Разработка фармакопейного стандартного образца для определения специфической активности иммуноглобулина человека против клещевого энцефалита

Разработка способа получения фармакопейного стандартного образца для определения
специфической активности иммуноглобулина человека против клещевого энцефалита
На основе международных технических докладов и положений отечественных
нормативных документов определены ключевые критерии для разработки ФСО: близость по
составу и свойствам иммуноглобулину человека против КЭ; стабильность; внутрисерийная
однородность. В качестве основы для стандарта использован полупродукт иммуноглобулина
человека против КЭ, из которого получены 4 кандидата в ФСО, различающиеся по
содержанию белка, стабилизированные смесью глицина и l-пролина по 12,5 г/л либо
глицином в концентрации 25,0 г/л. После корректировки показателя рН до 5,0 ± 0,5 растворы
стерильно разлиты во флаконы пенициллиновые по 1,6 мл при постоянном перемешивании и
контроле точности дозирования. Сублимационное высушивание проведено согласно способу
лиофилизации, разработанному для внутривенного иммуноглобулина человека против КЭ:
замораживание материала до минус (40 ± 1) °С, охлаждение конденсора до минус (55 ± 5) °С,
рабочий вакуум (0,15 ± 0,05) Торр, конечная температура материала 30 ± 3 °С, общее время
сублимации ‒ (28 ± 1) ч. Изменены тип флаконов и объем наполнения.
Результаты оценки свойств полученных лиофилизатов (таблица 1) свидетельствовали о
достижении требуемой величины остаточной влажности, не превышающей 1 %, при этом
образцы представлялисобойаморфнуюмассу белогоцвета, равномернымслоем
прилегающую к стенкам флакона, с растворимостью в пределах 9 минут. Показатели
цветности и прозрачности соответствовали установленным нормам для иммуноглобулинов
человека. Снижения специфической активности не наблюдалось. Различия в объеме
наполнения флаконов не превышали 1 %, что указывало на воспроизводимость процесса
дозирования.
Таблица 1 – Основные свойства кандидатов в ФСО
Кандидат в ФСО, состав стабилизатора
Наименование характеристики1234
(количество исследований)l-пролин и глицин –
глицин – 25,0 г/л
по 12,5 г/л
Белок, г/л (n = 5)47,4 ± 1,293,0 ± 2,251,0 ± 0,995,0 ± 2,3
Остаточная влажность, % (n = 5)0,85 ± 0,060,79 ± 0,06 0,87 ± 0,050,73 ± 0,04
Описание (n = 120)Аморфная масса белого цвета
Время растворения, минут (n = 5)7,5 ± 0,59,0 ± 0,85,5 ± 0,36,0 ± 0,5
Цветность, ед. ОП (n = 5)0,059 ± 0,003 0,127 ± 0,010 0,083 ± 0,008 0,140 ± 0,018
Прозрачность, ед. ОП (n = 5)0,024 ± 0,002 0,048 ± 0,007 0,038 ± 0,003 0,046 ± 0,010
Специфическая активность
1:80/1:801:160/1:160 1:160/1:1601:160/1:160
до/после лиофилизации (n = 3)
Точность розлива, CV % (n = 8)0,670,710,671,00
С целью выбора состава защитной среды проведены ускоренные испытания
стабильности,которыемоделироваливыдерживаниемобразцовприповышенных
температурах (30 ºС, 45 ºС и 56 ºС), срок наблюдения составил 210 суток. С учетом данных
динамики специфической активности кандидатов в ФСО построены зависимости логарифма
константы инактивации от обратной температуры (кривые Аррениуса) (рисунок 1).
-3,4
3,03,13,13,23,23,33,3
инактивации

-3,6y3 = -1,51x + 1,10
константы
Логарифм

R² = 1,0
-3,8y4 = -1,54x + 1,11
y2 = -1,52x + 0,90R² = 1,0
-4,0R² = 0,9
y1 = -1,45x + 0,61
-4,2R² = 0,9
К-ФСО 1 (n = 9)К-ФСО 2 (n = 9)К-ФСО 3 (n = 9)К-ФСО 4 (n = 9)
-4,4
Обратная температура, 1000/К

