0,562,0 ab2,1 bcd8,5 cd ТДЗ, 2,065,3 ab2,3 abc10,7 a Зеатин, 0,534,8 a1,0 a6,9 ab F3,4*5,8**6,9** Примечание: В каждом варианте изучены три повторности по 10 эксплантов. Данные, обозначенные разными буквами, достоверно различаются по результатам однофакторного дисперсионного анализа; *Р < 0,05; **Р ≤ 0,01. При культивировании зрелого и ювенильного материала коэффициент размножения не превышал 4-5 побегов на эксплант. В тоже время наряду с развитием пазушных побегов у эксплантов в области каллуса развивались многочисленные адвентивные побеги. Как правило, их не используют для клонального мироразмножения, поскольку они могут возникать в результате непрямого органогенеза, что увеличивает вероятность сомаклональной изменчивости. Для выявления путей морфогенеза было проведено гистологическоеисследованиеэксплантов,культивируемыхна безгормональной среде (контроль) и на среде MS, дополненной 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 и 4,0 мг/л БАП. На среде без гормонов каллус не формировался. На средах с добавлением БАП у первичного побега под каллусной тканью разрасталась базальная часть (рис. 5). В ней формировались проводящие пучки и зоны повышенной пролиферативной активности, которые давали начало апикальным меристемам новых побегов. Развитие адвентивных побегов посредством прямого органогенеза из меристем первичного побега обеспечивает их генетическое соответствие и позволяет использовать все вновь развившиеся побеги для увеличения коэффициента размножения и массового получения посадочного материала. С увеличением концентрации БАП в среде интенсивность пролиферации тканей увеличивалась, но при этом многочисленные адвентивные побеги были сильно укороченными, что затрудняло их использование для микроразмножения. Таким образом, среда MS, содержащая 0,5 мг/л БАП, является оптимальной не только для инициации стерильной культуры с использованием ювенильного и зрелого растительного материала L. anagyroides, но и обеспечивает образование хорошо развитых адвентивных побегов, которые можно использовать для увеличения коэффициента размножения. гл п гл п ктап пп абвг Рис. 5. Продольные срезы эксплантов, развившихся на среде MS c 0,5 мг/л БАП: а – через 3 нед культивирования (гл п – главный побег; кт – каллусная ткань; пп – проводящие пучки); б – развитие адвентивного побега (ап) через 8 нед культивирования; в – «почка» адвентивного побега (12 нед); г – прорастание адвентивных побегов через каллусную ткань (12 нед культивирования). Масштаб: 1 мм Для индукции корнеобразования микропобеги длиной ≥10 мм отделяли и пассировали на питательные среды различного состава (всего 11 вариантов). Нормальные корни развивались только на ¼ MS, дополненной ауксинами (ИУК, ИМК и НУК) в концентрации 0,5 мг/л. НУК стимулировал образование корней у наибольшего количества регенерантов (61,3%) (табл.5). Таблица 5. Ризогенез побегов L. anagyroides на среде ¼ MS, дополненной ауксинами (4 нед культивирования) КоличествоСреднее количество Ауксин, мг/лукоренившихсякорней наДлина корней, мм побегов, %регенеранте, шт. 0,00,00,00,0 ИУК, 0,524,7 a1,5 a8,0 a ИМК, 0,529,7 a5,8 b21,6 b НУК, 0,561,3 b5,4 b21,3 b F11,2*7,0*19,8** Примечание: В каждом варианте изучены три повторности по 10 эксплантов. Данные, обозначенные разными буквами в одном столбце, достоверно различаются между собой по результатам дисперсионного анализа; * Р < 0,05; ** Р ≤ 0,01. Ризогенез начинался через 10-14 сут после переноса побегов на среду с ауксинами. Развитие корней способствовало росту побегов и новых листьев (рис. 6). Спустя 30-45 сут регенеранты помещали в пробирки с нестерильной водой на 10-14 сут и затем пересаживали в почву. Положительные результаты были получены при использовании рыхлого водопроницаемого субстрата (рН 6,0-7,0) и хорошего дренажа посадочных емкостей (до ½ объема). Регенеранты не переносили переувлажнение субстрата. Выживаемость растений составила 70-75%. абва Рис. 6. Укорененные in vitro регенеранты L. anagyroides: а – через 4 нед культивирования на ¼ MS с 0,5 мг/л ИУК; б – через 4 нед культивирования