Разработка метода контроля уровня вируснейтрализующих антител на модели клеточных культур в производстве антирабического иммуноглобулина

В обзоре литературы освещены вопросы характеристики вируса бешенства, методов детекции цельного вируса, антигенов и антирабических антител, применяемых в области экспериментальных исследований, диагностики бешенства и производства антирабических медицинских препаратов, а также особенностей культивирования вируса в клеточной культуре с использованием различных питательных сред. Изучен вопрос применения и необходимости разработки стандартных образцов предприятия в производстве антирабического иммуноглобулина.
2.2 Материалы и методы исследования (глава 2)
В работе использовали штамм вируса бешенства «Москва 3253Vero», полученный путем многократных пассажей (пассаж 180) на клеточной культуре Vero из штамма вируса бешенства «Москва 3253», и фиксированный вирус бешенства «CVS». Штаммы ВБ «Москва 3253» и «CVS» (III группа патогенности) получены из коллекции Федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г.Москва. При разработке метода контроля уровня вируснейтрализующих антител в условиях in vitro использовали клеточные культуры Vero (B) (170-180 пассаж) и BHK-21 (неопределенный пассаж). Обе клеточные линии были получены из коллекции Биолот (Россия), предварительно исследованы на отсутствие микоплазм. Кроликов породы «Шиншилла» весом 1,5-2,5 кг использовали в качестве продуцентов сыворотки, содержащей антитела к рибонуклеопротеину вируса бешенства штамма «Москва 3253Vero». При постановке классической РН вируса бешенства в условиях in vivo использовали белых
мышей инбредной линии BALB/c весом 10-12 г. Лошадей рысистой породы массой не менее 400 кг использовали в качестве продуцентов иммунной антирабической сыворотки, исследуемой в реакциях нейтрализации in vivo и in vitro по показателю «специфическая активность».
В работе применяли следующие методы исследования:
биотехнологические – культивирование перевиваемых клеточных культур; культивирование вируса бешенства на клеточных культурах;
вирусологические – вычисление LD50, определение титра вируса бешенства и показателя специфической активности АИГ;
биологические – иммунизация животных, забор крови методом тотального обескровливания;
биохимические, биофизические, физико-химические и иммунохимические методы – выделение рибонуклеопротеина вируса бешенства; определение концентрации водородных ионов в растворе; электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия; определение содержания белка; выделение сыворотки крови; дот-иммуноанализ (ДИА); иммуноферментный анализ (ИФА); осаждение иммуноглобулинов сульфатом ам- мония; получение конъюгата антител к рибонуклеопротеину с ФИТЦ и Alexa Fluor (532 нм); люминесцентная микроскопия;
статистические – вычисление титра антител и инфицирующих доз (lg LD50 и lg ID50) вируса бешенства проводили по методу Рида и Менча; обработку результатов, полученных при разработке стандартного образца предприятия специфической активности АИГ, осуществляли в соответствии с ОФС «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами»; сравнение результатов исследования активности в тестах in vitro и in vivo методом Блэнда-Алтмана и методом вычисления коэффициента корреляции Пирсона. Вычисления осуществляли с применением программы Microsoft Office Excel 2010 и «Программы для расчета результатов реакции нейтрализации вируса бешенства на белых мышах по методу Рида и Менча» (ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб», Россия, свидетельство о государственной регистрации No 2016617051).
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Экспериментальные исследования изложены в 3 главах работы.
В главе 3 изложены исследования, посвященные получению рибонуклеопротеина (РНП) ВБ «Москва 3253Vero», антител к нему и конструированию на основе полученных антител флуоресцирующих конъюгатов. Получение антител из инфицированной ВБ клеточной культуры Vero осуществляли по модифицированному методу M. Dastkhosh. Способ позволил получить растворы, содержащие РНП в концентрации от 0,01 до 0,2 мг/мл в зависимости от количества клеток в исходном материале. С целью увеличения срока хранения, а также приготовления более концентрированных растворов, полученный РНП подвергали лиофилизации. Лиофилизат представлял собой пористую массу белого цвета, хорошо растворимую в воде и водных буферных растворах. Лиофильно высушенную субстанцию РНП хранили при 4 oC.
Результаты электрофоретических исследований в полиакриламидном геле (12 % ПААГ-ДСН), свидетельствовали об отсутствии примесей в полученных образцах РНП, ориентировочная молекулярная масса исследуемых образцов составила около 55 кДа (рисунок 1), что соответствует данным литературы (Львов Д.К., 2008). Лиофилизация не оказала повреждающего воздействия на структуру молекулы РНП: показатели электрофоре- тической однородности и ориентировочное значение молекулярной массы остались неизменны.