Рисунок 1 – Зависимости логарифма константы инактивации от обратной температуры в
условиях ускоренных испытаний кандидатов в ФСО (К-ФСО)
С использованием полученных зависимостей рассчитаны прогнозируемые сроки
годности (таблица 2). Для кандидатов в ФСО 1 и 2 с двухкомпонентным стабилизатором
снижение специфической активности происходило менее выражено, чем для вариантов 3 и 4
(р = 0,032). При этом между вариантами с одним составом наполнителя, но разным
содержанием белка, различия отсутствовали (р > 0,05). Это указывало на возможность не
нормировать данный показатель при разработке спецификации на ФСО. По итогам
ускоренных испытаний стабильности выбран двухкомпонентный наполнитель в составе
глицин и l-пролин в количестве по 12,5 г/л.
Таблица 2 – Константы инактивации при температуре хранения 4 °C и прогнозируемые сроки
годности кандидатов в ФСО
Значение константы инактивации при 4°C, Прогнозируемый срок годности,
Кандидат в ФСО
(КТ ± s) ×10-5, сутки-1месяцев
11,96 ± 0,3350
22,15 ± 0,3046
33,74 ± 0,5126
43,00 ± 0,3933

Тест термодеградации также позволил оценить стабильность стандарта при отклонении
температурного режима хранения от регламентированного. Снижение концентрации IgG к
вирусу КЭ кандидатов в ФСО с выбранным составом наполнителя происходило только на
210 сутки и составило 3,3 % при 56 °С, 2,2 % при 45 °С, 1,3 % при 30 °С, что позволило
предусмотреть возможность транспортировки стандарта при температуре окружающей среды.
Согласно вышеизложенному способу получены три экспериментальные серии ФСО с
выбранным составом стабилизатора. Объем каждой партии составил примерно 250 флаконов.
Экспериментальные серии ФСО исследованы согласно общепринятой практике по основным
критериям качества иммуноглобулинов человека, за исключением характеристик, которые
определяют безопасность лекарственной формы препарата при его клиническом применении,
а также по показателю «внутрисерийная однородность» (таблица 3).

Таблица 3 – Результаты определения показателей качества ФСО
Экспериментальная серияНормативное значение показателя
Наименование показателя качества
010203качества
ОписаниеАморфная масса белого цветаАморфная масса белого цвета
Остаточная влажность, %0,850,790,77Не более 1 %
Время растворения, минут5,05,04,5Не более 15 минут
Прозрачность, ед. ОП0,0140,0150,015Не более 0,050
Цветность, ед. ОП0,0340,0320,031Не более 0,150
рН5,045,025,025,0 ± 0,5
Белок, г/л647376Не нормируется
Электрофоретическая однородность,
относительное содержание фракции γ-95,395,297,5Не менее 95 %
глобулинов, % от общего белка
Молекулярные параметры, %:
ди- и мономеры97,897,497,0Не менее 85 %
полимеры и агрегаты0,50,50,8Не более 10 %
фрагменты1,72,12,2Не нормируется
Должна выявляться интенсивная линия
Интенсивная линия
Фракционный составпреципитации IgG и не более
преципитации IgG
4 дополнительных линий
СтерильностьСтериленДолжен быть стерильным
Поверхностный антиген вирусаДолжны отсутствовать поверхностный
гепатита В, антитела к вирусуантиген вируса гепатита В, антитела к
гепатита С, к вирусу иммунодефицитаОтсутствуютвирусу гепатита С, к вирусу
человека (ВИЧ) 1 и 2 типов и антигениммунодефицита человека (ВИЧ) 1 и 2
р24 ВИЧ-1 (вирусная безопасность)типов и антиген р24 ВИЧ-1
Специфическая активностьСодержание антител к вирусу КЭ
1:801:1601:320
(содержание антител к вирусу КЭ)должно быть не менее 1:80
Внутрисерийная однородность
(относительная неопределенность от2,1072,4372,447Не выше 3 %
неоднородности ℎ% ), %
По результатам испытаний установлены требования к остаточной влажности, рН и
внутрисерийной однородности. По остальным показателям экспериментальные серии
соответствовали нормам качества иммуноглобулиновых препаратов. Минимально допустимое
значение специфической активности составило 1:80, исходя из нормативной документации
производителей.
Таким образом, по итогам проведенных исследований разработан способ получения
ФСО, заключающийся в стабилизации раствора иммуноглобулина человека против КЭ
l-пролином и глицином в количестве по 12,5 г/л, корректировке рН до 5,0 ± 0,5, стерильном
розливе при непрерывном перемешивании и лиофилизации. Результаты оценки свойств
лиофилизатов антител трех экспериментальных серий явились основой для разработки
нормативных требований к ФСО содержания антител IgG человека к вирусу КЭ.
Аттестация фармакопейного стандартного образца для определения специфической
активности иммуноглобулина человека против клещевого энцефалита
Аттестация ФСО проведена специалистами двух независимых лабораторий ФГБУН
КНИИГиПК ФМБА России и ИЦЭК МИБП ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России в
регламентированных условиях с применением средств измерения сопоставимого уровня
точности. Аттестуемые характеристики ФСО – аттестованное значение содержания антител и
его неопределенность – получены методами РТГА и ИФА в трех сериях аттестационных
испытаний.
В РТГА одной лабораторией протестировано по 8 образцов стандарта, другой – по 7.
Результаты аттестационных испытаний представлены на рисунке 2.
Количество результатов
2519
6
10222
14214
51010
00200
1:801:1601:3201:801:1601:3201:801:1601:320
ФСО 01ФСО 02ФСО 03

