Разработка, фармако-токсикологические свойства и эффективность применения препарата фитоглинол в молочном скотоводстве

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Диссертационная работа выполнена в период с 2018 по 2021 гг. в ФГБНУ «Краснодарский научный центр по зоотехнии и ветеринарии» на базе отдела фар- макологии Краснодарского научно-исследовательского института в соответствии с планом научно-исследовательских работ по направлению 160. Молекулярно- биологические и нанобиотехнологические методы создания биопрепаратов но- вого поколения, технологии и способы их применения с целью борьбы с особо опасными инфекционными, паразитарными и незаразными болезнями животных с No госрегистрации АААА-А19-119111590044-2 (0688-2019-0019).
В проведении отдельных лабораторных исследований и клинических ис- пытаний принимали участие М.П. Семененко, Е.В. Кузьминова, Е.В. Рогалева, А.А. Абрамов, Е.В. Долгов.
Экспериментальная часть исследований посвящена разработке и изучению фармако-токсикологических и специфических свойств нового инъекционного препарата фитоглинол, обладающего антиоксидантным и стресс-протекторным действием на организм животных, а также его клинической эффективности в производственных условиях.
Все исследования проведены в соответствии с этическими принципами экс- периментирования на животных, изложенных в «Европейской конвенции по за- щите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других науч- ных целях» (Страсбург, 1987) и на основании «этического кодекса», содержащего международные рекомендации по проведению медико-биологических исследова- ний с использованием животных (Запорожан В.Н., 2005).
Основной объект исследования – фитоглинол, комплексный инъекционный препарат, в состав которого входит дигидрокверцетин (Dihydroquercetinum), ами- ноуксусная (Glycine) и янтарная (Acidum succinicum) кислоты, водный экстракт душицы обыкновенной (Origanum Vuigare L.), диметилсульфоксид (Dimethylsulfoxide) и вода для инъекций.
Дополнительными объектами исследования служили лабораторные и про- дуктивные животные – белые беспородные крысы (n=180), белые беспородные мыши (n=24), морские свинки (n=10), кролики (n=13), коровы стельные (n=40) и
новотельные (n=30) голштинской породы молочного направления в возрасте 3-4 лет.
Лабораторные исследования по изучению токсикометрических характери- стик препарата, его фармакологических свойств и специфической активности были проведены на базе отделов фармакологии и эпизоотологии, микологии и ВСЭ ФГБНУ КНЦЗВ, а также в условиях вивария Краснодарского научно-иссле- довательского ветеринарного института – обособленного структурного подраз- деления ФГБНУ КНЦЗВ. Клинические эксперименты проведены в учебно-опыт- ном хозяйстве «Кубань» ФГБОУ ВО «Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина».
При проведении экспериментов были использованы следующие виды ис- следований: клинические (n=930), гравиметрические (n=1882), гематологиче- ские (n=2009), биохимические (n=3788), гистологические (n=400).
Доклинические исследования препарата фитоглинол проведены в соответ- ствии со следующими методическими положениями и руководствами: «Методы определения токсичности и опасности химических веществ» под ред. И.В. Са- ноцкого (1970); «Методические рекомендации по токсико-экологической оценке лекарственных средств, применяемых в ветеринарии» (1998); «Научно-методо- логические аспекты исследования токсических свойств фармакологических ле- карственных средств для животных» (Смирнов А.М., Дорожкин В.И., 2008); «Ру- ководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармако- логических веществ», под общей редакцией проф. Р.У. Хабриева (2005); «Руко- водство по проведению доклинических исследований лекарственных средств» (часть первая), под ред. А.Н. Миронова (2012).
Острая токсичность препарата изучалась на половозрелых белых беспо- родных крысах и мышах обоего пола в двух сериях экспериментов при однократ- ном внутрижелудочном (с помощью металлического атравматического зонда) и парентеральном введении максимальных доз, предусмотренных для данного вида лабораторных животных, и с учетом пути введения фармакологического средства (5 мл для крыс и 0,5 мл для мышей). Животным контрольных групп теми же способами эквиобъемно применяли физиологический раствор.
Субхроническая токсичность препарата фитоглинол оценивалась на белых лабораторных крысах обоего пола (n=40), сформированных в 4 группы с учетом физиологического состояния, возраста и массы тела при внутримышечном спо- собе введения 3 уровней субтоксических доз, рассчитанных от максимально вве- денной в остром эксперименте. Критериями возможного токсического эффекта от длительного применения препарата служило клиническое состояние крыс, воз- можное число павших особей и сроки их гибели, гравиметрические, гематологи- ческие, биохимические и гистологические показатели опытных животных.
Определение массы тела у всех животных проводилось в динамике в начале опыта и затем каждые 10 дней на электронных весах (М-ER 122 ACF (JR), НПВ- 300). Кровь для морфо-биохимических исследований отбиралась в конце опыта у пяти животных из каждой группы.
Отбор проб для морфогистологических исследований органов и тканей ла- бораторных животных проводился согласно «Морфологическим исследованиям в ветеринарных лабораториях» (2008). Для гистологического исследования у крыс из каждой группы отбирались участки сердца, легких, печени, почек, селезенки. Материал готовился общепринятыми гистологическими методами. Срезы толщи- ной 5 мкм после депарафинирования окрашивались гематоксилином и эозином, а далее заключались в канадский бальзам. Фотографирование готовых гистологи- ческих препаратов проводилось при увеличениях х5, х10, с использованием мик- роскопа МС 300 (Австрия) со специализированным программным обеспечением регистрации изображения цифровой камерой Leica.
