Разработка методики исследования протеотипических пептидов для полуколичественного анализа мышечных белков в мясной продукции МRМ методом

Обоснованы актуальность и целесообразность проводимой работы, сформулирована цель и задачи исследований, практическая значимость работы и положения, выносимые на защиту.
ГЛАВА 1. Представлен анализ отечественной и зарубежной литературы относительно подходов к изучению механизмов синтеза и методов анализа белков. Представлены такие методы измерения количества белков как
спектрофотометрические, хроматографические и масс-спектрометрические.
Рассмотрены основные подходы протеомики в области идентификация и измерения видоспецифических пептидов и белков. Рассмотрены аналитические инструменты распознавание видоспецифических белков с помощью ДНК- гибридизации и ПЦР анализа, иммуноанализов (ELISA), ВЭЖХ МС, применяемой для обнаружения биомаркерных пептидов.
ГЛАВА 2. Представлены характеристики объектов исследований, организация и схема выполнения работы, подготовка проб и методы анализа.
В соответствии с целью работы объектами исследований являлись:
– модельные мясные системы из говядины в/с (97 мас. % мыш. ткани), свинины п/ж (50 мас. % мыш. ткани), свинины жирной (20 мас. % мыш. ткани), и немясные ингредиенты, соответствующие основному колбасному фаршу по ГОСТ 23670-2019. Содержание мышечной ткани по говядине и свинине отвечающие основным категориям мясной продукции: 8% (мас. %), 16% (мас. %) и 50% (мас. %) и 8% (мас. %) соответственно. Также были проанализированы модельные рецептуры без термической обработки и с использованием варки (режимы согласно ТИ к ГОСТ 33673-2015 Изделия колбасные вареные. Общие технические условия) (п. 3.2, 3.3); говяжьи сердца сырые (п. 3.2); грудные мышцы кур (m. Pectoralis major) (п. 3.2); свиные аорты и сердца; мясные консервы «Здоровое сердце», содержащие ткани миокарда (сердце) и аорты свиньи, разработанные в ФГБНУ «ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова» РАН; консервы мясные «Сердце свиное в собственном соку», выработанные по ГОСТ Р 55477-2013, изготовленные в ЗАО «Йошкар-олинский мясокомбинат» (п. 3.3); модельные фарши в колбасной оболочке из m.L. Dorsi свинины и говядины в соотношении 1:3, 1:1, 3:1, 20:1 (п. 3.4);
В работе использованы биохимические и протеомные методы исследования белков, включающие в себя спектрофотометрию, жидкостную хроматографию в сочетании с масс-спектрометрией, биоинформационный анализ и статистическую обработку данных.
Протеомные исследования: биоинформационный анализ (1) – подбор MRM
для 58 последовательностей пептидов (Stachniuk и соавт., 2020) проводили в
программе Skyline (https://skyline.ms/), для обеспечения специфичности пептида был выполнен поиск в базе данных BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/); ферментативный гидролиз (2) ‒ все реагенты использовались чистоты U.S.P. или выше. Все используемые растворители, включая воду, использовались маркировкой LC / MS. Белки экстрагировали из образцов и расщепляли трипсином на основе ранее опубликованных исследований (Ruiz Orduna и соавт., 2017, Khvostov и соавт., 2020, Stachniuk и соавт., 2020); флуоресцентный анализ (3) ‒ содержание белка измеряли с помощью набора для анализа белка Quant-it (Thermo Fisher Scientific, США) с использованием флуориметра Qubit (Thermo Fisher Scientific, США) в соответствии с инструкцией производителя; жидкостная хроматография в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (4) ‒ использовали колонку ZORBAX Eclipse Plus C18 с быстрым разрешением HD 2,7 мкм (50 × 2,1 мм; Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA), хроматографическое разделение проводили в Agilent 1260 Infinity ВЭЖХ (США), детекцию осуществляли с помощью трехквадрупольного масс-спектрометра (QQQ 6410, Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA), данные ВЭЖХ / ESI-МС были получены с использованием программного обеспечения MassHunter B.04.00 (Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA), калибровочные кривые были построены с использованием расчета площади полного ионного тока (TIC) (сумма двух отслеживаемых переходов), так и сигнала первого перехода (наиболее интенсивного), что дало полностью сопоставимые результаты(Khvostov и соавт., 2020); статистика и обработка данных (5) ‒ для целей статистической обработки использовался двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA) в программе STATISTICA 10.0, извлечение и обработка данных производилась в Microsoft Excel 2019 (США).