Лаборатория 1Лаборатория 2

Рисунок 2 – Результаты определения титра антител к вирусу клещевого энцефалита в ФСО
За аттестованное значение принята медиана титра антител к вирусу КЭ, вычисленная
по результатам трех серий аттестационных испытаний, выполненных каждой лабораторией, за
неопределенность аттестованного значения ‒ доверительный интервал медианы при Р=95%.
Результаты статистической обработки данных приведены в таблице 4.
Таблица 4 – Результаты статистической обработки данных аттестационных испытаний ФСО
методом реакции торможения гемагглютинации
Титр антител к вирусу КЭ в ФСО экспериментальной серии
Статистический параметр
010203
Медиана 1:801:1601:320
Границы доверительногосовпадают со
от 1:80 до 1:160от 1:160 до 1:320
интервала (k = 16, n = 45, P = 95 %)значением Me

Для серии 02 границы доверительного интервала совпали с аттестованным значением,
поэтому неопределенность установили по минимальной и максимальной величине титра
антител. В результате аттестуемые характеристики ФСО экспериментальных серий 01, 02 и 03
составили 1:80 (1:80 – 1:160), 1:160 (1:80 – 1:160), 1:320 (1:160 – 1:320).
В ИФА специалистами каждой лаборатории протестировано по 8 образцов стандарта.
В одной лаборатории ФСО исследовали в разведениях 1:2000, 1:4000, 1:8000, 1:16000 с
использованием набора реагентов ВектоВКЭ-IgG, в другой ‒ в разведениях 1:400, 1:800,
1:1600, 1:3200 и 1:500, 1:1000, 1:2000, 1:4000 с применением тест-систем ДС-ИФА-АНТИ-
ВКЭ-IGG и Anti-TBE Virus ELISA (IgG) соответственно.
При аттестации ФСО первого выпуска аттестуемая характеристика установлена исходя
из титра вируснейтрализующих антител, который составил 1:200 (результаты биологической
стандартизации ФСО методом реакции нейтрализации на культуре клеток почки эмбрионов
свиньи были предоставлены начальником лаборатории иммуноглобулинов и препаратов
крови ИЦЭК МИБП ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, д.м.н. Э.Ю. Кудашевой).
Неопределенностьаттестованногозначенияоцененапоразработанномуалгоритму,
включавшему в себя: построение калибровочных кривых по средним значениям оптической
плотности (ОП), полученным для четырех последовательных разведений ФСО; проверку
линейности (условия 2 > 0,95) и адекватности функций калибровки; расчет коэффициентов
активности и их стандартного отклонения.
По итогам проверки адекватности функций калибровки из уравнений, полученных при
использовании тест-системы Anti-TBE Virus ELISA (IgG), исключены свободные члены
уравнения a, поскольку они являлись незначимыми (р > 0,05). Помимо этого, функции
калибровки, полученные в аттестационных испытаниях 1 и 3 с применением тест-системы
ДС-ИФА-АНТИ-ВКЭ-IGG, не отвечали условию калибр. ≤ табл.. По-видимому, значения ОП
вразведении1:3200быликрайненизкимиинаходилисьвнеобластипрямой
пропорциональности кривой ИФА. Поэтому указанные величины исключены, графики
функциикалибровкипостроеныпотремкоординатамипересчитаныпараметры
дисперсионного анализа. Скорректированные зависимости, представленные на рисунке 3,
являлись линейными и удовлетворяли условию калибр. ≤ табл. .
1,2
Лаборатория 1,1,2Лаборатория 2,1,2Лаборатория 2,
ВектоВКЭ-IgGДС-ИФА-АНТИ-ВКЭ-IGGAnti-TBE Virus ELISA
y1 = 0,57x + 0,17y1 = 2,20x
1,01,0R² = 1,001,0R² = 1,00
y2= 2,01x – 0,13y3= 0,59x + 0,21
R² = 1,00R² = 0,99
0,80,80,8y3 = 3,80x
y1= 2,00 x – 0,15
R² = 1,00R² = 1,00