Функциональное состояние почек лабораторных животных оценивалось по органолептическим (визуально) и физико-химическим (с помощью поли- функциональных индикаторных тест-полосок УРОПОЛИАН-XN (производи- тель ООО «Биосенсор АН»)) показателям мочи. Органолептические показатели включали объем, консистенцию, цвет, запах, прозрачность; физико-химические показатели – удельный вес (относительную плотность), рН, концентрацию белка, глюкозы, кетоновых тел, билирубина, уробилина, гемоглобина.
Исследование пищеварительной системы проводилось путем оценки фека- лий кроликов по следующим тестам: цвет, консистенция, запах, примеси – визу- ально, рН – с помощью рН-метра ИВА-ТЕСТ, наличие билирубина – пробой Фуше, следы крови – бензидиновой пробой, желчные пигменты – пробой Терк- вея. Микроскопией исследовалось наличие клетчатки, крахмала, детрита, лейко- цитов, яйца простейших и гельминтов (Письменная С.В., 2013).
Исследование аллергенности препарата изучалось с помощью накожных ап- пликаций – на морских свинках и конъюнктивальной пробы – на кроликах (Саноц- кий И.В., 1970). Степень реакции учитывалась по оценочной шкале в баллах.
Эмбриотоксическое и тератогенное действие определялось согласно «Ме- тодическим указаниям по изучению репродуктивной токсичности фармакологи- ческих веществ» (Хабриев Р.У., 2005).
Ветеринарно-санитарная экспертиза мяса кроликов после использования препарата фитоглинол проводилась согласно ГОСТ 20235.0-74 – Мясо кроликов (качество мяса и жира кроликов, методы отбора образцов, химического и микро- скопического анализа) по оценке органолептических и вкусовых качеств мяса и бульона, биохимических показателей (рН с помощью рН-метра, реакции на пе- роксидазу, наличию аммиака, реакции с флороглюцином в ацетоне и резорцином в бензоле (по Видману) (Смольникова Я.В., Рубчевская Л.П., 2010).
Изучение анксиолитического действия препарата фитоглинол проводи- лось по его влиянию на поведенческую активность белых крыс в тесте «открытое поле». Критериями оценки служили следующие параметры: количество пересе- ченных квадратов опытными животными, вертикальные стойки, исследователь- ская активность, время неподвижности, груминг, дефекация, уринация крыс (Ку- рьянова Е.В., 2013).
Оценка адаптогенных, стресс-протекторных и антиоксидантных свойств фитоглинола проведена в двух сериях эксперимента на моделях острого стресса
9

(по методу Ю.И. Добрякова, 1978) и длительного теплового стрессирования лабо- раторных белых крыс в условиях специально оборудованной климаткамеры.
О выраженности стрессорной реакции организма животных и эффективно- сти фармакокоррекции фитоглинолом в ходе проведения модельных опытов су- дили по изменению показателей эмоционального состояния крыс, клинической картине, гравиметрическим показателям тела, терморегуляции, морфологиче- ским и биохимическим показателям крови, процессам развития продуктов пе- роксидации и эндогенной интоксикации в организме животных.
Морфологические и гематологические исследования крови проводились на гематологическом анализаторе для in vitro диагностики фирмы «ORPHEE» – Mythic 18 (страна-производитель Швейцария), биохимические исследования – с помощью биохимического автоматического анализатора Vitalab Selectra Junior с версией программного обеспечения 1.0. (открытая система для проведения фо- тометрических тестов, изготовитель Vital Scientific N. V. Netherlands) с исполь- зованием реактивов фирмы ELITech Clinical Systems (Франция) и Аnalyticon biotechnologies AG (Германия).
Уровень эндогенной интоксикации определялся по уровню молекул сред- ней массы (МСМ) по методу Н.И. Габриэлян и В.И. Липатовой (1984).
Оценка показателей системы ПОЛ-АОЗ проводилась в соответствии с ме- тодическими положениями по изучению процессов свободнорадикального окис- ления и системы антиоксидантной защиты организма (ВНИВИПФиТ (2010). По- казатели уровня общих липидов оценивались при помощи специализированного набора в опыте с серной кислотой фирмы DAC-SpectroMed.
Эффективность фитоглинола при профилактике оксидативного и коррекции послеродового стресса изучена в условиях учебно-опытного хозяйства «Кубань» Кубанского ГАУ имени И.Т. Трубилина на коровах голштинской породы 8-го ме- сяца стельности и новотельных коровах (10-14 дней после отела) как самостоя- тельного средства, так и в сравнении с препаратом эмидонолом 10 %.
Клиническая эффективность фармакопрофилактики определялась по вли- янию препарата на показатели метаболического статуса, степени развития эндо- токсемии и инициации процессов липопероксидации.
Расчет экономической эффективности проводился по «Методическим ре- комендациям по определению общего экономического эффекта от использова- ния результатов научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ в Агропромышленном комплексе» (2007) и «Экономической эффективности при- менения современных лекарственных средств в животноводстве, птицеводстве и звероводстве» (Никитин Н.И., 2014).
Достоверность результатов, полученных в ходе экспериментальной обра- ботки материалов, проводилась с помощью программного обеспечения фирмы Mikrosoft ®, фирмы Carl Zeiss ®, оценивалась по t-критерию Стьюдента и выра- жалась в виде средней арифметической (M±m). Полученные цифровые данные обрабатывались с использованием пакета статистических программ Statistica 6.0.
3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1 Состав и физико-химические свойства препарата фитоглинол
Фитоглинол (Phytoglinol) – комплексный инъекционный препарат для внутримышечного введения. В 1 мл содержится: дигидрокверцетин – 10 мг, ами- ноуксусная кислота – 50 мг, экстракт душицы – 10 мг, янтарная кислота – 10 мг, диметилсульфоксид – 0,2 мл, вода для инъекций – до 1 мл.
По внешнему виду представляет раствор темно-коричневого цвета, со спе- цифическим запахом и вкусом, имеет рН, равный 4,09.