Схема выполнения работы представлена на рисунке 1.
10

…..
Анализ литературы о состоянии проблемы исследования.
Анализ методов идентификации и измерения видоспецифических пептидов и белков.
Постановка целей и задач, выбор объектов исследования.
Поиск наиболее подходящих пептидных маркеров (биомоделирование) для определения мышечной ткани основного сырья. Видоспецифичность, термостабильность (п. 3.1-3.2).
Проверка селективности выбранных маркерных пептидов на примере различных тканей свинины (п. 3.3).
Разработка параметров хромато-масс-спектрометрического MRM. Выбор наиболее стабильных y- переход. (п. 3.4)
Апробация. Разработка методики на модельных фаршах. Относительное содержание, определение LOD и LOQ. (п. 3.4-3.6, Приложение В)
Расчет экономической эффективности разработанного подхода анализа биомаркеров. (п. 3.7, Приложение Г)
Рисунок 1 – Схема выполнения диссертационной работы
11
Экспериментально-аналитический этап
Теоретический этап

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
С целью выявления пептидов функциональности и аутентификации мясного сырья и готовых мясных продуктов вначале были проведены работы по определению белковых маркеров и получены спектры пептидов на примере количественной идентификации маркерных пептидов мышечной ткани говядины, свинины и птицы (курица), как основного сырья, используемого при переработке. Данные работы также направлены на расширение научного и технологического базиса по выявлению и идентификации ткане- и видоспецифичных веществ белково-пептидной природы в мясных продуктах.
3.1. Применение аспектов биомоделирования
Для выбора потенциальных маркерных пептидов были отобраны пептиды (таблицы 1 и 2), длина которых превышала шесть аминокислот, в соответствии с ранее указанными протоколами (Stachniuk и соавт., 2019). Таким образом, длина пептида обеспечивает видоспецифичность мышечного белка. Затем пептидные ионы-кандидаты были подвергнуты перекрестной проверке на хроматограмме других видов мяса, и были отобраны только те пептиды, которые присутствовали в одном типе мяса. Кроме того, для обеспечения специфичности пептида был выполнен поиск (рисунок 2) в базе данных BLAST (англ. Basic Local Alignment Search Tool – средство поиска основного локального выравнивания).
Рисунок 2 – Сравнение белка миоглобина разных видов животных при помощи BLAST.
3.2 Маркерная идентификация пептидов
Проведено изучение биомаркеров для идентификации говядины (таблица 1). Разработанная методика позволила одновременно идентифицировать и сравнивать до 13 биомаркеров пептидов говядины (рисунок 2). Используя критерий S/N, можно было сравнить пептидные маркеры на подлинность для сырого и термически обработанного мясного продукта. Считались успешными кандидатами, у которых отношение сигнал / шум было выше 3.
Рисунок 2 – Хроматограммы отобранных биомаркеров, идентифицирующих мышечную ткань говядины: А – основные пептиды, В – минорные пептиды.
Из анализа видоспецифических маркерных пептидов были отобраны три пептида (NDMAAQYK и YLEFISDAIIHVLHAK из миоглобина и SNVSDAVAQSAR из белка триозофосфат-изомеразы) для определения мышечной ткани в говядине с учетом следующих факторов: высокая распространенность в мышечных тканях (> 50*10^3 усл. ед. интенсивности), хорошее соотношение
сигнал / шум при низких концентрациях (SN> 10), высокая специфичность и наличие сайтов расщепления, специфичных для трипсина, на обоих концах белковой цепи. Для образцов с двумя уровнями концентрации и при тепловом воздействии (варки) отношение S/N были установлены выше 10. Для пептида HPSDFGADAQAAMSK проводился дополнительный поиск MRM. Использовались два родительских иона 766,8 m/z и 511,6 m/z. Наиболее значимым оказался ион 511.6 m/z. Интенсивность MRM по данной массе увеличилась на 40,0±7,4% по сравнению с ионом 766,8 m/z.
Таблица 1 – Сравнение маркерных пептидов по характеристикам сигнал/шум для двух концентраций и двух режимов приготовления (без и с термообработкой) говядины.