Для увеличения выхода РНП из инфицированной клеточной культуры был проведен подбор питательных сред для культивирования клеток и вируса бешенства. Культивирование вируса осуществляли на клеточной культуре Vero c использованием коммерческой среды, а также экспериментальной среды, приготовленной на основе ферментативного гидролизата
Рисунок 1. Электрофореграмма рибонуклеопротеина вируса бешенства
1. Маркеры молекулярных масс
2. Очищенный регидратированный рибонуклеопротеин вируса бешенства 3. Очищенный рибонуклеопротеин вируса бешенства в исходном растворе
фибрина (ФГФ) крови лошадей. В качестве ростовой добавки использовали сыворотку крови крупного рогатого скота (КРС). Изучение возможности применения питательной среды на основе ФГФ при культивировании клеток и вируса связано с поиском способа снижения стоимости исследований, поскольку фибрин крови лошади представляет собой отход производства гетерологичного АИГ.
Для приготовления экспериментальной питательной среды использовали белковую основу в виде высушенного ФГФ, полученного и охарактеризованного в соответствии с результатами, представленными ранее исследователями ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (Жулидов И.М. и др., 2011). С целью определения оптимальной концентрации белковой основы готовили экспериментальные среды, с концентрациями 0,05; 0,1, 0,25; 0,5 % ФГФ. Затем исследовали характер роста интактной культуры Vero, включающий значение индекса пролиферации, сроки образования и сохранения монослоя. В качестве контрольной среды применяли среду Игла МЕМ. Исходная концентрация клеток соответствовала (5±2)×104 клеток/мл. Исследуемые параметры для клеточной культуры Vero, выращенной на среде Игла МЕМ и экспериментальных средах с содержанием 0,1 и 0,25 % белковой основы, оказались сопоставимы: индекс пролиферации после 5 сут выращивания составил соответственно (15,0±0,3), (15,2±0,2), (14,8±0,3). Клетки сохраняли характерную для данного вида форму. Уменьшение концентрации белковой основы до 0,05 % приводило к снижению индекса пролиферации в течение 5 сут культивирования до (4,6±0,4) и отсутствию формирования клеточного монослоя в течение срока наблюдения. При увеличении концентрации ФГФ до 0,5 % наблюдали медленный рост и изменение морфологии клеток – вытянутая форма и образование длинных отростков. На основании полученных результатов установлено, что использование среды на основе ФГФ в концентрации 0,1 и 0,25 % при культивировании клеток Vero не уступает по эффективности коммерческой питательной среде Игла МЕМ.
Далее исследовали репродуктивную активность ВБ «Москва 3253Vero» в клеточной культуре Vero, культивируемой на экспериментальной питательной среде с сухим ферментативным гидролизатом фибрина, взятым в концентрациях 0,1 и 0,25 % с 2 и 5 % сыворотки КРС, а также на среде 199 с 5 % сыворотки КРС в качестве образца сравнения (таблица 1).
Таблица 1 – Характеристика репродукции вируса бешенства «Москва 3253Vero» в клетках Vero
Питательная среда
Экспериментальная среда, содержащая 0,10 % основы ФГФ и
2 % сыворотки КРС
Экспериментальная среда, содержащая 0,10 % основы ФГФ и
5 % сыворотки КРС
Экспериментальная среда, содержащая 0,25 % основы ФГФ и
2 % сыворотки КРС Экспериментальная среда, содержащая 0,25 % основы ФГФ и
5 % сыворотки КРС
Среда 199 и 5 % сыворотки КРС
(образец сравнения)
Время культивирования,
log2 титра вируса в
log2 титра вируса в реакции иммунофлуоресценции
4,47±0,14 4,78±0,15 4,47±0,14 4,84±0,17 4,47±0,17 4,9±0,14 4,78±0,13 4,9±0,21 4,31±0,14
4,47±0,11
сут. ИФА 4 2,6±0,4
7 3,7±0,4
4 3,3±0,4
7 4,0±0,3
4 2,7±0,3 7 4,3±0,4 4 4,0±0,3 7 5,3±0,4 4 3,3±0,4
7 4,6±0,4
Примечание: значения титра вируса были получены на основании эксперимента, проведенного в пяти повторностях.
Уровень накопления ВБ в среде определяли в ИФА с использованием набора для диагностики бешенства (ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», Россия). Уровень накопления вируса в цитоплазме клеток Vero определяли методом иммунофлуоресценции с применением набора для диагностики с меткой ФИТЦ (ФГБУ «ВНИИЗЖ», Россия).
При культивировании на экспериментальных питательных средах была отмечена тенденция к накоплению внутриклеточного ВБ. Содержание добавляемой в среду сыворотки КРС значительного влияния на процесс репродукции ВБ не оказало. При последующем культивировании вируса бешенства с целью получения РНП использовали экспериментальные питательные среды на основе ФГФ с содержанием белковой основы 0,1 и 0,25 %, а также коммерческие среды с 5 % сыворотки КРС. Вирус добавляли к клеточной суспензии в дозе 0,1 ID50 на клетку. Концентрация клеток в начале культивирования составляла от 0,8×105 до 1,6×105 клеток/мл. Время культивирования составило до 120 ч. После каждых 24 ч культивирования из клеточной культуры выделяли РНП. Результаты исследования показали наиболее высокий выход РНП при культивировании ВБ на клетках Vero с применением питательных сред на основе сухого ФГФ, по сравнению с культивированием на коммерческих средах (рисунок 2). Оптимальное время культивирования при инфицирующей дозе 0,1 ID50 составило (72±4) ч, что соответствовало времени максимального выхода РНП при использовании экспериментальных питательных сред.