Препарат апирогенен, стерилен, сохраняет стабильность в течение 1 года при соответствующих условиях хранения в герметичной упаковке, в сухом, за- щищенном от солнечных лучей месте при температуре 0+25оС.
3.2 Токсикологическая оценка фитоглинола
Острая токсичность фитоглинола изучалась на белых нелинейных крысах и белых мышах обоего пола в двух сериях эксперимента. В первой серии препарат животным вводился однократно непосредственно в желудок с помощью металли- ческого атравматического зонда в дозах, составляющих 5 мл для крыс и 0,5 мл для мышей (максимальные объемы, которые можно ввести белым лабораторным кры- сам с массой тела 210-240 г и белым мышам с массой тела 20-40 г).
Во второй серии острую токсичность фитоглинола оценивали при его внутримышечном введении лабораторным животным в дозах, аналогичных внутрижелудочному введению (5,0 и 0,5 мл на животное). Контрольным группам животных с учетом способа введения в тех же дозах применялась дистиллиро- ванная вода и физиологический раствор.
Негативное действие препарата на организм оценивалось по степени его функциональной и поведенческой токсичности, проявляемой по числу погибших и выживших крыс и мышей, динамике развития симптомов отравления и реаби- литации, а также по влиянию на клинический статус и особенности поведения грызунов.
Наблюдение, проводимое за животными на протяжении 14 дней постин- токсикационного периода, не выявило признаков клинической картины токси- коза и гибели ни в одной из опытных групп мышей и крыс, на основании чего среднесмертельную дозу (LD50) для фитоглинола определить не удалось. Следо- вательно, по степени фактической безопасности изучаемый препарат по ГОСТ 12.1.007-76 «Вредные вещества» отнесен к 4-му классу опасности (вещества ма- лоопасные).
Субхроническую токсичность фитоглинола оценивали при его внутримы- шечном введении белым нелинейным крысам обоего пола (n=40), сформирован- ным в 4 группы по 10 животных в каждой. Поскольку при оценке острой токсич- ности препарата среднесмертельная доза (ЛД50) установлена не была, расчет суб- токсических доз крысам опытных групп производился, исходя из максимально
введенной дозы, используемой в остром эксперименте – 5 мл, по следующей схеме:
1 опытная – 1/10 от максимальной дозы – 0,5 мл;
2 опытная – 1/20 от максимальной дозы – 0,25 мл;
3 опытная – 1/50 от максимальной дозы – 0,1 мл.
Контрольная группа – физиологический раствор в дозе 0,5 мл на животное. Длительность экспериментального периода составила 28 дней. Клиническая картина длительного введения фитоглинола позволила уста-
новить у первой опытной группы состояние умеренной сонливости, некоторой заторможенности и более слабого реагирования на внешние раздражители. Во второй и третьей опытных группах поведенческие реакции крыс отличались бо- лее выраженной активностью, тактильная чувствительность нарушена не была, изменения мышечного тонуса не наблюдались. Кормовые привычки были сохра- нены во всех опытных группах.
Несмотря на ежедневное стрессирование, связанное с фиксацией, внутри- мышечным введением препаратов и микротравмированием мягких тканей под- опытных животных, отклонений в потере мышечной массы крыс выявлено не было. Напротив, в опытных группах была отмечена тенденция к увеличению массы тела животных на 0,7-3,5 %, в зависимости от дозы фитоглинола.
Все определяемые морфологические константы крови крыс, получавших инъекции фитоглинола, были сопоставимы с аналогичными данными группы контроля и находились в пределах видовой нормы.
Результатами биохимического исследования подопытных животных выяв- лен ряд изменений гомеостаза крови и, в первую очередь, показателей белкового обмена. Концентрация общего белка в опытных группах, независимо от дозы вве- денного препарата, превышала значения контрольных крыс на 7,2; 7,8 и 10,3 % соответственно. Аналогичная картина прослеживалась и по уровню мочевины, межгрупповые различия которой в сравнении с контролем составили 5,4; 16,2 и 17,6 %. Активность АсАт была увеличена во всех группах (в среднем, на 10,3- 28,6 %) как результат появления в сыворотке фермента мышечной ткани, обуслов- ленного множественными травмами мягких тканей заднебедренных мышц. Все остальные значения биохимических показателей крови крыс по группам находи- лись в диапазоне видовой нормы и существенных различий не имели.
Препарат при длительном введении не вызывает отрицательного воздей- ствия на органы пищеварительной и выделительной системы животных, не об- ладает местными аллергическими и раздражающими свойствами, не проявляет эмбриотоксического и тератогенного действия, не влияет на течение беременно- сти и роды лабораторных животных, а также анатомию строения внутренних ор- ганов и их патоморфологические и гистологические изменения.
Ветеринарно-санитарной экспертизой мяса и бульона установлено отсут- ствие отрицательного влияния фитоглинола на качество и вкусовые особенности мяса кроликов.
Специфическая активность фитоглинола
3.3.1 Влияние на поведенческую активность крыс (анксиолитическое действие)
Целью исследований явилась оценка влияния препарата фитоглинол на со- стояние лабораторных крыс в условиях экспериментально созданного стресса, позволяющая выявить изменения поведенческой активности и эмоциональности животных. Тестирование проводилось на базе вивария на четырех группах бес- породных белых крыс (n=10) с массой тела 200-250 г. в тесте «открытое поле» (open field test) в течение 3-х дней. Препарат вводился крысам (n=5) внутримы- шечно за два дня до опыта и на 1-й день тестирования в следующих дозах: в 1 группе – 0,2 мл/животное, во 2 – 0,1 мл/животное, в 3 – 0,05 мл/животное. Кон- трольной группе грызунов в том же режиме вводился физиологический раствор в дозе 0,1 мл/животное. Оценка ориентировочно-исследовательского поведения осуществлялась по следующим параметрам: горизонтальная активность (коли- чество пересеченных квадратов), вертикальная активность (количество верти- кальных стоек), реакция груминга, исследовательская активность (число загля- дываний в норки), дефекация.