0,60,60,6y2 = 1,86x
y2 = 0,40x + 0,10R² = 1,00
R² = 1,00
0,40,40,4
y3= 1,65x – 0,13
R² = 1,00
0,20,20,2

0,00,00,0
0,00,20,40,60,80,00,51,01,52,02,5 0,00,20,40,6
Испытание 1Испытание 2 Испытание 3Испытание 1Испытание 2Испытание 3Испытание 1 Испытание 2Испытание 3

По оси Y ‒ коэффициент разведения ФСО, по оси X ‒ соответствующее значение ОП.
Рисунок 3 – Функции калибровки, полученные для ФСО первого выпуска
С использованием полученных уравнений рассчитаны коэффициенты активности ka
(рисунок 4). В результате сравнения выборок доказана статистическая эквивалентность
значенийпоказателя,полученныхвдвухлабораторияхсприменениемразных
̅ объединенных данных (n = 272),
диагностических наборов (p = 0,7). Среднее значение
равное1,0,свидетельствовалооправильностивыбраннойматематическоймодели
определения аттестуемой характеристики ФСО. Стандартное отклонение составило 0,12.

Рисунок 4 – Коэффициенты активности, полученные для ФСО первого выпуска
За нижнюю границу неопределенности принято обратное значение титра, полученное
при биологической стандартизации ФСО, аттестованное значение и верхняя граница
неопределенности рассчитаны с учетом ± 2 (таблица 5).
Таблица 5 – Результаты определения аттестуемой характеристики ФСО первого выпуска
методом иммуноферментного анализа
Аттестуемая характеристикаОтносительное значениеАбсолютное значение, ЕД/мл
Нижняя граница неопределенности0,76200
Аттестованное значение1,00248
Верхняя граница неопределенности1,24296

Аттестация повторных выпусков ФСО (экспериментальные серии 02 и 03) проведена
относительно ФСО первого выпуска (экспериментальная серия 01) методом параллельных
линий (рисунок 5). Результаты ИФА, полученные с использованием разных наборов
реагентов, были статистически эквивалентны (p > 0,05). Это позволило рассчитать
аттестуемые характеристики ФСО экспериментальных серий 01 и 02, которые составили
(297 ± 61) ЕД/мл и (360 ± 75) ЕД/мл.

р = 0,12

р = 0,90

Рисунок 5 – Результаты аттестационных испытаний ФСО экспериментальных серий 02 и 03

Таким образом, по результатам аттестационных испытаний первичного и повторных
выпусков ФСО установлены аттестуемые характеристики трех экспериментальных серий
стандарта методами РТГА и ИФА (таблица 6).

Таблица 6 – Результаты аттестации ФСО
ЭкспериментальнаяАттестуемая характеристика в ИФА,
Аттестуемая характеристика в РТГА
серия ФСОЕД/мл
011:80 (1:80 ‒ 1:160)248 (200 – 296)
021:160 (1:80 ‒ 1:160)297 (236 ‒ 358)
031:320 (1:160 ‒ 1:320)360 (285 ‒ 435)

Анализ стабильности и установление срока годности
фармакопейного стандартного образца
Срок годности ФСО определен по результатам долгосрочных испытаний стабильности
при температуре от 2 до 8 °С. Продолжительность хранения ФСО серии 01 составила 48
месяцев, серии 02 – 42 месяца, серии 03 – 36 месяцев. Для анализа отбирали по 5 образцов
стандарта каждые 6 месяцев, которые тестировали методами РТГА и ИФА.
Динамика титра антител к вирусу КЭ представлена на рисунке 6.