Полученный РНП ВБ использовали для иммунизации кроликов с целью получения специфических сывороток. Для получения сывороток с высоким содержанием антител к
0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0
24 ч
Экспериментальная среда с 0,1 % основы ФГФ с 5 % сыворотки КРС
Экспериментальная среда с 0,25 % основы ФГФ с 5 % сыворотки КРС Среда Игла МЕМ с 5 % сыворотки КРС
Среда 199 с 5 % сыворотки КРС
48 ч
72 ч
96 ч
120 ч
Рисунок 2. Динамика накопления рибонуклеопротеина вируса бешенства «Москва 3253Vero» в культуре Vero в зависимости от питательной среды
Примечание: концентрация РНП указана относительно 106 клеток.
РНП изучили возможность применения коллоидного золота и полиоксидония в качестве адъювантов. Исследование антителообразования проводили на трех группах животных.
Первую группу иммунизировали рибонуклеопротеином (400 мкг РНП), вторую и третью – рибонуклеопротеином с адъювантами: коллоидным золотом (наночастицы диаметром 14-17 нм; 0,14 ммоль коллоидного золота и 400 мкг РНП) и полиоксидонием (1 мг полиоксидония и 400 мкг РНП). Животным внутримышечно вводили по 1 мл антигенного материала на 0, 43 и 57 день эксперимента. Для исследования динамики антителообразования образцы крови отбирали из краевой вены уха непосредственно перед проведением иммунизации. Срок эксперимента составил 70 дней. Титр антител к РНП в собранных сыворотках определяли в ДИА с использованием антигенного диагностикума с наночастицами коллоидного золота. Результаты проведенного исследования свидетельствовали об образовании антител к РНП у животных каждой из групп. Динамика антителообразования отображена на рисунке 3.
Наибольшее нарастание титра антител к РНП ВБ установлено в сыворотках крови от животных, иммунизированных РНП с добавлением наночастиц коллоидного золота. К 43 дню эксперимента титр антител у животных 2 группы составил 1:3200, что превышало показатели в сыворотках крови от животных 1 и 3 групп в 4 и 2 раза соответственно. При завершении иммунизации осуществляли тотальный забор крови. Полученные сыворотки консервировали раствором хинозола и выдерживали при (6±2) oC в течение месяца для стабилизации уровня антител. Наибольший титр антител к РНП ВБ, значение которого составило 1:25600, отмечали в образцах сывороток от животных, иммунизированных препаратом РНП в сочетании с коллоидным золотом (рисунок 4).
Данное обстоятельство позволило обосновать использование РНП ВБ «Москва3253Vero» с наночастицами коллоидного золота в качестве адъюванта для иммунизации кроликов для получения сывороток с высоким титром антител к РНП ВБ.
Антитела к РНП ВБ выделяли осаждением сульфатом аммония. Удаление остатков солей осуществляли с помощью гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-50. Концентрацию белка устанавливали в значении (22±2) мг/мл, при этом титр антител к РНП вируса бешенства составил от 1:16000 до 1:32000. Очищенные антитела использовали при получении флуоресцирующих конъюгатов для обнаружения ВБ в клеточных культурах. В качестве флуоресцентных меток применяли ФИТЦ и Alexa Fluor (532 нм). Для контроля конъюгирования антител с флуорохромами исследовали спектрофотометрические
Выход рибонуклеопротеина вируса бешенства “Москва 3253Vero”, мг
30000
25000
20000
15000
10000
5000 0
25600 12800
800
3200
6400 1600 800 1600
12800
43-и сутки
Опытная группа 1 (без использования адъюванта)
Опытная группа 2 (адъювант коллоидное золото) Опытная группа 3 (адъювант полиоксидоний)
57-е сутки
70-е сутки
Рисунок 3. Динамика накопления антител к рибонуклеопротеину вируса бешенства в сыворотках крови кроликов (дот-иммуноанализ)
Рисунок 4. Уровень содержания антител к рибонуклеопротеину вируса бешенства в сыворотках крови, полученных от продуцентов после завершения иммунизационных мероприятий (дот-иммуноанализ; двукратные разведения сывороток с 1:800)
1 –опытная группа 1, без адъюванта
2 –опытная группа 2, адъювант коллоидное золото
3 –опытная группа 3, адъювант полиоксидоний
4 – отрицательный контроль, нормальная кроличья сыворотка
характеристики антител, красителей и готовых конъюгатов. Конъюгаты имели два выраженных пика поглощения, соответствующих белку и связанному красителю (рисунки 5 и 6). Образование конъюгата белка с флуорохромом подтверждали изменения оптических характеристик, выраженные в смещении максимума поглощения белкового компонента. Пик, характерный для белковых веществ, при конъюгации с ФИТЦ смещался в коротковол- новую область, а при конъюгации с Alexa Fluor (532 нм) – в длинноволновую область спектра на 20-30 нм. Значение максимума второго пика поглощения, соответствующего флуоресцентной метке, оставалось на прежнем уровне и для конъюгатов с ФИТЦ и Alexa Fluor (532 нм) составило соответственно 495 и 522 нм. Предел чувствительности полученных флуоресцирующих конъюгатов оценивали в сравнении с коммерческим ФИТЦ-конъюгатом антирабического иммуноглобулина (ФГБУ«ВНИИЗЖ», Россия). В каждую лунку микропланшета, за исключением зоны отрицательного контроля, вносили равное количество питательной среды, вируссодержащей суспензии и клеточной культуры, после чего планшет инкубировали в течение 3 сут в условиях CO2-инкубатора (5 % CO2, 37 oC).