Результатами исследований установлено увеличение горизонтальной ак- тивности в первой опытной группе – 45,1±1,08 квадратов, что превысило пока- затели других опытных групп в 1,4 (2 группа) и 1,56 (3 группа) раз. Вертикальная активность во всех группах варьировала менее значительно, при этом макси- мальное количество вертикальных стоек было зарегистрировано во второй опыт- ной группе – 9,0±0,70 шт.
Исследовательская активность в опытных группах была ниже чем в кон- трольной группе, что может свидетельствовать о наличии противотревожного эффекта у изучаемого препарата (таблица 1).
Таблица 1 – Результаты тестирования крыс в «открытом поле» (М±m; n=5)
Показатель
Кол-во вертикальных стоек, шт. Кол-во пересеченных квадратов, шт. Исследовательская
активность, шт. норок Время неподвижности, с Груминг, раз.
Груминг, с
Дефекация (кол-во фекальных болюсов, шт. )
Уринация, шт.
Группы
1 опытная 7,80±0,50
45,1±1,08*
3,2±0,12
20,5±1,84 8,2±0,08* 45,0±1,14
2,4±0,05
2 опытная 9,00±0,72
32,1±0,86
3,5±0,07
20,4±1,01 7,1±0,14 47,2±1,25
3 опытная 7,8±0,44
28,9±1,04
3,4±0,41
28,1±2,17 6,4±0,06 45,7±1,18
3,8±0,07 0,8±0,04
4 контроль 6,9±0,65
28,7±1,18
4,0±0,14
25,4±1,37 6,8±0,15 48,6±1,28
4,2±0,24 1,1±0,02
3,0±0,04* 1,0±0,07
1,0±0,02
Степень достоверности: *р 0,05 по отношению к контролю
13

В 3 опытной группе было отмечено увеличение времени неподвижности, составившее в среднем 28,1±2,17 секунды. В этой же группе и в группе контроль- ных крыс частота и продолжительность груминга составила, в среднем, 6,4±0,06 и 6,8±0,15 раз. Увеличение дефекации отмечено в третьей опытной группе, где количество фекальных болюсов составляло 3,8±0,07 шт., и контроле – 4,2±0,24 шт. Показатели уринации в группах относительно не варьировались.
Таким образом, в условиях модельного стресса препарат фитоглинол про- явил прямо пропорциональное дозам действие на уровень тревоги животных и снижения стрессового состояния при попадании в незнакомую ситуацию.
3.3.2 Влияние фитоглинола на организм крыс в условиях острого стресса
Эксперимент по оценке влияния препарата фитоглинол на организм жи- вотных после слабого стрессирующего воздействия проведен на половозрелых белых нелинейных крысах со средней массой тела 200-220 г, разделенных на три группы по 6 особей в каждой. Опытным группам крыс превентивно в течении 5 дней до начала эксперимента препарат фитоглинол вводился внутримышечно в следующих дозах: 1 опытная – 0,1 мл/животное; 2 опытная – 0,2 мл/животное, а затем за 2 часа до подвешивания была введена разрешающая доза препарата (0,1 мл и 0,2 мл соответственно по группам). Контрольной группе крыс в той же по- следовательности вводился физиологический раствор в дозе 0,2 мл/животное. В качестве стрессирующего фактора использовалось подвешивание животных на 60 минут фиксацией под лопатки с помощью шпагата (метод Ю. И. Добрякова, 1978).
Результатами эксперимента установлено, что острая эмоциональная стрес- сорная нагрузка способствовала снижению общего количества лейкоцитов в пе- риферической крови грызунов всех подопытных групп. Однако применение фи- тоглинола позволило предотвратить резкое падение лейкоцитов. Так в первой опытной группе его концентрация снизилась относительно видовой нормы крыс на 25,0 %, во второй – на 12,9 %, тогда как в группе контроля снижение лейко- цитов от нижних границ нормы колебалось на уровне 44,3 %. Межгрупповые различия по данному показателю составили 34,6 и 56,4 % в пользу значений опытных животных. Данный вид стресса вызвал абсолютную лимфоцитопению на фоне нейтрофилии со сдвигом вправо (количество лимфоцитов по группам сни- зилось на 17,7; 19,6 и 38,0 %, тогда как уровень сегментоядерных нейтрофилов, напротив, увеличился на 12,0; 18,3 и 38,9 % соответственно). Остальные морфо- логические показатели крови крыс существенных изменений не претерпели.
При анализе биохимических показателей основные изменения регистриро- вались по уровню общего белка и глюкозы, концентрация которых в контрольной группе была существенно увеличена в сравнении с аналогичными значениями крыс опытных групп (таблица 2).
Межгрупповые различия по общему белку между контролем и опытом со- ставили 1,3 (1 опытная группа) и 1,57 раза (2 опытная группа), по глюкозе – 1,38
и 1,53 раза соответственно. По другим биохимическим константам достоверно значимых изменений отмечено не было.