геометрического титра
Обратное значение
400279279320
243279279
300243
среднего

антител
160184
200139139139139184
9292139
10092106
80106
9292
06121824
Срок хранения, месяцев48
ФСО 01ФСО 02ФСО 03

Рисунок 6 – Результаты анализа стабильности ФСО по данным реакции торможения
гемагглютинации
Отсутствие изменения специфической активности по данным РТГА на протяжении срока
хранения подтверждено статистически (р > 0,05 для критерия Краскела – Уоллиса).
В ИФА стабильность ФСО экспериментальной серии 01 оценена относительно
образцов этой же серии, хранившихся при температуре минус 80 °С (базовая линия).
Содержание IgG к вирусу КЭ в экспериментальных сериях 02 и 03 определено относительно
ФСО экспериментальной серии 01. Специфическая активность выражена в % относительно
соответствующего аттестованного значения. За минимальную величину принята нижняя
граница неопределенности – 80 %. Результаты мониторинга стабильности по данным ИФА
представлены на рисунке 7.
Относительное содержание
IgG к вирусу КЭ, %

110106
106105106
100100104103103 105102101103
9597961009697
9093
0612182430364248
Длительность хранения, месяцев
ФСО 01ФСО 02ФСО 03Базовая линийНижняя граница неопределенности

Рисунок 7 – Результаты анализа стабильности ФСО по данным иммуноферментного анализа
В результате анализа корреляции концентрации антител и продолжительности
хранения ФСО показано отсутствие устойчивых трендов изменения содержания IgG к вирусу
КЭ (rs01 = -0,21, rs02 = 0,14, rs03 = 0,30). Постоянство специфической активности подтверждено
статистической эквивалентностью результатов, полученных в разные периоды наблюдения на
протяжении хранения (р01 = 0,27, р02 = 0,38, р03 = 0,34).
Поскольку для установления срока годности ФСО необходимо доказать сохранность
специфической активности по результатам исследования трех экспериментальных серий,
сделан вывод о его стабильности в течение 3 лет при температуре хранения от 2 до 8 °С с
возможностью продления срока годности по данным мониторинга стабильности.
Усовершенствование методики определения специфической активности на основе
реакции торможения гемагглютинации
Методика на основе РТГА усовершенствована введением коэффициента пересчета ,
учитывающегосмещениефактическоготитраантителвФСОотносительноего
аттестованного значения. Специфическую активность препарата ( ) рассчитывали по
отношению к ФСО по формуле:

= ∙ обр = ФСО ∙ обр ,(1)
ФСО

где – коэффициент пересчета;
обр. ‒ фактическое значение титра антител к вирусу КЭ в исследуемом образце;
ФСО ‒ аттестованное значение ФСО;
ФСО ‒ фактическое значение титра антител к вирусу КЭ в ФСО.
Предложенная модификация методики проверена с использованием образцов 9 серий
иммуноглобулина человека против КЭ трех производителей. Согласно паспортным данным
специфическая активность препаратов двух серий составляла 1:320 (образцы № 8 и № 9),
остальных – 1:160. Результаты трех испытаний с участием специалистов двух независимых
лабораторий представлены в таблице 7.
Таблица 7 – Результаты определения специфической активности коммерческих серий
иммуноглобулина человека против клещевого энцефалита с использованием ФСО
Специфическая активность препарата
№ образца препарата, критерийс использованием ФСО,
без использования ФСО
вычисленная по формуле (1)
1‒7от 1:160 до 1:3201:160
8, 9от 1:320 до 1:6401:320
Разница между результатами
шаг титрованияданные совпадают
двух независимых лабораторий

Установлено, что размах варьирования фактических данных составил шаг титрования.
После корректировки значений титра с учетом коэффициента результаты определения
специфической активности, полученные двумя специалистами, не различались. При оценке
прецизионности методики показано отсутствие разброса значений титра антител (n = 27).
Правильность подтверждена нахождением величины специфической активности ФСО в
пределах неопределенности аттестованного значения – от 1:80 до 1:160 (n = 6). На основании
полученных данных сделан вывод о пригодности усовершенствованной методики для оценки
специфической активности иммуноглобулина человека против КЭ.
Разработка методики определения специфической активности на основе
иммуноферментного анализа
Исследования проведены с использованием тест-систем для ИФА двух отечественных
и четырех зарубежных производителей, выбор которых основывался на коммерческой
доступности и имеющейся регистрации в РФ. Препараты иммуноглобулина человека против
КЭ и ФСО анализировали в серийных разведениях. По результатам анализа 528 кривых «доза-
отклик» установлено, что в разведении со значением ОП 0,5 в 98 % случаев выполнялось
условие их линейности и параллельности. Это позволило упростить вычисления и
использовать обработку не кривой в целом, а области вблизи точки с ОП, равной 0,5.
Разработанный алгоритм расчета состоял из 4 этапов: (1) логарифмирование по основанию 2
(log2) значений ОП и величин обратных разведений препарата и стандарта; (2) построение
линий регрессии вида = × + (где х – log2 ОП; y – log2 обратного разведения) и
проверка условия R2 > 0,95; (3) расчет по уравнениям линий регрессии значений y при х =
log20,5 = -1 для исследуемого препарата и ФСО; (4) вычисление концентрации IgG к вирусу
КЭ в исследуемом препарате по формуле:
= 2 ИГ − ФСО × ФСО(2)
гдеС – концентрация IgG к вирусу КЭ в исследуемом препарате, ЕД/мл;
ИГ – log2 обратного разведения исследуемого препарата при ОП=0,5;
ФСО – log2 обратного разведения ФСО при ОП=0,5;
ФСО ‒ аттестованное значение ФСО, ЕД/мл