На следующем этапе культуру окрашивали экспериментальными и коммерческим флуоресцирующими конъюгатами в течение 1 ч при 37 oC. Экспериментальные конъюгаты с ФИТЦ готовили в серийных двукратных разведениях от 1:10 до 1:160, конъюгаты с Alexa Fluor (532 нм) – в серийных пятикратных разведениях от 1:10 до 1:1250. Коммерческий
Обратный титр антител к рибонуклеопротеину вируса бешенства “Москва 3253Vero”

2.5 2 1.5 1 0.5 0
-0.5 360
460 560 Длина волны, нм
2 1.5 1 0.5 0
-0.5 360
460 560 660 760 Длина волны, нм
антитела к РНП
смесь ФИТЦ и антител конъюгат антител с ФИТЦ ФИТЦ
Alexa-Fluor (532 нм)
антитела к РНП
смесь антител и Alexa Fluor (532 нм) конъюгат антител и Alexa Fluor (532 нм)
Рисунок 6. Исследование спектров поглощения при конъюгировании антител к рибонуклеопротеину вируса бешенства с Alexa Fluor (532 нм)
Рисунок
поглощения при конъюгировании антител к рибонуклеопротеину вируса бешенства с ФИТЦ
5. Исследование спектров
14
Оптическая плотность, OD
Оптическая плотность, OD
ФИТЦ-конъюгат готовили в разведении 1:40, рекомендованном инструкцией по применению. При визуальной оценке эффективности применения экспериментального ФИТЦ-конъюгата установлено оптимальное рабочее разведение, соответствующее значению 1:80. Присутствие инфицированных клеток отмечали при их свечении не менее чем на 3 балла, так же как и при окрашивании коммерческим конъюгатом в разведении 1:40 (рисунок 7).
Рисунок 7. Сравнение эффективности коммерческого и экспериментального антирабических ФИТЦ-конъюгатов в образцах клеточной культуры Vero, увеличение (200х)
А – инфицированная virus fixe «Москва 3253Vero» клеточная культура Vero, окрашенная коммерческим ФИТЦ-конъюгатом (1:40); B – инфицированная virus fixe «Москва 3253Vero» клеточная культура Vero, окрашенная экспериментальным ФИТЦ-конъюгатом (1:80);
C – интактная клеточная культура Vero, окрашенная коммерческим ФИТЦ-конъюгатом (1:40); D – интактная клеточная культура Vero, окрашенная экспериментальным ФИТЦ- конъюгатом (1:80)
Увеличение степени разведения раствора конъюгата приводило к менее заметному свечению инфицированных клеток, которое оценивали на 1-2 балла. При визуальной оценке эффективности конъюгата антител с Alexa Fluor (532 нм) специфическое свечение вируссодержащих образцов с интенсивностью не менее чем на 3 балла отмечено при разведении конъюгата не более чем 1:250 (рисунок 8). Увеличение степени разведения раствора конъюгата приводило к снижению эффективности окрашивания образцов.
Рисунок 8. Образцы инфицированной virus fixe «Москва 3253Vero» клеточной культуры Vero, окрашенные конъюгатом антирабических антител с Alexa Fluor (532 нм), увеличение (100х)
А – окрашенный Alexa Fluor-конъюгатом (532 нм) образец (1:250);
B – окрашенный Alexa Fluor-конъюгатом (532 нм) образец (1:1250)
Дальнейшее исследование по разработке метода контроля уровня вирус- нейтрализующих антител на модели клеточных культур проводили с использованием коммерческого и экспериментальных антирабических конъюгатов, взятых в рабочих разведениях. Глава 4 посвящена поиску оптимальных параметров разрабатываемого метода определения вируснейтрализующей активности АИГ в РН ВБ на культуре клеток. Для разработки методического приема определения уровня антител был выбран штамм ВБ «Москва 3253Vero», адаптированный к клеточной культуре. Первая задача данного раздела состояла в изучении особенностей культивирования штамма «Москва 3253Vero» на культурах Vero и BHK-21 и последующем выборе оптимальной клеточной культуры для постановки разрабатываемого метода in vitro.