Таблица 2 – Влияние фитоглинола на морфо-биохимические показатели крови лабораторных животных на фоне острого стресса (М±m; n=6)
Показатели
Лейкоциты, 109/л Палочкоядерные нейтрофилы Лимфоциты
Общий белок, г/л
Глюкоза, ммоль/л
1 Опытная 5,25±0,13 2,7±0,03
53,9±2,23* 58,5±4,5 7,1±0,22*
Группы 2 Опытная 6,1±0,27** 3,2±0,01
52,2±5,70 48,3±2,1** 6,4 ±0,4*
Контрольная 3,9±0,42 5,6±0,02
40,3±4,80 75,9±4,3 9,8±0,5
Различия достоверны *р<0,05; **р<0,01 в сравнении с группой контроля Парентеральное введение фитоглинола лабораторным крысам не позво- лило развиться резкой гипергликемии как одному из маркеров стрессовой реак- ции, а также привело к частичному сохранению антиоксидантной защиты и уменьшению концентрации токсических продуктов ПОЛ и МСМ (таблица 3). Таблица 3 – Влияние фитоглинола на показатели ПОЛ и эндотоксикоза лабораторных животных на фоне острого стресса (М±m; n=6) Показатели ДК (232) , ед. опт. плотн./мл КД (273) , ед. опт. плотн./мл МДА (537), мкмоль/мл Группы, n=10 1 Опытная 2 Опытная Параметры липопероксидации Контрольная 1,77±0,21 0,83±0,07 0,081±0,05 0,52±0,01 0,268±0,03 0,78 ± 0,01 0,64 ± 0,029* 0,071 ± 0,01 0,52± 0,03* 0,57 ± 0,05* 0,08 ± 0,02 Молекулы средней массы 0,40±0,02 0,32±0,03* 0,243±0,01 0,237±0,01 Различия достоверны *р<0,05 в сравнении с группой контроля 254 нм, усл. ед. 280 нм, усл. ед. Разница по диеновым конъюгатам между опытными и контрольной груп- пами составила 2,27 и 3,4 раза. Аналогичные изменения наблюдались и по кетоди- енам. Межгрупповые различия находились на уровне 1,3 и 1,45 раза. Под дей- ствием фитоглинола в опытных группах произошло снижение отдельных фракций среднемолекулярных пептидов. В первой группе уровень МСМ при длине волны 254 нм был ниже аналогичного показателя группы контроля на 23,1 %, при длине волны 280 нм – на 9,3 %. Во второй опытной группе – на 38,5 и 11,6 % соответ- ственно, что свидетельствует об уменьшении интенсивности эндотоксикоза. Таким образом, превентивное введение фитоглинола на фоне острого стрессирования способствует частичному угнетению интенсификации процес- сов липопероксидации, снижает цитолиз и реактивирует состояние звеньев ан- тиоксидантной и антирадиальной защиты, а также оказывает положительное влияние на метаболический статус лабораторных животных. 3.3.3 Стресс-протективная и антиоксидантная активность фитоглинола при тепловом стрессе у крыс Оценка стресс-протекторного и антиоксидантного действия препарата фи- тоглинол на организм животных в условиях теплового стресса проведена на 45 белых нелинейных крысах со средней массой тела 260-300 г, разделенных на пять групп. Первая группа (n=5) – интактные здоровые животные, вторая, третья, четвертая группы (n=10) – опытные, пятая группа (n=10) – контроль. Экспери- мент предполагал изучение различных доз и временных интервалов введения препарата фитоглинол опытным группам крыс на фоне повышенных температур и высокой влажности. Интактные особи были взяты в эксперимент для контроля физиологического состояния организма животных, не подвергавшихся термиро- ванию. Схема опыта представлена в таблице 4. Таблица 4 – Схема опыта при тепловом стрессе у крыс Группа, n Интактные, n=5 1 Опытная, n=10 2 Опытная, n=10 3 Опытная, n=10 Контрольная, n=10 Кратность введения Без применения препаратов Фитоглинол в течении 5 дней, 1 раз в день до опыта, за 1 час до термирования и в течении 4 дней термирования (всего 9 дней) Фитоглинол в течении 5 дней, 1 раз в день до опыта, за 1 час до термирования и в течении 4 дней термирования (всего 9 дней) Фитоглинол во время опыта за 1 час до термирования (всего 4 дня) Физиологический раствор в течении 5 дней до опыта, за 1 час до термирования и в течении 4 дней термирования (всего 9 дней) Доза препарата, мл/жив – 0,5 мл 0,25 мл 0,5 мл 0,5 мл Тепловой стресс воспроизводили путем термирования исследуемых живот- ных в специально оборудованной климаткамере, для чего ежедневно в течении четырех дней контрольную и опытные группы крыс групповым методом в специ- альных боксах с оборудованными отверстиями для поступления кислорода поме- щали на 20 минут в камеру при температуре + 40 °C и влажности 80-85 %. Полученные в ходе эксперимента данные показали, что длительное тепло- вое воздействие на животных приводит к характерному для стрессовой реакции снижению массы тела. Так в контрольной группе крыс на фоне ежедневного тер- мирования отмечено убывание массы тела (59,6 % от массы тела интактных крыс). Тогда как введение фитоглинола в опытных группах способствовало со- хранению гравиметрических показателей животных с некоторыми колебаниями весовых показателей (на уровне тенденции). В первой опытной группе был от- мечен прирост массы тела на 3,1 г, во второй опытной группе – 4,5 г. Наиболь- ший прирост был выявлен в 3 опытной группе, в которой фитоглинол вводился в дозе 0,5 мл за час до термирования – 5,8 г. По данным термометрии колебания температуры в первой и второй опыт- ных группах, в которых фитоглинол вводился пролонгировано, регистрировались в пределах физиологической нормы, тогда как в 3 опытной группе отмечено по- вышение температуры в среднем на 0,8°C (в пределах физиологической нормы). В группе контроля в первые три дня опыта температурные колебания в сторону увеличения составили в среднем на 1,2±0,1°C, на 4 день различия между темпера- турой до термирования и после него составили 1,9±0,2°C (рис. 1). 