Разработанный способ расчета сравнили с референсным методом параллельных линий.
Для этого в серийных разведениях исследованы ФСО и 4 препарата иммуноглобулина. В
результате для одноименных образцов установлено отсутствие различий средних значений
концентрации IgG к вирусу КЭ, полученных с использованием разных вычислительных
приемов (p > 0,05). Помимо этого, доказана математическая тождественность данных (их
взаимозаменяемость), так как коэффициенты были близки 1, а свободные члены являлись
незначимыми (p > 0,05), уравнения регрессии преобразованы в равенство = (рисунок 8).
Следующим этапом экспериментального обоснования методики явилась ее валидация.
Образцами для проведения исследований служили иммуноглобулины человека против КЭ со
специфической активностью 1:160 и 1:320 трех производителей; ФСО экспериментальной
серии 01 со специфической активностью 1:80 и иммуноглобулин человека нормальный
(плацебо). В качестве стандарта использован ФСО экспериментальной серии 03 с аттестуемой
характеристикой(360±75)ЕД/мл.Специфичность,линейность,правильность,
повторяемость, промежуточная прецизионность оценены по результатам 10 определений IgG
к вирусу КЭ с использованием каждой из тест-систем: ДС-ИФА-АНТИ-ВКЭ-IGG, ВектоВКЭ-
IgG, Anti-TBE Virus ELISA, TBEV/FSME IgG ELISA.
450450
ДС-ИФА-АНТИ-ВКЭ-IGG (n = 40)ВектоВКЭ-IgG (n = 40)

400400

350350

PLA
PLA

300300
y=xy=x
R² = 0,97250R² = 0,97

200200
200250300350400450200250300350400450
in housein house

450450
Anti-TBE Virus ELISA (n = 40)TBEV/FSME IgG ELISA (n = 40)
400400

350350

PLA
PLA

300300
y = 0,99xy = 0,99x
R² = 0,95250R² = 0,98
200200
200250300350400450200250300350400450
in housein house

Рисунок 8 – Графики зависимости результатов определения содержания IgG к вирусу КЭ
(ЕД/мл), полученные с использованием разработанной математической модели (in house) и
метода параллельных линий (PLA)
Специфичность методики подтверждена тем, что иммуноглобулины человека против
КЭ и ФСО обладали специфической активностью (n = 160), в образце плацебо IgG к вирусу
КЭ не выявлены (n= 40).Значение коэффициентовдетерминациизависимости
аналитического сигнала (log2ОП) от содержания анализируемого вещества (log2обратного
разведения образца) были выше 0,95 (n = 160), что указывало на линейность методики в
пределахдиапазонаприменения.ПравильностьоцененасиспользованиемФСО
экспериментальной серии 01.Методика соответствовала установленному критерию,
поскольку вычисленные на основании экспериментальных данных доверительные интервалы
среднего значения стандарта находились в пределах неопределенности аттестованного
значения от 200 до 296 ЕД/мл (n = 40). Размах варьирования среднего значения относительно
аттестованного соответствовал интервалу от минус 3,6 до 1,6 %. Прецизионность методики в
условиях повторяемости характеризовалась коэффициентами вариации от 4 до 12 %, в
условиях воспроизводимости (факторы: время и тест-система) – от 6 до 10 %, и не превышала
15 %. Различия дисперсий и средних результатов, полученных с использованием разных
наборов реагентов, были незначимы (p > 0,05). По итогам проведенных исследований сделан
вывод о том, что разработанная методика ИФА с использованием ФСО пригодна для
контроля специфической активности иммуноглобулина человека против КЭ.
Экспериментальное изучение специфической активности иммуноглобулина человека
против клещевого энцефалита с использованием фармакопейного стандартного образца
Образцами для исследования явились 68 коммерческих серий иммуноглобулина
человека против КЭ, выпущенных АО «НПО «Микроген» (n = 36) и ГБУЗ «ЧОСПК» (n = 32).
Результаты определения специфической активности с использованием ФСО представлены на
рисунке 9. Титр антител к вирусу КЭ в исследуемых препаратах составил 1:80, 1:160 и 1:320,
концентрация IgG варьировала от 223 ЕД/мл до 649 ЕД/мл.