Проверялось влияние одного цикла заморозки/разморозки образца на интенсивность пептида HPSDFGADAQAAMSK (таблица 1). Для образцов, которые проходили термическую обработку, показатель S/N не изменился. Установлено, что один цикл заморозки/разморозки не влияет на большие концентрации (более 15% (мас. %)) мяса в образцах. При концентрациях меньше 10% (мас. %), падение интенсивности составило до 52,4±15,2%. Для пептидов ALDLDSNC[+57,0]K [20], DLADEVALVDVMEDK и GEFQLLLDALDK [12] была зафиксирована кросконтаминация при высоком содержание другого вида мяса без использования говядины (рисунок 3).
Рисунок 3 – Идентифицированные пептиды ALDLDSNC[+57,0]K, DLADEVALVDVMEDK и GEFQLLLDALDK в пробах, не содержащих говядину.
Некоторые пептиды не прошли пороговую оценку в рамки критерия S/N – выше трех. Пептиды MEIDDLASNVETISK TLALLFSGPASGEAEGGPK из белков миозинового ряда оказались чувствительны к термическому воздействию в образцах с содержанием мышечной ткани в 16% (мас. %). При более низких концентрациях критерий S/N приближался к 2-3. Не удалось подтвердить пептид DLADEVALVDVMEDK во всех типах образцов. Показатель S/N по всем пробам составил не более 2-х. Проведя однофакторный дисперсионный анализ ANOVA было установлено значимое влияние температуры на интенсивность маркерных пептидов при концентрации 8% (мас. %) (мас. %) (p = 0,021) и 16,0% (мас. %) (p = 0,013) говядины.
Был проведен сравнительный анализ протеотипических пептидов для идентификации мышечной ткани свинины на модельных образцах (таблица 2). Разработанная методика позволила одновременно выявить и сравнить до 20 биомаркерных пептидов свинины (рисунок 4) за короткое время (25 минут).
Рисунок 4 – Хроматограммы выбранных биомаркеров, отвечающих за идентификацию мышечной ткани свиньи: А – основные пептиды, В – минорные пептиды.
Из анализа видоспецифичных биомаркеров окончательно были определены
три пептида (SALAHAVQSSR и TLAFLFAER из миозина и LVVITAGAR из 16

белка лактатдегидрогиназы) для идентификации мышечной ткани свинины. Также хочется отметить, что нестабильно себя показали маркеры из белков миоглобина, бета-гемоглобина и Trifunctional enzyme subunit α, которые не рекомендуется использовать в количественных исследованиях.
Таблица 2 – Сравнение маркерных пептидов относительно характеристики сигнал/шум для двух концентраций и двух режимов приготовления (без и с термической обработкой).
Для пептидов VNVDEVGGEALGR, EVTEFAK, FVIER TVLGNFAAFVQK была зафиксирована кросконтаминация при высоком содержание другого вида
мяса без использования свинины (рисунок 5). Пептид FVIER был обнаружен (p < 0,05) при анализе образца говяжьей сердечной мышцы, выбранного контрольным образцом для проверки селективности протеотипических пептидов. Измеренная площадь пика составила 60% от площади пика образца фарша свинины с концентрацией 50,0% (мас. %). Таким образом, пептид FVIER не может быть выбран, как однозначный маркер для свиного мяса, ввиду его нахождения у других видов животных. Другие пептиды в образце сердечной мышцы говядины получены из сывороточного альбумина и бета-гемоглобина, где концентрация данных типов белков максимальна. Многие пептиды не прошли соответствие критерию S/N выше трех. Пептиды, представленные из белков миозина, такие как TLAFLFTGAAGADAEAGGGK LLSNLFANYAGADTPVEK и пептиды FFESFGDLSNADAVMGNPK, VNVDEVGGEALGR из бета-гемоглобина не удалось идентифицировать во всех типах образцов. Данные маркеры могут быть чувствительны к циклам заморозки/разморозки и длительному хранению даже при минусовой температуре. Показатель S/N по всем пробам составил не более 1 единицы. Рисунок 5 – Идентифицированные пептиды VNVDEVGGEALGR, EVTEFAK, FVIER TVLGNFAAFVQK в пробах, не содержащих свинину. Проведя однофакторный дисперсионный анализ, было установлено значимое влияние температуры на интенсивность маркерных пептидов при двух концентрациях 8,4% (мас. %) (p = 0,037) и 50,0% (мас. %) (p = 0,002). Это может быть связано с доступностью белковых молекул для ферментативного гидролиза при тепловой обработке. Эти данные необходимо будет учитывать при выборе стандартов для разработки количественных