40,5 40 39,5 39 38,5 38 37,5 37 36,5 36 1 день до терм. 1 день после терм. Опыт 1 2 день до терм. 2 день после терм. 3 день до терм. Опыт 3 3 день после терм. 4 день до терм. Контроль 4 день после терм. Опыт 2 Рис. 1 – Динамика температуры тела крыс при термировании По результатам морфологических исследований у крыс всех групп отме- чено снижение абсолютного количества лейкоцитов и нейтрофилов, что можно характеризовать как абсолютную видовую лейкопению. Однако на фоне лейко- пении у животных опытных групп к концу экспериментального периода выявля- ется увеличение общего количества лейкоцитов. Наибольшие показатели отме- чаются у крыс первой опытной группы, различия у которых с контрольными ана- логами составили 1,93 раза, а с интактными животными – 2,04 раза. По другим опытным группам повышение регистрировалось на уровне 1,6 и 1,7 раза и 1,2 и 1,3 раза соответственно. В третьей опытной группе процентное содержание нейтрофильных гранулоцитов в сравнении с группой контроля увеличилось на 7,1 %, с группой интактных крыс – на 55,1 %. По количеству моноцитов во вто- рой и третьей опытных группах повышение было значительным, составляя 44,3 % и 16,0 % относительно контрольных аналогов и 84,4 % и 48,2 % относительно крыс, не подвергавшихся термированию. По остальным показателям значения животных всех групп были в пределах видовой нормы. При оценке биохимических показателей сыворотки крови установлено, что уровень общего белка в группах, в которых фитоглинол вводился за 5 дней до термирования, был ниже значений интактного контроля на 3,75 (1 группа) и 10,4 % (2 группа) соответственно. При этом доза введения препарата оказала прямое влияние на степень снижения концентрации белка в сыворотке крови. То есть, большая дозировка (0,5 мл/животное) позволила предотвратить протеиновые по- тери, несмотря на наличие дополнительного стресса, обусловленного внутримы- шечными манипуляциями. Тогда как в третьей опытной группе уровень общего белка находился в пределах значений крыс, не подвергавшихся термированию. При исследовании уровня глюкозы в крови по опытным крысам различия с группой контроля составили 2,21; 1,51 и 2,57 раза в пользу животных, которым проводилась фармакокоррекция. У крыс, перенесших термирование после пред- варительной фармакокоррекции фитоглинолом, отмечалось статистически зна- чимое снижение аланинаминотрансферазы – в 1,61 и 1,97 раза (р<0,05) в сравне- нии с интактной группой животных. С контролем различия по данным группам составили 23,8 и 33,4 % соответственно. Негативный эффект теплового воздействия на крыс сопровождался актива- цией процессов ПОЛ и накоплением в крови продуктов пероксидации – увеличе- нием содержания диеновых конъюгатов – на 19,3; 10,5; 22,8 % (опытные группы) и 54,4 % (группа контроля) относительно животных, не участвующих в процессе термирования и кетодиенов – на 26,5; 32,4; 23,5 и 47,1 % соответственно. Концен- трация малонового диальдегида (МДА) возросла только в контрольной группе крыс – на 14,2 %, тогда как у животных первых двух опытных групп, получавших в качестве превентивного курсового (5 дней) назначения фитоглинол в различных дозах, уровень МДА снизился как по отношению к группе контроля – в 1,5 и 1,36 раза, так и по отношению к интактным крысам – в 1,32 и 1,2 раза. При оценке концентрации МСМ в крови животных, измеренных на длине волны МСМ λ=237 нм, установлено, что в двух опытных (1 и 3) и контрольной группах получены результаты, свидетельствующие о повышении содержания МСМ после термирования. Однако значения среднемолекулярных пептидов в опытных группах были близки к таковым у интактных крыс и колебались в пре- делах 1,2-10,1 %. Тогда как в группе контрольных крыс увеличение молекул сред- ней массы составило 22,5 %. При использовании длин волны λ=254 и 280 нм по- лученные данные были аналогичными – во всех опытных группах отмечалось умеренное увеличение СМП, за исключением контроля, значения которых пре- восходили показатели интактной группы на 25,0-33,3 %. Таким образом, фитоглинол в условиях теплового стресса обладает выра- женной антиоксидантоной и противотоксической активностью, способствуя раз- витию компенсаторных реакций, направленных на восстановление гомеостаза организма животных. 4 Клиническая эффективность препарата фитоглинол 4.1 Эффективность при профилактике оксидативного стресса у стельных коров в период сухостоя Опыт проведен на базе учебно-опытного хозяйства «Кубань» Кубанского ГАУ имени И.Т. Трубилина на коровах 8-го месяца стельности со средней мас- сой тела 520-600 кг. Предварительные исследования физиологического состоя- ния животных, оцениваемые по клиническому статусу и биохимическому про- филю сыворотки крови, показали, что в организме сухостойных коров в условиях промышленного содержания, характеризующегося наличием огромного количе- ства факторов, к которым вынужден приспосабливаться организм, выявлен ряд метаболических нарушений – снижение уровня общего белка на фоне гипоаль- бунемии, умеренная гипергаммаглобунемия, повышение общего билирубина (в 1,44 раза от верхних пределов видовой нормы), нарушение фосфорно-кальцие- вого обмена, связанного со снижением концентрации общего кальция, увеличе- ние ЩФ, а также значительное увеличение продуктов ПОЛ (ДК – в 1,8 раза, КД – на 30,1 %, МДА – в 1,63 раза). Для проведения эксперимента было сформировано четыре группы коров по 10 животных в каждой. Первой и второй группам внутримышечно один раз в сутки вводился фитоглинол в дозах 7 и 10 мл/животное. Третьей группе коров ежедневно внутримышечно инъецировали препарат эмидонол 10 % (антиокси- дант, ингибитор свободнорадикальных процессов) в дозе 10 мл/животное. Кон- трольным животным в том же режиме вводили физиологический раствор. Инъ- екции препаратов проводились в течение 10 дней с использованием адаптиро- ванного ветеринарного шприца-вакцинатора. Анализ проведенных исследований сыворотки крови коров, взятой на 10 день эксперимента, показал увеличение уровня общего белка в опытных группах – на 8,4 и 6,9 %, тогда как в группе с применением эмидонола и в группе контроля концентрация общего белка снизилась (в среднем на 3,0-4,8 %). Для данных групп характерным было и уменьшение уровня альбуминов по сравнению с фо- новыми значениями при сохранении более высоких показателей –глобулинов. Концентрация мочевины в первых трех группах снизилась – на 16,7; 27,7 и 7,5 % соответственно, тогда как у контрольных коров ее уровень увеличился на 36,7 %. В ферментной активности изменения были выявлены по содержанию ас- партатаминотрансферазы и щелочной фосфатазы, которые в группе контроль- ных коров превышали аналогичные значения опытных животных на 42,7; 48,4 и 10,9 % (АсАТ) и 19,3; 14,8 и12,0 % (ЩФ) соответственно. При оценке содержания в крови кортизола в сравнении с фоновыми пока- зателями отмечено его снижение в первой опытной группе на 15,4 %, во второй – на 17,3 %, в третьей – на 13,4 %, тогда как у контрольных коров уровень кор- тизола увеличился на 37,3 % (таблица 5). По уровню среднемолекулярных пептидов в сравнительном аспекте с кон- трольными животными межгрупповые различия составили: в первой опытной группе – 20,8 % (при длине экспозиции 237 усл. ед.), 2,43 раза (при длине экспо- зиции 254 усл. ед.) и 2,18 раза (при длине экспозиции 280 усл. ед.); во второй опыт- ной группе – 26,4 %, 2,17 и 2,2 раза; в третьей опытной группе – 16,7 %, 2,1 и 2,0 раза соответственно. При этом между опытными группами достоверных различий выявлено не было. Таблица 5 – Биохимические показатели сыворотки крови коров на фоне проведенной фармакопрофилактики (M±m; n=5) Показатели Общий белок, г/л Белковые фракции, % альбумины α-глобулины β-глобулины -глобулины Мочевина, мМ/л АлАт, Ед/л АсАт, Ед/л Щелочная фосфатаза, Ед/л Кортизол, нг/мл 1-опытная 82,9±3,8 37,1±1,4 13,6±0,9 11,7±0,4 37,6±1,5** 7,24±0,4 26,5±1,54 75,0±3,12 176,0±6,4* 38,6±1,05 Группы 2-опытная 81,8±2,2* 38,4±2,53 15,2±1,1 12,0±0,88 34,4±2,7 6,36±0,7* 21,0±1,23 72,1±3,4 183,0±6,8 37,7±0,72 3-опытная 73,5±3,6 32,5±1,8 14,6±0,57 13,3±1,02 39,6±2,1 8,01±0,8 25,0±2,4 96,5±2,45** 178,0±5,8 39,5±0,81 Контрольная 74,4±4,5 30,8±3,7 17,3±1,65 11,8±0,43 40,1±3,16 11,84±1,2 36,5±2,14 107,0±3,4 210,0±6,0 63,6±1,24 Различия достоверны * р<0,05; ** р<0,01 в сравнении с группой контроля Применение фитоглинола и эмидонола, обладающих антиоксидантным и мембраностабилизирующим действием в режиме ежедневного применения, ока- зало влияние на показатели липопероксидации. В сравнении с фоновыми значе- ниями уровень первичных метаболитов ПОЛ в опытных группах снизился на 12,8; 9,7 и 4,8 % (ДК) и 11,5; 30,8 и 23,1 % (КД). Содержание в крови коров ма- лонового диальгегида, обладающего относительно устойчивым составом, было ниже у животных, которым применялся фитоглинол. Различия с третьей опыт- ной группой составили 5,9 и 8,0 %, а с контрольными аналогами – 36,7 и 38,1 % соответственно. Таким образом, использование предупредительной фармакокоррекции жи- вотным оказало нормализующее влияние на показатели метаболического статуса, препятствовало развитию эндотоксемии и инициации процессов липопероксида- ции на ранней стадии реактивно-токсических процессов. При этом фитоглинол в дозе 7 мл/животное оказал сопоставимый фармакологический эффект в срав- нении с препаратом-аналогом, а в дозе 10 мл/животное его превзошел, обеспечи- вая высокое стресс-протекторное и антитоксическое действие. 4.2 Эффективность фитоглинола для коррекции послеродового стресса у новотельных коров Опыт по коррекции послеродового стресса был проведен на новотельных коровах (10-14 дней после отела). Данный эксперимент явился продолжением исследования эффективности фитоглинола на организм коров сухостойного пе- риода. При этом структура опыта включала использование трех групп животных – две опытные и контрольную. Опытные группы были сформированы из коров, которым на 8-м месяце стельности вводился фитоглинол в дозах 7 и 10 мл/жи- вотное в течение 10 дней. Контрольным животным в этой серии вводился физио- логический раствор в дозе 10 мл/животное. Схема настоящего эксперимента предусматривала коровам опытных групп внутримышечное введение фитоглинола в следующих дозах: первой опытной группе – 20 мл/животное, второй опытной группе – 15 мл/животное, контрольной группе – физиологического раствора в дозе 15 мл/животное в течении 7 дней. Анализ биохимических показателей сыворотки крови подопытных коров позволил выявить достоверное влияние фитоглинола на метаболическое состоя- ние организма животных. Применение фитоглинола позволило увеличить кон- центрацию глюкозы на 11,8 и 9,4 % соответственно, тогда как в группе