на ¼ MS с 0,5 мг/л НУК (слева) и ИМК (справа); в – через 6 нед выращивания в теплице. Масштаб: 10 мм На основе проведенных исследований разработаны протоколы клональногомикроразмноженияL. anagyroides с использованием ювенильного и зрелого материала (табл.6). Таблица 6. Протоколы клонального микроразмножения L. anagyroides Продол- ТипЭтапы Описаниежитель- эксплантамикроразмножения ность Ювенильный материал СеменаСтерилизация1) 1 % р-р СМС;15 мин 2) 70 % р-р спирта1 мин 3) 0,1 % р-р сулемы15 мин 1. ПолучениеПроращивание асептических семян на3-4 нед проростковсреде MS + 0,5 мг/л БАП 2. СобственноКультивирование верхушек проростков6-8 нед рамножениена среде MS + 0,5 мг/л БАП 3. УкоренениеКультивирование микропобегов длиной4-6 нед ≥10 мм на среде ¼ MS + 0,5 мг/л НУК 4. Адаптация кВысадка регенерантов в смесь листовой4-8 нед нестерильнымземли и кокосового волокна (1:1) условиям Зрелый материал ВегетативныеСтерилизация1) 1 % р-р СМС;15 мин почки2) 70 % р-р спирта1 мин 3) 0,1 % р-р сулемы10 мин 1. ИнициацияКультивирование почек на среде MS +2 нед стерильных0,5 мг/л БАП культур 2. СобственноКультивирование верхушек6-8 нед рамножениемикропобегов на ½ MS + 0,5 мг/л БАП 3. УкоренениеКультивирование микропобегов длиной3-4 нед ≥10 мм на среде ¼ MS + 0,5 мг/л НУК 4. Адаптация кВысадка регенерантов в смесь листовой4-8 нед нестерильнымземли и кокосового волокна (1:1) условиям ГЛАВА 4. ОБСУЖЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Проведенное исследование показало, что растения L. anagyroides полностью адаптировались к условиям Нижнего Поволжья. Однако их семена характеризуются низкой полевой и лабораторной всхожестью (8- 12%), тогда как у семян, полученных от растений, произрастающих в естественных местообитаниях, лабораторная всхожесть составляет около 70% (Poşta, Florin, 2017). Формирование твердосемянности, характерное для бобовых, связано с функционированием хилума, который, открываясь при низкой влажности воздуха, способствует обезвоживанию семян, и, закрываясь при высокой влажности, препятствует потери воды (Терехин, 1996). В Нижнем Поволжье период созревания семян обычно жаркий и засушливый. Высокие температуры и низкая влажность обуславливают обезвоживаниесемянистимулируютбыстроеформирование твердосемянности, а отрицательные температуры и низкая влажность в зимние месяцы увеличивают глубину покоя, вследствие чего способность семян к самостоятельному прорастанию значительно снижается. Развитие гидратированных нежизнеспособных проростков при проращивании на фильтровальной бумаге, а также гибель проростков при переувлажнении кокосового субстрата выявили еще одну возможную причину отсутствия массового самосева при интродукции L. anagyroides в Нижнем Поволжье. Быстрое таяние снега и обильные весенние осадки, а также особенности почвы в пункте интродукции (суглинок, отсутствие дренажа) приводят к избыточному увлажнению и застою влаги в почве вследствие чего единичные проростки, развившиеся от самосева, погибают. Результатыисследованияпозволяютконстатировать, что лимитирующими факторами для реализации семенного размножения у L. anagyroides в условиях Нижнего Поволжья являются: 1) высокая температура и низкая влажность воздуха в период созревания семян, способствующие быстрому формированию твердосемянности; 2) низкая температура и влажность зимнего периода, усиливающие глубину покоя; 3) высокая влажность почвы весной, приводящая к гибели единичных проростков, развившихся от самосева. Получить посадочный материал L. anagyroides можно только в лабораторныхитепличныхусловиях,соблюдаяследующую последовательность технологических процессов: 1) обработка интактных семян 15-25 мин горячей водой (≈90оС); 2) проращивание предобработанных семян в течение 3-4 нед в условиях in vitro на питательной среде MS, дополненной 0,5 мг/л БАП; 3) выращивание полученных сеянцев не менее 1 года в условиях теплицы в рыхлой почвенной смеси (рН 6,0-7,0), исключая переувлажнение субстрата. Для размножения элитных, адаптированных к новым условиям, генотипов и получения исходного материала для селекции