методик. Куриное мясо часто используют как замену более дорогим видам мяса. На рисунке 6 представлены пептиды из креатинкиназы M, миозина, β-енолазы, M- белкоы и пируваткиназы. Они являются источником термостабильных пептидов. Для цепей миозина были проанализированы девять термостойких пептидов. Семейство миозинов является наиболее репрезентативным семейством пептидов в белом мясе из-за его роли в сокращении мышц. Можно выделить два маркера на рисунке 6. Это пептид DQGTFEDFVEGLR, показавший интенсивность сигнала в (10−30)*10^3 усл. ед. интенсивности. Эти результаты согласуются с исследованиями Sentandreu и соавт. (2010) и Wang и соавт. (2018), где был обнаружен только этот пептид. Вторым маркером является пептид VAGAALPCAPAVK. Его интенсивность составляла в диапазоне (60−110)*10^3 усл. ед. интенсивности. Это значение оказалось самым высоким среди всех проанализированных пептидов. Новые данные могут сместить акцент на более детальное изучение пептида VAGAALPCAPAVK. Пептиды SAMLQLA VTEIEK, DLFDPVIQDR, LSVEALNSLEGEFK и LAMQEFMVLPVGAASFHDAMR показали интенсивность сигнала (10−90)*10^3 усл. ед. интенсивности. Однако разброс интенсивности определяемых переходов (при p< 0,05) составлял более 50% для этого ряда маркеров (рисунок 6). Это может сказываться на результатах во время выполнения ферментного гидролиза и подготовки проб, и результаты анализа не смогут пройти порог сходимости в 25 %. Поэтому на данном этапе работ рассматривается только пептид VAGAALPCAPAVK, как маркер для количественной оценки, удовлетворяющий вышеперечисленным критериям. Рисунок 6 – Анализ протеотипических пептидов для мышечной ткани мяса кур: А - сравнение площадей маркерных пептидов для детектирования мяса кур по всем SRM переходам для исследуемых образцов; B - время удерживания, переходы и масс-спектр дочерних ионов для видоспецифичных пептидов DQGTFEDFVEGLR и VAGAALPCAPAVK. На данном этапе работы были определены биомаркеры других ингредиентов не мышечной природы в готовых продуктах. Колбасный фарш в оболочке, содержащий белковые ингредиенты (Образец No6) и тот же образец после термообработки (Образец No9) представлены на рисунках 7 и 8. Были выбраны три 20 маркера на меланж и два на сухое молоко (рисунки 7 и 8). Содержание меланжа определено при добавлении в продукт на уровне 1.5% (мас. %) и сухого молока 2.5% (мас. %). Образцы также в составе содержали говядину и свинину. Для обнаружения перекрестной контаминации параллельно анализировались образцы, не содержащие данных ингредиентов. Рисунок 7 – Сравнение площадей интенсивности всех масс фрагментов маркерных пептидов меланжа для исследуемых образцов. В результате работ маркеры для обнаружения в составе меланжа, представленные на рисунке 7 из белков Ovotransferrin и lysozyme C показали кросс- контаминацию и не смогли быть идентифицированы в образцах, содержащих данный ингредиент. Концентрация добавленного компонента оказалась ниже предела детектирования. Для идентификации наличия сухого молока были выбраны два биомаркера из белка α-s1-casein. Для пептида YLGYLEQLLR были получены все SRM переходы для термообработанного продукта. Площадь пика для кривой составила 4,5 * 10^6 усл. ед. интенсивности (рисунок 8). При условии линейного снижения интенсивности сигнала возможно определение сухого молока до уровня в 0,05% (мас. %). Однако в продукте, не подвергающимся термической обработке с той же концентрацией добавки в 2.5% (мас. %) было заметное снижение интенсивности на 30,0% для данного маркерного пептида (рисунок 8). Это говорит, о доступности данного пептида в денатурирующих условиях. Пептид YLGYLEQLLR хорошо подойдет для количественной оценки сухого молока в мясных продуктах вареных. Рисунок 8 – Сравнение площадей по всем массам фрагментов для пептида YLGYLEQLLR и FFVAPFPEVFGK в исследуемых образцах. 