контроль- ных коров уровень глюкозы, напротив, снизился на 10,6 % относительно фоно- вых значений. По уровню ферментной активности была отмечена тенденция сни- жения АлАТ в опытных группах на 17,4 и 26,5 % при разнице с контрольными аналогами на 9,8 и 23,4 %. По АсАТ снижение на 13,8 % относительно показателей фона было установлено только в первой группе. Препарат способствовал снижению щелочной фосфатазы на 36,9 и 32,4 % по группам, тогда как в группе контроля уровень ЩФ практически не изменился. Уровень общего билирубина в опытных группах коров был ниже фоновых зна- чений на 35,5 и 9,8 %, показателей контрольной группы – на 47,4 и 27,6 % соот- ветственно. Уровень кортизола в крови новотельных коров первой опытной группы в сравнении с фоновыми показателями снизился на 26,5 %, второй – на 46,7 %, тогда как в контроле гормональная активность, напротив, увеличилась в 1,59 раз, что может указывать на усиление развития процессов оксидации. В опытных группах отмечены более низкие показатели МСМ на всех дли- нах волн: на 237 нм и 254 нм – на 1,2-7,4 % (р<0,05) и 5,5-11,1 %, на 280 нм – в 1,38 и 2,1 раза (р<0,01). Уровень диеновых коньюгатов в первой опытной группе по отношению к фоновым значениям снизился в 2,27 раза, кетодиенов – в 3,3 раза, малонового диальдегида – в 2,1 раза. Во второй опытной группе – в 1,53; 3,2 и 1,24 раза соответственно. Тогда как в контрольной группе новотельных ко- ров значения всех продуктов ПОЛ сохранились на уровне фоновых, а по количе- ству МДА – даже увеличились в 1,82 раза. Таким образом, фитоглинол способствовал ослаблению процессов липопе- роксидации на всех этапах формирования стресс-реакции, причем, его примене- ние в дозе 20 мл/животное оказалось более эффективным. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Выводы: 1. Разработан новый инъекционный препарат фитоглинол, в состав кото- рого входит дигидрокверцетин (Dihydroquercetinum), аминоуксусная (Glycine) и янтарная (Acidum succinicum) кислоты, водный экстракт душицы обыкновенной (Origanum Vuigare L.), диметилсульфоксид (Dimethylsulfoxide) и вода для инъек- ций. Лекарственное средство представляет собой раствор светло-коричневого цвета, со специфическим запахом и вкусом. 2. Препарат фитоглинол малотоксичен для теплокровных животных как в острых, так и в хронических опытах, и по степени воздействия на организм от- носится к IV классу опасности – вещества малоопасные (ГОСТ 12.1.007-76). Применение препарата не оказывает негативного влияния на физиологическое состояние, гомеостаз крови, пищеварение и мочеотделение лабораторных жи- вотных. Фитоглинол не оказывает местно-раздражающего, аллергизирующего, эмбриотоксического и тератогенного действия, не вызывает патологических из- менений в органах и тканях, не изменяет вкусовых качеств мяса животных. 3. В модельных опытах фитоглинол проявляет выраженную фармакологи- ческую активность. В тесте «открытое поле» отмечено анксиолитическое дей- ствие препарата, обусловленное снижением уровня тревоги, страха и стрессо- вого состояния лабораторных крыс, повышением ориентировочно-исследова- тельского поведения при попадании в незнакомую ситуацию. В условиях острого стресса введение фитоглинола в дозах 0,1-0,2 мл/животное позволяет предотвратить падение лейкоцитов на 12,9-25,0 %, снизить уровень глюкозы на 27,5-34,6 %, ДК и КД – в 2,3 и 3,4 раза, МСМ – на 11,6-38,5 %. 4. Превентивное введение фитоглинола лабораторным животным в дозе 0,5 мл, подвергнутым длительному тепловому стрессированию, способствует нормализации баланса терморегуляции, повышению уровня лейкоцитов в 1,9- 2,04 раза, нейтрофильных гранулоцитов – на 7,1-55,1 %, моноцитов – на 16,0- 48,2 %. Влияние препарата на гомеостаз крови проявляется сохранением высо- кого уровня общего белка и глюкозы. 5. Фитоглинол оказывает выраженное антиоксидантное и антитоксическое действие, препятствуя накоплению продуктов липопероксидации, что проявля- ется в достоверном снижении (р<0,05) различных звеньев системы ПОЛ: диено- вых коньюгатов – на 31,6-43,9 %, кетодиенов на 14,7-23,6 %, малонового диаль- дегида – в 1,36-1,5 раза, среднемолекулярных пептидов – на 25,0-33,3 %. 6. Применение фитоглинола для профилактики оксидативного стресса у коров сухостойного периода в дозе 10 мл на животное оказывает влияние на их гомеостаз, а также выраженность эндогенной и окислительной индукции сред- немолекулярных пептидов и продуктов ПОЛ. Препарат способствует увеличе- нию общего белка на 6,9-8,4 %, снижению уровня мочевины – на 7,5-27,7 %, фер- ментной активности – АсАТ – на 10,9-48,4 %, ЩФ – на 12,0-19,3 %, кортизола – на 15,4-17,3 %, эндогенной интоксикации – в 2,17-2,43 раза, процессов липопе- роксидации – на 9,7-12,7 % (ДК) и на 11,5-30,8 % (КД). 7. Внутримышечное введение фитоглинола в дозе 20 мл/животное в тече- ние 7 дней способствует профилактике послеотельного стресса у коров, снижая в крови уровень продуктов перекисного окисления липидов: диеновых конъюга- тов – в 2,27 раз, кетодиенов – в 3,3 раза, малонового диальдегида – в 2,1 раза, предотвращает развитие эндотоксикоза и накопление в крови МСМ – в 1,2-2,1 раза, а также способствует восстановлению биохимических констант крови. 8. Экономическая эффективность от применения фитоглинола при профи- лактике послеродового стресса у коров составляет 6,8 рублей на один рубль за- трат.