Схема эксперимента состояла в титровании вируссодержащей жидкости в 96- луночных микропланшетах в соответствующей питательной среде в последовательных десятикратных разведениях (от 10-2 до 10-6). После этого в каждую лунку микропланшетов вносили равный объем культуры клеток Vero или BHK-21 соответственно в концентрации (3±1)×105 клеток/мл. Для поддержания жизнедеятельности клеток использовали среду Игла МЕМ с содержанием сыворотки КРС от 2 до 10 %. Затем планшеты с клетками и вирусом выдерживали в CO2-инкубаторе (5 % CO2 при 37 oC) в течение 24, 48 и 72 ч. В указанные сроки исследовали клеточную культуру на ВБ методом иммунофлуоресценции. По завершении инкубации клеточный монослой фиксировали в течение 10 мин при комнатной температуре 80 % водным раствором ацетона, предварительно охлажденным до минус 20 oС. Фиксированный монослой окрашивали конъюгатом антирабического иммуноглобулина с ФИТЦ (ФГБУ «ВНИИЗЖ», Россия).
При инкубировании клеточных культур в течение 24 ч обнаруживали сла- босветящиеся фокусы специфической флуоресценции, визуально оцениваемые на 1-2 балла в разведениях вируса 10-2; при инкубировании в течение 48ч наблюдали фокусы флуоресценции, визуально оцененные на 2-3 балла в разведениях вируса 10-2-10-5 для клеточной культуры Vero и в разведениях вируса 10- 2-10-4 для клеточной культуры BHK-21. В планшетах с 48-часовой культурой BHK-21 во всех разведениях отмечали частичную деструкцию монослоя, в том числе в образцах с интактными клетками. При инкубировании клеточных культур в течение 72 ч обнаруживаемые фокусы специфической флуоресценции визуально оценивали на 3-4 балла в разведениях вируса 10-2-10-5 для клеточной культуры Vero и в разведениях вируса 10-2-10-4 для клеточной культуры BHK-21. В планшетах с 72-

часовой культурой BHK-21 во всех разведениях была отмечена обширная деструкция монослоя, в том числе в образцах с интактными клетками. К 72 ч инкубации в планшетах с культурой Vero появлялись признаки начала деструкции вследствие перерастания клеточного монослоя. Важно отметить, что для клеточных культур BHK-21, инкубируемых в течение 48 ч и 72 ч, фокусы флуоресценции состояли из малочисленных групп или единичных инфицированных клеток, достаточно удаленных друг от друга, что затрудняло учет результатов. При исследовании инфицированной ВБ клеточной культуры Vero, напротив, выявляли крупные и многочисленные фокусы флуоресценции.
Результаты экспериментов подтвердили возможность использования обеих клеточных культур для детекции вируса с применением люминесцентной микроскопии. Установлена оптимальная концентрация сыворотки КРС в среде для культивирования ВБ – от 2 до 5 %. При добавлении в среду 10 % сыворотки КРС отмечали снижение значения активности ВБ. Оптимальный срок инкубации инфицированной ВБ клеточной культуры соответствовал 48 ч для BHK-21 и 72 ч для культуры Vero. Анализ особенностей инфицирования ВБ исследуемых клеточных культур позволил обосновать выбор в пользу культуры Vero для применения в РН ВБ in vitro. В дальнейших исследованиях по разработке метода контроля уровня антирабических антител in vitro применяли клеточную культуру Vero и питательную среду Игла МЕМ с добавлением 5 % сыворотки КРС, учет результатов осуществляли через 72 ч от начала инкубации.
На следующем этапе было изучено влияние типа фиксирующего вещества и времени фиксации на структуру инфицированного ВБ клеточного монослоя и значение активности ВБ. Существующие в настоящее время протоколы исследования ВБ в клеточных культурах методом иммунофлуоресценции предполагают фиксацию клеточных культур охлажденным 80 % водным раствором ацетона с последующим окрашиванием конъюгатом антирабических антител с ФИТЦ в течение 1 ч. Также в литературе встречаются рекомендации по использованию для фиксации клеточных культур раствора формальдегида. При определении антигена ВБ на клеточной культуре важна не только процедура фиксации клеточного монослоя, но и способ дальнейшего окрашивания фиксированных образцов. В данном исследовании для выявления ВБ предлагается использование коммерческого и экспериментальных конъюгатов антител с флуорохромами. В связи с этим в задачи настоящего раздела также входило определение условий, оптимальных для применения экспериментальных диагностических конъюгатов антител к РНП ВБ с ФИТЦ и Alexa Fluor (532 нм). Для фиксации клеточного монослоя использовали 80 % водный раствор ацетона и 4% раствор формальдегида. Фиксирующие агенты добавляли в лунки планшета с раститрованным ВБ по 50 мкл. Фиксацию проводили при (6±2) и (23±3) oС с интервалами времени 3, 5, 10, 20 и 30 мин. Затем в течение часа осуществляли окрашивание монослоя конъюгатами антител с флуорохромами, взятыми в рабочих разведениях. После окрашивания оценивали титр вируса и состояние монослоя.