могут быть использованы протоколы микроразмножения. При их разработке были установлены следующие специфические особенности размножения L. anagyroides в культуре in vitro. Так, в отличие от большинства древесных растений, в том числе и бобовых (Ahuja, 1993; Vengadesan et al., 2002), использование в качестве первичных эксплантов узловых сегментов оказалось значительно менее эффективным по сравнению с одиночными почками. Причем, вегетативные почки равнозначно успешно были инициированы не только весной, но и осенью. При микроразмножении как ювенильного, так и зрелого материала БАП в концентрации 0,5 мг/л не эффективно стимулировал регенерацию побегов и обеспечивал стабильную пролиферацию культур на протяжении 2-3 лет. Лучшим индуктором ризогенеза оказался НУК в концентрации 0,5 мг/л. Коэффициент размножения при культивировании и ювенильного, и зрелого материала составил в среднем 4-5 микропобегов. Результаты проведенного исследования могут быть использованы для массового размножения L. anagyroides в регионах, где его естественное семенное размножение затруднено, что позволит более интенсивно применять его как высоко декоративное растение и источник ценного фармацевтического сырья. ВЫВОДЫ 1. В условиях умеренно-континентального климата Нижнего Поволжья L. anagyroides регулярно проходит полный цикл сезонного развития, который совпадает с таковым в естественных местообитаниях. Общее акклиматизационное число составляет 84 балла, что свидетельствует о полной акклиматизации и успешной интродукции растений в условиях Нижнего Поволжья. 2. Цитоэмбриологический анализ показал, что изученные растения характеризуются половым способом репродукции и факультативной аллогамией (P/O ratio = 1440±84). Зародышевые мешки развиваются в соответствии с Polygonum-типом. Средняя степень дефектности пыльцы 15,4%. Эмбрио- и эндоспермогенез осуществляются без нарушений, растения формируют полноценные семена. 3. Отсутствие у L. anagyroides массового самосева при интродукции в Нижнем Поволжье обусловлено глубоким физическим покоем семян, вследствие чего более 90% из них не способны к естественному прорастанию, а также гибелью проростков из-за несоответствия эдатафических и гидротермических условий пункта интродукции естественным местообитаниям. 4. Из апробированных вариантов искусственного выведения семян L. anagyroides из состояния покоя и получения жизнеспообных проростковнаиболееэффективнымоказалосьпроращивание о высокотемпературно предобработанных (+90 С, 15-25 мин) семян на среде MS с добавлением 0,5 мг/л БАП. Высокотемпературная предобработка не оказывала негативного влияния на зародыш и стимулировала прорастание 82,3% семян. Проращивание в условиях in vitro обеспечило получение проростков, которые после высадки в почву приживались с высокой частотой (95-98%). 5. Для массового размножения и отбора растений, адаптированных к новым эколого-климатическим условиям, были разработаны протоколы клонального микроразмножения L. anagyroides с использованием зрелого и ювенильного растительного материала. Вне зависимости от типа первичного экспланта питательная среда MS эффективнее среды WPM. Лучший индуктор морфогенеза среди протестированных цитокининов – БАП, среди ауксинов – НУК. Оптимальная концентрация фитогормонов составила 0,5 мг/л, более высокие концентрации стимулировали развитие аномальных побегов и корней. Коэффициент размножения при культивировании как ювенильного, так и зрелого материала составил в среднем 3-5 микропобегов. 6. Одновременно с пазушными побегами, развившимися путем прямого органогенеза, развивались многочисленные адвентивные побеги из каллуса, сформировавшегося в базальной части эксплантов. Гистологическое исследование показало, что не зависимо от используемых концентраций БАП все вновь развившиеся адвентивные побеги являются результатом пролиферативной активности меристем базальной части главного побега и связаны с ним общей проводящей системой. Это допускает использование адвентивных побегов для увеличения коэффициента размножения и массового получения посадочного материала.