3.3 Проверка селективности маркеров свинины по типу ткани Целью данного этапа работы стало изучение состава мясных продуктов, содержащих, помимо мышечной, другие типы тканей: гладкая мускулатура внутренних органов (аорты) и сердечную мышцу. Необходимо было установить, присутствуют выбранные маркерные пептиды (таблица 2) для мышечной ткани свинины в других типах ткани для предотвращения намеренной подмены основного сырья другим типом ткани в составе готового термообработанного мясного продукта. В ходе анализа не удалось обнаружить ранее выявленные маркеры мышечной ткани не в одном другом типе ткани (рисунок 9). Это говорит о селективности выбранных маркеров для аутентификации мышечной ткани свинины, а именно пептиды SALAHAVQSSR и TLAFLFAER из миозина и LVVITAGAR из белка лактатдегидрогеназы, сигнала которых нет на хроматограммах для гладкой мускулатуры и сердечной мышцы. При использовании такого подхода производитель не сможет применять сырье более низкого качество от того же вида животного. Рисунок 9 – Сравнение площадей маркерных пептидов свинины по всем SRM переходам для исследуемых образцов: а – рецептура 1 (таблица 2); б – гладкомышечная ткань свиных аорт; в – сердечной мышца свиная; г – паштет ЗС. 23 3.4 Разработка методики содержания мышечной ткани в мясном сырье Была апробирована ЖХ-МС методика для обнаружения и полуколичественного определения мышечной ткани двух различных видов мяса (говядина и свинина) в сложной биологической матрице, такой как бесструктурные фарши. После выделения белков и расщепления их трипсином для количественного определения были выбраны видоспецифичные пептидные маркеры0 для каждого типа животного (таблица 3). Метод был апробирован на модельных образцах смеси мышечной ткани двух видов животных (образцов m.l.Dorsi свинины и говядины). Таблица 3 – Оптимизированные параметры MRM для 7 пептидов свинины (Sus scrofa) и говядины (Bos taurus). Для выбора наиболее чувствительной ионной пары MRM для каждого пептида и включения в конечный мультиплексный метод MRM, были выбраны три наиболее интенсивные пары ионов MRM (определено прямым анализом ввода пробы) затем тестировали в условиях ВЭЖХ-МС анализа. Все три ионных перехода MRM для каждого пептида использовались для подтверждения идентичности. Это также позволило определить их соответствующие времена удерживания (рисунок 10). Целесообразно использовать только SRM, включающие только 2х зарядные y-ионы с получением дочерних ионов большей m/z, обеспечивающие максимальную величину аналитического сигнала (таблица 7) Рисунок 10 – Хроматограммы определения мышечной ткани основного мясного ингредиенты: А – говядина; В - свинина. Чтобы максимизировать емкость аналита и пропускную способность метода мультиплексирования MRM, было сосредоточено внимание на минимизации количества используемых пар ионов MRM (рисунок 11). После выбора маркерных пептидов для каждого из исследуемых видов эти пептиды были проанализированы, с целью установления пределов обнаружения (LOD) и количественного определения метода (LOQ), а также линейность ответа при 5% (мас. %) содержании мышечной ткани говядины в смеси 95% (мас. %) свинины. Для этого в хроматограммах были интегрированы площади маркерных пептидов (сумма трех отслеживаемых переходов). Рисунок 11 – Хроматограммы видоспецифического пептида SNVSDAVAQSAR говяжьей лактатдегидрогеназы. Соотношение между площадью каждого маркерного пептида и площадью общего пептида было вычислено для нормализации данных и во избежание различий из-за возможных вариаций в эффективности экстракции белка, активности фермента и других факторов. Калибровочные кривые (рисунок 12), охватывают весь диапазон концентраций ВЭЖХ-МС анализа. Рисунок 12 – Калибровочная кривая протеотипического пептида SNVSDAVAQSAR мышечной ткани говядины (белок –лактатдегидрогеназа). Установлены метрологические характеристики метода: сходимость на модельных системах в пределах 25,0% ср. кв. отклонения (при n = 3). Хорошая линейность была установлена для говядины, в отличие от свинины (таблица 4). Линейный динамический диапазон MRM для 7-ми пептидов варьировался от 5% (мас. %) мышечной ткани до 100% (мас. %) в смеси с другим видом мяса (свинина, говядина). Пределы обнаружения видов в модельных образцах находились в диапазоне 0,20–3,27% (мас. %), а пределы количественного определения – в диапазоне 0,61–9,91% (мас. %). Расчеты проводились в процентах от общего количества мяса. Таблица 