При применении 80 % раствора ацетона и 4 % раствора формальдегида были получены сопоставимые результаты. Максимальный титр ВБ наблюдали в образцах, фикси- рованных формальдегидом или ацетоном в течение 10 мин. При использовании формальдегида отмечали снижение интенсивности флуоресценции в образцах по мере возрастания времени фиксации с 10 до 30 мин. Результаты исследования, полученные при фиксации в температурных условиях (23±3) oC оказались сопоставимы с результатами эксперимента, проведенного при (6±2) oС. В исследовании влияния фиксирующих веществ на интактную клеточную культуру отмечали отсутствие визуально обнаруживаемых нарушений целостности монослоя.
На следующем этапе исследования было обосновано оптимальное время окрашивания образцов экспериментальными конъюгатами антител к РНП ВБ с ФИТЦ и Alexa Fluor (532 нм). Окрашивание проводили в течение 0,5-1,5 ч, качество окрашивания исследовали с интервалом времени 10 мин. Появление фокусов флуоресценции, оцениваемых на 3-4 балла, наблюдали через 40 мин окрашивания любым из исследуемых конъюгатов. В образцах,
окрашиваемых в течение 50-70 мин, фиксировали большее количество фокусов специфической флуоресценции на лунку, чем в образцах, окрашенных в течение 40 мин. Для образцов, окрашиваемых в течение 80-90 мин, вне зависимости от вида используемого конъюгата было отмечено наличие яркого фонового свечения монослоя, препятствующее достоверному определению локализации фокусов флуоресценции. По результатам исследования установлено: оптимальное время фиксации клеточного монослоя 80 % раствором ацетона или 4 % раствором формальдегида – (15±5) мин; оптимальное время окрашивания образцов экспериментальными диагностическими конъюгатами антител к РНП ВБ – (60±10) мин.
Далее проводили определение оптимальной рабочей дозы ВБ «Москва 3253Vero» с целью дальнейшего применения в реакции нейтрализации ВБ in vitro. Для исследования были выбраны инфицирующие дозы 50, 100, 300, 500, 1000, 5000 ID50/0,05 мл. Определение рабочей дозы проводили с применением Европейского стандартного образца антирабического иммуноглобулина (Human rabies immunoglobulin BRP batch 1; активность 91 МЕ/мл). Для эксперимента было подготовлено 3 культуральных 96-луночных планшета – по одному на исследование двух вариантов рабочих доз. В лунках планшета готовили трехкратные разведения Европейского стандартного образца АИГ на питательной среде Игла МЕМ с добавлением 5 % сыворотки КРС, начиная с разведения 1:50. Каждое разведение исследовали в 8 повторностях. Отрицательный контроль представлял клеточный монослой Vero с нормальной лошадиной сывороткой. Обнаружение ВБ осуществляли методом люминесцентной микроскопии. Расчет титра антител проводили по методу Рида и Менча.
Экспериментально установлено, что при исследовании рабочих разведений ВБ 100, 300, 500, 1000 ID50/0,05 мл титры антител стандартного образца АИГ соответствовали 3,38; 3,23; 2,6; 2,3 lg ED50. При добавлении вируса в дозе 5000 ID50/0,05 мл антитела обнаруживали в титре менее 2 lg ED50, что заметно понижало чувствительность метода. При использовании дозы ВБ 50 ID50/0,05 мл не удалось установить конечную точку титрования стандартного об- разца АИГ. На основании полученных результатов была установлена оптимальная доза ВБ для определения антирабических антител в РН in vitro – 100-300 ID50/0,05 мл.
При определении оптимальной рабочей дозы ВБ «Москва 3253Vero» нейтрализацию вируса осуществляли в течение 1ч согласно протоколу проведения FAVN-теста. Использование штамма ВБ «Москва3253Vero» в разрабатываемом методе предполагает необходимость обоснования для данного штамма времени нейтрализации антирабическими антителами. Для установления оптимального значения периода нейтрализации Европейский стандартный образец АИГ титровали в 96-луночных планшетах. Далее в каждую лунку вносили по 50 мкл рабочего разведения ВБ и инкубировали планшеты в CO2-инкубаторе при 37 oC в течение различных интервалов времени от 10 до 60 мин. По завершении соответствующих периодов нейтрализации добавляли клеточную культуру Vero, инкубиро- вали планшеты в течение 72 ч в CO2-инкубаторе и исследовали с применением метода люминесцентной микроскопии.
Появление фокусов флуоресценции наблюдали в разведении стандартного образца АИГ 1:375 при нейтрализации в течение 10 мин. С увеличением времени нейтрализации отмечали снижение количества фокусов флуоресценции в лунках с более высоким разведе- нием антител. При нейтрализации вируса в течение 40-60 мин фиксировали стабильные значения титров антирабических антител. Минимальное значение времени нейтрализации, не оказывающее влияние на результат РН in vitro, составило 40 мин.