Рисунок 9 – Специфическая активность лекарственных препаратов иммуноглобулина
человека против клещевого энцефалита
Различия в результатах ИФА между иммуноглобулинами со специфической
активностью 1:80, 1:160 и 1:320 являлись значимыми (р < 0,0001). При этом коэффициент корреляции , равный 0,89, свидетельствовал о высокой степени связи данных двух методов. Все это указывало на возможность нахождения соотношения между результатами ИФА и РТГА. На основании экспериментальных данных оценки специфической активности с использованием ФСО эмпирически установлено соответствие титра антител диапазону концентрации IgG к вирусу КЭ (таблица 8). Таблица 8 ‒ Результаты экспериментальной оценки соответствия титра антител диапазону концентрации IgG к вирусу клещевого энцефалита Титр антител к вирусу КЭСодержание IgG к вирусу КЭ по данным РТГАпо данным ИФА, ЕД/мл 1:80200* ‒ 269 1:160270 ‒ 359 1:320360 ‒ 650 * Нижняя граница установлена по результатам аттестации ФСО первого выпуска в ИФА. В рамках обоснования экономической целесообразности применения ФСО показано, что затраты в размере 0,04 % от стоимости серии иммуноглобулина, связанные с применением стандарта, существенно ниже даже минимальных убытков, связанных с риском выбраковки серии препарата по показателю качества «специфическая активность», которые составляют 38 % от стоимости серии. Таким образом, применение ФСО для оценки основного показателя качества иммуноглобулина человека против КЭ представляется экономически эффективным. По результатам выполненных исследований разработана нормативно-технологическая документация на ФСО ГФ РФ 3.1.00453: инструкция по изготовлению, контролю и аттестации, проекты паспорта и инструкции по применению ФСО. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Врезультатенаучногоанализасовременногосостоянияпроблемыоценки специфической активности иммуноглобулина человека против КЭ показана необходимость совершенствования методики на основе РТГА и разработки унифицированной методики на основе ИФА с применением ФСО. На момент начала наших исследований стандарт содержания антител IgG человека к вирусу КЭ в РФ и за рубежом отсутствовал. В результате проведенного исследования обоснован способ получения ФСО, заключающийся в стабилизации раствора иммуноглобулина, произведенного из иммунной плазмы крови доноров, l-пролином и глицином в количестве по 12,5 г/л, корректировке рН до 5,0 ± 0,5, стерильном розливе при непрерывном перемешивании и лиофилизации, который обеспечивает близость состава и свойств ФСО контролируемым препаратам, внутрисерийную однородность и стабильность аттестованного значения на протяжении 3 лет (с возможностью продления срока годности по данным мониторинга стабильности). ПроведенамежлабораторнаяаттестацияФСОметодамиРТГАиИФА.За аттестованное значение в РТГА принята медиана результатов, за неопределенность – доверительныйинтервалмедианы.Предложеналгоритмопределенияаттестуемой характеристики ФСО в ИФА, заключающийся в построении калибровочных кривых; проверке их линейности и адекватности; расчете коэффициентов активности и их стандартного отклонения s. За нижнюю границу неопределенности принята величина обратного титра вируснейтрализующих антител, установленного в результате биологической стандартизации ФСО. Аттестованное значение и верхняя граница неопределенности рассчитаны с учетом 2s. Относительно первой экспериментальной серии аттестованы два повторных выпуска ФСО методом параллельных линий. В результате получены аттестуемые характеристики трех экспериментальных серий ФСО ‒ 1:80 (1:80 – 1:160), 1:160 (1:80 – 1:160), 1:320 (1:160 – 1:320) по данным РТГА и (248 ± 48) ЕД/мл, (297 ± 61) ЕД/мл и (360 ± 75) ЕД/мл по данным ИФА. Усовершенствована методика на основе РТГА и доказана ее пригодность для определения специфической активности иммуноглобулина человека против КЭ. Для расчета содержания антител введен коэффициент, учитывающий смещение фактического титра антител в стандарте относительно его аттестованного значения. Благодаря