4 – Калибровочные кривые, пределы обнаружения и количественного определения для протеотипических пептидов. После того, как был установлен порог обнаружения метода для каждого вида мяса, несколько образцов с неизвестным составом были подвергнуты анализу по разработанному методу для идентификации сторонних компонентов мышечной ткани другого вида животного. Учитывая, что предложенный метод ВЭЖХ / ESI- МС / МС позволяет обнаружить подмес мяса другого вида животного, отсутствие ложноотрицательных результатов демонстрирует высокую чувствительность метода. Разработанный метод показал также высокую специфичность; ложноположительные результаты не выявлены, то есть при отсутствии определенного вида мяса образцы всегда давали результаты ниже LOD. В обобщенную мультиплексную методику анализа белковой фракции были добавлены ранее выбранные биомаркеры (таблица 5). Эта комплексная методология учитывала наиболее используемые виды в мясном секторе и в будущем способна применяться к реальным промышленным продуктам. Это имеет первостепенное значение при анализе сложных пищевых матриц как фарши, которые являются основным сырьем для готовой продукции и наиболее подвержены фальсификации. Таблица 5 – Показатели контроля качества разработанной мультиплексной методики для мясного сырья и готовых продуктов за один анализ. В рамках текущей работы предоставляем полезный инструмент как для контролирующих органов (для оценки подлинности продукции), так и для пищевой промышленности (для мониторинга поставок сырья). Более того, успех применения этого метода к сложной пищевой матрице демонстрирует, как тот же самый подход может быть успешно применен к широкому спектру пищевых продуктов. 3.5. Экономическая эффективность Результаты расчёта экономической эффективности (в ценах 2021 года) показали, что суммарные затраты на проведение аналитических исследований «Идентификационный анализ протеотипических пептидов для мясного сырья методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс- спектрометрическим детектированием» составили 1416,64 рублей с использованием измерения общего растворимого белка и дополнительной стадией очистки и 738,25 рублей без данных стадий. Расчет стоимости произведен для одного полноценного профилирования белкового состава на данный момент для 4 показателей и имеющий потенциально расширение до 15 показателей за один анализ. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 1. В результате биоинформационного поиска было выбрано более 100 уникальных пептидов, не содержащих аминокислоты, подверженных химической модификации. 2. Проведен сравнительный анализ 58-ми аминокислотных последовательностей. Определены лучшие протеотипические пептиды для идентификации и надежного детектирования мышечной ткани основного мясного сырья и белковых ингредиентов: говядины (YLEFISDAIIHVLHAK, NDMAAQYK), свинины (YLEFISEAIIQVLQSK, SALAHA VQSSR), мяса кур (VAGAALPCAPAVK), сухого молока (FFVAPFPEVFGK, YLGYLEQLLR), обладающих термостабильностью и специфичностью. 3. Установлена селективность протеотипических пептидов на примере сравнения различных тканей свинины. 4. Разработана ВЭЖХ-МС/МС методика полуколичественной оценки мышечной ткани свинины и говядины в сложной пищевой матрице. Установлены метрологические характеристики: сходимость на модельных системах в пределах 25,0% ср. кв. отклонения (при n = 3). Предел обнаружения методики – ≥0,3% (мас. %). Предел количественного определения ≥0,9 % мас. Диапазон количественного определения от 0,9-100,0% (мас. %) с точностью в пределах 25,0% ср. кв. отклонения. Чувствительность методики позволят провести различие между случайным загрязнением (< 1,0 % (мас. %)) и сознательным внесением незаявленных ингредиентов (> 1,0 % (мас. %)).
5. Приложение по идентификации мышечной ткани включено в методические рекомендации «Методика измерений массовой доли мясного ингредиента кур в пробах мясной продукции, выработанной по национальным и межгосударственным стандартам (за исключением консервов) (No 241.0067/RA.RU.311866/2021), методом флуоресценции для детектирования продуктов полимеразной цепной реакции в реальном времени».