Поскольку ВОЗ рекомендует применение вторичных стандартных образцов для про- ведения рутинных исследований, при разработке метода определения уровня ан- тирабических антител на клеточной культуре возникла необходимость в получении соответствующего стандартного образца предприятия (СОП). В главе 5 приведено описание результатов исследований, относящихся к разработке и аттестации СОП для контроля АИГ по показателю «специфическая активность» в РН ВБ на культуре клеток, как компонента аналитической системы, а также сравнительный анализ данных по активности АРС и АИГ,
полученных в РН ВБ in vivo и разработанным методом in vitro. Кандидатом в СОП стал АИГ серии 174, полученный в соответствии с требованиями промышленного регламента на производство АИГ. Аттестацию кандидата проводили в соответствии с нормативными документами P N 002639/01–250210, разделом «Специфическая активность» и методическими приемами, обоснованными в ходе исследований в рамках главы 4. Значение показателя специфической активности кандидата в стандартные образцы предприятия определяли в РН вируса на клеточной культуре. В качестве образца сравнения использовали АИГ, соответствующий требованиям Европейской Фармакопеи, для применения в исследо- ваниях in vitro. Для исследования выбрали три образца кандидата в СОП специфической ак- тивности АИГ (таблица 2). Значение специфической активности для кандидата в СОП составило (180,8±18,8) МЕ/мл. Разработанный СОП специфической активности АИГ для применения в РН ВБ на культуре клеток (сер. 41-01-20) утвержден и внесен в реестр СОП, допущенных к применению в экспериментально-производственных подразделениях ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб».
Таблица 2 – Определение титра антирабических антител в трех образцах кандидата в
стандартные образцы предприятия иммуноглобулина
специфической активности
1:14591 227 1:9411 147
1:12150 189 1:2700 158
1:3394 198
1:3024 177 1:4525 204 1:4032 182 1:3200 144 1:4032 182
антирабического
Образцы кандидата в СОП
Титр активности стандартного образца Европейской фармакопеи
Активность стандартного образца Европейской фармакопеи
в МЕ/мл
Титр активности СОП
Титр активности СОП в МЕ/мл
Аттестованное значение СОП в МЕ/мл
(x  x)
Образец 1, опыт 1
Образец 2, опыт 2
Образец 3, опыт 3
1:5841 91 1:1559 91
1:2016 91
180,8±18,8
Срок годности разработанного стандарта обоснован результатами исследования его стабильности по показателю «специфическая активность» в долгосрочных испытаниях. При регистрации стандартного образца были представлены данные по сохранению стабильности в течение 1,5 лет. Указанный СОП применяли в качестве образца сравнения при дальнейших исследованиях специфической активности АИГ на клеточной культуре. С учетом установленных в вышеописанных экспериментах оптимальных параметров проводили определение значения специфической активности АРС и АИГ в РН ВБ на клеточной культуре и сравнительный анализ полученных данных с результатами исследования тех же образцов в РН ВБ на белых мышах. При постановке РН in vivo в качестве образца сравнения использовали СОП специфической активности антирабического иммуноглобулина для применения в РН на белых мышах с активностью 190 МЕ/мл. Сравнительный анализ полу- ченных результатов показал наличие сильной корреляции (r > 0,9) между результатами дан- ных тестов.
Для оценки согласованности данных по активности образцов АИГ и АРС, полученных методами in vivo и in vitro, применяли метод описательной статистики Блэнда- Алтмана, принятый для сравнения каждой пары показателей, полученных различными способами. Диаграммы Блэнда-Алтмана для сравнения вируснейтрализующей активности АИГ и АРС показаны на рисунках 9 и 10.
0.4 0.3 0.2 0.1
0 -0.1 -0.2 -0.3 -0.4 -0.5 -0.6
01234 Среднее значение (lg in vivo + lg in vitro)/2
M
Верхний предел согласия
Нижний предел согласия
0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 -0.05 -0.1 -0.15 -0.2
01234 Среднее значение (lg in vivo + lg in vitro)/2
M
Верхний предел согласия
Нижний предел согласия
Рисунок 9. Диаграмма Блэнда-Алтмана (образцы антирабического иммуноглобулина)
Рисунок 10. Диаграмма Блэнда-Алтмана (образцы антирабических сывороток)
Анализ представленных на рисунках диаграмм показал, что 93,75 % значений разницы показателей при парных измерениях попадают в доверительный интервал (±1,96×SD), что говорит о тесной линейной связи. При анализе активности АИГ средняя разность между измерениями составила 0,0425, а при анализе АРС – минус 0,12, что свидетельствует об отсутствии систематического расхождения.