использованию ФСО достигнута статистическая эквивалентность результатов, полученных разными специалистами, и повышена точность определения специфической активности. Разработана методика на основе ИФА и доказана ее пригодность для определения специфической активности иммуноглобулина человека против КЭ. Концентрация IgG к вирусу КЭ в препарате рассчитана по отношению к активности ФСО в точке со значением ОП 0,5, что позволяет унифицировать результаты, полученные с использованием разных наборов реагентовдляИФА,иупроститьвычисления. Доказана эквивалентностьданных разработанной математической модели и референсного метода параллельных линий. Установлена специфичность и линейность методики, прецизионность подтверждена коэффициентом вариации, не превышающим 15 %, правильность характеризуется смещением среднего значения относительно аттестованного – от минус 3,6 до 1,6 %. С использованием разработанного ФСО определена специфическая активность 68 серий иммуноглобулина человека против КЭ. По данным РТГА преобладают препараты с титром антител 1:160 и 1:320. Впервые препараты охарактеризованы по концентрации IgG к вирусу КЭ в ИФА, которая составляет от 223 до 649 ЕД/мл. Установлено соответствие результатов ИФА данным РТГА для перевода концентрации IgG, выраженной в ЕД/мл, в титры антител. В результате экономического обоснования показано, что применение ФСО являетсяэффективным,посколькузначительноснижаетзатратынапроизводство иммуноглобулина человека против КЭ, связанные с риском выбраковки серии по показателю качества«специфическаяактивность».Порезультатамвыполненныхисследований разработана нормативно-технологическая документация на ФСО, что дает возможность осуществлять его серийный выпуск. Практические рекомендации. ФСО содержания антител IgG человека к вирусу КЭ создан для специалистов, занимающихся фармацевтической разработкой, промышленным производством, контролем, экспертизой качества и государственной регистрацией препаратов иммуноглобулина человека против КЭ, и рекомендован к использованию для оценки качества указанных лекарственных средств. Перспективы дальнейшей разработки темы. ФСО может быть использован при разработке методики определения специфической активности донорской плазмы на основе ИФА.Этопозволитосуществлятьотбориммунногосырьядляпроизводства иммуноглобулина человека против КЭ по концентрации IgG, выраженной в ЕД/мл. ВЫВОДЫ 1.Разработанный способ получения ФСО, заключающийся в стабилизации раствора иммуноглобулина человека против КЭ l-пролином и глицином в количестве по 12,5 г/л, корректировке рН до 5,0 ± 0,5, стерильном розливе при непрерывном перемешивании и лиофилизации, позволяет осуществлять выпуск целевого продукта, характеризующегося внутрисерийной однородностью (погрешность от неоднородности не выше 3 %) и постоянством аттестованного значения в течение 3 лет. 2.Аттестуемые характеристики ФСО трех экспериментальных серий составили 1:80, 1:160 и 1:320 с неопределенностью не более шага двукратного разведения в РТГА, а также (248 ± 48) ЕД/мл, (297 ± 61) ЕД/мл и (360 ± 75) ЕД/мл в ИФА. 3.Усовершенствованнаяметодикаопределенияспецифическойактивности иммуноглобулина человека против КЭ на основе РТГА, предусматривающая модификацию способа обработки данных и использование ФСО, позволяет повысить точность определения титра антител к вирусу КЭ за счет снижения вариабельности результатов. 4.Разработанная методика определения специфической активности на основе метода ИФА, предусматривающая обработку линий регрессии стандарта и исследуемого препарата вблизи точки с оптической плотностью 0,5, обеспечивает унификацию результатов определения содержания IgG к вирусу КЭ, полученных с использованием разных тест-систем. 5.ПолученныесприменениемразработанногоФСОрезультатыоценки специфической активности свидетельствуют о том, что на территории РФ преобладают лекарственные препараты иммуноглобулина человека против КЭ с титром антител 1:160 и 1:320, что соответствует концентрации IgG к вирусу КЭ от 270 до 650 ЕД/мл по данным ИФА.