Анализ данных позволил сделать вывод о наличии согласованности между значениями специфической активности образцов АИГ и АРС, полученными в результате проведения РН на клеточной культуре Vero и на белых мышах. Полученные в ходе исследований главы 5 данные свидетельствуют о возможности использования разработанного подхода определения уровня антирабических антител в качестве метода контроля специфической активности АРС и АИГ в производстве препарата антирабического иммуноглобулина наравне с методом in vivo.
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
По результатам проведенной работы предложен и экспериментально обоснован комплекс биотехнологических решений по разработке метода определения специфической активности антирабического иммуноглобулина на клеточной культуре, включающий применение питательной среды на основе ферментативного гидролизата фибрина при культивировании инфицированной вирусом бешенства клеточной культуры, получение флуоресцентного диагностикума, разработку стандартного образца предприятия специфической активности антирабического иммуноглобулина для применения в реакции нейтрализации вируса на культуре клеток, а также методический прием для определения уровня антирабических антител в иммунных лошадиных сыворотках и препарате иммуноглобулина.
5. ВЫВОДЫ
1. Экспериментально обоснована возможность выделения рибонуклеопротеина из цитоплазмы клеточной культуры Vero, инфицированной вирусом бешенства «Москва 3253Vero», выращенной на экспериментальной питательной среде, содержащей от 0,1 до 0,25 % сухого ферментативного гидролизата фибрина. Применение экспериментальной среды в указанных концентрациях позволило в (1,45±0,05) раза увеличить выход рибонуклеопротеина, выделяемого из инфицированной 72-часовой культуры Vero, по сравнению с коммерческими питательными средами 199 и Игла МЕМ.
Разность (lg in vivo – lg in vitro)
Разность (lg in vivo – lg in vitro)
2. Разработана эффективная схема иммунизации кроликов для получения антител к рибонуклеопротеину вируса бешенства, заключающаяся во внутримышечном введении животным на 0, 43 и 57 дни рибонуклеопротеина (400 мкг) с наночастицами коллоидного золота в качестве адъюванта (14-17 нм, 0,14 ммоль). Данная схема позволила получить сыворотки с вдвое большей активностью (1:25600), чем при применении схем иммунизации с использованием полиоксидония в качестве адъюванта и без применения адъюванта.
3. Получены флуоресцирующие конъюгаты на основе антител к рибонуклеопротеину вируса бешенства штамма «Москва 3253Vero». При этом показана возможность эффективного применения полученных экспериментальных конъюгатов антител к рибонуклеопротеину с флуорохромами ФИТЦ и Alexa Fluor (532 нм), взятых в разведениях 1:80 и 1:250 соответственно, наряду с коммерчески доступным ФИТЦ- конъюгатом антирабического иммуноглобулина при исследовании образцов инфицированных вирусом бешенства клеточных культур методом прямой флуоресценции.
4. Разработан методический прием для определения специфической активности антирабических сывороток и иммуноглобулина на культуре клеток. Особенностями предлагаемого метода являются: использование вируса бешенства «Москва 3253 Vero», взятого в рабочей дозе от 100 до 300 ID50/0,05 мл, и клеточной культуры Vero; применение в качестве фиксатора 80 % водного раствора ацетона или 4 % раствора формальдегида в течение (15±5) мин; окрашивание образцов коммерческим или экспериментально полученными диагностическими конъюгатами в течение (60±10) мин; период нейтрализации вируса бешенства антирабическими антителами – не менее 40 мин; учет результатов реакции с применением люминесцентной микроскопии через 72 ч от начала инкубации.
5. Разработан и аттестован стандартный образец предприятия специфической активности антирабического иммуноглобулина для применения в реакции нейтрализации вируса на культуре клеток. Установлена аттестуемая характеристика образца, соответствующая значению (180,8±18,8) МЕ/мл. Экспериментально подтверждена возможность его использования для определения специфической активности иммуноглобулина in vitro при проведении контрольных исследований.
6. Установлена сильная корреляция (r > 0,9 при уровне значимости > 95 %) и согласованность результатов (93,75 % значений разницы показателей при парных измере- ниях вошли в доверительный интервал (±1,96)×SD), полученных при определении специфи- ческой активности антирабических сывороток и иммуноглобулина с использованием предла- гаемого методического приема и в реакции нейтрализации вируса на белых мышах, приме- няемой в настоящее время в производстве антирабического иммуноглобулина.
6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ РЕЗУЛЬТАТОВ ДИССЕРТАЦИОННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
Полученные опытные данные будут способствовать внедрению разработанного методического приема в производство иммунобиологического лекарственного средства «Иммуноглобулин антирабический из сыворотки крови лошади жидкий» для определения его специфической активности in vitro при проведении выпускающего контроля качества производителем и подтверждения соответствия требованиям нормативной документации уполномоченными учреждениями Минздрава РФ с целью ввода в гражданский оборот. Разработанный метод может быть применен для оперативного контроля уровня специфических антител в иммунных сыворотках крови лошадей в процессе производственной эксплуатации и индивидуальной оценки напряженности иммунитета каждого продуцента.